Summary
Bu protokol, beyin ensheathing perisitlerinden floresan kalsiyum görüntülerini ve uyuşturulmış farelerde yakındaki kan damarlarından kan akışı verilerini elde etmek ve analiz etmek için adımlar sunar. Bu teknikler duvar hücresi fizyolojisi çalışmaları için yararlıdır ve herhangi bir hücre tipinde kalsiyum geçicilerini araştırmak için uyarlanabilir.
Abstract
Protein biyolojisi ve fare genetiğindeki son gelişmeler, beyin hücrelerinin hücre içi kalsiyum dalgalanmalarının in vivo olarak ölçülmeyi ve bunu lokal hemodinamik ile ilişkilendirmeyi mümkün kıltlamaktadır. Bu protokol, kronik bir kraniyal pencere ile hazırlanmış transgenik fareler kullanır ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi RCaMP1.07'yi, vasküler düz kas hücreleri ve ensheathing perisitleri gibi duvar hücrelerini özellikle etiketlemek için α pürüzsüz kas aktilin promotörü altında ifade eder. Kan akışını izlemek için floresan boyaların intravenöz enjeksiyonu için bir kuyruk damar kateterinin nasıl hazırlanacağı ve ketamin /ksilazine uyuşturulmuş farelerde kraniyal pencereden in vivo olarak iki foton mikroskopisi ile beyin perisit kalsiyumu ve lokal kan damarı hemodinamiklerinin (çap, kırmızı kan hücresi hızı vb.) nasıl ölçüleceğinin adımları özetlenmiştir. Son olarak, bu süreçlerin diğer hücresel görüntüleme verilerine nasıl uyarlanabilebileceğine vurgu yapılarak, Barrett ve ark. 2018 tarafından geliştirilen görüntü işleme algoritmaları aracılığıyla kalsiyum dalgalanmalarının ve kan akışı filmlerinin analizi için ayrıntılar sağlanmaktadır.
Introduction
Merkezi sinir sistemi vaskülat, delici arteriküller, kılcal damarlar ve yükselen venülelerden oluşur. Bu ağ içinde, damar düz kas hücreleri arteriyoleleri ve perisitleri kaplayan vasküler hücreler, hücresel süreçleri ilk arteriole dalları ve kılcal damarlar boyunca genişletir1. Perisitlerin beyin içinde kan-beyin bariyeri 1 ,2,göç ve hareketlilik3, potansiyel kök hücre özelliklerinin bakımı ve beyin kan akışının düzenlenmesi 4,5 ,6dahil olmak üzere çeşitlirolleresahip olduğu görülmektedir. Perisitlerin fonksiyonel rollerinin çoğu, hücre içi kalsiyumda bu hücrelerin genişlemesini veya daralmasını düzenleyebilecek dalgalanmalarla bağlantılıdır4,5,6.
Birkaç yeni çalışma, farklı beyin perisitleri7,8. Penetrasyon arteriyüllerinin ilk 4 dalındaki duvar hücreleri, kontrtil protein α pürüzsüz kas aktinin (αSMA) ifadelerine ve çıkıntılı, ovoid somata damarlarını saran süreçlere dayanan ensheathing perisitlerdir 7,8,9. Ensheathing perisitlerindeki kalsiyum dalgalanmalarını görselleştirmek için, bu protokol yeni bir transgenik fare hattı kullanır, Acta2-RCaMP1.07, Tg (RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik/J10olarak da bilinir. Bu fareler, αSMA eksprese hücrelerinde (damar düz kas hücreleri ve ensheathing perisitleri) genetik olarak kodlanmış kırmızı kalsiyum göstergesi RCaMP1.07'yi ifade eder. Üreme kolonileri, hemizygotlarla noncarrier hayvanları geçerek korunur. RCaMP1.07, hücre içi kalsiyum 10,11'ebağlanırken floresan artıran calmodulin bağlayıcıetki alanına sahip kırmızı bir floresan proteindir. Bu protokol, floresan boyaların kuyruk damarı enjeksiyonu, uyuşturulmuş farelerde mikroskop görüntü alımı ve programlama platformları ile veri analizi dahil olmak üzere iki foton mikroskopisi ile ensheathing perisitlerin ve kan akışı ölçümlerinin kombine kalsiyum görüntüleme adımlarını özetlemektedir (Şekil 1). Bu teknikler, duvar hücresi fizyolojisi ile ilgili soruları ele almak için yararlıdır, ancak beyindeki veya diğer organ sistemindeki herhangi bir hücre tipinde kalsiyum geçicilerini incelemek için uyarlanabilir.
Bu makalede sunulan deney için 10 aylık bir dişi Acta2-RCaMP1.07 fare kullanıldı. Fare iki ay önce kronik kraniyal pencere ve kafa sonrası implantasyon için ameliyat oldu. Cerrahi protokole ilişkin detaylar önceki çalışmalarda ele alınmıştır12,13 ve benzeri işlemler daha önce yayınlanan diğer protokollerde de gerçeklenmiştir14,15. Vaskülat, intravenöz olarak enjekte edilen yeşil floresan-Dektran (70.000 MW, anionik çözelti, % 2.5 w/v) ile etiketlenmiştir. Bu boya uygun maliyetlidir ve ticari kaynaklardan kolayca temin edilebilir, ancak RCaMP emisyonu ile örtüşebilecek ve mikroskop görüntü alımı sırasında kanayabilecek daha geniş bir emisyon spektrumu vardır. Spektral karıştırma adımları, bunu atlatmak için aşağıdaki Bölüm 4'te özetlenmiştir, ancak EGFP'ye dayananlar gibi daha dar emisyon spektrumlarına sahip diğer yeşil boyalar da kullanılabilir.
Protocol
Aşağıda özetlenen deney hayvanlarını içeren tüm prosedürler, Kanada Hayvan Bakım Konseyi tarafından yönetilen Manitoba Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Prosedür kurulumu ve hazırlanması
NOT: Kuyruk damarı kateter enjeksiyonu için aşağıdaki öğeler gereklidir: insülin şırıngaları, 15 cm'lik pe10 boru parçası, 30 G iğne, gazlı bez, salin, forseps, yeşil floresan dektran boyası, pense ve makas. Ayrıca, görüntüleme seansından önce enjekte edilecek ketamin/ksilazine anestezi ile bir iğne hazırlayın.
KRİtİk: Adım 1 ve 2'deki tüm malzeme ve ekipmanlar, %70 etanol ile otomatik olarak kapatılarak veya durulanarak kullanılmadan önce sterilize edilmelidir. Pense düzgün bir şekilde sterilize edilemezse, bir çift büyük iğne tutucu kullanılması önerilir. Kateter tertibatı, kazara iğne delinmelerini önlemek için pense ve tokmaklarla yapılmalıdır.
- Yaklaşık 15-20 cm Polietilen Boru, PE10 (I.D. 28 mm; O.D. 61 mm).
- 27 G'lık bir insülin şırıngasını% 0.9 salin ile doldurun ve şırınganın iğnesini polietilen tüpün ucuna bağlayın. Sızıntı olmadığından emin olmak için salinleri tüpten itin.
- Pense kullanarak, 30 G'lık bir iğneyi (0,3 mm x 25 mm) merkezden kopana kadar ileri geri bükün. İğne bükülmeden temiz olmalıdır.
- İğneyi tokmaklarla tutarak, iğneyi salin dolu şırıngaya tutturulmuş PE10 borunun ucuna dikkatlice yerleştirin ve hava kabarcıklarını çıkarın. Bu enjeksiyon için kateter.
- Enjeksiyondan önce 13-25 μm filtre ile %2,5 (w/v) floresan dektran 30 μL filtreleyin.
- Başka bir insülin şırındını 30 μL dektran aliquot ile doldurun ve doldurulmuş şırınna kabarcık olmadığından emin olun.
2. Kuyruk damarı enjeksiyonu
- Fareyi izofluran (%4 indüksiyon, %1,5 bakım) veya ketamin/ksilazin (60 mg/kg; 10 mg/kg; i.p.) ile uyuşturun ve göz yağlayıcı jel uygulayın. Görüntüleme sırasında daha kararlı kan akışı ölçümleri için ketamin/ksilazin önerilir ve doz 90 mg/kg'a çıkarılabilir; Daha uzun görüntüleme seansları için 10 mg/kg ketamin/ksilazin.
- Fare anestezinin cerrahi düzlemindeyken, yanal damarı genişletmek için kuyruğa ılık suyla dolu bir eldiven yerleştirin.
- Eldiveni 30 sn sonra çıkarın ve kuyruğu etanol ile temizleyin.
- Kuyruğu başparmak ve orta parmak arasına yerleştirin. Damarı genişletmek için kuyruk üzerindeki işaret parmağı ile basınç sağlayın. Diğer taraftan, kateterin iğnesini çerçeveyi tavana doğru yukarı doğru yönlendiren ön ayaklarla alın.
- Kuyruğu % 70 etanol ile temizledikten sonra, sorunsuz bir şekilde, iğneyi damara 0 ° açıyla yerleştirin ve iğnenin doğru yerleştirildiğinden emin olmak için kateterden salin enjekte edin.
NOT: Pistonda direnç yoksa ve kuyrukta şişlik yoksa, iğne damardadır. Önemli bir direnç veya şişlik varsa, iğne çıkarılmalıdır. 2.2-2.5 adımları kuyruğun her iki tarafında 3 kat tekrarlanabilir ve yerleştirme doğru olana kadar her saniye kateterin ucundaki 30G iğnesi değiştirilebilir. - İğne damara girdikten sonra kateterin ucundaki tuzlu şırıngayı floresan dektran içeren şırınga ile değiştirin (Adım 1.6). Dektranı yavaşça kateter tüpüne enjekte edin ve tüpe kabarcık girmemesini sağlayın. Bir hava kabarcığı belirginse, çıkarmak için kabarcık içeren boruyu kesin ve şırınnayı yeniden takın.
- Tüm dektran (30 μL aliquot) enjekte edildiğinde, şırınnayı çıkarın ve tuzlu şırınna ile değiştirin. Tüpte boya kalmayana kadar kalan dektranı borudan fareye enjekte edin.
- İğneyi kuyruktan çıkarın ve kanama durana kadar 10-30 sn gazlı bezle basınç sağlayın.
KRİtİk: 6 denemeden sonra kuyruk damarı enjeksiyonu başarılı olmazsa, hayvan başka bir seansta görüntülenmelidir. Ayrıca, fareye enjekte edilen toplam hacim (salin ve dektran) 100 μL'yi geçmemelidir.
3. İki foton mikroskopisi
- Kranial pencereye odaklanma
NOT: Veri toplama sırasında izoflurana göre daha az damar etkisine (vazodilasyon) sahip olduğu için ketamin/ksilazine anestezi kullanın. Yukarıdaki adımlarda izofluran kullanıyorsanız, görüntülemeden önce fareye ketamin/ksilazine i.p. (yukarıda açıklanan önerilen doz) enjekte edin.- Fareyi baş direğinden bir vida ile mikroskop altında bir ısıtma yastığı olan bir platforma sabitlayın.
- Farenin gözlerine göz yağı uygulayın.
- Kranial pencereyi nemli diş aplikatörleriyle temizleyin. Görüntüleme işlemini engelleyebilecek parçacık kalmadığından emin olun.
- Pencereye ultrason jeli uygulayın.
- Pial kan damarları pencerenin altında görülene kadar iki foton mikroskop hedefine odaklanın.
- Farenin nefes alışını kontrol edin ve ısıtma yastığının yeterli sıcaklık desteği sağladığından emin olun.
- Görüntü edinme
NOT: Bu deneyde kullanılan iki fotonlu mikroskop, numuneye ulaşan lazer miktarını kontrol eden bir Pockel hücresi ile floresan eksitasyon için ayarlanabilir bir Ti-Sapphire lazere sahiptir. Yayılan ışık, algılama için 595/50 bant geçiş filtresi (kırmızı) ve 525/70 bant geçiş filtresi (yeşil) ile iki GaAsP fotomultiplier tüpüne (PMT) 565 uzun geçiş dikrolik olarak bölünür.
Adım 3.2 ila 3.4'te açıklanan yordamlar, bu protokoldeki iki foton mikroskobun belirli yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir (bkz. Malzeme Tablosu). Bu adımlar diğer mikroskop yazılım ve ekipmanlarına uyarlanabilir.- Oda ışıkları kapalıyken, 2-P Lazer kutusuna tıklayarak hem RCaMP'yi hem de floresan-dektranı heyecanlandırmak için mikroskop yazılımında istenen dalga boyunu 990 nm olarak ayarlayın.
- Güç/Kazanç kutusu/Lazerler bölümüne tıklayarak ve Pockels 1 hücre voltajını %30'da veya 1000 ölçeğinde 300 değerini ayarlayarak lazer gücünü ayarlayın. Bu ayarda örneğe ulaşan lazer gücünün daha önce ~30 mW olduğu belirlenmişti.
- Güç/Kazanç kutusu/ PMT'ler bölümüne tıklayarak ve değeri 700-800 olarak ayarlayarak PMT dedektörü hassasiyetini ayarlayın.
NOT: Bu değerler floresan örneğinin yoğunluğuna göre ayarlanabilir ve odadaki ışıkları açmadan önce sıfıra ayarlanmalıdır. - Görüntü Çözünürlüğü bölümüne gidin ve daha büyük bir görüntü boyutu için 512 x 512 çözünürlüğe tıklayın.
- 2-P Lazerdeklanşör açmak için 2-P Lazer /Aç'a tıklayın.
- Tarama Bölümü'ne gidin ve Canlı Tarama düğmesine tıklayın.
NOT: Bu parametreler ve daha yüksek çözünürlükte canlı tarama, RCaMP pozitif duvar hücreleri ve floresan etiketli kan plazması görülebilir. Sinyal zayıfsa, tablo net olana kadar pockel değeri artırılabilir.
KRİtİk: Yüzeysel doku katmanlarında, lazer gücü 50 mW'ı geçmemelidir, bu örnekteki Pockels hücreleri ayarlarında yaklaşık 600'dür.
- Duvar hücrelerinin ve vasküler ağın derinlik yığınını edinme
NOT: Vasküler ağdaki perisitleri düzgün bir şekilde bulmak için bir derinlik yığınının alınması önerilir. Ensheathing perisitleri, penetrasyonu arteriole 7,8,9'danbirinci ila dördüncü dallarda bulunur. Bu protokolde kullanılan mikroskop yazılımı derinlik yığınlarını "Z serisi" olarak ifade eder.- Mikroskop hedefini X, Y ve Z düzleminde hareket ettirerek, RCaMP'nin düz kas hücresi etiketlemesi temel alınarak beynin yüzeyinde büyük bir arter lokalize edilir.
- Z Serisi kutusuna tıklayın.
- Pial damarların yakınındaki dokunun üst kısmına odaklanın, Geçerli Z serisi / Başlangıç konumu [μm] bölümüne tıklayarak bunu Z serisi yığınının sıfır noktası ve üst noktası olarak ayarlayın. Dört siyah çizgili ve üstte bir kırmızı çizgili kutuya tıklayın.
- Dokuda istediğiniz derinliğe odaklanın ve Geçerli Z serisi/Durdurma konumu [μm] bölümüne tıklayarak bunu yığının altı olarak ayarlayın. Dört siyah çizgili ve altta bir kırmızı çizgili kutuya tıklayın.
- "Adım Boyutu" düğmesinin altındaki kutuya istediğiniz değeri yazarak her görüntü düzleminin kalınlığını (adım boyutu) 1-2 μm olarak ayarlayın (Adım Boyutu düğmesi Z serisi/ Geçerli Z serisi bölümündeyerelleştirilmiştir). Bu, yığında alınan resim sayısını tanımlar.
- Lazer/PMT Telafisi kutusuna tıklayıp Göreli (Üstel Degrade)öğesini seçerek mikroskop yığında daha derine doğru ilerlerken lazer gücünü katlanarak artacak şekilde ayarlayın.
- Dosyayı adlandırın, kaydetmek için bir klasör seçtim ve Başlat Z serisi 'nitıklatın.
- Satın aldıktan sonra, görüntüleme işleme yazılımında Z serisini açın.
- İki kanalı renkli görüntüler olarak birleştirin ve görüntü | kutusuna tıklayarak ilgi çekici perisitleri ve kan damarlarını arayan yığında tarama yapın Renk | Kanalları Böl; Resim | Renk | Kanalları Birleştir.
- Perisit içeren ilgi alanları (ROI'ler) seçeneğini belirleyin ve gelecekteki görüntüleme oturumlarında bu noktaların yeniden bulunmasına yardımcı olmak için konumları kaydedin.
- T serisi kalsiyum görüntüleme filmi kazanımı (zaman)
- Derinlik yığınını ve yukarıdan ROI'leri referans olarak kullanarak, canlı tarama modu sırasında X, Y ve Z eksenindeki mikroskop hedefini bir ilgi perisit bulunana kadar taşıyın.
- Perisit kalsiyum olaylarının bir filmini toplamak için Görüntü Çözünürlüğü bölümüne gidip 128x128 kutusuna tıklayarak edinme kare hızını (saniyede 10 kare >) artırın.
- T serisi kutusuna tıklayıp süre kutusuna süreyi girerek görüntüleme süresini 60 s olarak ayarlayın.
- Yolu Kaydet kutusunun yanında, kaydetme yolunu benzersiz bir dosya adıyla güncelleştirmek için üç noktalı düğmeye tıklayın.
- Daha düşük çözünürlüğü hesaba katmak ve Optik Yakınlaştırma [mag] bölümündeki değeri ayarlayarak perisitin daha yakından görünümünü elde etmek için gemiye optik olarak yakınlaştırın.
- Başlangıç T serisi 'ne tıklayarak T serisini edin.
- Kimograflarla hemodinamik ölçümler (hat taramaları)
- Canlı Tarama modunda 512 x 512piksel çözünürlükte ilgi çekici gemiye odaklanın.
- Kan damarı çapını ve kırmızı kan hücresi hızını ölçmek için, mikroskopla tek boyutlu tarama başlatmak için Hat Taraması'nı tıklayın.
- Tarama süresini (30-60 s) milisaniye olarak ayarlayın.
- İlgi çekici damarı ikiye bölen ve gemi boyunca paralel hareket eden bir çizgi çizin. Bu, soldaki damar çapının ve sağdaki damardan hareket eden kırmızı kan hücrelerinin çizgilerinin bir kimografını oluşturacaktır.
NOT: Birden fazla kan damarı aynı görüntüleme düzleminde olduğu sürece aynı çizgi ile ölçülebilir. - Dosyayı adlandırın ve verileri almak için Başlangıç Satırlarını tıklatın.
4. Görüntü Analizi
- Kalsiyum film analizi.
NOT: Bu protokol spektral karıştırma adımlarını özetler (Şekil 2) ve elle seçilmiş ROI'leri kullanarak ensheathing perisit kalsiyum olaylarını analiz etmek için iki farklı yöntem (Şekil 3) ve otomatik, etkinlik tabanlı yatırım getirisi seçimi (Şekil 4)16,17. Her yatırım getirisinden normalleştirilmiş kalsiyum izi ile sinyal zirvelerini tespit etmek ve sınıflandırmak için, veriler genlik ve genişlik tahminleri için verileri yumuşatmaya ve ayrıca farklı şekillerdeki zirveleri tanımlamaya yardımcı olan uzun geçişli ve bant geçişli filtrelenir: tek tepeler, çok tepeler ve platolar (Şekil 3B). Bu analizin parametreleri, farklı dinamik hücresel sinyal türlerini tespit etmek için optimize edilebilir. Aşağıdaki adımlar, yukarıda belirtildiği gibi kalsiyum filmlerini analiz etmek için farklı kodlar içeren görüntü işleme paketleri ile görüntü işleme yazılımının ve programlama yazılımının kullanılmasını gerektirecektir. Bu protokolde kullanılan programların ve paketlerin tam listesi için lütfen malzeme tablosuna bakın. Farklı mikroskop türlerinden görüntüleme verileri, görüntülerdeki meta verileri koruyan bu paketlerle içe aktarılabilir.
NOT: Adım 4.1.1-4.1.7, manuel kalsiyum analiz yönteminde daha sonra kullanılmak üzere görüntü işleme yazılımında elle ROI'lerin nasıl seçileceği açıklar (Adım 4.1.16)- .xml dosyasını yazılım araç çubuğuna sürükleyerek kalsiyum görüntüleme T serisini görüntü işleme yazılımına yükleyin. Tamam kutusuna tıklayın.
- Yığının ortalamasını alın (yığının ortalaması görüntü işleme yazılımı tarafından "Z projeksiyonu" olarak etiketlenir). Bu, Resim | tıklayarak yapılabilir Yığınlar | Takım çubuğunda Z projeksiyonu.
- Adım 3.3.9'da olduğu gibi her iki kanaldan da renkli bir görüntü yapın.
- Çözümle | kutusunu tıklatarak yatırım getirisi yöneticisi penceresini açın Araçlar | Yatırım Getiri Yöneticisiveya klavyedeki "T" harfine basmanız yeterlidir.
- Görüntü işleme yazılımı araç çubuğundaki çokgen şekline tıklayarak çokgen aracını seçin ve soma ve işlemler gibi görünür ensheathing perisit yapılarını özetleyin.
- Seçili ROI'leri yatırım getirisi yöneticisine eklemek için YATıRıM GETIRI'si yöneticisi penceresinde bulunan Ekle düğmesini tıklatın.
- Yeniden Adlandır düğmesini tıklatarak her ilgi alanına benzersiz bir ad verin ve Daha Fazla'yı tıklatarak daha sonra programlama yazılımına yüklenebilen bir zip klasörü olarak kaydedin>> | 'yi kaydedin.
NOT: Adım 4.1.8-4.1.14, kalsiyum T serisinin programlama platformuna nasıl aktarılacağını ve mikroskop PMT'leri tarafından tespit edilen farklı floroforların farklı kanallara nasıl karıştırıldığını açıklar (Şekil 2). - Programlama yazılımını açın ve görüntü işleme paketlerinin klasörlerinin yolda olduğundan emin olun (bkz. Malzeme Tablosu).
- Dosya seçim penceresini otomatik olarak açan programlama platformu komut penceresinde bioformats işlevini çağırarak kalsiyum T serisini programlama yazılımına içe aktarın.
- İstediğiniz numarayı girerek her kanalda ne olduğunu tanımlayın. Bu örnek verilerde Kanal 1 yanıtı=6 (cellular_signal), Kanal 2 yanıtı=1 (blood_plasma).
- Çizim işlevini çağırarak görselleştirmeyi kolaylaştırmak için verileri programlama yazılımı içinde bir film olarak çizin.
- Kırmızı RCaMP kanalına kanayan floresan-dektrandan yeşil floresan çıkarmak için, programlama platformu komut penceresindeki unmix_chs işlevini çağırarak görüntü işleme paketindeki kanalları açın.
- Kanal 1'deki bu florofordan yalnızca floresan içeren bir bölge seçin (örneğin, bu durumda RCaMP).
- Bu örnekte kan plazmasındaki floresan gibi florofor 2'den yalnızca floresan içeren bir bölge seçin.
- Her iki florofordan floresan olmayan bir arka plan alanı seçin. Bu, her kanaldaki her piksele uygulanan bir spektral katkı matrisi oluşturur. Bu yapılarda kalsiyum olaylarının tespitini artıracak RCaMP sinyalinin lokalizasyonunu önemli ölçüde geliştirir.
NOT: Yukarıda belirtildiği gibi, kalsiyum görüntüleme verilerinin görüntü işleme paketleri içinde analiz edilebilmesinin birden fazla yolu vardır. Adım 4.1.16-4.1.23, elle seçilmiş CE'leri kullanarak ensheathing perisit kalsiyum olaylarını analiz etme yöntemini açıklar. - Programlama platformu komut penceresinde CellScan işlevini çağırarak, karıştırılmamış kalsiyum filminde hücresel sinyal analizini çalıştırın.
- Kodda "Hangi yatırım getirisi algılama yöntemini kullanmak istersiniz?" sorulur. Elle seçilen ROI'leri programlama platformuna yüklemek için 2 sayısını yazın.
- İlgi çekici bölgeleri perisitlerden seçilen zip klasöründen daha önce elle yükleyin (Adım 4.1.6).
- Kodda "Ölçek faktörü nedir?" sorulur. Analiz edilen görüntü serisine göre elle seçilen ROI'ler için ölçek faktörünü belirleyin ve ölçeğin sayısını yazın. Bu örnekte, orijinal kalsiyum filmiyle aynı çözünürlükte, 128x128 pikselli görüntülerde seçildiklerinden ROI'lerin yeniden boyutlandırılması gerekmediğinden ölçek faktörü 1'dir.
- Komut penceresindeki işlem ve çizim işlevlerini çağırarak her yatırım getirisinin çizimlerini ve normalleştirilmiş kalsiyum izlerini farklı renklerde (Şekil 3A) oluşturun.
- Kod, tek tek izlemelerdeki kalsiyum olaylarının çoğunu algılamazsa, opt_config işlevini çağırarak ve kısa geçiş filtrelenmiş verilerin eşiğini T serisinin ilk 30 karesi olan temel dönemin standart sapmasının üç katına düşürme gibi değerleri ayarlayarak yapılandırma iyileştirme kutusundaki yerleşik parametreleri değiştirin.
- Yeni parametreleri uygulamak için en iyi duruma getirme kutusundaki İşlem düğmesini seçin.
NOT: Sinyalleri tespit etmek ve sınıflandırmak için, normalleştirilmiş kalsiyum izi uzun geçişli ve bant geçişi filtrelenmiştir, bu da genlik ve genişlik tahminleri için verileri yumuşatmaya yardımcı olur, aynı zamanda sinyallerin tek tepeler, çok tepeli veya plato olup olmadığını belirlemeye yardımcı olur (Şekil 3B). - Verileri, ilgi alanları ve komut penceresindeki output_data işlevi çağrılarak tanımlanan tepeler hakkında uzamsal bilgiler içeren bir .csv dosyası olarak çıktısını verin. Bir istatistik programında daha fazla analiz için dosyaya benzersiz bir ad verin.
NOT: Adım 4.1.24-4.1.31, aktivite tabanlı ROI'lerin analizini kullanarak ensheathing perisit kalsiyum olaylarını analiz etme yöntemini açıklar. - Kalsiyum filmini içe aktarmak, kanalları karıştırmak ve programlama platformundaki CellScan işlevini çağırmak için 4.1.8.-4.1.16 adımlarını yineleyin.
- Kodda "Hangi yatırım getirisi algılama yöntemini kullanmak istersiniz?" sorulur. Faaliyete göre otomatik faiz tanımlama bölgesini seçmek ve floresandaki değişimi 3 boyutta (x, y ve zaman) seçmek için 6 sayısını yazın; "3D FLIKA algoritması").
- Komut penceresindeki işlem ve çizim işlevlerini çağırarak, tanımlanan ilgi alanlarını farklı renkler olarak görüntülemek için işlenen sonuçları çizin. Her yatırım getirisi zaman ve mekanda ayırt edilir ve yer paylaşımı maskesi olarak temsil edilir (Şekil 4).
- Algoritma gözle açıkça görülebilen ROI'leri algılamazsa, opt_config işlevini çağırarak ve verileri zamanında (2 sn) yumuşatan gauss filtresini artırmak ve ROI bulma eşiğini taban çizgisinin standart sapmasının 3 katına çıkarmak gibi değerleri ayarlayarak iyileştirme kutusundaki yerleşik parametreleri değiştirin.
- Yeni parametreleri uygulamak için en iyi duruma getirme kutusundaki işlem düğmesini seçin. Optimizasyon işlemi ile daha fazla ROI tanımlanmalıdır (Şekil 4B).
- Daha fazla görselleştirme için varsayılan kutunun modunu optimizasyon penceresinde filme değiştirerek etkinlik alanlarını (gökkuşağı renkleriyle özetlenmiş) net bir şekilde tanımlamak için ROI'leri bir film olarak çizin.
- Komut penceresinde output_data işlevini çağırarak verileri csv dosyası olarak çıktısını verin. Bu dosya bir istatistik programında daha fazla analiz edilebilir.
NOT: Analiz parametreleri her türlü dinamik hücresel sinyale (kalsiyum, FRET oranları vb.) uyacak şekilde ayarlanabilir. Yukarıdaki tüm adımlar, birçok kalsiyum filmini aynı ayarlarla toplu olarak işlemek için basit programlama kodu ile otomatiklenebilir.
- Hat taraması kan akışı analizi.
- Bölüm 3.5'te alınan hat tarama kimograf veri dosyasını programlama yazılımına alın.
- Kodda "Kanal 1 ve 2'de neler gösteriliyor?" sorulur. İstendiğinde her kanalda ne olduğunu tanımlayın. Bu örnekte, Kanal 1 boştur (0yazın) ve Kanal 2 blood_plasma (1yazın).
- Kimografideki çapa karşılık gelen alanı seçmek için bir kutu açan LineScanDiam işlevini çağırarak hat taramasında çap analizi işlevini çalıştırın (Şekil 5B, sol).
- Kimograf floresan sınırlarının dışına damar çapına karşılık gelen bir kutu çizin.
- Gemi çapı için tam genişliği yarı maksima cinsinden ölçmek ve çizim işleviyle bir çizim (Şekil 5C) oluşturmak için işlem işlevini çağırarak bu veri sınıfını işleyin.
- Komut penceresinde output_data işlevini çağırarak verileri csv dosyası olarak çıktısını verin. Bu dosya bir istatistik programında daha fazla analiz edilebilir.
- Kimografideki RBC hızına karşılık gelen alanı seçmek için bir kutu açan LineScanVel işlevini çağırarak hız radon dönüşüm analizini çalıştırın (Şekil 5B, sağ).
- Kimograf floresanının sınırına damar hızına karşılık gelen bir kutu çizin.
- Floresandaki çizgilerin açısından kırmızı kan hücrelerinin hızını, akısını ve doğrusal yoğunluğunu hesaplamak için işlem işlevini çağırarak bu veri sınıfını işleyin. Çizim işleviyle bir çizim (Şekil 5D) oluşturun.
- Komut penceresinde output_data işlevini çağırarak verileri csv dosyası olarak çıktısını verin. Bu dosya bir istatistik programında daha fazla analiz edilebilir.
NOT: Kimografların çap ve hız analizinin doğru olabilmesi için siyah boşluklar arasında iyi tanımlanmış kenarlara sahip berrak floresan olması gerekir (Şekil 5A, B). Ortogonal ve paralel çizgilerin kesin bir şekilde çizilmesi çok önemlidir, aksi takdirde kimografların güvenilir analizi mümkün olmayacaktır. Görüntü işleme algoritmaları ile kalsiyum analizine benzer şekilde, çap ve hız hesaplama parametreleri optimize edilebilir.
Representative Results
Floresan-dektran, ensheathing perisitlerinde RCaMP tespitini etkileyen kırmızı kanala kanayabilen geniş bir emisyon spektrumuna sahiptir (Şekil 2A). Yazılım programında veri toplama işleminden sonra spektral karıştırma, floresan kanamasını azaltır (Şekil 2B, daha düşük), sonraki analiz adımlarında kalsiyum sinyal tespitini artırır.
Bu protokolde kullanılan görüntü işleme algoritmaları ile kalsiyum analizi, ROI'leri ve hücre içi kalsiyum dalgalanmalarını (yani kalsiyum sinyallerini) tanımlamak için birkaç farklı yaklaşım sağlar. Hücresel yapıların elle seçilmesi, normalleştirilmiş kalsiyum izleri düşükgeçişli ve bant geçişli filtrelendikten sonra, tek tepeler ve çok tepeler gibi farklı sinyal zirveleri de dahil olmak üzere bu bölgelerdeki kalsiyum dalgalanmalarının tespitine izin verir (Şekil 3B). Ayrıca, ROI'ler Ellefsen ve ark. 201416 ve Barrett ve ark. 201817 (Şekil 4)tarafından geliştirilen görüntü işleme algoritmaları kullanılarak floresan yoğunluğunun zaman içinde değiştiği aktif pikselleri gruplayarak tanımlanır. Bu, sinyalin beklenen boyutunu ve şeklini kapsayacak şekilde zaman, eşik ve uzamsal parametreleri ayarlayarak herhangi bir dinamik hücresel sinyale uygulanabilir. Sinyal tanımlama eşiğini azaltmak daha fazla ilgi alanı bulur (Şekil 4B).
Parlak ve net hemodinamik kimograflar, ensheathing perisitlerinin yakınındaki kan damarlarında çapı ve RBC hızını ölçmek için analiz edilebilir (Şekil 5A, B). Çap, floresan maksimum yarım tam genişlikten hesaplanır (Şekil 5C). RBC hızı, açının hızı, akıyı (hücreler/hücreler) ve doğrusal yoğunluğu (hücreler/mm) hesaplamak için radon dönüşümüne girdiği etiketsiz RBC'lerden yapılan çizgilerden yaklaşık olarak elde edilir; Şekil 5D). Floresan doygunluğunun, gürültü oranının zayıf sinyalinin veya görüntüleme alanının hareketinin olduğu düşük kaliteli kimograflar (Şekil 6A) verilerin belirlenemediği hata noktaları (kırmızı haçlar) ile güvenilmez çizimler oluşturur (Şekil 6B, C). Elde edilen verilerin kalitesi iyi bir sonuç için kritik öneme sahiptir ve bu protokolde açıklanan adımları takip ederek iyi sonuçlar sağlar.
Şekil 1. Protokolün özeti. Protokol, beyin ensheathing perisitlerinden floresan kalsiyum görüntülerini ve uyuşturulmış farelerde yakındaki kan damarlarından kan akışı verilerini elde etmek ve analiz etmek için adımlar sunar. Protokol 4 adıma ayrılmıştır. 1) Prosedür hazırlığı: ekipman ve kateter hazırlama kurulumu; 2) Kuyruk damarı enjeksiyonu; 3) İki fotonlu mikroskopi ile veri toplama; 4) Görüntü işleme algoritmaları ile veri analizi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Spektral floroforların karıştırılmamış. A) RCaMP ensheathing perisit ve floresan-dektran etiketli kan damarının temsili ortalama görüntüsü bir T serisi alımından. Ölçek çubuğu= 10 μm.B) Üst: Tek tek kanallar göz önüne alındığında, Kanal 1'de (solda) Kanal 2'den kanama belirgindir. Alt: Spektral karıştırmadan sonra, taşma payı azalır ve RCaMP'den gelen sinyal perisit yapısında daha belirgindir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Elle seçilmiş ROI'ler ve optimize edilmiş kalsiyum izleri. A) Kullanılan görüntü işleme yazılımında (gökkuşağı şekilleri) seçilen ilgi alanları kalsiyum sinyal izlerini tanımlamak için kullanılabilir. B) Normalleştirilmiş izlerden gelen sinyal tepeleri, verileri filtreleyen düşük geçiş ve bant geçişi ile tanımlanır. Sinyal eşiğini taban çizgisinin standart sapmasının 3 katı (ilk 30 kare) olarak tanımladık ve bu eşiğin üzerindeki tüm zirveler bir sinyal (daha düşük izleme) olarak kabul edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. Kalsiyum analizi için otomatik, aktivite tabanlı ROI'ler. Aynı veriler, taban çizgisinin (A) standart sapmasından 7 kat, taban çizgisinin (B) standart sapmasından 3 kat daha fazla eşik ile analiz edildi. Etkin pikselleri tanımlama eşiğini azaltmak, perisitler içinde daha fazla ROI (B) ve sinyal zirvesi (pasta grafik) bulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5. Kimograf hemodinamik ölçümleri. A) Geminin içinden örnek hat taraması. B) Çap (sol) ve hız (sağ) için iyi tanımlanmış kimograf örneği. Doğru floresan bandı içindeki siyah çizgiler, net vasomotion dalgalanmaları ile RBC.C) Çap analizine karşılık gelir. D) Y ekseni için çizimlerle hız analizi= RBC akı(hücreler/ler), çizgi yoğunluğu (hücreler/mm), hız (mm/s) ve çizgi açısı (derece), sinyalden gürültü oranına (rastgele birimler, a.u.), X ekseni=zaman (sn). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6. Düşük Kaliteli Hemodinamik ölçümlerin temsili. A) Floresan doygunluğu, düşük sinyal-gürültü oranı veya satın alma sırasında görüntüleme alanının hareketi ile düşük kaliteli kimograf örnekleri. B ve C) Kimografilerin kalitesiz olması nedeniyle hata noktaları (kırmızı noktalar) olan çap ve hız verilerinin Şekil 7'ye benzer çizimleri. (görüntü E, Y ekseni=Çap (μm), X ekseni=zaman (sn); görüntü F, Y ekseni= RBC akı(hücreler/ler), çizgi yoğunluğu (hücreler/mm), hız (mm/s) ve çizgi açısı (derece), sinyalden gürültüye oranı (a.u.), X ekseni=zaman (sn). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Mevcut yöntem, bir kateter ile fare kuyruğu damar enjeksiyonu, derinlik yığınları için iki foton mikroskop görüntü alımı, hücre kalsiyum sinyal filmleri, hemodinamik kimografların oluşturulması ve görüntü işleme algoritmalarımızla kalsiyum ve hemodinamik analiz hakkında ayrıntılı bilgi vermektedir17 (Şekil 1). Bu tekniklerin in vivo görüntüleme sonucunu iyileştiren ve oturum sırasında zaman, kaynak ve hayvan stresini azaltan çeşitli avantajları vardır. İlk olarak, kuyruk damarı enjeksiyonu için kateter kullanılması, iğne, şırınga ve farenin dolaşımına enjekte edilen madde miktarı üzerinde daha fazla kontrol sağlar. Ek olarak, kuyruk dokusuna boya enjeksiyonu önleyerek pahalı reaktiflerden tasarruf sağlar. İkinci olarak, ensheathing perisitlerinde genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörlerini ifade eden transgenik fareler kullanıyoruz ve bunları beyin damar ağı içinde, sonraki görüntüleme seanslarında hücre tanımlamasını ve yer değiştirmesini uzun süreli kolaylaştıran bir derinlik z-yığını ile nasıl lokalize edeceğimizi gösteriyoruz. Bu perisit çalışmalarında önemli bir faktördür ve uygun hücre sınıflandırmasısağlar 6,7. Üçüncü olarak, dinamik hücresel sinyalleri ölçmek için iyi bir başlangıç noktası olan kalsiyum filmleri ve hemodinamik hat tarama verilerini toplamak için parametrelerimizi sunuyoruz. Son olarak, görüntü işleme algoritmalarımızı sunuyoruz17Görüntü ön işleme (spektral karıştırma gibi), kalsiyum görüntü analizi ve hemodinamik analiz (çap, hız vb.) için birden fazla yaklaşım içeren kapsamlı bir görüntü işleme araç kutusu. Bu algoritmalar, sonuçları analiz etmek için gereken kullanıcı uzmanlığı düzeyini en aza indirirken, verilerin hızlı ve kolay bir şekilde görselleştirilmesi için çizimler oluşturabilir. Ayrıca, aynı parametrelerle birden çok veri kümesini hızlı bir şekilde işlemek için birkaç kod satırıyla otomatik hale getirebilir. Bu, potansiyel olarak veri görselleştirmeyi ve araştırmacının zaman yatırımını artırabilir.
İyi kalsiyum görüntüleme verilerini toplamanın anahtarı, net floresan sinyal alımı için lazer gücünü ve PMT ayarlarını yapmak, aynı zamanda tüm kalsiyum olayını yakalamak için yeterli kare hızında veri toplamaktır. Bu protokoldeki veriler saniyede 10-11 karede elde edildi, bu da ensheathing perisitlerindeki daha yavaş kalsiyum salınımlarını yakalar. Analiz sırasında analiz sonucunu iyileştirebilecek birkaç adım da vardır. İlk olarak, spektral karıştırma, floroforların emisyon spektrumu arasında önemli bir örtüşüyorsa faydalıdır (Şekil 2). Floresan-dektran bu protokolde kullanılmıştır, çünkü hemodinamik ölçümler için yaygın olarak kullanılan uygun maliyetli ve ticari olarak kullanılabilen bir dektran konjugedir5. Spektral karıştırma, kalsiyum sinyallerinin daha iyi tespiti için verilerin temizlenmesine yardımcı olur, ancak daha dar emisyon spektrumlarına sahip alternatif floroforlar da kullanılabilir. İkincisi, hücresel yapıları ROI olarak elle seçmek (Şekil 3) soma veya proses dalları gibi farklı hücresel altı bölgelerdeki kalsiyum olaylarını sınıflandırmak için yararlıdır. Aktivite bazlı yatırım getirisi seçimi (Şekil 4)16, bireysel kalsiyum olayları hakkında daha mekansal ve zamansal bilgi sağlar. Bu, belirli bir alandaki kalsiyum olaylarının sıklığını veya olayların diğer hücresel alanlara yayılmasını belirlerken yararlı olabilir. Görüntüleme verilerini analiz etmek için programlama yazılımının kullanılması, veriler toplu olarak işlendiğinde araştırmacılara saatler kazandırabilir, ancak en iyi sonuçlar için parametreleri ayarlamak için biraz ilk zaman yatırımı gerektirir. En önemli faktörler aktif bölgenin beklenen boyutu(μm 2cinsinden) ve sinyalin süresidir (minimum sinyal süresi ve maksimum sinyal süresi tanımlanmalıdır). Araştırmacılar, hangi parametrelerin verilerine en iyi şekilde uyduğunu belirlemek için önce bazı örnek T serisi filmleri incelemelidir. Son olarak, mikroskopta elde edilen düşük kaliteli veriler kalsiyum ve hemodinamik analizini büyük ölçüde engelleyebilir (Şekil 6). Bu nedenle, başlangıçta mikroskop alma ayarlarını optimize etmeye özen edilmelidir. Bu faktörler göz önünde bulundurularak, diğer dokularda veya hücre tiplerinde kalsiyum görüntüleme veya diğer dinamik hücresel sinyallerin (örneğin floresan sodyum, potasyum, metabolit veya voltaj dalgalanmaları) analizine uyacak şekilde uyarlanabilen bu protokol.
Bu iletişim kuralının birkaç sınırlaması vardır. İlk olarak, veriler anestezi altında toplanır, bu da beyin aktivitesini etkiler ve kan akışını etkileyebilir. Benzer görüntüleme, daha fizyolojik sonuçlar için kafa fiksasyonunu kabul etmek için eğitilmiş uyanık farelerde de yapılabilir. Ek olarak, 3 boyutlu bir hücrenin ve kan damarının 2 boyutlu görüntülerini topladığımızı hatırlamak önemlidir vivo. Bu nedenle, bu hücrelerdeki kalsiyum olaylarının bir fraksiyonu veya kan damarının tek bir bölümündeki kan akışını aynı anda yakalayabiliriz.
Dikkat edilmesi gereken bir başka sınırlama, iki fotonlu kalsiyum görüntülemenin, odak düzlemine girip çıkan hareketin kalsiyum dalgalanmaları ile karıştırılabileceği hareket eserlerine karşı hassas olmasıdır. Bu protokol, hayvanın hareketini sınırlayan anestezi altında gerçekleştirildi; bununla birlikte, hareket eserleri farenin nefes alma hızı, kalp atış hızı, olası doku şişmesi ve ensheathing perisitleri, damar kasılması veya vasomotion durumunda 4,6,18,19ile tanıtılabilir. Hareket eserleri çeşitli stratejilerle azaltılabilir. Bu protokolde kullanılan görüntü işleme paketleri, görünür vaskülat13,17'ye dayanarak görüntüleri T serisi içinde hizalamak için 2D konvolüsyon motoru kullanan isteğe bağlı bir hareket düzeltme adımı içerir. Odak düzleminde önemli değişiklikler olan çerçeveler bu algoritma tarafından tanımlanır ve analizden hariç tutulabilir. Ek olarak, görüntüleme işleme paketleri içinde, harekete bağlı kalsiyum dalgalanmalarını normalleştirmek için floresan izlerini oluştururken Z skoru gibi istatistiksel stratejiler kullanmak mümkündür20. İki fotonlu görüntülemede hareket yapıtlarını hesaba katmak için en sağlam yaklaşım, kalsiyum göstergesi (örneğin, GCaMP) ve kalsiyumdan bağımsız bir floresan muhabiri (örneğin, mCherry) gibi aynı hücre içindeki iki floresan göstergenin ifadesini birleştirmektir. Floresan muhabirdeki dalgalanmalar daha sonra harekete bağlanabilir ve hareket yapıtlarını normalleştirmek için kalsiyum gösterge sinyalinden çıkarılır.
Bu protokolün amacı, en uygun kalsiyum görüntüleme ve kan akışı verilerinin in vivo olarak nasıl toplanır konusunda net bir anlayış sağlamak ve araştırmacıların sonuçlarını iyileştirmek için uygulayabilecekleri yeni yöntemler ve analiz araçları sunmaktır. Bu teknikler, farklı perisit popülasyonlarının kan akışı kontrolünde veya farklı beyin hastalığı durumlarındaki rolünü incelemek için uygulanabilir. Bu görüntüleme parametreleri diğer hücre tiplerinde ve organ sistemlerinde kalsiyum ve kan akışını incelemek için de kullanılabilir ve benzer ilkeler, kalsiyum dışında genetik olarak kodlanmış diğer sensörler tarafından mümkün olan diğer dinamik görüntüleme teknikleri için de geçerlidir.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
J. Meza, Mitacs ve Research Manitoba bursları tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma için kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri, Araştırma Manitoba, Manitoba Tıbbi Hizmet Vakfı, Kanada Beyin Araştırma Fonu aracılığıyla Manitoba Üniversitesi ve Brain Canada'dan başlangıç finansmanı, Health Canada ve Azrieli Vakfı'nın finansal desteğiyle sağlandı. Burada ifade edilen görüşler mutlaka Sağlık Bakanı'nın veya Kanada Hükümeti'nin görüşlerini temsil etmez.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acta2-RCaMP1.07 | The Jackson Laboratory | 28345 | In the video protocol the animal model used is a female mouse of 10 months, 1 day old. |
| Applicators (Regular) | Bisco | X-80250P | |
| BioFormats package for MATLAB | NA | NA | Denominated in this protocol as "image processing packages". Available in: https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/ |
| CHIPS MATLAB toolbox | NA | NA | Denomitaded in this protocol as "image processing algorithms". Barrett MJP, Ferrari KD, Stobart JL, Holub M, Weber B. CHIPS: an Extensible Toolbox for Cellular and Hemodynamic Two-Photon Image Analysis. Neuroinformatics. 2018;16(1):145-147. doi:10.1007/s12021-017-9344-y. Available in: https://github.com/EIN-lab/CHIPS |
| Clear Ultrasound Gel, Medium viscosity | HealthCare Plus | UGC250 | |
| Dextran, fluorescein, 70,000 MW, anionic | Thermo Fisher Scientific | D1823 | |
| Dextran, Texas Red, 70,000 MW, neutral | Thermo Fisher Scientific | D1830 | |
| Eye Lube Plus | Optixcare | NA | |
| FIJI | Image J | NA | Denominated in this protocol as "image processor software". Available in: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
| GCaMP6sfl/fl | The Jackson Laboratory | ||
| Head Post fixing platform | University of Zurich | NA | |
| Ketamine (Narketan 100 mg/mL) | Vetoquinol | 440893 | |
| MATLAB R2020b | NA | Denominated in this protocol as "programming platform ". Available in: https://www.mathworks.com/downloads/ | |
| Needle 0.3mmx25mm | BD PrecisionGlide | 305128 | |
| Objective XLUMPLFLN20XW | Olympus | NA | https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/lumplfln-w/ |
| PDGFRβ-CreERT2 | The Jackson Laboratory | 30201 | |
| Polyethylene Tubing, PE10 I.D. 28mm (0.11”) O.D. 61mm (.024”) | BD Intramedic | 427401 | |
| Prairie View | Bruker Fluorescence Microscopy | NA | https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html |
| Ultima In Vitro Multiphoton Microscope | Bruker Fluorescence Microscopy | NA | https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html |
| Under Tank Heater | Reptitherm U.T.H | E169064 | |
| Xylazine (Rompun 20 mg/mL) | Bayer HealthCare | 2169592 |
References
- Armulik, A., Genové, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
- Berthiaume, A. -A., et al. Dynamic remodeling of pericytes in vivo maintains capillary coverage in the adult mouse brain. Cell Reports. 22 (1), 8-16 (2018).
- Rungta, R. L., Chaigneau, E., Osmanski, B. -F. F., Charpak, S. Vascular compartmentalization of functional hyperemia from the synapse to the pia. Neuron. 99 (2), 362-375 (2018).
- Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nature Methods. 9 (3), 273-276 (2012).
- Gonzales, A. L., et al. Contractile pericytes determine the direction of blood flow at capillary junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 27022-27033 (2020).
- Hartmann, D. a, et al. Pericyte structure and distribution in the cerebral cortex revealed by high-resolution imaging of transgenic mice. Neurophotonics. 2 (4), 041402 (2015).
- Grant, R. I., et al. Organizational hierarchy and structural diversity of microvascular pericytes in adult mouse cortex. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 39 (3), 411-425 (2017).
- Hill, R. A., Tong, L., Yuan, P., Murikinati, S., Gupta, S., Grutzendler, J. Regional blood flow in the normal and ischemic brain is controlled by arteriolar smooth muscle cell contractility and not by capillary pericytes. Neuron. 87 (1), 95-110 (2015).
- 28345 - STOCK Tg(RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik/J. Jackson Laboratory. , Available from: https://www.jax.org/strain/028345 (2021).
- Ohkura, M., Sasaki, T., Kobayashi, C., Ikegaya, Y., Nakai, J. An improved genetically encoded red fluorescent Ca2+ indicator for detecting optically evoked action potentials. PLoS ONE. 7 (7), (2012).
- Stobart, J. L., et al. Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation. Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).
- Stobart, J. L., et al. Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons. Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. JoVE. (12), e680 (2008).
- Lin, X., et al. Imaging neural activity in the primary somatosensory cortex using Thy1-GCaMP6s transgenic mice. JoVE. (143), e56297 (2019).
- Ellefsen, K. L., Settle, B., Parker, I., Smith, I. F. An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging. Cell Calcium. 56 (3), 147-156 (2014).
- Barrett, M. J. P., Ferrari, K. D., Stobart, J. L., Holub, M., Weber, B. CHIPS: an extensible toolbox for cellular and hemodynamic two-photon image analysis. Neuroinformatics. 16, 145-147 (2018).
- Hall, C. N., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (1), 55-60 (2014).
- Nilsson, H., Aalkjaer, C. Vasomotion: mechanisms and physiological importance. Molecular interventions. 3 (2), 79-89 (2003).
- Rungta, R. L., et al. Vascular arbors in layer II / III somatosensory cortex. Communications Biology. , (2021).
