Summary
여기에 제시된 것은 pH 에 민감한 형광 분자에 공주되는 비협화효모(zymosan) 입자의 대식세포(MΦ) 식세포증의 중간엽 줄기세포(MSC) 중재조절의 동적 이미지를 정량화하고 생성하는 프로토콜이다.
Abstract
중간 엽 줄기 세포 (MSC)는 전통적으로 그들의 재생 특성에 대 한 공부 되었습니다., 하지만 더 최근에, 그들의 면역 조절 특성 최전선에 있다. 그(것)들은 면역 세포 활동과 상호 작용하고 통제합니다. 이 연구의 초점은 대식세포 활성의 MSC 조절입니다. 대식세포(MΦ) phagocytosis는 감염에 대한 선천적인 면역 계통 반응의 중요한 부분이며, MSC가 이 반응을 조절하는 메커니즘은 적극적인 조사를 받고 있습니다. 여기에 제시된 MΦ phagocytosis의 비편화 된 자모산 입자를 pH 에 민감한 형광 분자에 접합 하는 방법 MSC와 공동 배양 하는 동안. 식세포 활성이 증가하고 표지된 zymosan 입자가 phagolysosome의 산성 환경 내에서 동봉됨에 따라 pH 에 민감한 분자의 형광 강도가 증가합니다. 적절한 발각 및 방출 파장으로, 식세포 활성은 형광 분광계를 사용하여 측정되고 운동 데이터는 70 분 동안 상대 형광 단위의 변화로 제시된다. 이 정량적 데이터를 지원하기 위해, phagocytic 활동의 변화는 동적 이미징을 사용하여 시각화됩니다. 이 방법을 사용한 결과는 공동 배양시 MSC가 순진한 및 IFN-γ 처리MΦ의 비편화 자모산의 MΦ phagocytosis를 향상시킨다는 것을 보여줍니다. 이 데이터는 선천적인 면역 계통의 MSC 규정의 현재 지식에 추가합니다. 이 방법은 근본적인 세포 및 분자 기계장치를 완전히 묘사하기 위하여 미래 조사에 적용될 수 있습니다.
Introduction
중간 엽 줄기 세포 (MSC)는 결합 조직 세포를 초래하는 전구 세포입니다. MSC는 성인 포유류 조직에 존재하며 골수1로부터분리 될 수 있습니다. 그들의 면역 조절 특성 때문에, 이들 세포는 널리 연구된다2. T세포3,4,5,6의 MSC 조절에 초점을 맞춘 초기 연구는 최근에는 선천성 면역의 주요 세포 성분인 대식세포 세포(MΦ)의 조절에 초점을 맞추고 있으며,7, 8,9,10,11,12,13,14의 증가된 관심을 받고 있습니다. . 염증성 질환의 치료에 있는 MSC-MΦ 상호작용의 중요성은 동물 모델8에서단핵구/대식세포의 고갈이 MSC의 치료 효과를 흡수한다는 사실에 의해 강조된다. 여기서, 초점은 MΦ와 MSC의 세포 접촉 상호 작용이다. MSC는 염증에서 항염증 반응으로의 전환을 촉진하여 MΦ의 표현형을 조절할 수 있는 능력을 가지며, 조직 수리 활동8,9,10,11로이어지는 이러한 조절 메커니즘을 입증하기 위해 많은 작업을 수행하였다. 다른 상황에서, MSC는 MΦ 구동 염증반응을지원하거나 악화시킬 수 있으며,13, 13및 MΦ phagocytic 활동을 향상시킬 수있습니다(14,15). 그러나 MSC가 MΦ phagocytic 활동을 조절하는 메커니즘과 조건을 식별하는 기존 데이터가 매우 부족합니다.
MΦ는 협소화(항체 또는 보체 코팅) 또는 비편화병원균(16)을인식하는 수용체의 제품군을 가지고 있다. 후자의 활성화 및 활동은 덜 잘 연구17. 비염증성 체외 환경에서, MSC는 비편성병원체(13)의MΦ phagocytosis를 향상시킵니다. 그러나, MΦ에 의한 비편화 병원균의 인식은 적응성 면역 반응 도중 림프구에 의해 생성된 선동적인 환경에 노출 후에 감소될 수 있다. 자연 킬러 세포및 이펙터 림프구에 의해 방출되는 IFN-γ, 비응진입자(18)의MΦ phagocytosis에 대한 억제 효과가 있다. MΦ phagocytosis의 MSC 직접 접촉 조절의 메커니즘을 연구하기 위해 공동 배양 모델이 개발되었습니다. 여기서 제시된 실험의 목적은 MSC가 MΦ가 IFN-γ(도1)에노출된 후 비편화 병원체의 MΦ phagocytosis를 조절하는지 여부를 결정하는 것이다.
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Protocol
참고: 모든 중간 제제 및 세포 배양 기술은 라미나르 흐름을 가진 생물 안전 캐비닛을 사용하여 무균 조건하에서 수행됩니다. 설명된 모든 배양 배양 단계는 37°C, 5% CO2및 95% 습도의 대기를 유지하도록 설계된 인큐베이터를 사용하여 수행됩니다.
1. 세포 배양
- 성장 매체의 준비
- MSC와 LADMAC의 경우 50mL의 FBS와 5mL의 항생제/항마이코틱 믹스를 500mL의 높은 포도당 DMEM에 추가하십시오.
- MΦ의 경우, 50mL의 FBS, LADMAC 상태 배지 100mL(섹션 1.2의 단계에 따라 제조됨), 5mL의 100x 항생제 믹스를 500mL의 고혈당 DMEM에 추가한다.
참고: LADMAC 세포는 MΦ 세포의 성장을 지원하는 데 필요한 식민지 자극 인자(CSF-1)를 생성합니다.
- LADMAC 조절 매체의 준비
- 냉동 육수에서 LADMAC 세포를 종자하려면, 5T75cm cm2 세포 배양 처리 플라스크의 각각 1.1항에서 성장 배지의 19 mL을 추가하고 37 °C로 평형하기 위해 15 분 동안 세포 배양 인큐베이터에 배치.
- 한편, 37°C 수조에서 2-3분 동안 또는 해동될 때까지106개의 냉동 셀의 알리쿼트 1개를 빠르게 해동한다. 15mL 또는 50mL 멸균 원문 관및 원심분리기에서 5분 동안 스윙 버킷 로터에 125 x g의 신선한 MSC 성장 배지9mL에 세포를 추가합니다.
- 상체를 흡인하거나 데수, 신선한 성장 매체의 5 mL을 추가하고, 부드럽게 세포 펠릿을 다시 중단하기 위해 위아래로 파이펫.
- 멸균 세리컬 파이펫을 사용하여 5개의 T75 cm2 플라스크 각각에 셀 서스펜션 1mL을 추가하고 세포 배양 배양 배양에 배치한다.
- 2-3일마다 7-10일 동안 10mL의 배지를 추가합니다. 이어서, 세포와 상체체를 멸균 50mL 원물 튜브로 수집하여 멸균 세로지피펫과 원심분리기를 125 x g에서 5분 동안 수집한다.
- 0.2 μm 멸균 일회용 진공 필터 장치를 사용하여 상체 를 셀 펠릿과 멸균 필터와 분리합니다.
- 패키지에서 흡구체 어셈블리를 제거하고 진공 튜브를 사용하여 아스피레이터 펌프에 연결합니다. 상체를 상단 구획에 붓고 커버를 교체합니다. 아스피라기 펌프를 켜서 아래 칸으로 필터링합니다.
- 50mL 멸균 원문 튜브로 파이프팅하여 알리코트에 넣고 -20°C에 보관하십시오.
- 셀 펠릿을 동결하려면 106 셀 /mL에서 동결 배지에서 다시 중단하고 동결 용기에 넣은 다음 -80 ° C 냉동고에 놓습니다. 24시간 후 LN2 스토리지로 전송합니다.
- 공동 배양에 대비하여 세포 전파
- 냉동 육수로부터 MSC 및 MΦ 세포를 종자하기 위해, 각 세포 유형에 대한 4개의 100mm 세포 배양 처리 접시 각각에 각각 1.1항에 제조된 적절한 성장 배지의 9mL을 15분 동안 세포 배양배소에 배치하였다.
- 한편, 37°C 수조에서 2-3분 동안 또는 해동될 때까지106개의 냉동 셀의 알리쿼트를 빠르게 해동한다. 이어서, 해동된 MSC 세포를 신선한 MSC 성장 배지의 9mL에 추가하고 15 또는 50mL 멸균 원문 튜브 및 원심분리기에서 9mL의 신선한 MΦ 성장 배지에 해동된 MΦ 세포를 5분 동안 스윙 버킷 로터에 125 x g로 첨가한다.
- 상류체를 흡인 또는 데수및 적절한 신선한 성장 매체의 4mL에서 각 펠릿을 부드럽게 위아래로 피펫하여 재보선한다. 1.3.1 단계에서 평형된 각 세포 유형에 대해 각각 4개의 100mm 접시에 셀 현탁액 1mL을 추가합니다.
- 세포와 함께 접시를 인큐베이터에 되돌려 보입니다. 매 2-3일마다 70%-80%까지 배지를 변경합니다.
2. 실험 요리에 MSC 씨를 씨앗, 1 일
참고: MSC를 시드하기 전에 형광측정과 동적 이미징을 위한 챔버 슬라이드를 위한 실험적인 96웰 플레이트 레이아웃을 설계합니다. 96 웰 플레이트의 경우, 세포를 포함하는 우물이있는 측면 실험 우물은 분석에서 사용하지 않습니다. 시약 공백(RBL)에 사용할 우물이 적어도 4개 이상 표시됩니다. 4웰 챔버 슬라이드 템플릿의 예는 예제 96웰 템플릿 및 표 2에 대한 표 1을 참조하십시오. 선명한 하의가 있는 검은색 또는 흰색 96웰 플레이트를 추천합니다. 1.5mm 보로실리케이트 유리 챔버 슬라이드가 최적이지만 연구 설계에 따라 챔버 수를 조정할 수 있습니다. 다음 메서드의 요약 흐름 차트는 그림 2에포함되어 있습니다.
- 70%-80%의 인플루엔자에서 100mm 요리로 배양으로부터 성장 매체를 흡수하고 5mL의 PBS를 추가하여 MSC를 분리합니다.
- PBS를 흡인하고, 0.05% 트립신/EDTA의 2mL를 추가하고, 3-5분 동안 배양 인큐베이터에 넣습니다.
- 3 분 후, 반전 된 현미경을 사용하여 세포 분리를 확인하십시오. 셀이 분리되면 다음 단계로 계속; 그렇지 않은 경우, 또 다른 1-2 분 동안 인큐베이션을 계속합니다. 5-6분 이상 배양하지 마십시오.
- 분리 된 세포와 접시에 신선한 성장 매체의 5 mL을 추가합니다. 트립신/중간 혼합물을 사용하여 접시를 헹구고 멸균 세로지학적 파이펫을 사용하여 깨끗한 멸균 50mL 원추형 튜브로 세포를 수집합니다.
- 원심 분리기 는 125 x g에서5 분 동안. 상류체를 흡인시키고 10mL의 신선한 성장 매체에서 셀 펠릿을 부드럽게 위아래로 피펫하여 재보냅니다.
- 세포를 계산하려면 셀 서스펜션의 10 μL을 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브에 0.4% 트라이팬 블루 용액의 30 μL에 추가합니다. 이어서, 혈류계 계수 챔버의 커버슬립 하에서 혼합물의 파이펫 10 μL.
- 10배 의 객관적인 반전 또는 밝은 필드 현미경을 사용하여 1mm2 제곱 의 4개에서 스테인드(unstaed) 세포를 계산합니다. 수식을 사용하여 셀 번호를 계산합니다: 셀/mL = 셀 카운트/# 1mm2 제곱 x 희석 계수 x 104.
참고: 이 예제에서는 계산된 1mm2 제곱의 수는 4개이고 희석 계수는 4개입니다. - 방정식 C1V1 = C 2 V2를사용하여 1 x 10 5 셀/mL 서스펜션을 계산하고 준비합니다. 플레이트 설계에 따라 채워질 4웰 챔버 슬라이드의 모든 챔버에 대해 채워질 96웰 플레이트의 모든 컬럼에 대해 1mL의 셀/mL 서스펜션과 0.75 mL를 준비한다.
참고 : C1 = 셀 카운트, V1 = 계산되는 것, C2 = 1 x 105,V2 = 5.50 mL. - V1을결정하고, 서스펜션을 준비하는 데 필요한 신선한 매체의 부피를 결정하기 위해 총 부피의 원하는 5.50 mL에서 빼는다. 1 x105 셀/mL을 사용하여 총 5.50mL의 신선한 배지에 원래 현탁액으로부터 셀(V 1)의 부피를 추가합니다.
- 플레이트 설계에 따라 마이크로피펫을 사용하여 챔버 슬라이드의 각 웰에 멀티채널 마이크로파이프터 및 530 μL을 사용하여 플레이트 설계에 따라 96웰 플레이트의 각 웰에 1x 105 셀/mL 서스펜션100 μL을 추가합니다. 하룻밤 동안 배양.
참고:이 실험의 경우, MSC는 96웰 플레이트(표 1)의 열1,2, 3 및 6개 열로 도금되고 4웰 챔버 슬라이드(표 2)의 우물 1과 2개(표2)를도금한다. 따라서, 1 x 10 5 셀/mL 서스펜션의 최소5.50mL가 제조된다. MΦ80%의 합류는 MSC가 실험판에서 시드되는 당일 염증성 중재기로 처리된다.
3. IFN-γ, 1일째로 MΦ 활성화
- 활성화 매체 및 IFN-γ 재고를 준비합니다.
- 활성화 매체200mL의 경우 0.2 μm 멸균 일회용 진공 필터 유닛을 사용하여 200mL의 혈청 없는 고혈당 DMEM 및 멸균 필터에 BSA 40 mg을 추가합니다.
- 0.1% BSA/PBS를 준비하려면 PBS 20mL에 20 mg의 BSA를 추가하십시오. 용해하는 소용돌이. 0.2 μm 멸균 주사기 필터를 사용하여 깨끗하고 멸균된 50mL 원문 튜브로 필터링하십시오.
- 1mL의 멸균 0.1% BSA/PBS 용액을 100 μg의 lyophilized IFN-γ 100 μg에 추가하여 100 μg/mL의 스톡 솔루션을 달성합니다. -20°C에서 50 μL 알리코에 보관하십시오.
- IFN-γ 통해 MΦ 활성화
- 필요한 매체의 1mL에 IFN-γ 재고 100μg/mL의 2.5 μL을 추가합니다. 100mm 접시마다 활성화할 수 있도록 IFN-γ 함유된 활성화 배지 10mL를 250 ng/mL 농도로 준비한다.
- MΦ 배양에서 성장 배지를 흡인하고 IFN-γ 없이 활성화 매체의 5mL로 대체한다.
- 헹기 위해 사용되는 배지를 흡인하고 실험용 비활성화용 활성화 배지를 10mL로 γ 대조군을 위한 비보충 활성화 배지로 대체한다. 16-24 h의 문화를 배양합니다.
4. MΦ를 분리하고 공동 문화권, 2일째를 준비합니다.
- MΦ 세포에서 활성화 배지를 제거하고 5mL의 신선한 성장 매체로 대체하십시오. 셀 리프터로 부드럽게 긁어 내고 세포를 50 mL 원상 관으로 수집합니다.
- MSC에 대해 설명된 바와 같이 트라이판 블루 배제 및 혈종측정을 사용하여 세포를 계산하여 2.6-2.7단계.
- 단계 2.8-2.9에서 방정식을 사용하여, 2 x 105 셀/mL의 두 개의 별도 현탁액을 준비하고, 하나는 대조군에서 세포를, 하나는 처리된 MΦ 배양으로부터 세포를 가진 것이다.
참고: 플레이트 설계에 따라 채워질 4웰 챔버 슬라이드의 모든 챔버에 대해 채워질 96웰 플레이트의 모든 열에 대해 1mL의 셀/mL 서스펜션과 0.75 mL를 준비한다. - MSC를 함유한 96웰 플레이트의 실험용 우물에서 배지를 부드럽게 흡인시합니다. 멀티채널 마이크로피펫을 사용하여, 플레이트 설계에 따라 MSC의 유무에 관계없이 적절한 실험용 웰에 처리된 MΦ 셀 서스펜션의 100 μL을 추가한다. 하룻밤 동안 배양.
- MSC를 포함하는 4웰 챔버 슬라이드에서 배지를 부드럽게 흡인시키고, 마이크로 피펫을 사용하여 설계에 따라 적절한 우물에 MΦ 셀 서스펜션 530 μL을 추가합니다. 하룻밤 동안 배양.
5. 식세포 분석, 운동 형광 96 웰 플레이트 읽기, 3 일째
- 분석 매개 변수 설정
- 분석 당일, 형광판 판독기를 켜고 컴퓨터-온도37°C로 시스템 상에서 온도를 설정한다.
- 시스템 Pro 소프트웨어를 열고 왼쪽 상단 모서리에 있는 계측기 아이콘을 확인하여 계측기가 컴퓨터에 연결되어 있는지 확인합니다. 선이 있는 빨간색 원이 표시되면 악기 아이콘을 클릭하고 팝업 창에서 계측기를 선택하여 연결을 만듭니다.
- 플레이트 설정 도우미 팝업 창에 액세스하려면 새 실험을 선택합니다. 플레이트 설정 도우미 메뉴에서 획득 설정 구성을 선택합니다.
- 광학 구성을 위해 설정 메뉴에서 Monochromator를 선택합니다. 읽기 유형에 대한 읽기 모드 및 Kinetic에 대한 FL(형광)을 선택합니다.
- 카테고리아래와 동일한 구성 창에서 파장을클릭한 다음 흥분을 위해 9nm로 대역폭을 설정하고 방출을 위해 15nm로 대역폭을 설정합니다.
- 파장 쌍 수를 1로 설정합니다. 파장 LM1을 510nm로 설정하고 방출을 위해 540nm로 설정합니다.
- 범주를 계속 살펴보고 다음 플레이트 유형을 선택합니다. 사용 중인 플레이트 유형과 일치하는 옵션을 선택합니다.
참고: 선택 영역이 플레이트 유형과 일치하는 것이 중요합니다. 읽기 높이는 선택에 따라 시스템에 의해 설정됩니다. - 다음으로 읽기 영역을 선택하고 실험 설계에 포함된 96웰 플레이트 영역을 강조 표시합니다.
- PMT 및 광학을선택하고 PMT 게인을 높은 것으로 설정하고 읽기당 깜박임이 6으로설정됩니다. 투명 바닥 플레이트를 사용하는 경우 아래쪽에서 읽기 옆에 있는 확인란을 선택합니다.
- 타이밍을 선택하고 70분 동안 10분 간격으로 설정합니다.
- 쉐이크를선택하고 첫 번째 읽기 전에 확인함을 선택하고 5s로 설정합니다. 읽기 간 상자를 확인하고 3s로 설정합니다. 흔들림 강도를 낮음과 선형으로설정합니다.
- 창을 닫습니다. 플레이트 설정 도우미 창이 팝업되면 플레이트 레이아웃 구성을 선택합니다. 플레이트 디자인의 BL 웰을 강조하고 플레이트 블랭크를 클릭합니다.
- 각 실험 행을 강조 표시하고, 추가를클릭하고, 그룹 이름을 지정한 다음 색상을 선택합니다.
- 플레이트 디자인 아래의 할당 옵션에서 계열을선택한 다음 창에서 계열을 정의하고 확인을 클릭합니다. 각 그룹에 대해 반복합니다.
- 지모산 서스펜션 준비
- 시스템 온도가 37°C에 도달하기를 기다리는 동안, 라이브 셀 이미징 매체의 5mL에서 자모산 입자 1 mg을 재중단한다.
- 입자를 포함하는 유리병에 1mL의 살아있는 세포 이미징 매체를 추가하고 유리 배양 튜브로 수집합니다. 유리병을 추가로 1mL의 이미징 용액으로 헹굴하고 동일한 유리 튜브로 이송하여 모든 입자가 전달되도록 합니다. 입자 현탁액의 0.2 mg/mL을 달성하기 위해 3mL의 추가 이미징 솔루션을 추가합니다.
- 30-60 s에 대한 빠른 펄스와 소용돌이. 그런 다음 프로브 초음파 처리기를 사용하여 60 개의 빠른 펄스로 초음파 처리하십시오.
참고: 입자의 균일한 현탁액을 만들고 현탁액이 실험 용 우물에 추가하기 전에 너무 오래 앉아 있지 않도록하는 것이 매우 중요합니다. 응집은 빠르게 되풀이됩니다. 세포 밀도당 입자는 사용되는 MΦ의 소스, 처리 및 밀도에 따라 최적화되어야 할 수 있습니다. 제시된 연구 결과에서는, 접쥬게이드 zymosan 입자가 이용되었습니다. 그러나, cojugated 대장균및 S. 아우레우스도 유효합니다.
- 시스템 온도가 37°C에 도달하기를 기다리는 동안, 라이브 셀 이미징 매체의 5mL에서 자모산 입자 1 mg을 재중단한다.
- zymosan을 추가하고 접시를 읽으십시오.
- 실험용 우물에서 배지를 흡인하고 100 μL의 라이브 셀 이미징 용액으로 헹구는다. 라이브 셀 이미징 솔루션으로 RBL 우물을 헹구는 것도 좋습니다.
- 실험 및 RBL 우물에서 라이브 셀 이미징 솔루션을 흡인하고 5.2절에 제조된 자모산 입자 서스펜션의 100 μL로 대체한다.
- 터치패드 인터페이스를 사용하여 형광 리더의 플레이트 트레이를 엽니다. 왼쪽 상단 모서리에 A1이 잘 있는 트레이에 뚜껑이 없는 접시를 놓습니다. 터치패드를 사용하여 트레이를 닫고 상단 메뉴의 녹색 읽기 버튼을 클릭합니다.
- 읽기가 완료되면 파일을 적절한 폴더에 저장하고 파일을 클릭하고 내보내기를선택하여 스프레드시트 형식으로 데이터를 내보낼 수 있습니다.
- 스프레드시트(보충파일 1)에서각 복제 그룹에 대한 평균 ± SEM 상대형형광을 계산하고 그래프 소프트웨어로 데이터를 전송한다.
- 선 그래프 형식을 사용하여 데이터를 표시하고 양방향 ANOVA(시간 x 처리/MSC 를 요인으로 적용)한 다음 Tukey의 다중 비교 테스트를 적용하여 개별 그룹 간의 차이점을 결정합니다.
참고: 96웰 플레이트 판독이 진행 중이지만 시간 경과 이미지 수집을 위해 동적 이미징 플레이트를 준비합니다. 동적 이미징이 한 번에 하나의 실험적 분석을 잘 진행하도록 합니다.
6. 식세포 분석, 동적 이미징, 3일째
- 이미징 시스템과 컴퓨터를 켭니다. 소프트웨어를 엽니다 두 번 클릭합니다. 프로 프로그램 모드를 선택합니다.
- 스테이지 영역을 확인하여 샘플이 존재하지 않고 스테이지의 움직임을 방해하지 않는 지 확인합니다. 그런 다음 지금 교정을 클릭합니다.
- 오른쪽 사이드바의 인큐베이션 메뉴 아래에서 H Unit XL 옆의 확인란을 확인하고 37°C로 설정합니다.
참고: 이미징 샘플을 준비하기 전에 배양 된 단계가 거의 온도에 다때까지 기다립니다. - 이미징 매체의 750 μL로 첫 번째 실험을 잘 헹구고 5.2절에 제조된 자모산 입자 서스펜션의 400 μL로 대체한다. 나머지 우물을 성장 매체에 남겨둡니다.
참고: 15분 이상 정착한 경우 입자 현탁액을 다시 잠깐 만연하고 초음파 처리해야 할 수도 있습니다. - 이미징 시스템의 배양 단계에 슬라이드를 배치합니다. 타이머를 10분 동안 설정합니다.
- 이미징 소프트웨어를 사용하고 찾기 탭 에서 브라이트필드를 선택한 다음 아래 시스템 구성 창에서 접안 아이콘을 클릭합니다. 10배 의 목표를 제자리에 두고, 접안렌즈와 초점 손잡이를 사용하여 세포에 집중하십시오.
- 획득 탭을 선택하고 실험 드롭다운 메뉴를 사용한 다음, pH 민감염의 509 nm 난출 533 nm 방출 파장을 수용할 수 있도록 EGFP 필터가 포함된 파장 세트를 선택합니다.
- 타이머에 ~2분 이남은 경우, 소프트웨어를 사용하여 목표 메뉴의 20x 아이콘을 클릭하여 목표를 20배로 변경합니다.
- 채널 메뉴를 클릭하고 EGFP 필터를 선택하고 노출 메뉴를 사용하여 노출 시간을 400ms로 설정하여 phagolysosome에 동봉된 후 pH 에 민감한 녹색 형광소를 감지합니다.
- 라이브를 클릭하고 초점 손잡이를 사용하여 초점을 조정합니다.
- 정지를 클릭하여 빛을 끄고 상단의 타임랩스 실험 설정 옆에 있는 확인란을 선택합니다.
- 초점 전략 메뉴에서 소프트웨어 자동 초점을 선택합니다. 자동 초점 메뉴의 드롭다운에서 스마트 및 거친 설정을 선택하여 자동 초점이 실행되는 동안 라이트에 노출되는 시간을 줄입니다.
- 타임랩스 메뉴에서 원하는 인수 수를 30-60으로 설정하고 간격 시간을 1분으로 설정합니다.
- 시간 경과 매개 변수가 설정된 후 첫 번째 우물에 파티클을 10분 간 추가한 후 시작 실험 버튼을 클릭하여 수집을 시작합니다.
- 첫 번째 실험 우물을 사용하여 획득이 완료되면 나머지 각 실험 용 우물에 대해 6.4-6.12 단계를 반복하십시오.
- 제목에 날짜 및 매개 변수가 있는 모든 실험 파일을 적절한 폴더에 저장합니다.
- 소프트웨어를 닫습니다. 프로세싱 모드에서 소프트웨어를 다시 열고 내보내기 메뉴를 사용하여 MP4 형식으로 파일을 내보냅니다.
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Representative Results
모든 시간 지점에서 각 그룹에 대한 평균 ± SEM을 계산한 후 데이터는 Y축을 상대형 형광 강도로, X축을 시간으로 선 그래프 형식으로 표시됩니다. 보충 파일 1스프레드시트 형식으로 96웰 플레이트의 운동 판독에서 원시 데이터의 예를 제공합니다.
본 연구에서는, 도 3A에제시된 최적의 결과, 및 표 3에서 제시된 최적 결과는 MSC와의 공동 배양이 대식세포의 교피 활성을 향상시킨다는 것을 보여주고, 2) IFN-y 처리는 대식세포의 활성을 감소시키고, 3) MSC와 공동 배양하여 MΦ phagocytic 활성을 부분적으로 구출시킨다. 최적의 세포 밀도는 이러한 연구에서 중요하며 MΦ가 밀도가 너무 낮게 도금되면 형광 강도의 변화를 감지할 수없습니다(그림 3B). 도 3C는 MΦ가 밀도와 형광 강도가 너무 높은 곳에서 도금된 연구에서 데이터를 나타내며, 모든 그룹에서 형광 강도가 급격히 상승하고, 차이를 분별할 수 없다. 동적 이미징 비디오는 형광 강도 변화가 식세포증으로 인한 것이지 매체의 산성화가 아니라는 것을 확인합니다. 또한 질적 데이터와 식세포 활동의 속도 및 정도의 시각적 표현을제공합니다(그림 4).
그림 1: 제시된 데이터의 중심 질문을 묘사한 그림으로, "MSC가 IFN-γ 처리MΦ의 phagocytic 활동을 복구할 수 있습니까?".
그림 2: 공동 배양 및 phagocytosis 분석 워크플로우의 개요. MSC와 공동 배양에서 MΦ phagocytosis 활동의 정량적 및 질적 분석을 위한 워크플로우의 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 운동 판독에서 대표적인 정량적 데이터최적이고 최적이 아닌 결과를 입증합니다. (A)에서, 데이터는 최적의 MΦ 세포 밀도를 가진 실험을 대표하며,(B)데이터는 최적이 너무 낮은 MΦ 세포 밀도를 가진 실험을 대표하며,(C)데이터는 최적이 너무 높은 MΦ 세포 밀도를 가진 실험을 대표한다. 상대형광단위(RFU)로 측정된 상대형광 강도는 Y축에 플롯되고 시간이 X축에 그려져 있습니다. 최적의 및 최적 실험 중 RFU 범위의 차이를 기록합니다. A에서,MSC는 70분 동안 IFN-γ 억제의 설정에서 MΦ phagocytic 활성을 부분적으로 구출한다. RFU는 SEM, n = 6에 ± 평균으로 제시됩니다. 분석은 중요한 양방향 ANOVA, 상호 작용 효과 P = 0.0001, 시간 효과 P = 0.0001 및 처리 /MSC 효과 P = 0.0001 후에 Tukey의 다중 비교 테스트를 사용하여 수행되었다. 심볼은 여러 비교 테스트의 결과를 나타냅니다. * = MSC / MΦ + IFN- γ 대 MΦ + IFN-γ, Ŧ = MΦ 대 MΦ + IFN-γ, 그리고 † = MSC / MΦ 대 MΦ 사이의 상당한 차이 사이의 상당한 차이. 여러 비교 테스트의 자세한 결과는 표 3을 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: MΦ phagolysosome에 통합 한 후 라벨 zymosan 입자의 산성 활성화에서 형광의 세포 별 증가의 시각적 확인을 제공하는 동적 이미징 비디오. 시간 경과 설정은 400ms의 노출 시간과 EGFP 필터 세트를 사용하여 30 분 동안 1 분마다 획득되었습니다. (A)MΦ는 단문화,(B)MΦMSC와 공동 배양,(C)MΦ는 IFN-γ (250 ng/mL)로 처리되고(D)MΦ는 MSC와 공동 배양시로 IFN-γ(250 ng/mL)로 처리된다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| B | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| C | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| D | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| E | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| F | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| G | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| H | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL |
표 1: 96웰 플레이트 디자인의 예입니다. CBL - 셀 블랭크; MSC - 시드 일 1; MΦ+ 치료 및 MΦ 치료 되지 않은 씨앗 일 2; RBL 시약 공백은 분석 일 3에 추가되었습니다.
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ |
표 2: 4웰 챔버 슬라이드 디자인의 예입니다. MSC - 도금 일 1; MΦ+ 처리 및 MΦ 처리 되지 않은 도금 일 2.
| 투키의 여러 비교 테스트 | 평균 Diff. | 95.00% CI 의 diff. | 임계값 이하? | 요약 | 조정된 P 값 |
| 0분 | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | -3871 | -9495 ~1754 | 아니요 | ns | 0.2836 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 720.3 | -4904 ~ 6345 | 아니요 | ns | 0.9873 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | -77.17 | -5702 ~ 5548 | 아니요 | ns | >0.9999 |
| 10분 | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | -3466 | -9091 ~2159 | 아니요 | ns | 0.3817 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 2326 | -3299 ~ 7950 | 아니요 | ns | 0.7062 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 992 | -4633 ~ 6617 | 아니요 | ns | 0.968 |
| 20분 | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | -1311 | -6936 ~4314 | 아니요 | ns | 0.9303 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 3315 | -2310 ~ 8940 | 아니요 | ns | 0.422 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 3146 | -2478 ~ 8771 | 아니요 | ns | 0.4689 |
| 30분 | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | 384.8 | -5240 ~ 6010 | 아니요 | ns | 0.998 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 2313 | -3312 ~ 7937 | 아니요 | ns | 0.7098 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 8726 | 3101 ~ 14350 | 예 | *** | 0.0005 |
| 40분 | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | 2247 | -3377 ~ 7872 | 아니요 | ns | 0.7278 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 4913 | -712.2 ~ 10537 | 아니요 | ns | 0.1101 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 16521 | 10896 ~ 22145 | 예 | **** | <0.0001 |
| 50분 | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | 5657 | 32.12 ~ 11282 | 예 | * | 0.0481 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 4932 | -692.9 ~ 10557 | 아니요 | ns | 0.1079 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 19083 | 13458 ~ 24708 | 예 | **** | <0.0001 |
| 60분 | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | 12376 | 6752 -18001 | 예 | **** | <0.0001 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 9361 | 3736 -14986 | 예 | *** | 0.0002 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 24748 | 19123년 ~ 30373 | 예 | **** | <0.0001 |
| 70분 | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | 13770 | 8145 -19395 | 예 | **** | <0.0001 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 11987 | 6362 - 17612 | 예 | **** | <0.0001 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 27264 | 21639 ~ 32888 | 예 | **** | <0.0001 |
표 3: 도 3A에제시된 데이터의 상세한 통계 분석. 그림 3A에제시된 데이터의 중요한 양방향 ANOVA 후 Tukey의 여러 비교 테스트의 결과 .
보충 파일 1: 최적의 실험에서 원시 운동 데이터의 대표적인 스프레드시트 파일입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
pH 에 민감한 염료에 컨쥬커드된 생체입자를 이용한 식세포증의 분석은 기존의 형광표지입자(12,19,20)에비해 유리하다는 비교적 새로운 도구이다. 기존의 형광 라벨 입자를 사용하면 엔드 포인트 분석만 가능합니다. 검출은 식세포에 의해 채택되지 않은 입자를 세척하거나 담금질 한 후 형광 현미경 검사및 /또는 분광로메로 수행됩니다. 분광성법에서 유래된 정량적 데이터는 비침범입자를 검출할 수 있는 잠재력을 가지며, 세포내 입자만 정량화하는 이미지 분석은 기존의 형광 현미경시스템(14)을사용하여 지루하고 시간이 많이 소요된다. pH에 민감한 염료형광에 공인된 바이오입자는 식염수와 같은 산성 환경에서만 불필요하며, 따라서 지루한 세척 및 담금질 단계는 불필요합니다14. 또한 pH 에민감한 라벨이 부착된 바이오입자는 FITC 또는 기타 불소-공주 된 바이오 입자로 쉽게 획득하지 못하는 운동 데이터를 제공하는 이점을 제공합니다.
이 새로운 도구를 이용한 연구는 유동 세포측정 및/또는 이미징 플랫폼을 사용하여 식세포 활성19,20,21의정량적 및 운동 측정을 생성합니다. 유동 세포측정은 식세포 개체수가 제한되어 있거나 유전적스크린(19)과같은 다운스트림 분석을 선별하는 데 관심이 있는 경우 유리하다. MSC는 직접적인 접촉과 수용성 요인을 통해 MΦ 표현형을 조절하는 것으로 알려져 있다. 예비 연구는 MSC에서 조건된 매체가 MΦ phagocytosis를 억압한다는 것을 보여주었습니다, 따라서, 이 프로토콜은 MSC와 직접 공동 배양에 있는 동안 MΦ phagocytic 활동의 변경을 결정하기 위하여 디자인되었습니다. 이러한 조건하에서, 분광성로메로법은 식세포 활성을 시각화하고 확인하기 위해 정량화하고 동적 이미징을 하는 것이 가장 적절하다.
이러한 방법의 성공에 중요한 것은 세포 밀도의 최적화입니다. MSC는 MΦ 세포와의 최적의 세포 접촉을 허용하는 밀도로 도금되어야 합니다. MΦ는 최적의 접촉을 허용할 뿐만 아니라 최적의 형광 검출을 허용하는 밀도로 모노 및 공동 배양으로 시드되어야 합니다. 밀도가 너무 낮으면 상대형광단위(그림 3B)의식증및 작거나 평평한 변화에 낮은 편입이 발생합니다. MΦ가 밀도가 너무 높게 시드되면, phagocytosis가 급격히 증가하고, 그룹 간의 차이의 검출은 마스크된다(도 3C). 세포 수당 지모산 입자로 표기된 pH 민감성 염료의 농도를 최적화하는 것도 매우 중요합니다. 예비 실험은 MSC 및 MΦ의 세포 밀도및 MΦ 셀당 입자 수를 최적화하기 위해 수행되어야 합니다. 또한, 대장균 또는 S. 아우레우스와같은 다른 표지된 생체 입자가 사용되는 경우 이러한 최적화 단계를 취해야 한다.
적절한 이미징 매체도 중요합니다. 두 메서드의 매체는 버퍼링된 매체여야 하며 페놀 레드를 포함해서는 안 됩니다. 페놀 레드는 형광 방출의 검출을 음소거합니다. 또한 매체를 산성화할 수 있는 첨가제 또는 상태는 라벨이 부착된 입자를 조기에 활성화하고 높은 배경을 소개합니다. 시약 블랭크는 매체의 잠재적산성화를 식별하는 데 매우 중요합니다.
이러한 프로토콜은 다양한 pH 민감성 바이오입자의 MΦ phagocytosis의 MSC 조절을 조사하는 데 사용될 뿐만 아니라 호중구 및 기타 파고세포를 포함하는 다양한 공동 배양 모델에도 적용될 수 있다. 추가적으로, 이 모형을 사용하여, 대식세포 phagocytic 활동의 세포 접촉 매개 규칙에 관여하는 것으로 의심되는 분자 및 통로는 의심되는 분자 표적을 확인하거나 반박하기 위하여 siRNA 또는 CRISPR 중재다운 규제를 통해 조사될 수 있습니다. 잠재적인 표적은 접착 분자, phagocytic 수용체 및 통합 분자를 포함합니다.
이러한 방법을 사용하여 작업하면 MSC와의 세포 접촉 상호 작용에 따라 MΦ의 증가된 phagocytic 반응의 기본 신호 메커니즘에 관한 새로운 정보를 발견하여 선천성 면역 을 조절하는 MSC가 하는 역할에 대한 이해를 증진시킵니다. 이러한 연구 와 같은 연구는 연구 부족 영역을 해결하고 MSC가 대식세포 활동에 미치는 영향의 완전한 그림을 산출합니다, 이는 면역에 자신의 역할의 전체 이해를 위해 필요한.
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Disclosures
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 1626093 및 1919583 보조금 수에 따라 NSF 주요 연구 기기 메커니즘에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Black Polystyrene Microplate | MilliporeSigma | CLS3603-48EA | |
| 0.4% trypan blue solution | MilliporeSigma | T8154-20ML | |
| 15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 339653 | |
| 4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | ThermoFisher | 155382PK | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco | ThermoFisher | 15240096 | |
| Axiobserver 7 Imaging System | Zeiss | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MilliporeSigma | A8806-1G | |
| Cell lifter | MilliporeSigma | CLS3008-100EA | |
| Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75 cm2, canted neck, with cap, filtered | MilliporeSigma | C7231-120EA | |
| D1 ORL UVA [D1] | ATCC | CRL-12424 | Mouse MSC Cell Line |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Hemocytometer | FisherScientific | 02-671-51B | |
| I-11.15 | ATCC | CRL-2470 | Mouse MΦ Cell Line |
| LADMAC Cell Line | ATCC | CRL-2420 | LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1). |
| Live-Cell Imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010031 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate | ThermoFisher | P35365 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Preprotech | 315-05 | |
| Spectramax i3X | Molecular Devices | ||
| Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 µm | ThermoFisher | 568-0020 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 micrometer | ThermoFisher | 723-2520 | |
| Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm | MilliporeSigma | CLS430167-100EA | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher | 25300054 |
References
- Phinney, D. G., Prockop, D. J. Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair--current views. Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).
- Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation. Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).
- Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease. Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).
- Giuliani, M., et al. Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation. PLoS One. 6 (5), 19988 (2011).
- Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells. Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).
- Luz-Crawford, P., et al. Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (3), 65 (2013).
- Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), 10088 (2010).
- Nemeth, K., et al. marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).
- Maggini, J., et al. Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile. PLoS One. 5 (2), 9252 (2010).
- Takizawa, N., et al. marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture. Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).
- Kim, J., Hematti, P. Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages. Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).
- Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 56 (2015).
- Cho, D. I., et al. Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages. Experimental Molecular Medicine. 46, 70 (2014).
- Fernandez, N., et al. Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response. Stem Cells International. 2017, 5846257 (2017).
- Jackson, M. V., et al. Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS. Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).
- Chaplin, D. D.
- Lim, J., et al. Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages. Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).
- Wang, Z., et al. Interferon-γ inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway. Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).
- Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts. Biotechniques. 68, 245-250 (2020).
- Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
- Takahashi, D., et al. Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE. Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).
