Summary
В этом протоколе представлены шаги по получению и анализу флуоресцентных изображений кальция из перицитов головного мозга и данных кровотока из близлежащих кровеносных сосудов у анестезируемых мышей. Эти методы полезны для изучения физиологии муло-клеток и могут быть адаптированы для исследования переходных процессов кальция в любом типе клеток.
Abstract
Последние достижения в области белковой биологии и генетики мышей позволили измерить внутриклеточные колебания кальция клеток мозга in vivo и соотнести это с местной гемодинамикой. Этот протокол использует трансгенных мышей, которые были подготовлены с хроническим черепным окном и экспрессируют генетически закодированный индикатор кальция, RCaMP1.07, под α промотором актина гладкой мускулатуры, чтобы специфически маркировать настенные клетки, такие как гладкомышечные клетки сосудов и перициты. Описаны шаги о том, как подготовить катетер хвостовой вены к внутривенному введению флуоресцентных красителей для отслеживания кровотока, а также как измерить кальций перицита мозга и местную гемодинамику кровеносных сосудов (диаметр, скорость эритроцитов и т. Д.) С помощью двух фотонных микроскопий in vivo через краниальное окно у мышей, обезболенных кетамином / ксилазином. Наконец, предоставляются подробности для анализа колебаний кальция и фильмов кровотока с помощью алгоритмов обработки изображений, разработанных Barrett et al. 2018, с акцентом на то, как эти процессы могут быть адаптированы к другим данным клеточной визуализации.
Introduction
Сосудистая система центральной нервной системы состоит из проникающих артериол, капилляров и восходящих венул. В рамках этой сети муральные клетки, такие как гладкомышечные клетки сосудов, заражая артериолы и перициты, расширяют клеточные процессы вдоль первых ветвей артериол и капилляров1. Перициты, по-видимому, играют несколько ролей в мозге, включая поддержание гематоэнцефалического барьера1,2,миграцию иподвижность 3,потенциальные свойства стволовых клеток и регуляцию мозгового кровотока4,5,6. Многие из функциональных ролей перицитов были связаны с колебаниями внутриклеточного кальция, которые могут регулировать расширение или сокращение этих клеток4,5,6.
В нескольких недавних исследованиях были установлены критерии для идентификации различных типов перицитов мозга7,8. Муральные клетки в пределах первых 4 ветвей проникающих артериол являются обволакивающими перицитами на основе их экспрессии сократительного белка α-гладкомышечные актины (αSMA) и их выступающих, яйцевидных соматов с отростками, которые оборачиваются вокруг сосудов7,8,9. Для визуализации колебаний кальция в перицитах, этот протокол использует новую трансгенную линию мыши Acta2-RCaMP1.07, также известную как Tg(RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik/J10. Эти мыши экспрессируют красный генетически закодированный индикатор кальция, RCaMP1.07, в клетках, экспрессивиющих αSMA (клетках гладкой мускулатуры сосудов и перицитах). Племенные колонии поддерживаются путем скрещивания ненесующих животных с гемизиготами. RCaMP1.07 представляет собой красный флуоресцентный белок с связывающим кальмодулином доменом, который увеличивает флуоресценцию при связывании с внутриклеточным кальцием10,11. В этом протоколе описываются этапы комбинированной кальциевой визуализации перицитов и измерения кровотока с помощью двух фотонной микроскопии, включая процедуры инъекции флуоресцентных красителей в хвостовую вену, получение изображений микроскопом у анестезируемых мышей и анализ данных с помощью программных платформ(рисунок 1). Эти методы полезны для решения вопросов о физиологии муло-клеток, но могут быть адаптированы для изучения переходных процессов кальция в любом типе клеток в мозге или другой системе органов.
Для эксперимента, представленного в этой статье, использовалась 10-месячная самка мыши Acta2-RCaMP1.07. Мышь перенесла операцию по поводу хронического черепного окна и головы после имплантации за два месяца до этого. Детали хирургического протокола обсуждаются в предыдущих исследованиях12,13 и аналогичные процедуры были выполнены в других ранее опубликованных протоколах14,15. Сосудистая процедура маркируется зеленым флуоресцеином-декстраном (70 000 МВт, антионный раствор, 2,5% мас./об.), вводимым внутривенно. Этот краситель является экономически эффективным и легко доступным из коммерческих источников, но он имеет более широкий спектр излучения, который может перекрываться с излучением RCaMP и пропускаться во время получения изображения микроскопом. Шаги для спектрального размешивания описаны в разделе 4 ниже, чтобы обойти это, но также могут использоваться другие зеленые красители с более узкими спектрами излучения, такие как те, которые основаны на EGFP.
Protocol
Все процедуры с участием экспериментальных животных, описанные ниже, были одобрены Комитетом по уходу за животными Университета Манитобы, который регулируется Канадским советом по уходу за животными.
1. Настройка и подготовка процедуры
ПРИМЕЧАНИЕ: Для инъекции катетера в хвостовую вену требуются следующие предметы: инсулиновые шприцы, 15-сантиметровый кусок трубки PE10, иглы 30 г, марля, физиологический раствор, щипцы, краситель зеленый флуоресцеин декстран, плоскогубцы и ножницы. Кроме того, испаготовите иглу с кетаминовой / ксилазиновой анестезией, которая будет введена перед сеансом визуализации.
КРИТИЧЕСКИЙ: Все материалы и оборудование, описанные в Шагах 1 и 2, должны быть стерилизовано перед использованием путем автоклавирования или промывки 70% этанолом. Если плоскогубцы не могут быть должным образом стерилизовано, рекомендуется использовать пару больших держателей игл. Сборка катетера должна осуществляться плоскогубцами и щипцами, чтобы избежать случайных проколов игл.
- Нарезанный приблизительно 15-20 см полиэтиленовых труб, PE10 (I.D. 28 мм; O.D. 61 мм).
- Заполните инсулиновый шприц 27 г 0,9% физиологическим раствором и заклейте иглу шприца в наконечник полиэтиленовой трубки. Протолкивайте физиологический раствор через трубку, убедившись, что нет утечек.
- Используя плоскогубцы, сгибайте иглу 30 G (0,3 мм x 25 мм) вперед и назад, пока она не сломается от ступицы. Игла должна быть чистой без изгибов.
- Удерживая иглу щипцами, осторожно вставьте иглу в конец трубки PE10, которая прикреплена к солевым шпрингу, и удалите пузырьки воздуха. Это катетер для инъекций.
- Фильтруйте 30 мкл 2,5% (мас./об.) флуоресцеина декстрана через фильтр 13-25 мкм перед инъекцией.
- Заполните другой инсулиновый шприц 30 мкл аликвотой декстрана и убедитесь, что в заполненном шприце нет пузырьков.
2. Инъекция в хвостовую вену
- Обезболить мышь изофлураном (4% индукция, 1,5% поддерживающей) или кетамином/ксилазином (60 мг/кг; 10 мг/кг; т.п.) и нанести глазной смазочный гель. Кетамин/ксилазин рекомендуется для более стабильных измерений кровотока во время визуализации и доза может быть увеличена до 90 мг/кг; 10 мг/кг кетамина/ксилазина для более длительных сеансов визуализации.
- Когда мышь находится в хирургической плоскости анестезии, поместите перчатку, наполненную теплой водой, на хвост, чтобы расширить боковую вену.
- Снимите перчатку через 30 с и очистите хвост этанолом.
- Поместите хвост между большим и средним пальцами. Обеспечьте давление указательным пальцем на хвост, чтобы расширить вену. Другой рукой подберите иглу катетера с щипцами, ориентирующими безель вверх к потолку.
- После очистки хвоста 70% этанолом, плавно вставьте иглу в вену под углом 0° и осторожно введите физиологический раствор через катетер, чтобы убедиться, что игла помещена правильно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если нет сопротивления на поршени и нет набухания хвоста, то игла находится в вене. При наличии значительного сопротивления или отека иглу следует удалить. Шаги 2,2-2,5 можно повторять до 3 раз с каждой стороны хвоста, заменяя иглу 30G в конце катетера каждый второй раз до тех пор, пока установка не будет правильной. - Как только игла окажется в вене, переключите солевой шприц на конце катетера на шприц, содержащий флуоресцеин декстран (этап 1.6). Медленно вводите декстран в трубку катетера, гарантируя, что пузырьки не попадут в трубку. Если пузырь воздуха очевиден, отрежьте трубку, содержащую пузырь, чтобы удалить его и повторно прикрепить шприц.
- Когда весь декстран (30 мкл аликвота) будет введен, извлеките шприц и замените его солевым шприцем. Введите оставшийся декстран из трубки в мышь до тех пор, пока в трубке не останется красителя.
- Снимите иглу с хвоста и обеспечьте давление марлей в течение 10-30 с до тех пор, пока кровотечение не прекратится.
КРИТИЧЕСКИЙ: Если после 6 попыток инъекция хвостовой вены не увенчалась успехом, животное должно быть сфотобировано на другом сеансе. Также общий объем (физиологический раствор и декстран), вводимый в мышь, не должен превышать 100 мкл.
3. Двухфотонная микроскопия
- Фокусировка на краниальном окне
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте кетаминовую / ксилазиновую анестезию во время сбора данных, потому что она имеет меньше сосудистых эффектов (вазодилатация), чем изофлуран. При использовании изофлурана на описанных выше шагах, вводите мыше с кетамином/ксилазином i.p. (рекомендуемая доза, описанная выше) перед визуализацией.- Закрепите мышь винтом через головной столб к платформе с грелкой под микроскопом.
- Нанесите смазку для глаз на глаза мыши.
- Очистите краниальное окно влажными зубными аппликаторами. Убедитесь, что не осталось частиц, которые могли бы помешать процессу визуализации.
- Нанесите ультразвуковой гель на окно.
- Фокусируйтесь через двухфотонный объектив микроскопа, пока под окном не будут видны кровеносные сосуды.
- Проверьте дыхание мыши и убедитесь, что грелка обеспечивает достаточную температурную поддержку.
- Получение изображений
ПРИМЕЧАНИЕ: Двухфотонный микроскоп, используемый в этом эксперименте, имеет перестраиваемый Ti-сапфировый лазер для флуоресцентного возбуждения с помощью ячейки Поккеля, которая контролирует количество лазера, достигаемого образца. Излучаемый свет разделяется 565-длинным проходным дихроиком на две фотоумножимные трубки GaAsP (PMT) с полосным фильтром 595/50 (красный) и полосным фильтром 525/70 (зеленый) для обнаружения.
Процедуры, описанные в Шагах 3.2-3.4, выполняются с использованием специального программного обеспечения двухфотонного микроскопа из этого протокола (см. Таблицу материалов). Эти шаги могут быть адаптированы к другому программному обеспечению и оборудованию микроскопа.- Когда свет в комнате выключен, установите желаемую длину волны в программном обеспечении микроскопа на 990 нм, чтобы возбуждать как RCaMP, так и флуоресцеин-декстран, нажав на 2-P лазерную коробку.
- Установите мощность лазера, щелкнув по разделу Power/Gain box/Lasers и отрегулировав напряжение ячейки Pockels 1 на уровне 30% или значение 300 по шкале 1000. Мощность лазера, которая достигает образца в этой настройке, ранее была определена как ~ 30 мВт.
- Установите чувствительность детектора PMT, щелкнув по разделу Power/Gain box/PMT и отрегулировав значение до 700-800.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти значения могут быть скорректированы относительно интенсивности флуоресцентного образца и должны быть установлены на ноль перед включением света в комнате. - Перейдите в раздел «Разрешение изображения» и нажмите на разрешение 512 x 512, чтобы увеличить размер изображения.
- Нажмите на 2-P Laser/Open, чтобы открыть 2-P лазерный затвор.
- Перейдите в раздел «Сканирование» и нажмите кнопку «Сканирование в реальном времени».
ПРИМЕЧАНИЕ: Живое сканирование с этими параметрами и более высоким разрешением, RCaMP положительные настенные клетки и флуоресцентно меченая плазма крови могут быть замечены. Если сигнал слабый, значение pockel можно увеличивать до тех пор, пока картинка не станет ясной.
КРИТИЧЕСКИЙ: В поверхностных слоях тканей мощность лазера не должна превышать 50 мВт, что составляет около 600 в настройках клеток Pockels в этом примере.
- Получение глубинного стека настенных клеток и сосудистой сети
ПРИМЕЧАНИЕ: Приобретение глубинного стека рекомендуется для правильного нахождения перицитов в сосудистой сети. Эншетирование перицитов расположено на первой-четвертой ветвях от проникающейартериолы 7,8,9. Программное обеспечение микроскопа, используемое в этом протоколе, относится к стекам глубины как «Z-серия».- Перемещая объектив микроскопа в плоскости X, Y и Z, локализуют большую артерию на поверхности мозга на основе маркировки гладкомышественных клеток RCaMP.
- Нажмите на поле Z-Series.
- Сосредоточьтесь на верхней части ткани вблизи пиальных сосудов, установите ее в качестве нулевой точки и верхней части стека серии Z, щелкнув по разделу Текущая Z-серия / Начальная позиция [мкм]. Нажмите на поле с четырьмя черными полосами и одной красной полосой сверху.
- Сосредоточьтесь вниз в ткани на нужную глубину и установите ее в качестве нижней части стека, щелкнув по разделу Текущая Z-серия/Стоп-положение [мкм]. Нажмите на поле с четырьмя черными полосами и одной красной полосой внизу.
- Установите толщину каждой плоскости изображения (размер шага) на 1-2 мкм, набрав нужное значение в поле под кнопкой"Step Size"(кнопкаStep Size локализована в разделе Z-series/Current Z-series). Это определит количество изображений, которые будут получены в стеке.
- Установите экспоненциальную мощность лазера по мере того, как микроскоп перемещается глубже через стек, щелкнув поле «Компенсация лазера / PMT» и выбрав «Относительный (экспоненциальный градиент)».
- Назовите файл, выберите папку для его сохранения и нажмите на Start Z-series.
- После приобретения откройте серию Z в программном обеспечении для обработки изображений.
- Объедините два канала в виде цветных изображений и просканируйте стек в поисках интересующих перицитов и кровеносных сосудов, щелкнув в поле Изображение | Цвет | Разделенные каналы; | изображений Цвет | Объединение каналов.
- Выберите интересующих области (ROI), содержащие перициты, и сохраните позиции, чтобы помочь найти эти пятна снова в будущих сеансах визуализации.
- Получение фильмов с кальцием серии T (время)
- Используя стек глубины и ROI сверху в качестве ориентира, перемещайте объектив микроскопа по оси X, Y и Z в режиме динамического сканирования, пока не будет найден интересующий перицит.
- Чтобы собрать фильм о перицитных кальциевых событиях, увеличьте частоту кадров (>10 кадров в секунду), перейдя в раздел «Разрешение изображения» и нажав на поле 128x128.
- Установите длительность изображения на 60 с, щелкнув поле серии T и введя время в поле длительности.
- Рядом с полем «Сохранить путь» нажмите на кнопку с тремя точками, чтобы обновить путь сохранения уникальным именем файла.
- Оптическое масштабирование судна, чтобы учесть более низкое разрешение и получить более близкое представление о перицилте, отрегулировав значение в разделе Optical Zoom [mag].
- Приобретите T-серию, нажав на Кнопку Начать T-серию.
- Измерения гемодинамики с помощью кимографов (линейное сканирование)
- Сосредоточьтесь на интересуемом сосуде с разрешением 512 x 512пикселей в режиме Live Scan.
- Чтобы измерить диаметр кровеносных сосудов и скорость эритроцитов, нажмите на Line Scan, чтобы начать одномерное сканирование с помощью микроскопа.
- Установите длительность сканирования (30-60 с) в миллисекундах.
- Прорисуйте линию, которая делит интересуемое судно пополам и движется параллельно вдоль сосуда. Это сгенерирует кимограф диаметра сосуда слева и полосы красных кровяных телец, движущихся по сосуду справа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько кровеносных сосудов могут быть измерены с помощью одной и той же линии, если они находятся в одной плоскости визуализации. - Назовите файл и нажмите на Start Linescan(s), чтобы получить данные.
4. Анализ изображений
- Анализ кальциевых фильмов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает шаги для спектрального размешивания (Рисунок 2) и два различных метода анализа событий перицитного кальция с использованием вручную выбранных вручную ROI (Рисунок 3) и автоматизированный выбор окупаемостью инвестиций на основе деятельности (Рисунок 4)16,17. Чтобы обнаружить и классифицировать пики сигнала с нормализованным следом кальция из каждого ROI, данные фильтруются с длинными и полосовыми проходами, что помогает сгладить данные для оценки амплитуды и ширины, а также идентифицировать пики различной формы: одиночные пики, мультипики и плато (Рисунок 3B). Параметры этого анализа могут быть оптимизированы для обнаружения различных типов динамических клеточных сигналов. Приведенные ниже шаги потребуют использования программного обеспечения для обработки изображений и программного обеспечения для программирования с пакетами обработки изображений, которые содержат различные коды для анализа кальциевых фильмов, как упоминалось выше. Пожалуйста, ознакомьтесь с таблицей материалов для получения полного списка программ и пакетов, используемых в этом протоколе. Данные визуализации с различных типов микроскопов могут быть импортированы с помощью этих пакетов, сохраняющих метаданные из изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 4.1.1-4.1.7 описывают, как выбрать ROI вручную в программном обеспечении для обработки изображений для последующего использования в ручном методе анализа кальция (Шаг 4.1.16)- Загрузите кальциевую визуализацию серии T в программное обеспечение для обработки изображений, перетащив файл .xml на панель инструментов программного обеспечения. Нажмите на поле OK.
- Возьмем среднее значение стека (среднее значение стека помечено как«Z-проекция»программным обеспечением для обработки изображений). Это можно сделать, нажав на Image | стеки | Z-проекция на панели инструментов.
- Сделайте цветное изображение из обоих каналов, как по шагам 3.3.9.
- Откройте окно менеджера ROI, щелкнув в поле Анализировать | Инструменты | ROI Manager, или просто нажатие буквы«T»на клавиатуре.
- Выберите инструмент «Полигон», щелкнув форму полигона на панели инструментов программного обеспечения для обработки изображений, и наметьте видимые структуры перицитов, такие как сома и процессы.
- Нажмите на кнопку Добавить, расположенную в окне менеджера ROI, чтобы добавить выбранные ROI в менеджер ROI.
- Присвойте каждой интересующей области уникальное имя, нажав кнопку Переименовать, и сохраните их в виде ZIP-папки, которую можно загрузить позже в программном обеспечении, нажав кнопку Дополнительно>> | Сохранить.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 4.1.8-4.1.14 описывают, как импортировать Т-серию кальция в программную платформу и как размешивать различные флуорофоры, обнаруженные микроскопом PMT, в различные каналы(рисунок 2). - Откройте программное обеспечение для программирования и убедитесь, что папки для пакетов обработки изображений находятся на пути (см. Таблица материалов).
- Импортируйте кальциевую T-серию в программное обеспечение программирования, вызвав функцию BioFormats в командном окне платформы программирования, которая автоматически открывает окно выбора файла.
- Определите, что находится на каждом канале, введя нужное число. В этом примере данных ответ канала 1 =6 (cellular_signal), ответа канала 2 =1 (blood_plasma).
- Отоглядите данные в виде фильма в программном обеспечении для облегчения визуализации путем вызова функции сюжета.
- Для удаления зеленой флуоресценции из флуоресцеина-декстрана, который пропускается в красный канал RCaMP, разминировать каналы в пакете обработки изображений, вызвав функцию unmix_chs в командном окне платформы программирования.
- Выберите область, содержащую только флуоресценцию от этого флуорофора в канале 1, например RCaMP в данном случае.
- Выберите область, которая содержит только флуоресценцию из флуорофора 2, такую как флуоресцеин в плазме крови в этом примере.
- Выберите фоновую область, которая не имеет флуоресценции ни от одного флуорофора. Это создает матрицу спектрального вклада, которая применяется к каждому пикселю в каждом канале. Это значительно улучшает локализацию сигнала RCaMP, что улучшит обнаружение кальциевых событий в этих структурах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как упоминалось выше, существует несколько способов анализа данных визуализации кальция в пакетах обработки изображений. Этапы 4.1.16-4.1.23 описывают метод анализа событий перицитного кальция с использованием вручную выбранных вручную ROI. - Запустите анализ клеточной сигнализации на несмешанный кальциевый фильм, вызвав функцию CellScan в командном окне платформы программирования.
- Код спросит: «Какой метод обнаружения ROI вы хотели бы использовать?». Введите число 2, чтобы загрузить выбранные вручную ROI на платформу программирования.
- Загрузите интересуемые области из zip-папки, которые были выбраны из перицитов вручную ранее (шаг 4.1.6).
- Код спросит:«Каков коэффициент масштабирования?». Определите коэффициент масштабирования для выбранных вручную ROI относительно анализируемого ряда изображений и введите номер шкалы. В этом примере коэффициент масштабирования равно 1, поскольку roi не нужно измещать, поскольку они были выбраны на изображениях с разрешением 128x128 пикселей, с тем же разрешением, что и в исходном кальциевом фильме.
- Генерируйте графики каждой окупаемости инвестиций и нормализованные следы кальция в разных цветах(рисунок 3A),вызывая функции процесса и графика в командном окне.
- Если код не обнаруживает большинство событий кальция в отдельных трассировках, измените встроенные параметры в поле оптимизации конфигурации, вызвав функцию opt_config и настроив значения, такие как снижение порога для короткопроходных отфильтрованных данных до трехкратного стандартного отклонения базового периода, который является первыми 30 кадрами T-ряда.
- Нажмите кнопку Обработать в поле оптимизации, чтобы применить новые параметры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обнаружения и классификации сигналов нормализованный след кальция фильтруется с длинным проходом и полосовым проходом, что помогает сгладить данные для оценки амплитуды и ширины, а также определить, являются ли сигналы одиночными пиками, несколькими пиками или плато(рисунок 3B). - Выдайте данные в виде файла .csv, содержащего пространственную информацию об интересующих областях и пиках, которые были идентифицированы путем вызова функции output_data в командном окне. Присвойте файлу уникальное имя для дальнейшего анализа в статистической программе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы 4.1.24-4.1.31 описывают метод анализа событий перицита кальция с использованием анализа ROI на основе активности. - Повторите шаги 4.1.8.-4.1.16, чтобы импортировать кальциевую кино, отменить коммикширование каналов и вызвать функцию CellScan в программной платформе.
- Код спросит: «Какой метод обнаружения ROI вы хотели бы использовать?». Введите число 6 для выбора автоматизированной идентификации интересующего региона на основе активности и изменения флуоресценции в 3 измерениях (x, y и время; "3D алгоритм FLIKA").
- Постройте обработанные результаты для просмотра определенных областей интереса в виде разных цветов путем вызова функций процесса и построения в командном окне. Каждая рентабельность инвестиций различается во времени и пространстве и представлена в виде наложенной маски(рисунок 4).
- Если алгоритм не обнаруживает ROI, которые хорошо видны на глаз, измените встроенные параметры в поле оптимизации, вызвав функцию opt_config и отрегулировав значения, например увеличив гауссов фильтр, который сглаживает данные во времени (на 2 с) и уменьшив порог для поиска ROI до 3-кратного стандартного отклонения от базового уровня.
- Нажмите кнопку процесса в поле оптимизации, чтобы применить новые параметры. В процессе оптимизации должно быть определено больше ROI(рисунок 4B).
- Постройте ROI как фильм, чтобы четко определить области деятельности (очерченные цветами радуги) путем изменения режима поля по умолчанию на фильм в окне оптимизации для дальнейшей визуализации.
- Выведем данные в виде CSV-файла, вызвав функцию output_data в командном окне. Этот файл может быть проанализирован далее в статистической программе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры анализа могут быть скорректированы в соответствии с любым типом динамического сотового сигнала (кальций, коэффициенты FRET и т. Д.). Все вышеперечисленные шаги могут быть автоматизированы с помощью простого программного кода, чтобы пакетно обрабатывать многие кальциевые фильмы с одинаковыми настройками.
- Анализ кровотока при линейном сканировании.
- Импортируйте файл данных линейного сканирования кимографа, полученный в разделе 3.5, в программное обеспечение для программирования.
- Код спросит: «Что показывают на 1 и 2 каналах?». Определите, что находится на каждом канале при появлении запроса. В этом примере канал 1 пуст (тип 0),а канал 2 — blood_plasma (тип 1).
- Запустите функцию анализа диаметра при сканировании линии, вызвав функцию LineScanDiam, которая открывает поле для выбора области, соответствующей диаметру в кимографе(рисунок 5B,слева).
- Нарисуйте коробку за пределами границ флуоресценции кимографа, соответствующую диаметру сосуда.
- Обработайте этот класс данных, вызвав функцию процесса, чтобы измерить полную ширину при половинных максимумах для диаметра сосуда и сгенерировать график(рисунок 5C)с функцией графика.
- Выведем данные в виде CSV-файла, вызвав функцию output_data в командном окне. Этот файл может быть проанализирован далее в статистической программе.
- Запустите анализ преобразования радона скорости, вызвав функцию LineScanVel, которая открывает окно для выбора области, соответствующей скорости RBC в кимографе(рисунок 5B,справа).
- Нарисуйте внутри границы флуоресценции кимографа коробку, соответствующую скорости сосуда.
- Обработайте этот класс данных, вызвав функцию процесса, чтобы рассчитать скорость, поток и линейную плотность эритроцитов под углом полос во флуоресценции. Сгенерируйте график(рисунок 5D)с функцией графика.
- Выведем данные в виде CSV-файла, вызвав функцию output_data в командном окне. Этот файл может быть проанализирован далее в статистической программе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кимографы должны иметь четкую флуоресценцию с четко определенными краями между черными пространствами, чтобы анализ диаметра и скорости был точным(рисунок 5A,B). Очень важно точно нарисовать ортогональную и параллельную линии, иначе надежный анализ кимографов будет невозможен. Подобно анализу кальция с помощью алгоритмов обработки изображений, параметры для расчета диаметра и скорости могут быть оптимизированы.
Representative Results
Флуоресцеин-декстран имеет широкий спектр излучения, который может просачиваться в красный канал, влияя на обнаружение RCaMP в перицитах(рисунок 2A). Спектральное размешивание после сбора данных в программном обеспечении уменьшает флуоресцеиновое кровотечение через(рисунок 2B,ниже), улучшая обнаружение сигнала кальция на последующих этапах анализа.
Анализ кальция с помощью алгоритмов обработки изображений, используемых в этом протоколе, позволяет использовать несколько различных подходов к идентификации ROI и внутриклеточных колебаний кальция (то есть сигналов кальция). Выбор клеточных структур вручную позволяет обнаруживать колебания кальция в этих областях(рисунок 3A),включая различные типы пиков сигнала, такие как одиночные пики и мультипики, после того, как нормализованные следы кальция фильтруются нижними и полосовыми частотами(рисунок 3B). Кроме того, ROI идентифицируются путем группировки активных пикселей вместе, где интенсивность флуоресценции изменяется с течением времени, с использованием алгоритмов обработки изображений, разработанных Ellefsen et al.2014 16 и Barrett et al. 201817 (рисунок 4). Это может быть применено к любому динамическому сотовому сигналу путем настройки времени, порога и пространственных параметров для охвата ожидаемого размера и формы сигнала. Снижение порога для идентификации сигнала обнаруживает больше областей, представляющих интерес(рисунок 4B).
Яркие и четкие гемодинамические кимографы могут быть проанализированы для измерения диаметра и скорости эритроцитов в кровеносных сосудах вблизи перицитов(рисунок 5A,B). Диаметр рассчитывается из полной ширины при половинном максимуме флуоресценции(рисунок 5С). Скорость RBC аппроксимируется из полос, сделанных из немаркированных эритроцитов, где угол вводится в преобразование радона для расчета скорости, потока (ячеек/с) и линейной плотности (ячейки/мм); Рисунок 5D). Некачественные кимографы, где наблюдается флуоресцентное насыщение, плохое отношение сигнал/шум или движение поля изображения(рисунок 6А),создают ненадежные графики с точками погрешности (красными крестиками), где данные не могутбыть определены (рисунок 6B,C). Качество полученных данных имеет решающее значение для хорошего результата, и выполнение шагов, описанных в этом протоколе, обеспечивает хорошие результаты.
Рисунок 1. Краткое изложение протокола. В протоколе представлены шаги по получению и анализу флуоресцентных изображений кальция из перицитов, обволакивающих мозг, и данных кровотока из близлежащих кровеносных сосудов у анестезируемых мышей. Протокол разделен на 4 этапа. 1) Подготовка процедуры: установка оборудования и подготовка катетера; 2) Инъекция в хвостовую вену; 3) Сбор данных с помощью двухфотонной микроскопии; 4) Анализ данных с помощью алгоритмов обработки изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Спектральное размешивание флуорофоров. A) Репрезентативное среднее изображение RCaMP обволакивающего перицита и флуоресцеин-декстрана, меченого кровеносным сосудом из приобретения серии Т. Шкала bar= 10 мкм.B) Верхняя: при рассмотрении отдельных каналов в канале 1 (слева) очевидно прохождение через канал 2. Нижний: после спектрального размешивания кровотечение уменьшается, и сигнал от RCaMP более заметен в структуре перицилетов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Вручную выбранные ROI и оптимизированные следы кальция. A) Области интереса, выбранные в используемом программном обеспечении для обработки изображений (радужные формы), могут быть использованы для идентификации следов сигнала кальция. B) Пики сигнала от нормализованных трасс идентифицируются с помощью низкой и полосовой фильтрации данных. Мы определили порог сигнала как 3-кратное стандартное отклонение базового периода (первые 30 кадров), и любые пики выше этого порога считались сигналом (нижняя трассировка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4. Автоматизированные, основанные на активности ROI для анализа кальция. Эти же данные были проанализированы с порогом, в 7 раз превышая стандартное отклонение исходного уровня (А) и в 3 раза стандартное отклонение базового уровня (В). Снижение порога для идентификации активных пикселей обнаруживает больше ROI (B) и пиков сигнала (круговая диаграмма) в перицитах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5. Гемограф гемодинамических измерений. А) Пример сканирования линии через судно. B) Пример четко определенных кимографов для диаметра (слева) и скорости (справа). Черные полосы в правой полосе флуоресценции соответствуют эритроцитным .C) Анализ диаметра с четкими флуктуациями вазомоции. D) Анализ скорости с графиками для оси Y = потока RBC (ячейки / с), плотности линии (ячейки / мм), скорости (мм / с) и угла полосы (градус), отношения сигнал/шум (произвольные единицы, a.u.), ось X = время (сек). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6. Представление некачественных гемодинамических измерений. A) Примеры некачественных кимографов с флуоресцентной насыщенностью, плохим соотношением сигнал/шум или движением поля изображения во время съемки. B и C) Графики, аналогичные рисунку 7 данных о диаметре и скорости, которые имеют точки ошибки (красные точки) из-за низкого качества кимографов. (изображение E, ось Y = диаметр (мкм), ось X = время (сек); изображение F, ось Y = поток RBC (ячейки / с), плотность линии (ячейки / мм), скорость (мм / с) и угол полосы (градус), отношение сигнал/шум (a.u.), ось X = время (сек). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Настоящий способ предоставляет подробную информацию об инъекции в вену хвоста мыши с помощью катетера, двухфотонном микроскопе получения изображений для глубинных стеков, клеточных кальциевых сигнальных фильмов, создании гемодинамических кимографов, а также кальциевом и гемодинамическом анализе с помощью наших алгоритмов обработки изображений17 (фиг.1). У этих методов есть несколько преимуществ, которые улучшают результат визуализации in vivo и сокращают время, ресурсы и стресс животных во время сеанса. Во-первых, использование катетера для инъекции в хвостовую вену обеспечивает больший контроль над иглой, шприцем и количеством вещества, вводимого в кровообращение мыши. Кроме того, он предотвращает инъекцию красителя в ткань хвоста, экономя дорогостоящие реагенты. Во-вторых, мы используем трансгенных мышей, которые экспрессируют генетически закодированные датчики кальция в перицитах и демонстрируют, как локализовать их в сосудистой сети мозга с помощью глубинного z-стека, что облегчает идентификацию и перемещение клеток в последующих сеансах визуализации в долгосрочной перспективе. Это является важным фактором в исследованиях перицитов и обеспечивает правильную классификацию клеток6,7. В-третьих, мы предоставляем наши параметры для сбора кальциевых фильмов и данных сканирования гемодинамических линий, которые являются хорошей отправной точкой для измерения динамических клеточных сигналов. Наконец, мы представляем наши алгоритмы обработки изображений17,комплексный набор инструментов для обработки изображений, который содержит несколько подходов к предварительной обработке изображений (например, спектральное размешивание), анализ изображений кальция и гемодинамический анализ (диаметр, скорость и т. Д.). Эти алгоритмы могут генерировать графики для быстрой и простой визуализации данных, сводя к минимуму уровень знаний пользователей, необходимых для анализа результатов. Кроме того, он может быть автоматизирован с помощью нескольких строк кода для быстрой пакетной обработки нескольких наборов данных с одинаковыми параметрами. Это может потенциально улучшить визуализацию данных и временные вложения исследователя.
Ключом к сбору хороших данных визуализации кальция является настройка мощности лазера и PMT для получения четкого флуоресцентного сигнала, а также сбор данных с достаточной частотой кадров для захвата всего события кальция. Данные в этом протоколе были получены со скоростью 10-11 кадров в секунду, что фиксирует более медленные колебания кальция в перицитах. Существует также несколько шагов во время анализа, которые могут улучшить результат анализа. Во-первых, спектральное размешивание полезно, если существует значительное перекрытие между спектрами излучения флуорофоров(рисунок 2). Флуоресцеин-декстран был использован в этом протоколе, потому что он является экономически эффективным и коммерчески доступным конъюгатом декстрана, который обычно используется для гемодинамических измерений5. Спектральное размешивание помогает очистить данные для улучшенного обнаружения сигналов кальция, но также могут быть использованы альтернативные флуорофоры с более узкими спектрами излучения. Во-вторых, ручной выбор клеточных структур в качестве ROI(рисунок 3)полезен для классификации событий кальция в различных субклеточных областях, таких как сома или ветви процесса. Выбор ROI на основе активности(рисунок 4)16 предоставляет больше пространственной и временной информации об отдельных событиях кальция. Это может быть полезно при определении частоты событий кальция в данной области или распространении событий на другие клеточные области. Использование программного обеспечения для анализа данных изображений может сэкономить исследователям часы времени, когда данные обрабатываются пакетно, но для настройки параметров для достижения оптимальных результатов требуются некоторые первоначальные временные вложения. Наиболее важными факторами являются ожидаемый размер (вмкм2)активной области, а также продолжительность сигнала (необходимо определить минимальное время сигнала и максимальное время сигнала). Исследователи должны сначала изучить некоторые примеры фильмов серии T, чтобы наилучшим образом определить, какие параметры соответствуют их данным. Наконец, данные низкого качества, полученные на микроскопе, могут значительно затруднить анализ кальция и гемодинамики(рисунок 6). Поэтому следует позаботиться об оптимизации настроек сбора микроскопа в начале. Имея в виду эти факторы, этот протокол может быть адаптирован для визуализации кальция или анализа других динамических клеточных сигналов (например, флуоресцентных натрия, калия, метаболитов или колебаний напряжения) в других тканях или типах клеток.
У этого протокола есть несколько ограничений. Во-первых, данные собираются под наркозом, что влияет на активность мозга и может повлиять на кровоток. Аналогичная визуализация может быть сделана у бодрствующих мышей, которые обучены принимать фиксацию головы для более физиологических результатов. Кроме того, важно помнить, что мы собираем 2-мерные изображения 3-мерной клетки и кровеносного сосуда in vivo. Таким образом, мы можем захватить только фракцию кальциевых событий в этих клетках или кровоток в одном участке кровеносного сосуда за раз.
Еще одно ограничение, которое следует отметить, заключается в том, что двухфотонная визуализация кальция чувствительна к артефактам движения, где движение в фокальной плоскости и из нее может быть ошибочно принято за колебания кальция. Этот протокол выполнялся под наркозом, который ограничивал движение животного; однако артефакты движения могут быть введены по частоте дыхания мыши, частоте сердечных сокращений, возможному отеку тканей, а в случае окутывающих перицитов — по сокращению сосудов или вазомоции 4,6,18,19. Артефакты движения могут быть смягчены несколькими стратегиями. Пакеты обработки изображений, используемые в этом протоколе, включают дополнительный этап коррекции движения, который использует механизм 2D-свертки для выравнивания изображений в пределах T-серии на основе видимой сосудистой системы13,17. Кадры со значительными изменениями в фокальной плоскости идентифицируются этим алгоритмом и могут быть исключены из анализа. Кроме того, можно использовать статистические стратегии в пакетах обработки изображений, такие как Z-оценка при генерации флуоресцентных следов для нормализации флуктуаций кальция, вызванных движением20. Наиболее надежным подходом к учету артефактов движения в двухфотонной визуализации является объединение экспрессии двух флуоресцентных индикаторов в одной клетке, таких как индикатор кальция (например, GCaMP) и флуоресцентный репортер (например, mCherry), который не зависит от кальция. Флуктуации в флуоресцентном репортере затем могут быть отнесены к движению и вычитаются из сигнала индикатора кальция для нормализации артефактов движения.
Цель этого протокола - обеспечить четкое понимание того, как собирать оптимальные данные визуализации кальция и кровотока in vivo, а также представить новые методы и инструменты анализа, которые исследователи могут реализовать для улучшения своих результатов. Эти методы могут быть применены для изучения роли различных популяций перицитов в контроле кровотока или в различных состояниях заболеваний головного мозга. Эти параметры визуализации также могут быть использованы для изучения кальция и кровотока в других типах клеток и системах органов, и аналогичные принципы применяются к другим методам динамической визуализации, которые стали возможными благодаря другим генетически закодированным датчикам, помимо кальция.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
J. Meza поддерживается стипендиями mitacs и Research Manitoba. Финансирование этой работы было предоставлено Канадскими институтами исследований в области здравоохранения, Исследовательской организацией Манитобы, Фондом медицинской службы Манитобы, стартовым финансированием от Университета Манитобы и Brain Canada через Канадский фонд исследований мозга при финансовой поддержке Министерства здравоохранения Канады и Фонда Азриэли. Мнения, выраженные в настоящем документе, не обязательно отражают точку зрения министра здравоохранения или правительства Канады.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acta2-RCaMP1.07 | The Jackson Laboratory | 28345 | In the video protocol the animal model used is a female mouse of 10 months, 1 day old. |
| Applicators (Regular) | Bisco | X-80250P | |
| BioFormats package for MATLAB | NA | NA | Denominated in this protocol as "image processing packages". Available in: https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/ |
| CHIPS MATLAB toolbox | NA | NA | Denomitaded in this protocol as "image processing algorithms". Barrett MJP, Ferrari KD, Stobart JL, Holub M, Weber B. CHIPS: an Extensible Toolbox for Cellular and Hemodynamic Two-Photon Image Analysis. Neuroinformatics. 2018;16(1):145-147. doi:10.1007/s12021-017-9344-y. Available in: https://github.com/EIN-lab/CHIPS |
| Clear Ultrasound Gel, Medium viscosity | HealthCare Plus | UGC250 | |
| Dextran, fluorescein, 70,000 MW, anionic | Thermo Fisher Scientific | D1823 | |
| Dextran, Texas Red, 70,000 MW, neutral | Thermo Fisher Scientific | D1830 | |
| Eye Lube Plus | Optixcare | NA | |
| FIJI | Image J | NA | Denominated in this protocol as "image processor software". Available in: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
| GCaMP6sfl/fl | The Jackson Laboratory | ||
| Head Post fixing platform | University of Zurich | NA | |
| Ketamine (Narketan 100 mg/mL) | Vetoquinol | 440893 | |
| MATLAB R2020b | NA | Denominated in this protocol as "programming platform ". Available in: https://www.mathworks.com/downloads/ | |
| Needle 0.3mmx25mm | BD PrecisionGlide | 305128 | |
| Objective XLUMPLFLN20XW | Olympus | NA | https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/lumplfln-w/ |
| PDGFRβ-CreERT2 | The Jackson Laboratory | 30201 | |
| Polyethylene Tubing, PE10 I.D. 28mm (0.11”) O.D. 61mm (.024”) | BD Intramedic | 427401 | |
| Prairie View | Bruker Fluorescence Microscopy | NA | https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html |
| Ultima In Vitro Multiphoton Microscope | Bruker Fluorescence Microscopy | NA | https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html |
| Under Tank Heater | Reptitherm U.T.H | E169064 | |
| Xylazine (Rompun 20 mg/mL) | Bayer HealthCare | 2169592 |
References
- Armulik, A., Genové, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
- Berthiaume, A. -A., et al. Dynamic remodeling of pericytes in vivo maintains capillary coverage in the adult mouse brain. Cell Reports. 22 (1), 8-16 (2018).
- Rungta, R. L., Chaigneau, E., Osmanski, B. -F. F., Charpak, S. Vascular compartmentalization of functional hyperemia from the synapse to the pia. Neuron. 99 (2), 362-375 (2018).
- Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nature Methods. 9 (3), 273-276 (2012).
- Gonzales, A. L., et al. Contractile pericytes determine the direction of blood flow at capillary junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 27022-27033 (2020).
- Hartmann, D. a, et al. Pericyte structure and distribution in the cerebral cortex revealed by high-resolution imaging of transgenic mice. Neurophotonics. 2 (4), 041402 (2015).
- Grant, R. I., et al. Organizational hierarchy and structural diversity of microvascular pericytes in adult mouse cortex. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 39 (3), 411-425 (2017).
- Hill, R. A., Tong, L., Yuan, P., Murikinati, S., Gupta, S., Grutzendler, J. Regional blood flow in the normal and ischemic brain is controlled by arteriolar smooth muscle cell contractility and not by capillary pericytes. Neuron. 87 (1), 95-110 (2015).
- 28345 - STOCK Tg(RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik/J. Jackson Laboratory. , Available from: https://www.jax.org/strain/028345 (2021).
- Ohkura, M., Sasaki, T., Kobayashi, C., Ikegaya, Y., Nakai, J. An improved genetically encoded red fluorescent Ca2+ indicator for detecting optically evoked action potentials. PLoS ONE. 7 (7), (2012).
- Stobart, J. L., et al. Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation. Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).
- Stobart, J. L., et al. Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons. Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. JoVE. (12), e680 (2008).
- Lin, X., et al. Imaging neural activity in the primary somatosensory cortex using Thy1-GCaMP6s transgenic mice. JoVE. (143), e56297 (2019).
- Ellefsen, K. L., Settle, B., Parker, I., Smith, I. F. An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging. Cell Calcium. 56 (3), 147-156 (2014).
- Barrett, M. J. P., Ferrari, K. D., Stobart, J. L., Holub, M., Weber, B. CHIPS: an extensible toolbox for cellular and hemodynamic two-photon image analysis. Neuroinformatics. 16, 145-147 (2018).
- Hall, C. N., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (1), 55-60 (2014).
- Nilsson, H., Aalkjaer, C. Vasomotion: mechanisms and physiological importance. Molecular interventions. 3 (2), 79-89 (2003).
- Rungta, R. L., et al. Vascular arbors in layer II / III somatosensory cortex. Communications Biology. , (2021).
