Summary
Здесь представлен протокол для количественной оценки и получения динамических изображений мезенхимальных стволовых клеток (MSC), опосредованной регуляцией фагоцитоза макрофагов (MΦ) частиц неопсонизированных дрожжей (zymosan), которые конъюгируются с pH-чувствительной флуоресцентной молекулой.
Abstract
Мезенхимальные стволовые клетки (MSC) традиционно изучались на предмет их регенеративных свойств, но в последнее время их иммунорегуляторные характеристики были на переднем крае. Они взаимодействуют и регулируют активность иммунных клеток. В центре внимания данного исследования находится МСК-регуляция фагоцитарной активности макрофагов. Фагоцитоз макрофагов (MΦ) является важной частью врожденного ответа иммунной системы на инфекцию, и механизмы, с помощью которых MSC модулируют этот ответ, активно исследуются. Здесь представлен метод изучения фагоцитоза MΦ неопсонизированных частиц зимозана, конъюгированных с pH-чувствительной флуоресцентной молекулой в совместной культуре с MSC. По мере увеличения фагоцитарной активности и попадания меченых частиц зимозана в кислую среду фаголизосомы интенсивность флуоресценции рН-чувствительной молекулы увеличивается. При соответствующих длинах волн возбуждения и излучения фагоцитарную активность измеряют с помощью флуоресцентного спектрофотометра, а кинетические данные представляют в виде изменений относительных флуоресцентных единиц в течение 70-минутного периода. Чтобы поддержать эти количественные данные, изменение фагоцитарной активности визуализируется с помощью динамической визуализации. Результаты с использованием этого метода показывают, что при совместной культуре MSC усиливают фагоцитоз MΦ неопсонизированного зимозана как наивного, так и IFN-γ обработанного MΦ. Эти данные дополняют текущие знания о регуляции MSC врожденной иммунной системы. Этот метод может быть применен в будущих исследованиях, чтобы полностью очертить лежащие в основе клеточные и молекулярные механизмы.
Introduction
Мезенхимальные стволовые клетки (MSC) являются клетками-прародителем, которые дают начало клеткам соединительной ткани. MSC присутствуют в тканях взрослых млекопитающих и могут быть выделены из костного мозга1. Благодаря своим иммуномодулирующим свойствам, эти клетки широко изучены2. Ранние исследования были сосредоточены на регуляции MSC Т-клеток3,4,5,6, но в последнее время их регуляция клеток макрофагов (MΦ), основного клеточного компонента врожденного иммунитета, получила повышенное внимание7,8,9,10,11,12,13,14 . Важность взаимодействия MSC-MΦ в лечении воспалительных заболеваний подчеркивается тем фактом, что истощение моноцитов/макрофагов отменяет терапевтические эффекты MSC на животных моделях8. Здесь в центре внимания находится клеточно-контактное взаимодействие MSC с MΦ. MSC обладают способностью регулировать фенотип MΦ, способствуя переходу от воспалительных к противовоспалительным реакциям, что приводит к деятельности по восстановлениютканей 8,9,10,11,и многое было сделано для демонстрации этих регуляторных механизмов. При других обстоятельствах MSC может поддерживать или усугублять воспалительную реакцию, вызванную MΦ12,13 и усиливать фагоцитарную активность MΦ14,15. Однако существует критическая нехватка существующих данных, которые идентифицируют механизмы, с помощью которых MSC и условия, при которых MSC регулируют фагоцитарную активность MΦ.
MΦ имеют семейства рецепторов, которые распознают либо опсонизированные (покрытые антителами или комплементом), либо неопсонизированные патогены, приводящие к фагоцитозу16. Активация и активность последних изучены менее хорошо17. В невоспалительной среде in vitro MSC усиливают MΦ фагоцитоз неопсонизированных патогенов13. Однако распознавание неопсонизированных патогенов MΦ может быть уменьшено после воздействия воспалительной среды, продуцируемой лимфоцитами во время адаптивного иммунного ответа. IFN-γ, высвобождаемая естественными клетками-киллерами и эффекторными лимфоцитами, оказывает ингибирующее действие на фагоцитоз MΦ неопсонизированных частиц18. Разработана модель кокультуры для изучения механизмов регуляции MSC прямого контакта MΦ фагоцитоза. Цель эксперимента, представленного здесь, состоит в том, чтобы определить, регулируют ли MSC фагоцитоз MΦ неопсонизированных патогенов после того, как MΦ подверглись воздействию IFN-γ(рисунок 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все методы подготовки среды и культивирования клеток проводятся в асептических условиях с использованием шкафа биобезопасности с ламинарным потоком. Все описанные этапы инкубации культуры проводят с использованием инкубатора, предназначенного для поддержания атмосферы 37 °C, 5% CO2и влажности 95%.
1. Клеточная культура
- Приготовление питательной среды
- Для MSC и LADMAC добавьте 50 мл FBS и 5 мл 100-кратной антибиотической / антимикотической смеси к 500 мл высокоуглекового DMEM.
- Для MΦ добавьте 50 мл FBS, 100 мл среды ladmac (приготовленной в соответствии с этапами раздела 1.2) и 5 мл 100-кратной смеси антибиотиков к 500 мл высокоуглексового DMEM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки LADMAC продуцируют колониестимулирующий фактор (CSF-1), необходимый для поддержки роста клеток MΦ.
- Приготовление кондиционированной среды LADMAC
- Чтобы засеять клетки LADMAC из замороженного бульона, добавьте 19 мл питательной среды из секции 1,1 в каждую из пяти колб, обработанных культурой клеток T75см2, и поместите в инкубатор клеточной культуры на 15 мин, чтобы уравновесить до 37 °C.
- Между тем, быстро разморозить одну аликвоту из 106 замороженных клеток путем инкубации на водяной бане 37 °C в течение 2-3 мин или до тех пор, пока она не разморозится. Добавьте клетки к 9 мл свежей питательной среды MSC в стерильной конической трубке объемом 15 мл или 50 мл и центрифугу при 125 х г в качающемся роторе ведра в течение 5 мин.
- Аспирировать или декантировать супернатант, добавить 5 мл свежей питательной среды и аккуратно пипетку вверх и вниз, чтобы повторно суспендировать гранулу клетки.
- Добавьте 1 мл клеточной суспензии в каждую из пяти колб T75см2 с помощью стерильной серологической пипетки и поместите их в инкубатор клеточной культуры.
- Каждые 2-3 дня добавляйте дополнительно 10 мл среды в течение 7-10-дневного периода. Затем соберите клетки и супернатант в стерильные конические трубки 50 мл с помощью стерильной серологической пипетки и центрифуги при 125 х г в течение 5 мин.
- Отделите супернатант от ячейки гранулы и стерильный фильтр супернатанта с помощью 0,2 мкм стерильного одноразового вакуумного фильтрующего устройства.
- Извлеките аспиратор из пакета и подключите с помощью вакуумной трубки к аспиратору насос. Вылейте супернатант в верхний отсек и замените крышку. Включите аспираторный насос для фильтрации в нижний отсек.
- Приготовьте аликвоты путем пипетки в 50 мл стерильных конических трубок и храните при -20 °C.
- Чтобы заморозить ячейку гранулы, повторно суспендировать в морозильной среде при10 6 ячейках/мл, поместить в морозильную емкость, а затем поместить их в морозильную камеру с температурой -80 °C. Через 24 ч перевести на хранение LN2.
- Размножение клеток при подготовке к совместной культуре
- Чтобы посеять клетки MSC и MΦ из замороженного бульона, уравновешивают 9 мл соответствующей питательной среды, приготовленной в секции 1.1, в каждой из четырех 100 мм клеток, обработанных культурой клеток, для каждого типа клеток и помещают в инкубатор клеточной культуры в течение 15 мин.
- Между тем, быстро разморозьте аликвоты 106 замороженных клеток, инкубируя их на водяной бане 37 °C в течение 2-3 минут или до тех пор, пока они не разморозятся. Затем добавляют размороженные ячейки MSC к 9 мл свежей питательной среды MSC и добавляют размороженные клетки MΦ к 9 мл свежей среды роста MΦ в 15 или 50 мл стерильных конических трубок и центрифугу при 125 х г в качающемся роторе ведра в течение 5 мин.
- Аспирировать или декантировать супернатант и повторно суспендировать каждую гранулу в 4 мл соответствующей свежей питательной среды, осторожно пипетируя вверх и вниз. Добавьте 1 мл клеточной суспензии к каждой из четырех 100-мм посуды для каждого типа клеток, которые были уравновешиваны на этапе 1.3.1.
- Верните посуду с клетками в инкубатор. Меняйте среду каждые 2-3 дня до 70%-80% конфлюента.
2. Семена MSC в экспериментальных блюдах, День 1
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед посевом MSC спроектируйте экспериментальную схему пластин с 96 скважинами для флуоресцентной спектрофотометрии и слайд камеры для динамической визуализации. Для плиты с 96 скважинами фланковые экспериментальные скважины с ячейками, но не используйте их в анализе. Отметьте не менее четырех скважин, которые будут использоваться для заготовки реагентов (RBL). См. Таблицу 1 для примера шаблона 96 скважин и Таблицу 2 для примера шаблона слайда камеры 4 скважины. Рекомендуются черные или белые 96-скважинные плиты с четким дном. Оптимальным является 1,5-мм боросиликатный стеклянный затвор камеры, но количество камер может быть отрегулировано в зависимости от конструкции исследования. Сводная блок-схема следующих методов приведена на рисунке 2.
- При 70%-80% слиянии аспирируют питательную среду из культур в 100 мм посуде и добавляют 5 мл PBS для выделения MSC.
- Аспирировать PBS, добавить 2 мл 0,05% трипсина/ЭДТА и поместить его в инкубатор культуры на 3-5 мин.
- Через 3 мин проверьте отслоение клеток с помощью перевернутого микроскопа. Если ячейки отсоединены, перейдите к следующему шагу; если нет, продолжайте инкубацию еще 1-2 мин. Не инкубировать дольше 5-6 мин.
- Добавьте 5 мл свежей питательной среды в блюдо с отслоивленными клетками. Промыть блюдо, используя смесь трипсина / среды, и собрать клетки в чистую, стерильную коническую трубку 50 мл с использованием стерильной серологической пипетки.
- Центрифуга в течение 5 мин при 125 х г. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать гранулу клетки в 10 мл свежей питательной среды, осторожно пипетируя вверх и вниз.
- Чтобы подсчитать клетки, добавьте 10 мкл клеточной суспензии к 30 мкл 0,4% раствора трипанового синего цвета в микроцентрифужной пробирке размером 1,5 мл. Затем пипетку 10 мкл смеси под крышкой счетной камеры гемоцитометра.
- Используя инвертированный или яркий полевой микроскоп с 10-кратным объективом, подсчитайте незапятнанные (жизнеспособные) клетки в четырех из 1 мм2 квадратов. Вычислите номер ячейки по формуле: ячейки/мл = количество ячеек/# 1 мм2 квадрата x коэффициент разбавления x 104.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого примера число 1 мм2 квадратов, насчитанных квадратов, составляет четыре, а коэффициент разрежения - 4. - Используйте уравнение C1V1 = C2V2 для расчета и подготовки суспензии 1 x10 5 ячеек/мл. Подготовьте 1 мл суспензии ячейки/мл для каждой колонны заполненной плиты из 96 скважин и 0,75 мл для каждой камеры слайда с 4-й скважиной, которая будет заполнена в соответствии с конструкцией пластины.
ПРИМЕЧАНИЕ: C1 = количество ячеек, V1 = то, что вычисляется, C2 = 1 x10 5,V2 = 5,50 мл. - ОпределитеV1,вычтите его из желаемых 5,50 мл общего объема, чтобы определить объем свежей среды, необходимой для приготовления суспензии. Добавьте объем клеток(V1)из исходной суспензии к объему свежей среды в общей сложности 5,50 мл с 1 х 105 ячейками/мл.
- Добавьте 100 мкл 1 х 105 ячеек/мл суспензии к каждой скважине 96-скважинной пластины в соответствии с конструкцией пластины с использованием многоканального микропипеттора и 530 мкл к каждой из скважин камерного затвора с использованием микропипетки в соответствии с конструкцией пластины. Инкубировать на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого эксперимента МСК помещают колоннами 1, 2, 3 и 6 плиты из 96 скважин(таблица 1)и скважинами 1 и 2 слайда с 4-й камерой(таблица 2). Поэтому получают, по меньшей мере, 5,50 мл суспензии 1х 10 5 клеток/мл. MΦ при 80% слиянии обрабатывают воспалительными медиаторами в тот же день, когда MSC засевают в экспериментальные пластины.
3. Активируйте MΦ с помощью IFN-γ, день 1
- Подготовьте носитель активации и запас IFN-γ.
- Для 200 мл активационной среды добавьте 40 мг BSA к 200 мл бессывороточного высокоуглексового DMEM и стерильного фильтра с использованием 0,2 мкм стерильного одноразового вакуумного фильтра.
- Чтобы приготовить 0,1% BSA/PBS, добавьте 20 мг BSA к 20 мл PBS. Вихрь растворяется. Используйте стерильный шприцевой фильтр 0,2 мкм для фильтрации в чистую, стерильную коническую трубку 50 мл.
- Добавьте 1 мл стерильного 0,1% раствора BSA/PBS к 100 мкг лиофилизированного IFN-γ для получения 100 мкг/мл запасного раствора. Хранить в 50 мкл аликвот при -20 °C.
- Активация MΦ с помощью IFN-γ
- Добавьте 2,5 мкл 100 мкг/мл IFN-γ запаса на каждый 1 мл необходимой среды. Для каждой 100 мм чашки, которая будет активирована, готовят 10 мл активационной среды, содержащей IFN-γ в концентрации 250 нг/мл.
- Аспирировать питательную среду из культур MΦ и заменить ее 5 мл активационной среды без ИФН-γ промывки.
- Аспирировать среду, используемую для промывки, и заменить ее 10 мл IFN-γ дополненной активационной средой для экспериментальной чашки и 10 мл ненеполнимой активационной среды для контроля. Инкубировать культуры в течение 16-24 ч.
4. Изолируйте MΦ и подготовьте сокультуры, День 2
- Удалите активационную среду из клеток MΦ и замените ее 5 мл свежей питательной среды. Аккуратно соскоблите с помощью подъемника клеток и соберите ячейки в коническую трубку размером 50 мл.
- Подсчитайте клетки с помощью трипанового синего исключения и гемоцитометрии, как описано для MSC в, шаги 2.6-2.7.
- Используя уравнение на этапах 2.8-2.9, подготовьте две отдельные суспензии 2 х10 5 клеток/мл, одну с клетками из контрольной части и одну с клетками из обработанных MΦ культур.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте 1 мл суспензии ячейки/мл для каждой колонны заполненной плиты из 96 скважин и 0,75 мл для каждой камеры слайда с 4-й скважинной камерой, которая должна быть заполнена в соответствии с конструкцией пластины. - Аккуратно аспирировать среду из экспериментальных скважин 96-скважинной плиты, содержащей МСК. Используя многоканальную микропипетку, добавляют 100 мкл обработанных и контрольных суспензий MΦ-клеток в соответствующие экспериментальные скважины с МСК и без него в соответствии с конструкцией пластины. Инкубировать на ночь.
- Осторожно аспирировать среду из 4-скважинного камерного слайда, содержащего MSC, и, используя микропипетку, добавить 530 мкл клеточной суспензии MΦ в соответствующие скважины в соответствии с конструкцией. Инкубировать на ночь.
5. Анализ фагоцитоза, кинетическая флуоресцентная 96-хорошо читаемая пластина, день 3
- Установка параметров анализа
- В день анализа включите считыватель флуоресцентных пластин и установите температуру в системе на 37 °C.
- Откройте программное обеспечение системы Pro и проверьте значок инструмента в левом верхнем углу, чтобы определить, подключен ли инструмент к компьютеру. Если виден красный круг с линией, нажмите на значок инструмента и выберите инструмент во всплывающем окне, чтобы установить соединение.
- Выберите «Новый эксперимент», чтобы открыть всплывающее окно «Помощник по настройке пластины». В меню Помощник по настройке пластин выберите Настроить параметры приобретения.
- Выберите Монохроматор в меню настроек оптической конфигурации. Выберите FL (флуоресценция) для режима чтения и Kinetic для типа чтения.
- В том же окне конфигураций в разделе Категориящелкните Длины волн, а затем установите полосу пропускания 9 нм для возбуждения и 15 нм для излучения.
- Установите для числа пар длин волн значение 1. Установите длины волн LM1 в 510 нм для возбуждения и до 540 нм для излучения.
- Продолжите просмотр категорий и выберите Тип пластины далее. Выберите параметр, соответствующий используемому типу пластины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы выбор соответствовал типу пластины. Высота считывания устанавливается системой в соответствии с выбором. - Затем выберите «Область считывания» и выделите площадь плиты из 96 скважин, включенной в экспериментальный проект.
- Выберите PMT и оптика, установитедля параметра PMT Gain значение High и Flashes per reads значение 6. Установите флажок Читать снизу, если используется пластина с четким дном.
- Выберите Время и установите интервалы 10 минут в течение 70 минут.
- Выберите Встряхнуть,установите флажок Перед первым чтением и установите значение 5 с. Установите флажок Между чтением и установите значение 3 с. Установите интенсивность встряхивания как для низкого, так и для линейного.
- Закройте окно. Когда появится окно Помощник по настройке пластины, выберите Настроить макет тарелки. Выделите колодцы BL конструкции пластины и нажмите на Plate Blank.
- Выделите каждую из экспериментальных строк, нажмите кнопку Добавить,назовите группу, а затем выберите цвет.
- В разделе Параметры назначения под дизайном пластины выберите Серия, а затем определите серию в окне и нажмите кнопку ОК. Повторите для каждой группы.
- Приготовьте суспензию зимозана
- Ожидая, пока температура системы достигнет 37 °C, повторно суспендировать 1 мг частиц зимозана в 5 мл среды визуализации живых клеток.
- Добавьте 1 мл среды визуализации живых клеток во флакон, содержащий частицы, и соберите их в стеклянную культуральную трубку. Промойте флакон дополнительным 1 мл раствора для визуализации и переложите в ту же стеклянную трубку, чтобы убедиться, что все частицы перенесены. Добавьте 3 мл дополнительного раствора для визуализации для получения 0,2 мг/мл суспензии частиц.
- Вихрь с быстрыми импульсами в течение 30-60 с. Затем используйте зондовый ультразвуковой аппарат для ультразвука с помощью 60 быстрых импульсов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно создать однородную суспензию частиц и не дать суспензии сидеть слишком долго перед добавлением в экспериментальные скважины. Слипание быстро повторяется. Плотность частиц на ячейку, возможно, потребуется оптимизировать в зависимости от источника, обработки и плотности используемого MΦ. В представленных исследованиях использовались сопряженные частицы зимозана. Тем не менее, конъюгированные E. coli и S. aureus также доступны.
- Ожидая, пока температура системы достигнет 37 °C, повторно суспендировать 1 мг частиц зимозана в 5 мл среды визуализации живых клеток.
- Добавьте зимозан и прочитайте табличку
- Аспирировать среду из экспериментальных скважин и промыть 1x 100 мкл раствора для визуализации живых клеток. Промывайте скважины RBL с помощью решения для визуализации живых клеток.
- Аспирировать раствор для визуализации живых клеток из экспериментальных скважин и скважин RBL и заменить его 100 мкл суспензии частиц зимозана, приготовленной в разделе 5.2.
- Откройте лоток пластин флуоресцентного считывателя с помощью интерфейса сенсорной панели. Установите пластину без крышки в лоток с колодецом А1 в левом верхнем углу. Закройте лоток с помощью сенсорной панели и нажмите на зеленую кнопку «Прочитать» в верхнем меню.
- Когда чтение будет завершено, сохраните файл в соответствующую папку и экспортируйте данные в формат электронной таблицы, щелкнув Файл и выбрав Экспорт.
- Рассчитайте среднюю ± относительной флуоресценции SEM для каждой реплицируемой группы в каждый момент времени (10 мин, 20 мин, 30 мин и т.д.) в электронной таблице(Дополнительный файл 1)и передайте данные в графическое программное обеспечение.
- Используйте формат линейного графика для представления данных и применяйте двусторовидную ANOVA (Time x Treatment/MSC as factors), за которой следует тест множественных сравнений Tukey для определения различий между отдельными группами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пока выполняется считывание 96-скважинной пластины, подготовьте пластину динамического изображения для покадрового получения изображения. Убедитесь, что динамическая визуализация продолжается с анализом одной экспериментальной скважины за раз.
6. Анализ фагоцитоза, динамическая визуализация, день 3
- Включите систему обработки изображений и компьютер. Дважды щелкните, чтобы открыть программное обеспечение. Выберите режим программы Pro.
- Проверьте площадь сцены, чтобы убедиться, что образцы отсутствуют и ничто не препятствует движению сцены. Затем нажмите «Откалибровать сейчас».
- В меню Инкубация на боковой панели справа установите флажок рядом с H Unit XL и установите его на 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подождите, пока инкубированная стадия не дойдет почти до температуры, прежде чем готовить образцы для визуализации. - Промыть первую экспериментальную скважину 750 мкл среды визуализации и заменить ее 400 мкл суспензии частиц зимозана, приготовленной в разделе 5.2. Остальные скважины оставьте в питательной среде.
ПРИМЕЧАНИЕ: Может потребоваться вихрь и ультразвуком суспензии частицы снова ненадолго, если она осела более 15 минут. - Поместите слайд на инкубированную стадию системы визуализации. Установите таймер на 10 минут.
- Используйте программное обеспечение для создания образов, выберите Brightfield на вкладке Поиск, а затем щелкните значок окуляра в окне конфигурации системы ниже. С 10-кратным объективом на месте используйте окуляр и ручку фокусировки, чтобы сфокусироваться на ячейках.
- Перейдите на вкладку Приобретение, воспользуйтесь раскрывающимся меню Эксперимент, а затем выберите набор длин волн, включающий набор фильтров EGFP для размещения длин волн возбуждения 533 нм pH-чувствительного красителя.
- Когда на таймере осталось ~ 2 минуты, используйте программное обеспечение, чтобы изменить цель на 20x, нажав на значок 20x в меню целей.
- Нажмите на меню «Каналы», выберите фильтры EGFP и используйте меню «Экспозиция», чтобы установить время экспозиции на 400 мс, чтобы обнаружить чувствительный к pH зеленый флуорофор после того, как он был заключен в фаголизосому.
- Нажмите «Live» и отрегулируйте фокус с помощью ручки фокусировки.
- Нажмите «Стоп», чтобы выключить свет, и установите флажок рядом с экспериментальной настройкой Time-lapse в верхней части.
- В меню Стратегия фокусировки выберите Программная автофокусировка. В раскрывающемся меню автофокусировки выберите Интеллектуальные и грубые настройки, чтобы сократить время воздействия света во время работы автофокуса.
- В меню Time-Lapse установите нужное количество приобретений на 30-60, а интервал времени на 1 мин.
- После установки параметров замедленной съемки и после 10 мин добавления частиц в первую скважину нажмите на кнопку Начать эксперимент, чтобы начать сбор.
- Когда заготовка будет завершена с использованием первой экспериментальной скважины, повторите этапы 6.4-6.12 для каждой из оставшихся экспериментальных скважин.
- Сохраните все файлы эксперимента с датой и параметрами в заголовке в соответствующей папке.
- Закройте программное обеспечение. Повторно откройте программное обеспечение в режиме обработки и экспортируйте файлы в формате MP4 с помощью меню «Экспорт».
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После вычисления среднего ± SEM для каждой группы во всех временных точках данные представляются в формате линейного графика с осью Y как относительной интенсивностью флуоресцента и осью X как временем. Дополнительный файл 1 содержит пример необработанных данных из кинетического считывания 96-скважинной пластины в формате электронной таблицы.
В этом исследовании оптимальные результаты, представленные на рисунке 3Aи в таблице 3, демонстрируют, что 1) кокультура с MSC усиливает фагоцитарную активность макрофага, 2) лечение IFN-y снижает активность макрофага и 3) кокультура с MSC частично спасает фагоцитарную активность MΦ. Оптимальные плотности клеток имеют решающее значение в этих исследованиях, и когда MΦ покрыты слишком низкой плотностью, изменения интенсивности флуоресценции не могут быть обнаружены(рисунок 3B). Рисунок 3C представляет данные исследования, в котором MΦ были покрыты при слишком высокой плотности, а интенсивность флуоресценции быстро повышается во всех группах, и различия не могут быть различимы. Видео динамической визуализации подтверждают, что изменения интенсивности флуоресцентной частоты являются результатом фагоцитоза, а не подкисления среды. Они также предоставляют качественные данные и визуальное представление о скорости и степени фагоцитарной активности(рисунок 4).
Рисунок 1:Иллюстрация, изображающая центральный вопрос представленных данных, который заключается в следующем: «Может ли MSC восстановить фагоцитарную активность IFN-γ обработанного MΦ?». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Обзор рабочего процесса анализа кокультуры и фагоцитоза. Схема рабочего процесса количественного и качественного анализа активности фагоцитоза MΦ в кокультуре с MSC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Репрезентативные количественные данные из кинетического чтения, демонстрирующие оптимальные и неоптимальные результаты. В (A), данные репрезентативны для эксперимента с оптимальной плотностью клеток MΦ, в (B) данные являются репрезентативными для эксперимента с субоптимальной слишком низкой плотностью клеток MΦ, а в (C) данные являются репрезентативными для эксперимента с субоптимальной слишком высокой плотностью клеток MΦ. Относительная интенсивность флуоресценции, измеренная в относительных флуоресцентных единицах (РФС), строится на оси Y, в то время как время строится на оси X. Обратите внимание на различия в диапазоне РФС между оптимальными и неоптимальными экспериментами. В АМСК частично спасают фагоцитарную активность MΦ в условиях подавления ИФН-γ в течение 70 мин. РФС представлен как среднее ± SEM, n = 6. Анализ проводили с использованием теста туки на множественные сравнения после значительного двустороннего ANOVA, эффекта взаимодействия P = 0,0001, эффекта времени P = 0,0001 и эффекта лечения / MSC P = 0,0001. Символы обозначают результаты нескольких сравнительных тестов. * = существенная разница между MSC/MΦ + IFN-γ и MΦ + IFN-γ, Ŧ = существенная разница между MΦ и MΦ + IFN-γ, и † = значительная разница между MSC/MΦ и MΦ. Подробные результаты многочисленных сравнительных тестов см. в таблице 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Динамические видео визуализации, обеспечивающие визуальное подтверждение клеточного увеличения флуоресценции от кислотной активации меченых частиц зимозана после включения в фаголизосому MΦ. Покадровые настройки собирались каждые 1 мин в течение 30-минутного периода с использованием времени экспозиции 400 мс и набора фильтров EGFP. (A)MΦ в монокультуре,(B)MΦ в кокультуре с MSC,(C)MΦ, обработанный IFN-γ (250 нг/мл) и(D)MΦ, обработанный IFN-γ (250 нг/мл) в кокультуре с MSC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | КБЛ | МСК/МΦ | МСК/МΦ+ | МΦ | МΦ+ | КБЛ | РБЛ | |||||
| B | КБЛ | МСК/МΦ | МСК/МΦ+ | МΦ | МΦ+ | КБЛ | РБЛ | |||||
| C | КБЛ | МСК/МΦ | МСК/МΦ+ | МΦ | МΦ+ | КБЛ | РБЛ | |||||
| D | КБЛ | МСК/МΦ | МСК/МΦ+ | МΦ | МΦ+ | КБЛ | РБЛ | |||||
| E | КБЛ | МСК/МΦ | МСК/МΦ+ | МΦ | МΦ+ | КБЛ | РБЛ | |||||
| F | КБЛ | МСК/МΦ | МСК/МΦ+ | МΦ | МΦ+ | КБЛ | РБЛ | |||||
| G | КБЛ | МСК/МΦ | МСК/МΦ+ | МΦ | МΦ+ | КБЛ | РБЛ | |||||
| H | КБЛ | МСК/МΦ | МСК/МΦ+ | МΦ | МΦ+ | КБЛ | РБЛ |
Таблица 1: Пример конструкции плиты из 96 скважин. CBL - Ячейка пустая; MSC - посевной день 1; MΦ+ обработанный и MΦ необработанный семенной день 2; Заготовку реагента RBL добавляют на 3 день анализа.
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| МСК/МΦ | МСК/МΦ+ | МΦ | МΦ+ |
Таблица 2: Пример конструкции слайда с 4-х скважинной камерой. MSC - покрытие 1 день; MΦ+ обработанный и MΦ необработанный покрытый день 2.
| Тест множественных сравнений Туки | Средний дифф. | 95.00% ДИ дифф. | Ниже порога? | Сводка | Скорректированное значение P |
| 0 минут | |||||
| MSC/MΦ против MΦ | -3871 | -9495 до 1754 | Нет | нс | 0.2836 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 720.3 | -4904 до 6345 | Нет | нс | 0.9873 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | -77.17 | -5702 до 5548 | Нет | нс | >0.9999 |
| 10 минут | |||||
| MSC/MΦ против MΦ | -3466 | -9091 до 2159 | Нет | нс | 0.3817 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 2326 | -3299 до 7950 | Нет | нс | 0.7062 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 992 | -4633 до 6617 | Нет | нс | 0.968 |
| 20 минут | |||||
| MSC/MΦ против MΦ | -1311 | -6936 до 4314 | Нет | нс | 0.9303 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 3315 | -2310 до 8940 | Нет | нс | 0.422 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 3146 | -2478 до 8771 | Нет | нс | 0.4689 |
| 30 минут | |||||
| MSC/MΦ против MΦ | 384.8 | -5240 до 6010 | Нет | нс | 0.998 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 2313 | -3312 до 7937 | Нет | нс | 0.7098 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 8726 | 3101 до 14350 | Да | *** | 0.0005 |
| 40 минут | |||||
| MSC/MΦ против MΦ | 2247 | -3377 до 7872 | Нет | нс | 0.7278 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 4913 | -712.2 до 10537 | Нет | нс | 0.1101 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 16521 | 10896 до 22145 | Да | **** | <0.0001 |
| 50 минут | |||||
| MSC/MΦ против MΦ | 5657 | 32.12 до 11282 | Да | * | 0.0481 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 4932 | -692.9 до 10557 | Нет | нс | 0.1079 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 19083 | 13458 до 24708 | Да | **** | <0.0001 |
| 60 минут | |||||
| MSC/MΦ против MΦ | 12376 | 6752 до 18001 | Да | **** | <0.0001 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 9361 | 3736 до 14986 | Да | *** | 0.0002 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 24748 | 19123 до 30373 | Да | **** | <0.0001 |
| 70 минут | |||||
| MSC/MΦ против MΦ | 13770 | 8145 до 19395 | Да | **** | <0.0001 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 11987 | 6362 до 17612 | Да | **** | <0.0001 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 27264 | 21639 до 32888 | Да | **** | <0.0001 |
Таблица 3: Подробный статистический анализ данных, представленных на рисунке 3А. Результаты многочисленных сравнительных тестов Туки после значительного двустороннего ANOVA данных, представленных на рисунке 3A.
Дополнительный файл 1: Репрезентативный файл электронной таблицы с необработанными кинетическими данными из оптимального эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Анализ фагоцитоза с использованием биочастиц, конъюгированных с рН-чувствительным красителем, является относительно новым инструментом, который оказался преимуществом перед традиционными флуоресцентно мечеными частицами12,19,20. С традиционными флуоресцентно-мечеными частицами возможен только анализ конечных точек. Обнаружение проводят с помощью флуоресцентной микроскопии и/или спектрофторометрии после промывки или гашения частиц, которые не были захвачены фагоцитом. Количественные данные, полученные в результате спектрофторометрии, могут обнаружить непоглощенные частицы, а анализ изображений для количественной оценки только внутриклеточных частиц утомичен и трудоемок с использованием традиционных флуоресцентных систем микроскопии14. Биочастицы, конъюгированные с pH-чувствительными красителями, флуоресцируют только в кислой среде, такой как фаголизосома, и, следовательно, утомительные этапы промывки и закалки являются ненужными14. Кроме того, pH-чувствительные меченые биочастицы обеспечивают преимущество предоставления кинетических данных, которые не будут легко получены с помощью FITC или других фторофор-конъюгированных биочастиц.
В исследованиях с использованием этого нового инструмента использовалась проточная цитометрия и/или платформы визуализации для получения количественного и кинетического измерения активности фагоцитов19,20,21. Проточная цитометрия выгодна, если существует ограниченная популяция фагоцитов или если кто-то заинтересован в сортировке для последующих анализов, таких как генетические скрининги19. Известно, что MSC регулируют фенотип MΦ как через прямой контакт, так и через растворимые факторы. Предварительные исследования показали, что обусловленная среда из MSC подавляет MΦ фагоцитоз, и поэтому этот протокол был разработан для определения изменений фагоцитарной активности MΦ при прямой совместной культуре с MSC. В этих условиях спектрофторометрия для количественной оценки и динамическая визуализация для визуализации и подтверждения фагоцитарной активности являются наиболее подходящими.
Решающее значение для успеха этих методов имеет оптимизация плотности клеток. MSC должен быть покрыт плотностью, которая обеспечивает оптимальный контакт ячейки с ячейками MΦ. MΦ необходимо засевать в монокультуры и сокультуры с плотностью, которая не только обеспечивает оптимальный контакт, но и позволяет оптимальное обнаружение флуоресценции. Слишком низкая плотность приведет к низкому включению в фаголизосому и небольшим или плоским изменениям в относительных флуоресцентных единицах(рисунок 3B). Если MΦ засеяны при слишком высокой плотности, фагоцитоз быстро нарастит, а обнаружение различий между группами маскируется(рисунок 3C). Оптимизация концентрации чувствительных к pH красителю меченых частиц зимозана на количество клеток также имеет решающее значение. Предварительные эксперименты должны быть проведены для оптимизации плотности ячеек MSC и MΦ, а также количества частиц на ячейку MΦ. Кроме того, эти шаги оптимизации должны быть предприняты, если используются другие меченые биочастицы, такие как E. coli или S. aureus.
Соответствующая среда визуализации также имеет решающее значение. Среда для обоих методов должна быть буферной средой и не должна содержать фенол красного цвета. Фенол красный будет приглушать обнаружение флуоресцентного излучения. Кроме того, любая добавка или условие, которое может подкислять среду, преждевременно активирует меченые частицы и вводит повышенный фон. Заготовка реагента имеет решающее значение для идентификации потенциального подкисления среды.
Мало того, что эти протоколы могут быть использованы для исследования MSC-регуляции MΦ фагоцитоза различных pH-чувствительных биочастиц, но метод также может быть применен к различным моделям кокультур, которые включают нейтрофилы и другие фагоциты. Кроме того, используя эту модель, молекулы и пути, подозреваемые в участии в клеточной контакт-опосредоточной регуляции фагоцитарной активности макрофагов, могут быть исследованы с помощью siRNA или CRISPR-опосредооченной понижающей регуляции для проверки или опровержения подозреваемых молекулярных мишеней. Потенциальные мишени включают молекулы адгезии, фагоцитарные рецепторы и молекулы интегрина.
Работа с использованием этих методов откроет новую информацию о сигнальных механизмах, лежащих в основе повышенных фагоцитарных реакций MΦ после взаимодействия клеточного контакта с MSC, тем самым способствуя нашему пониманию роли MSC в регулировании врожденного иммунитета. Исследования, подобные этим, касаются недостаточно изученной области и дадут полную картину влияния MSC на активность макрофагов, что необходимо для полного понимания их роли в иммунитете.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана механизмом NSF Major Research Instrument в рамках грантов 1626093 и 1919583.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Black Polystyrene Microplate | MilliporeSigma | CLS3603-48EA | |
| 0.4% trypan blue solution | MilliporeSigma | T8154-20ML | |
| 15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 339653 | |
| 4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | ThermoFisher | 155382PK | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco | ThermoFisher | 15240096 | |
| Axiobserver 7 Imaging System | Zeiss | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MilliporeSigma | A8806-1G | |
| Cell lifter | MilliporeSigma | CLS3008-100EA | |
| Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75 cm2, canted neck, with cap, filtered | MilliporeSigma | C7231-120EA | |
| D1 ORL UVA [D1] | ATCC | CRL-12424 | Mouse MSC Cell Line |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Hemocytometer | FisherScientific | 02-671-51B | |
| I-11.15 | ATCC | CRL-2470 | Mouse MΦ Cell Line |
| LADMAC Cell Line | ATCC | CRL-2420 | LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1). |
| Live-Cell Imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010031 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate | ThermoFisher | P35365 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Preprotech | 315-05 | |
| Spectramax i3X | Molecular Devices | ||
| Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 µm | ThermoFisher | 568-0020 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 micrometer | ThermoFisher | 723-2520 | |
| Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm | MilliporeSigma | CLS430167-100EA | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher | 25300054 |
References
- Phinney, D. G., Prockop, D. J. Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair--current views. Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).
- Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation. Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).
- Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease. Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).
- Giuliani, M., et al. Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation. PLoS One. 6 (5), 19988 (2011).
- Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells. Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).
- Luz-Crawford, P., et al. Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (3), 65 (2013).
- Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), 10088 (2010).
- Nemeth, K., et al. marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).
- Maggini, J., et al. Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile. PLoS One. 5 (2), 9252 (2010).
- Takizawa, N., et al. marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture. Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).
- Kim, J., Hematti, P. Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages. Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).
- Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 56 (2015).
- Cho, D. I., et al. Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages. Experimental Molecular Medicine. 46, 70 (2014).
- Fernandez, N., et al. Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response. Stem Cells International. 2017, 5846257 (2017).
- Jackson, M. V., et al. Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS. Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).
- Chaplin, D. D.
- Lim, J., et al. Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages. Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).
- Wang, Z., et al. Interferon-γ inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway. Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).
- Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts. Biotechniques. 68, 245-250 (2020).
- Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
- Takahashi, D., et al. Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE. Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).
