Summary
Præsenteret her er en protokol til at kvantificere og producere dynamiske billeder af mesenchymal stamcelle (MSC) medieret regulering af makrofag (MΦ) fagocytose af ikke-opsonized gær (zymosan) partikler, der er konjugeret til en pH-følsomme fluorescerende molekyle.
Abstract
Mesenchymal stamceller (MSC) er traditionelt blevet undersøgt for deres regenerative egenskaber, men for nylig har deres immunregulatoriske egenskaber været på forkant. De interagerer med og regulerer immuncelleaktivitet. Fokus for denne undersøgelse er MSC regulering af makrofags-phagocytisk aktivitet. Makrofag (MΦ) phagocytose er en vigtig del af det medfødte immunsystems reaktion på infektion, og de mekanismer, hvorigennem MSC modulerer dette svar, er under aktiv undersøgelse. Præsenteret her er en metode til at studere MΦ fagocytose af ikke-opsoniserede zymosanpartikler konjugeret til en pH-følsomme fluorescerende molekyle, mens i co-kultur med MSC. Efterhånden som fagocytisk aktivitet øges, og de mærkede zymosanpartikler omsluttes i det sure miljø i fagoclysomaet, øges fluorescensintensiteten af det pH-følsomme molekyle. Med passende excitation og emission bølgelængder måles fagocytisk aktivitet ved hjælp af et fluorescerende spektrofotometer, og kinetiske data præsenteres som ændringer i relative fluorescerende enheder over en 70 min periode. For at understøtte disse kvantitative data visualiseres ændringen i den fagocytiske aktivitet ved hjælp af dynamisk billeddannelse. Resultater ved hjælp af denne metode viser, at når MSC er i co-culture, forbedrer han MΦ-fagocytose af ikke-opsoniseret zymosan af både naiv og IFN-γ behandlet MΦ. Disse data bidrager til den nuværende viden om MSC-regulering af det medfødte immunsystem. Denne metode kan anvendes i fremtidige undersøgelser for fuldt ud at afgrænse de underliggende cellulære og molekylære mekanismer.
Introduction
Mesenchymale stamceller (MSC) er stamceller, der giver anledning til bindevævsceller. MSC er til stede i voksne pattedyr væv og kan isoleres fra knoglemarven1. På grund af deres immunmodulerende egenskaber studeres disse celler bredt2. Tidlige undersøgelser fokuseret på MSC regulering af T-celler3,4,5,6, men for nylig, deres regulering af makrofag celler (MΦ), en vigtig cellulær komponent i medfødt immunitet, har fået øget opmærksomhed7,8,9,10,11,12,13,14 . Betydningen af MSC-MΦ interaktion i behandlingen af inflammatorisk sygdom understreges af det faktum, at udtømning af monocytter / makrofager ophæver de terapeutiske virkninger af MSC i dyremodeller8. Her er fokus MSC's cellekontaktinteraktion med MΦ. MSC har kapacitet til at regulere fænotypen af MΦ ved at fremme overgangen fra inflammatoriske til antiinflammatoriske reaktioner, hvilket fører til vævsreparationsaktiviteter8,9,10,11, og der er gjort meget for at demonstrere disse reguleringsmekanismer. Under andre omstændigheder kan MSC understøtte eller forværre et MΦ-drevet inflammatorisk respons12,13 og forbedre MΦ-fagocytisk aktivitet14,15. Der er imidlertid en kritisk mangel på eksisterende data, der identificerer de mekanismer, hvorved og de betingelser, hvorunder MSC regulerer MΦ-fagocytisk aktivitet.
MΦ har familier af receptorer, der genkender enten opsoniseret (antistof eller komplementbelagt) eller ikke-opsoniserede patogener, der fører til fagocytose16. Aktiveringen og aktiviteten af sidstnævnte er mindre godt undersøgt17. I et ikke-inflammatorisk in vitro-miljø forbedrer MSC MΦ-fagocytose af ikke-opsoniserede patogener13. Genkendelse af ikke-opsoniserede patogener ved MΦ kan dog reduceres efter eksponering for et inflammatorisk miljø produceret af lymfocytter under et adaptivt immunrespons. IFN-γ, udgivet af naturlige dræberceller og effektorlymfocytter, har en hæmmende virkning på MΦ-fagoccytose af ikke-opsoniserede partikler18. En co-kultur model blev udviklet til at studere mekanismerne i MSC direkte kontakt regulering af MΦ fagocytose. Målet med det eksperiment, der præsenteres her, er at afgøre, om MSC regulerer MΦ-fagocytose af ikke-opsoniserede patogener, efter at MΦ har været udsat for IFN-γ (Figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle medium forberedelses- og cellekulturteknikker udføres under aseptiske forhold ved hjælp af et biosikkerhedsskab med laminarstrøm. Alle beskrevne kulturinkubationtrapper udføres ved hjælp af en inkubator, der er designet til at opretholde en atmosfære på 37 °C, 5% CO2og 95% fugtighed.
1. Cellekultur
- Udarbejdelse af vækstmedium
- For MSC og LADMAC tilsættes 50 mL FBS og 5 mL 100x antibiotisk/antimykotisk blanding til 500 mL høj glukose DMEM.
- For MΦ tilsættes 50 mL FBS, 100 mL LADMAC tilstand medium (udarbejdet efter trinene i afsnit 1.2), og 5 mL af 100x antibiotika mix til 500 mL høj glukose DMEM.
BEMÆRK: LADMAC-celler producerer kolonistimulerende faktor (CSF-1), der er nødvendig for at understøtte væksten af MΦ-cellerne.
- Forberedelse af LADMAC konditioneret medium
- For at så LADMAC-celler fra frossen bestand tilsættes 19 mL vækstmedium fra punkt 1.1 i hver af de fem T75 cm2 cellekulturbehandlede kolber og placeres i cellekulturinkubatoren i 15 min.
- I mellemtiden, hurtig optø en aliquot af 106 frosne celler ved inkubation i en 37 ° C vandbad i 2-3 min eller indtil det bliver optøet. Tilsæt cellerne til 9 mL frisk MSC vækstmedium i en 15 mL eller 50 mL steril konisk rør og centrifuge ved 125 x g i en svingende spand rotor i 5 min.
- Aspirere eller dekantere supernatant, tilsæt 5 mL frisk vækst medium, og forsigtigt pipette op og ned for at genbruge celle pellet.
- Tilsæt 1 mL af celleaffjedringen til hver af de fem T75 cm2 kolber ved hjælp af en steril serologisk pipette og læg dem i cellekulturinkubatoren.
- Hver 2-3 dage, tilføje yderligere 10 mL medium over en 7-10-dages periode. Derefter opsamles cellerne og supernatanten i sterile 50 mL koniske rør ved hjælp af en steril serologisk pipette og centrifuge ved 125 x g i 5 min.
- Supernatanten adskilles fra cellepillen, og sterilt filter supernatanten adskilles ved hjælp af en 0,2 μm steril engangsstøvsugerenhed.
- Fjern aspiratorsamlingen fra pakken, og tilslut ved hjælp af vakuumslanger til aspiratorpumpen. Hæld supernatanten i det øverste rum og udskift dækslet. Tænd aspiratorpumpen for at filtrere ind i det nederste rum.
- Tilbered aliquots ved pipetter i 50 mL sterile koniske rør og opbevares ved -20 °C.
- Hvis du vil fryse cellepillen, skal den genbruges i frysemedium ved 106 celler/mL, placeres i en frysebeholder og derefter placeres i en fryser på -80 °C. Efter 24 timer overføres til LN2 opbevaring.
- Former celler som forberedelse til samkultur
- For at så MSC- og MΦ-celler fra den frosne bestand skal ækvilibrere 9 mL passende vækstmedium, der er fremstillet i punkt 1.1 i hver af de fire 100 mm cellekulturbehandlede retter for hver celletype og placeres i cellekulturinkubatoren i 15 min.
- I mellemtiden, hurtig optø aliquots af 106 frosne celler ved at inkubere dem i en 37 ° C vandbad i 2-3 min eller indtil lige optøet. Derefter tilsættes de optøede MSC-celler til 9 mL frisk MSC vækstmedium og tilsæt de optøede MΦ-celler til 9 mL frisk MΦ vækstmedium i 15 eller 50 mL sterile koniske rør og centrifuge ved 125 x g i svingende skovlrotor i 5 min.
- Aspirere eller dekantere supernatant og resuspend hver pille i 4 mL af passende frisk vækst medium ved forsigtigt pipetter op og ned. Der tilsættes 1 mL af celleaffjedringen til hver af de fire 100 mm retter for hver celletype, der er blevet ekvilibreret i trin 1.3.1.
- Returner opvasken med celler til inkubatoren. Skift medium hver 2-3 dage indtil 70%-80% sammenløb.
2. Frø MSC i eksperimentelle retter, Dag 1
BEMÆRK: Før du sår MSC, skal du designe det eksperimentelle 96-brønds pladelayout til fluorescerende spektrofotometri og kammerdiaset til dynamisk billeddannelse. For 96-brønd plade, flanke eksperimentelle brønde med brønde, der indeholder celler, men ikke bruger dem i analysen. Marker mindst fire brønde, der skal anvendes til reagens blank (RBL). Se tabel 1 for en eksempel 96-brønd skabelon og tabel 2 for et eksempel på en 4-brønd kammer slide skabelon. Sorte eller hvide 96-brøndsplader med klare bunde anbefales. En 1,5 mm borosilicat glaskammer slide er optimal, men antallet af kamre kan justeres afhængig af undersøgelsen design. Et oversigtsflowdiagram over de følgende metoder findes i figur 2.
- Ved 70%-80% sammenløb, aspirere vækstmediet fra kulturerne i 100 mm retter og tilsæt 5 mL PBS for at isolere MSC.
- Aspirere PBS, tilsæt 2 mL af 0,05% trypsin / EDTA, og læg den i kulturkuvøsen i 3-5 min.
- Efter 3 min skal cellestarten kontrolleres ved hjælp af et omvendt mikroskop. Hvis cellerne er løsrevet, skal du fortsætte til næste trin. hvis ikke, skal du fortsætte inkubationen i yderligere 1-2 min. Inkuber ikke længere end 5-6 min.
- Tilsæt 5 mL frisk vækstmedium til fadet med de fritliggende celler. Skyl fadet med trypsin/medium blandingen og saml cellerne i et rent, sterilt 50 mL konisk rør ved hjælp af en steril serologisk pipette.
- Centrifuge i 5 min ved 125 x g. Aspirere supernatant og genbruge cellepillen i 10 mL frisk vækst medium ved forsigtigt pipetter op og ned.
- For at tælle cellerne tilsættes 10 μL af celleaffjedringen til 30 μL på 0,4% trypanblå opløsning i et 1,5 mL mikrocentrifugerør. Derefter pipette 10 μL af blandingen under coverlip af et hæmocytometer tællekammer.
- Ved hjælp af et omvendt eller lyst feltmikroskop med 10x-målet tælles de ufarvede (levedygtige) celler i fire af de 1 mm2 kvadrater. Beregn cellenummeret ved hjælp af formlen: celler/mL = celleantal/# 1 mm2 kvadrater x fortyndingsfaktor x 104.
BEMÆRK: I dette eksempel er antallet af 1 mm2 kvadrater talt fire, og fortyndingsfaktoren er 4. - Brug ligningen C1V1 = C2V2 til at beregne for og forberede en 1 x 105 celle / mL suspension. Forbered 1 mL celle /mL suspension for hver kolonne af 96-brønd plade, der skal fyldes og 0,75 mL for hvert kammer af 4-brønd kammer dias, der skal fyldes i henhold til plade design.
BEMÆRK: C1 = celleantal, V1 = hvad der beregnes, C2 = 1 x 105, V2 = 5,50 mL. - Bestem V1, træk det fra de ønskede 5,50 mL af det samlede volumen for at bestemme mængden af det friske medium, der er nødvendigt for at forberede suspensionen. Volumen af celler (V1) fra den oprindelige suspension til mængden af frisk medium for i alt 5,50 mL med 1 x 105 celler / mL.
- Tilsæt 100 μL på 1 x 105 celle/mL affjedring til hver brønd af 96-brøndspladen i henhold til pladedesignet ved hjælp af en multikanalmikropipettor og 530 μL til hver af kammerets brønde glider ved hjælp af en mikropipette i henhold til pladedesignet. Inkuber natten over.
BEMÆRK: Til dette forsøg er MSC belagt i kolonne 1, 2, 3 og 6 på 96-brøndpladen (tabel 1) og brønde 1 og 2 i 4-brøndkammerdiaset (tabel 2). Derfor fremstilles der mindst 5,50 mL af en 1 x 105 celle/mL-affjedring. MΦ ved 80% sammenløb behandles med inflammatoriske mæglere samme dag, som MSC er seedet i forsøgspladerne.
3. Aktiver MΦ med IFN-γ, dag 1
- Forbered aktiveringsmediet og IFN-γ lager.
- For 200 mL aktiveringsmedium tilsættes 40 mg BSA til 200 mL serumfrit høj glukose DMEM og sterilt filter ved hjælp af en 0,2 μm steril engangsstøvsfilterenhed.
- For at forberede 0,1% BSA/PBS tilsættes 20 mg BSA til 20 mL PBS. Vortex til at opløses. Brug et 0,2 μm sterilt sprøjtefilter til at filtrere i et rent, sterilt 50 mL konisk rør.
- Der tilsættes 1 mL af den sterile 0,1% BSA/PBS-opløsning til 100 μg lyophilized IFN-γ for at opnå en 100 μg/mL lageropløsning. Opbevares i 50 μL aliquots ved -20 °C.
- Aktiver MΦ med IFN-γ
- Der tilsættes 2,5 μL på 100 μg/mL IFN-γ lager for hver 1 mL af det nødvendige medium. For hver 100 mm skål, der skal aktiveres, skal der forberedes 10 mm aktiveringsmedium, der indeholder IFN-γ, i en koncentration på 250 ng/mL.
- Aspirer vækstmediet fra MΦ-kulturerne og udskift det med 5 mL af aktiveringsmediet uden IFN- γ til skylning.
- Aspirer det medium, der anvendes til skylning, og udskift det med 10 mL IFN- γ suppleret aktiveringsmedium til forsøgsskålen og med 10 mL ikke-suppleret aktiveringsmedium til styringen. Inkuber kulturerne i 16-24 timer.
4. Isoler MΦ og forberede co-kulturer, Dag 2
- Fjern aktiveringsmediet fra MΦ-cellerne, og udskift det med 5 mL frisk vækstmedium. Skrab forsigtigt med en celleløfter og saml cellerne i et 50 mL konisk rør.
- Tæl cellerne ved hjælp af trypan blå eksklusion og hæmocytometri som beskrevet for MSC i trin 2.6-2.7.
- Ved hjælp af ligningen i trin 2.8-2.9 skal du forberede to separate suspensioner på 2 x 105 celler/mL, en med celler fra kontrolelementet og en med celler fra de behandlede MΦ-kulturer.
BEMÆRK: Forbered 1 mL celle/mL-affjedring for hver kolonne på 96-brøndpladen, der skal fyldes, og 0,75 mL for hvert kammer i 4-brøndskammerdiaset, der skal fyldes i henhold til pladedesignet. - Opsigts forsigtigt mediet fra de eksperimentelle brønde på den 96-brønds plade, der indeholder MSC. Ved hjælp af en multikanalmikropipette tilsættes 100 μL af de behandlede og kontrol MΦ celleaffjedringerne i de relevante eksperimentelle brønde med og uden MSC i henhold til pladedesignet. Inkuber natten over.
- Rør forsigtigt mediet fra 4-brøndskammersliden, der indeholder MSC, og tilføj ved hjælp af en mikropipette 530 μL MΦ-celleaffjedring til de relevante brønde i henhold til designet. Inkuber natten over.
5. Fagocytose assay, kinetisk fluorescerende 96-brønd plade læse, Dag 3
- Angiv analyseparametrene
- På dagen for analysen skal du tænde for den fluorescerende pladelæser og computer indstille temperaturen på systemet til 37 °C.
- Åbn system Pro-softwaren, og kontroller instrumentikonet i øverste venstre hjørne for at finde ud af, om instrumentet er tilsluttet computeren. Hvis den røde cirkel med en linje er synlig, skal du klikke på instrumentikonet og vælge instrumentet i pop op-vinduet for at oprette forbindelsen.
- Vælg Nyt eksperiment for at få adgang til pop op-vinduet Pladeopsætningshjælper. Vælg Konfigurer anskaffelsesindstillingeri menuen Pladeopsætningshjælper .
- Vælg Monochromator i indstillingsmenuen for den optiske konfiguration. Vælg FL (fluorescens) til læsetilstanden og Kinetisk for læsetypen.
- I samme konfigurationer vindue, under Kategori, skal du klikke på Bølgelængder, og derefter indstille båndbredder til 9 nm for excitation og 15 nm for emission.
- Angiv antallet af bølgelængdepar til 1. Indstil bølgelængderne LM1 til 510 nm for excitation og til 540 nm for emission.
- Fortsæt gennem kategorierne, og vælg Pladetype næste. Vælg den indstilling, der svarer til den pladetype, der bruges.
BEMÆRK: Det er vigtigt, at valget matcher pladetypen. Læsehøjderne indstilles af systemet i henhold til markeringen. - Vælg derefter Læs område og fremhæv det område af 96-brøndpladen, der er inkluderet i det eksperimentelle design.
- Vælg PMT og Optik, angiv YDELSE til høj og blinker pr. læsning til 6. Markér afkrydsningsfeltet ud for Læs fra bunden, hvis du bruger en fribundsplade.
- Vælg Tidsindstilling, og angiv for 10 min intervaller over en periode på 70 min.
- Vælg Ryst, markér afkrydsningsfeltet Før første læsning, og angiv til 5'er. Markér afkrydsningsfeltet Mellem læser og sæt til 3'er. Indstil rysteintensiteten for både lav og lineær.
- Luk vinduet. Når vinduet Pladeopsætningshjælper dukker op, skal du vælge Konfigurer pladelayout . Fremhæv BL brønde af plade design og klik på Plade Blank.
- Marker hver af de eksperimentelle rækker, klik på Tilføj, navngiv gruppen, og vælg derefter en farve.
- Vælg Serieunder Tildelingsindstillinger under pladedesignet , og definer derefter serien i vinduet , og klik på OK. Gentag for hver gruppe.
- Forbered zymosan suspension
- Mens du venter på, at systemtemperaturen når op på 37 °C, skal du genbruge 1 mg zymosanske partikler i 5 mL af det levende cellebilledmedie.
- Tilsæt 1 mL af levende celle billeddannelse medium til hætteglasset indeholder partiklerne og samle dem i et glas kultur rør. Skyl hætteglasset med yderligere 1 mL billedopløsning, og overfør til det samme glasrør for at sikre, at alle partiklerne overføres. Der tilsættes 3 mL ekstra billedbehandlingsopløsning for at opnå en partikelaffjedring på 0,2 mg/mL.
- Vortex med hurtige pulser i 30-60 s. Brug derefter en sondesoniker til at sonikere med 60 hurtige pulser.
BEMÆRK: Det er meget vigtigt at skabe en homogen suspension af partikler og ikke lade suspensionen sidde for længe, før du tilføjer til de eksperimentelle brønde. Klumper sig hurtigt sammen. Partikel pr celletæthed kan være nødvendigt at optimere afhængigt af kilden, behandling, og tæthed af MΦ anvendes. I de fremlagte undersøgelser blev der anvendt konjugeret zymosanpartikler. Der tilbydes dog også konjugeret E. coli og S. aureus.
- Mens du venter på, at systemtemperaturen når op på 37 °C, skal du genbruge 1 mg zymosanske partikler i 5 mL af det levende cellebilledmedie.
- Tilsæt zymosan og læs pladen
- Aspirere mediet fra de eksperimentelle brønde og skyl 1x med 100 μL af den levende cellebilleddannelsesopløsning. Skyl også RBL-brøndene med den levende cellebilledopløsning.
- Indsugning af den levende cellebilleddannelsesopløsning fra eksperimentelle og RBL-brønde og udskift den med 100 μL af den zymosiske partikelaffjedring, der er udarbejdet i punkt 5.2.
- Åbn pladebakken på lysstofrøreren ved hjælp af touchpad-grænsefladen. Sæt pladen, uden låg, i bakken med A1 godt i øverste venstre hjørne. Luk bakken ved hjælp af touchpad'en, og klik på den grønne læseknap i den øverste menu.
- Når læsningen er fuldført, skal du gemme filen i den relevante mappe og eksportere dataene i et regnearksformat ved at klikke på Filer og vælge Eksporter.
- Beregn middel ± SEM relative fluorescens for hver replikeringsgruppe på hvert tidspunkt (10 min, 20 min, 30 min osv.) i regnearket (Supplerende fil 1) og overfør dataene til grafsoftware.
- Brug et kurvegrafformat til at præsentere dataene og anvende tovejs ANOVA (Time x Treatment/MSC som faktorer) efterfulgt af Tukeys test af flere sammenligninger for at bestemme forskelle mellem de enkelte grupper.
BEMÆRK: Mens 96-brønd plade læsning er i gang, forberede den dynamiske billedbehandling plade for time-lapse billede erhvervelse. Sørg for, at den dynamiske billeddannelse fortsætter med analysen af en eksperimentel brønd ad gangen.
6. Phagocytosis assay, dynamisk billeddannelse, Dag 3
- Tænd for billedsystemet og computeren. Dobbeltklik for at åbne softwaren. Vælg Pro-programtilstanden.
- Kontroller sceneområdet for at sikre, at der ikke er nogen prøver til stede, og intet hindrer scenens bevægelse. Klik derefter på Kalir nu.
- Markér afkrydsningsfeltet ud for H Unit XL under inkubationsmenuen til højre og sæt det til 37 °C.
BEMÆRK: Vent, indtil det inkuberede stadium næsten er til temperaturen, før prøverne forberedes til billeddannelse. - Skyl den første forsøgstrønde med 750 μL billedmedium, og udskift den med 400 μL af den zymosiske partikelaffjedring, der er udarbejdet i punkt 5.2. Lad de resterende brønde stå i vækstmediet.
BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at hvirvle og sonikere partikelaffjedringen igen kortvarigt, hvis den har lagt sig i mere end 15 min. - Placer diaset på billedsystemets inkuberede fase. Indstil en timer til 10 min.
- Brug billedsoftwaren, vælg Brightfield under fanen Find, og klik derefter på okularikonet i systemkonfigurationsvinduet nedenfor. Med 10x målet på plads, skal du bruge okularet og fokus drejeknap til at fokusere på cellerne.
- Vælg fanen Anskaffelse, brug rullemenuen Eksperiment, og vælg derefter et sæt bølgelængder, der indeholder EGFP-filtersæt til at rumme 509 nm excitation 533 nm emissionsbølgelængder for det pH-følsomme farvestof.
- Når der er ~ 2 min tilbage på timeren, skal du bruge softwaren til at ændre målet til 20x ved at klikke på 20x ikonet i målmenuen.
- Klik på menuen Kanaler, vælg EGFP-filtre, og brug menuen Eksponering til at indstille eksponeringstiden til 400 ms til at registrere den pH-følsomme grønne fluorophore, når den er omsluttet af fagesomaet.
- Klik på Live og justere fokus ved hjælp af fokus drejeknap.
- Klik på Stop for at slukke lyset og markere afkrydsningsfeltet ud for den eksperimentelle indstilling Time-lapse øverst.
- Vælg Autofokuspå Software i menuen Fokuseringsstrategi . Vælg Smarte og grove indstillinger på rullelisten i menuen Autofokus for at reducere eksponeringstiden for lys, mens autofokus kører.
- I menuen Time-Lapse skal du angive det ønskede antal anskaffelser til 30-60 og intervaltiden til 1 min.
- Når time-lapse parametre er indstillet, og efter 10 min tilsætning af partikler til den første brønd, skal du klikke på knappen Start Eksperiment for at begynde erhvervelse.
- Når erhvervelsen er færdig ved hjælp af den første eksperimentelle brønd, gentages trin 6.4-6.12 for hver af de resterende eksperimentelle brønde.
- Gem alle eksperimentfilerne med datoen og parametrene i titlen i den relevante mappe.
- Luk softwaren. Åbn softwaren igen i behandlingstilstand, og eksporter filerne i MP4-format ved hjælp af menuen Eksporter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter beregning af middelværdi ± SEM for hver gruppe på alle tidspunkter, præsenteres dataene i linjegrafformat med Y-aksen som relativ fluorescerende intensitet og X-aksen som Tid. Supplerende fil 1 giver et eksempel på rådata fra en kinetisk læsning af 96-brøndspladen i regnearksformat.
I denne undersøgelse viser de optimale resultater i figur 3Aog tabel 3, at 1) samkultur med MSC forbedrer makrofagets fagocytiske aktivitet, 2) IFN-y-behandling reducerer makrofagets aktivitet, og 3) samkultur med MSC redder delvist MΦ-phagocytisk aktivitet. Optimale celletætheder er kritiske i disse undersøgelser, og når MΦ er for for lavt af en densitet, kan ændringer i fluorescensintensiteten ikke påvises (Figur 3B). Figur 3C repræsenterer data fra en undersøgelse, hvor MΦ blev for for højt af densitet, og fluorescensintensiteten er forhøjet hurtigt i alle grupper, og forskelle kan ikke skelnes. De dynamiske billeddanner bekræfter, at de fluorescerende intensitetsændringer skyldes fagocytose og ikke forsuring af mediet. De indeholder også kvalitative data og en visuel repræsentation af hastigheden og omfanget af fagocytisk aktivitet (figur 4).
Figur 1: En illustration, der skildrer det centrale spørgsmål om de fremlagte data, som er "Kan MSC genvinde den fagocytiske aktivitet i IFN-γ behandlede MΦ?". Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Oversigt over arbejdsgangen for co-culture og fagocytoseanalyse. En skitse af arbejdsgangen for kvantitativ og kvalitativ analyse af MΦ fagocytose aktivitet i samkultur med MSC. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentative kvantitative data fra de kinetiske læsedata, der giver optimale og suboptimale resultater. I (A) er data repræsentative for et eksperiment med optimal MΦ-celletæthed, i(B)data er repræsentative for et eksperiment med suboptimal for lav MΦ-celletæthed, og i (C) er data repræsentative for et eksperiment med suboptimal for høj MΦ-celletæthed. Den relative fluorescensintensitet målt i relative fluorescerende enheder (RFU) afbildes på Y-aksen, mens tiden afbildes på X-aksen. Bemærk forskellene i RFU-området blandt optimale og suboptimale eksperimenter. I A, MSC delvist redde MΦ fagocytisk aktivitet i indstillingen af IFN-γ undertrykkelse over en 70 min periode. RFU præsenteres som middel ± SEM, n = 6. Analysen blev udført ved hjælp af Tukeys multiple sammenligningstest efter en signifikant tovejs ANOVA, Interaktionseffekt P = 0,0001, Tidseffekt P = 0,0001 og Behandling /MSC-effekt P = 0,0001. Symboler angiver resultater af flere sammenligningstest. * = signifikant forskel mellem MSC/MΦ + IFN- γ vs. MΦ + IFN-γ, Ŧ = signifikant forskel mellem MΦ vs. MΦ + IFN-γ og † = signifikant forskel mellem MSC/MΦ vs. MΦ. Se tabel 3 for detaljerede resultater af de mange sammenligningstest. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Dynamiske billedvideoer, der giver visuel bekræftelse af den cellespecifikke stigning i fluorescens fra sur aktivering af mærkede zymosanske partikler efter inkorporering i MΦ-fagesomaet. Time-lapse indstillinger blev erhvervelse hver 1 minut over en 30 min periode ved hjælp af en eksponeringstid på 400 ms og EGFP filter sæt. (A) MΦ i monokultur, (B) MΦ i samkultur med MSC, (C) MΦ behandlet med IFN-γ (250 ng/mL) og (D) MΦ behandlet med IFN-γ (250 ng/mL) i samkultur med MSC. Klik her for at downloade denne fil.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| En | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| B | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| C | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| D | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| E | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| F | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| G | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| H | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL |
Tabel 1: Eksempel på et 96-brønds pladedesign. CBL - Celle tom; MSC - seedet dag 1; MΦ+ behandlet og MΦ ubehandlet seedet dag 2; RBL reagens blank tilsat på assay dag 3.
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ |
Tabel 2: Eksempel på et 4-brønds kammer slide design. MSC - forgyldt dag 1; MΦ+ behandlet og MΦ ubehandlet forgyldt dag 2.
| Tukeys test af flere sammenligninger | Mean Diff. | 95,00% CI af diff. | Under tærsklen? | Resumé | Justeret P-værdi |
| 0 minutter | |||||
| MSC/MΦ mod MΦ | -3871 | -9495 til 1754 | Nej | Ns | 0.2836 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 720.3 | -4904 til 6345 | Nej | Ns | 0.9873 |
| MΦ mod MΦ + IFN-γ | -77.17 | -5702 til 5548 | Nej | Ns | >0.9999 |
| 10 minutter | |||||
| MSC/MΦ mod MΦ | -3466 | -9091 til 2159 | Nej | Ns | 0.3817 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 2326 | -3299 til 7950 | Nej | Ns | 0.7062 |
| MΦ mod MΦ + IFN-γ | 992 | -4633 til 6617 | Nej | Ns | 0.968 |
| 20 minutter | |||||
| MSC/MΦ mod MΦ | -1311 | -6936 til 4314 | Nej | Ns | 0.9303 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 3315 | -2310 til 8940 | Nej | Ns | 0.422 |
| MΦ mod MΦ + IFN-γ | 3146 | -2478 til 8771 | Nej | Ns | 0.4689 |
| 30 minutter | |||||
| MSC/MΦ mod MΦ | 384.8 | -5240 til 6010 | Nej | Ns | 0.998 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 2313 | -3312 til 7937 | Nej | Ns | 0.7098 |
| MΦ mod MΦ + IFN-γ | 8726 | 3101 til 14350 | Ja | *** | 0.0005 |
| 40 minutter | |||||
| MSC/MΦ mod MΦ | 2247 | -3377 til 7872 | Nej | Ns | 0.7278 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 4913 | -712,2 til 10537 | Nej | Ns | 0.1101 |
| MΦ mod MΦ + IFN-γ | 16521 | 10896 til 22145 | Ja | **** | <0.0001 |
| 50 minutter | |||||
| MSC/MΦ mod MΦ | 5657 | 32.12 til 11282 | Ja | * | 0.0481 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 4932 | -692,9 til 10557 | Nej | Ns | 0.1079 |
| MΦ mod MΦ + IFN-γ | 19083 | 13458 til 24708 | Ja | **** | <0.0001 |
| 60 minutter | |||||
| MSC/MΦ mod MΦ | 12376 | 6752 til 18001 | Ja | **** | <0.0001 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 9361 | 3736 til 14986 | Ja | *** | 0.0002 |
| MΦ mod MΦ + IFN-γ | 24748 | 19123 til 30373 | Ja | **** | <0.0001 |
| 70 minutter | |||||
| MSC/MΦ mod MΦ | 13770 | 8145 til 19395 | Ja | **** | <0.0001 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 11987 | 6362 til 17612 | Ja | **** | <0.0001 |
| MΦ mod MΦ + IFN-γ | 27264 | 21639 til 32888 | Ja | **** | <0.0001 |
Tabel 3: Detaljeret statistisk analyse af de data, der er fremlagt i figur 3A. Resultaterne af Tukeys flere sammenligningstests efter en betydelig tovejs ANOVA af data, der præsenteres i figur 3A.
Supplerende fil 1: En repræsentativ regnearksfil med rå kinetiske data fra et optimalt eksperiment. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analyse af fagocytose ved hjælp af biopartikler, der er konjugeret til et pH-følsomt farvestof, er et relativt nyt værktøj , der har vist sig fordelagtigt i forhold til traditionelle fluorescerende mærkede partikler12,19,20. Med traditionelle fluorescerende partikler er kun slutpunktsanalyse mulig. Detektionen sker med fluorescerende mikroskopi og/eller spektrofluorometri efter vask eller afkøling af partikler, der ikke er taget op af fagocytten. Kvantitative data fra spektrofluorometri har potentiale til at detektere ikke-opslugte partikler, og billedanalyse til kun at kvantificere intracellulære partikler er kedelige og tidskrævende ved hjælp af traditionelle fluorescerende mikroskopisystemer14. Biopartikler, der kun er konjugeret til pH-følsomme farvestoffer, fluorescerer i et surt miljø som fagolysomaet, og derfor er de kedelige vaske- og slukningstrin unødvendige14. Derudover giver pH-følsomme mærkede biopartikler den fordel, at de leverer kinetiske data, som ikke let ville blive erhvervet med FITC eller andre fluorophore-konjugerede biopartikler.
Undersøgelser ved hjælp af dette nye værktøj har anvendt flowcytometri - og/eller billeddannelsesplatforme til at generere en kvantitativ og kinetisk måling af fagocytaktivitet19,20,21. Flowcytometri er fordelagtigt, hvis der er en begrænset fagocytpopulation, eller hvis man er interesseret i at sortere til downstream-analyser som genetiske skærme19. MSC er kendt for at regulere MΦ fænotypen gennem både direkte kontakt og gennem opløselige faktorer. Foreløbige undersøgelser har vist, at konditioneret medium fra MSC undertrykt MΦ fagocytose, og derfor, denne protokol var designet til at bestemme ændringerne i MΦ fagocytisk aktivitet, mens i direkte co-kultur med MSC. Under disse forhold er spektrofluorometri for at kvantificere og dynamisk billeddannelse for at visualisere og bekræfte fagocytisk aktivitet mest passende.
Afgørende for succesen af disse metoder er optimering af celletætheder. MSC skal belagt med en tæthed, der giver mulighed for optimal cellekontakt med MΦ-cellerne. MΦ skal sås i mono- og co-kulturer med en tæthed, der ikke kun giver mulighed for optimal kontakt, men også giver mulighed for optimal fluorescensdetektering. For lav af en massefylde vil resultere i lav inkorporering i fagoclysomet og små eller flade ændringer i relative fluorescerende enheder (figur 3B). Hvis MΦ er seedet ved for høj densitet, øges fagocytose hurtigt, og påvisning af forskelle mellem grupper maskeres (Figur 3C). Optimering af koncentrationen af pH-følsomt farvestof mærket zymosanpartikler pr. cellenummer er også kritisk. Indledende forsøg bør udføres for at optimere celletætheden i MSC og MΦ og antallet af partikler pr. MΦ-celle. Derudover bør disse optimeringstrin tages, hvis der anvendes andre mærkede biopartikler, såsom E. coli eller S. aureus.
Det relevante billedmedie er også kritisk. Mediet til begge metoder skal være et buffermedie og må ikke indeholde phenolrødt. Phenol rød vil slå påvisning af fluorescerende emission. Også ethvert tilsætningsstof eller tilstand, der kan forsuring af mediet, vil for tidligt aktivere de mærkede partikler og introducere forhøjet baggrund. Reagens blank er afgørende for at identificere den potentielle forsuring af mediet.
Ikke alene kan disse protokoller bruges til at undersøge MSC regulering af MΦ fagocytose af en række pH-følsomme biopartikler, men metoden kan også anvendes på en række samkulturelle modeller, der omfatter neutrofiler og andre fagocytter. Derudover kan molekyler og veje, der mistænkes for at være involveret i cellekontaktmedieret regulering af makrofaglig fagocytisk aktivitet, undersøges via siRNA eller CRISPR medieret nedregulering for at validere eller tilbagevise formodede molekylære mål. Potentielle mål omfatter vedhæftning molekyler, fagoccytiske receptorer, og integrin molekyler.
Arbejde ved hjælp af disse metoder vil afdække nye oplysninger om de signalmekanismer, der ligger til grund for de øgede fagocytiske reaktioner fra MΦ efter cellekontaktinteraktioner med MSC, og derved fremme vores forståelse af den rolle, MSC spiller i reguleringen af medfødt immunitet. Undersøgelser som disse omhandler et understudiet område og vil give et fuldstændigt billede af den indflydelse, MSC har på makrofagaktivitet, hvilket er nødvendigt for en fuld forståelse af deres rolle i immunitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NSF's mekanisme for større forskningsinstrumenter under tilskudsnumre 1626093 og 1919583.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Black Polystyrene Microplate | MilliporeSigma | CLS3603-48EA | |
| 0.4% trypan blue solution | MilliporeSigma | T8154-20ML | |
| 15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 339653 | |
| 4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | ThermoFisher | 155382PK | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco | ThermoFisher | 15240096 | |
| Axiobserver 7 Imaging System | Zeiss | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MilliporeSigma | A8806-1G | |
| Cell lifter | MilliporeSigma | CLS3008-100EA | |
| Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75 cm2, canted neck, with cap, filtered | MilliporeSigma | C7231-120EA | |
| D1 ORL UVA [D1] | ATCC | CRL-12424 | Mouse MSC Cell Line |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Hemocytometer | FisherScientific | 02-671-51B | |
| I-11.15 | ATCC | CRL-2470 | Mouse MΦ Cell Line |
| LADMAC Cell Line | ATCC | CRL-2420 | LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1). |
| Live-Cell Imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010031 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate | ThermoFisher | P35365 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Preprotech | 315-05 | |
| Spectramax i3X | Molecular Devices | ||
| Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 µm | ThermoFisher | 568-0020 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 micrometer | ThermoFisher | 723-2520 | |
| Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm | MilliporeSigma | CLS430167-100EA | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher | 25300054 |
References
- Phinney, D. G., Prockop, D. J. Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair--current views. Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).
- Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation. Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).
- Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease. Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).
- Giuliani, M., et al. Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation. PLoS One. 6 (5), 19988 (2011).
- Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells. Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).
- Luz-Crawford, P., et al. Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (3), 65 (2013).
- Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), 10088 (2010).
- Nemeth, K., et al. marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).
- Maggini, J., et al. Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile. PLoS One. 5 (2), 9252 (2010).
- Takizawa, N., et al. marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture. Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).
- Kim, J., Hematti, P. Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages. Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).
- Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 56 (2015).
- Cho, D. I., et al. Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages. Experimental Molecular Medicine. 46, 70 (2014).
- Fernandez, N., et al. Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response. Stem Cells International. 2017, 5846257 (2017).
- Jackson, M. V., et al. Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS. Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).
- Chaplin, D. D. Overview of the immune response. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), Suppl 2 3-23 (2010).
- Lim, J., et al. Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages. Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).
- Wang, Z., et al. Interferon-γ inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway. Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).
- Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts. Biotechniques. 68, 245-250 (2020).
- Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
- Takahashi, D., et al. Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE. Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).
