Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd om dynamische beelden van mesenchymale stamcel (MSC) gemedieerde regulatie van macrofaag (MΦ) fagocytose van niet-opsonized gist (zymosan) deeltjes die zijn geconjugeerd aan een pH-gevoelig fluorescerend molecuul te kwantificeren en te produceren.
Abstract
Mesenchymale stamcellen (MSC) zijn traditioneel bestudeerd voor hun regeneratieve eigenschappen, maar meer recentelijk hebben hun immunoregulerende kenmerken op de voorgrond gestaan. Ze interageren met en reguleren de activiteit van immuuncellen. De focus van deze studie ligt op de MSC-regulatie van macrofaag fagocytische activiteit. Macrofaag (MΦ) fagocytose is een belangrijk onderdeel van de aangeboren reactie van het immuunsysteem op infectie, en de mechanismen waarmee MSC deze respons moduleert, worden actief onderzocht. Hier wordt een methode gepresenteerd om MΦ-fagocytose van niet-opsonized zymosan-deeltjes geconjugeerd aan een pH-gevoelig fluorescerend molecuul te bestuderen terwijl ze in co-cultuur met MSC zijn. Naarmate de fagocytische activiteit toeneemt en de gelabelde zymosandeeltjes worden ingesloten in de zure omgeving van het fagolysosoom, neemt de fluorescentie-intensiteit van het pH-gevoelige molecuul toe. Met de juiste excitatie- en emissiegolflengten wordt fagocytische activiteit gemeten met behulp van een fluorescerende spectrofotometer en worden kinetische gegevens gepresenteerd als veranderingen in relatieve fluorescerende eenheden gedurende een periode van 70 minuten. Om deze kwantitatieve gegevens te ondersteunen, wordt de verandering in de fagocytische activiteit gevisualiseerd met behulp van dynamische beeldvorming. Resultaten met behulp van deze methode tonen aan dat MSC in co-cultuur MΦ fagocytose van niet-opsonized zymosan van zowel naïeve als IFN-γ behandelde MΦ verbetert. Deze gegevens dragen bij aan de huidige kennis van MSC-regulatie van het aangeboren immuunsysteem. Deze methode kan worden toegepast in toekomstig onderzoek om de onderliggende cellulaire en moleculaire mechanismen volledig af te bakenen.
Introduction
Mesenchymale stamcellen (MSC) zijn voorlopercellen die aanleiding geven tot bindweefselcellen. MSC zijn aanwezig in volwassen zoogdierweefsels en kunnen worden geïsoleerd uit het beenmerg1. Vanwege hun immunomodulerende eigenschappen worden deze cellen op grote schaal bestudeerd2. Vroege studies richtten zich op MSC-regulatie van T-cellen3,4,5,6, maar meer recent heeft hun regulatie van macrofaagcellen (MΦ), een belangrijke cellulaire component van aangeboren immuniteit, meer aandacht gekregen7,8,9,10,11,12,13,14 . Het belang van MSC-MΦ-interactie bij de behandeling van ontstekingsziekten wordt onderstreept door het feit dat uitputting van monocyten / macrofagen de therapeutische effecten van MSC in diermodellenopheft 8. Hier ligt de focus op de celcontactinteractie van de MSC met MΦ. MSC heeft de capaciteit om het fenotype van MΦ te reguleren door de overgang van inflammatoire naar ontstekingsremmende reacties te bevorderen, wat leidt tot weefselherstelactiviteiten8,9,10,11,en er is veel gedaan om deze regulerende mechanismen aan te tonen. Onder andere omstandigheden kan MSC een door MΦ aangedreven ontstekingsreactie12, 13 ondersteunen of verergeren en de fagocytische activiteit van MΦverbeteren 14,15. Er is echter een kritiek gebrek aan bestaande gegevens die de mechanismen identificeren waarbij en de omstandigheden waaronder MSC de fagocytische activiteit van MΦ reguleert.
MΦ hebben families van receptoren die ofwel opsonized (antilichaam of complement gecoat) of niet-opsonized pathogenen herkennen die leiden tot fagocytose16. De activering en activiteit van de laatste is minder goed bestudeerd17. In een niet-inflammatoire in vitro omgeving verbetert MSC MΦ fagocytose van niet-opsonized pathogenen13. Herkenning van niet-opsonized pathogenen door MΦ kan echter worden verminderd na blootstelling aan een inflammatoire omgeving geproduceerd door lymfocyten tijdens een adaptieve immuunrespons. IFN-γ, vrijgegeven door natural killer cellen en effector lymfocyten, heeft een remmend effect op MΦ fagocytose van niet-opsonized deeltjes18. Een co-cultuurmodel werd ontwikkeld om de mechanismen van MSC directe contactregulatie van MΦ fagocytose te bestuderen. Het doel van het hier gepresenteerde experiment is om te bepalen of MSC MΦ fagocytose van niet-opsonized pathogenen reguleert nadat MΦ zijn blootgesteld aan IFN-γ (Figuur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Alle mediumvoorbereidings- en celkweektechnieken worden uitgevoerd onder aseptische omstandigheden met behulp van een bioveiligheidskast met laminaire stroming. Alle beschreven kweekincubatiestappen worden uitgevoerd met behulp van een incubator die is ontworpen om een atmosfeer van 37 °C, 5% CO2en 95% vochtigheid te handhaven.
1. Celkweek
- Bereiding van groeimedium
- Voeg voor MSC en LADMAC 50 ml FBS en 5 ml 100x antibioticum / antimycotisch mengsel toe aan 500 ml dmem met hoge glucose.
- Voeg voor de MΦ 50 ml FBS, 100 ml LADMAC-conditiemedium (bereid volgens de stappen van sectie 1.2) en 5 ml 100x antibioticamix toe aan 500 ml dmem met hoge glucose.
OPMERKING: LADMAC-cellen produceren koloniestimulerende factor (CSF-1) die nodig is om de groei van de MΦ-cellen te ondersteunen.
- Bereiding van LADMAC geconditioneerd medium
- Om LADMAC-cellen uit bevroren voorraad te zaaien, voegt u 19 ml groeimedium uit sectie 1.1 toe aan elk van de vijf met 2 cellen met 2 cellen met 2 cellenmet 2 cellen behandelde T75 cm-kolven en plaatst u deze gedurende 15 minuten in de celkweekincubator om te balanceren tot 37 °C.
- Ontdooi ondertussen snel een aliquot van 106 bevroren cellen door te broeden in een waterbad van 37 °C gedurende 2-3 minuten of totdat het ontdooid is. Voeg de cellen toe aan 9 ml vers MSC-groeimedium in een steriele conische buis van 15 ml of 50 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 125 x g in een zwenkbakrotor.
- Aspirateer of decanteer het supernatant, voeg 5 ml vers groeimedium toe en pipetteer voorzichtig op en neer om de celkorrel te resuspenderen.
- Voeg met een steriele serologische pipet 1 ml van de celsuspensie toe aan elk van de vijf T75 cm2 kolven en plaats ze in de celkweekincubator.
- Voeg elke 2-3 dagen een extra 10 ml medium toe gedurende een periode van 7-10 dagen. Verzamel vervolgens de cellen en het supernatant in steriele conische buizen van 50 ml met behulp van een steriele serologische pipet en centrifugeer bij 125 x g gedurende 5 minuten.
- Scheid het supernatant van de celkorrel en filter het supernatant steriel met behulp van een steriele vacuümfiltereenheid voor eenmalig gebruik van 0,2 μm.
- Verwijder de aspirator uit de verpakking en sluit deze met behulp van vacuümbuizen aan op de aspiratorpomp. Giet het supernatant in het bovenste compartiment en plaats de hoes. Zet de aspiratorpomp aan om in het onderste compartiment te filteren.
- Bereid aliquots door te pipetteren in steriele conische buisjes van 50 ml en bewaar bij -20 °C.
- Om de celkorrel in te vriezen, resuspend in vriesmedium bij 106 cellen / ml, plaats ze in een vriescontainer en plaats ze vervolgens in een vriezer van -80 °C. Breng na 24 uur over naar LN2-opslag.
- Cellen vermeerderen ter voorbereiding op co-kweek
- Om MSC- en MΦ-cellen uit de ingevroren voorraad te zaaien, moet u 9 ml geschikt groeimedium, bereid in sectie 1.1, in elk van de vier met 100 mm celkweek behandelde schotels voor elk celtype in evenwicht brengen en gedurende 15 minuten in de celkweekincubator plaatsen.
- Ontdooi ondertussen snel de aliquots van 106 bevroren cellen door ze te incuberen in een waterbad van 37 °C gedurende 2-3 minuten of tot ze net ontdooid zijn. Voeg vervolgens de ontdooide MSC-cellen toe aan 9 ml vers MSC-groeimedium en voeg de ontdooide MΦ-cellen toe aan 9 ml vers MΦ-groeimedium in steriele conische buizen van 15 of 50 ml en centrifugeer 125 x g in zwenkbakrotor gedurende 5 minuten.
- Aspirateer of decanteer het supernatant en resuspend elke pellet in 4 ml van het geschikte verse groeimedium door voorzichtig op en neer te pipetteren. Voeg 1 ml van de celsuspensie toe aan elk van de vier 100 mm schotels voor elk celtype die in stap 1.3.1 in evenwicht zijn gebracht.
- Breng de gerechten met cellen terug naar de couveuse. Vervang het medium elke 2-3 dagen tot 70%-80% confluent.
2. Zaad MSC in experimentele gerechten, dag 1
OPMERKING: Ontwerp voordat u de MSC zaait de experimentele 96-well plaatlay-out voor fluorescerende spectrofotometrie en de kamerdia voor dynamische beeldvorming. Flankeer voor de 96-putplaat experimentele putten met putjes die cellen bevatten, maar gebruik ze niet in de test. Markeer ten minste vier putjes die moeten worden gebruikt voor het reagens blanco (RBL). Zie tabel 1 voor een voorbeeldsjabloon met 96 putten en tabel 2 voor een voorbeeld van een diasjabloon met 4 putten. Zwarte of witte 96-well platen met heldere bodems worden aanbevolen. Een borosilicaatglaskamerschuif van 1,5 mm is optimaal, maar het aantal kamers kan afhankelijk van de onderzoeksopzet worden aangepast. Een samenvattend stroomdiagram van de volgende methoden is opgenomen in figuur 2.
- Bij 70%-80% confluency, aspirateer het groeimedium uit de culturen in 100 mm schotels en voeg 5 ml PBS toe om de MSC te isoleren.
- Aspirateer de PBS, voeg 2 ml 0,05% trypsine/EDTA toe en plaats deze gedurende 3-5 minuten in de kweekincubator.
- Controleer na 3 minuten de celdetachement met behulp van een omgekeerde microscoop. Als de cellen zijn losgemaakt, gaat u verder met de volgende stap; zo niet, ga dan nog 1-2 minuten door met incubatie. Niet langer dan 5-6 min incuberen.
- Voeg 5 ml vers groeimedium toe aan de schaal met de losgemaakte cellen. Spoel de schaal af met het trypsine/medium mengsel en verzamel cellen in een schone, steriele conische buis van 50 ml met behulp van een steriele serologische pipet.
- Centrifugeer gedurende 5 min bij 125 x g. Adem het supernatant op en resuspend de celkorrel in 10 ml vers groeimedium door voorzichtig op en neer te pipetteren.
- Om de cellen te tellen, voegt u 10 μL van de celsuspensie toe aan 30 μL van 0,4% trypan blauwe oplossing in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Pipetteer vervolgens 10 μL van het mengsel onder de deksellip van een hemocytometertelkamer.
- Tel met behulp van een omgekeerde of heldere veldmicroscoop, met het 10x objectief, de onbevlekte (levensvatbare) cellen in vier van de 1 mm2 vierkanten. Bereken het celgetal met behulp van de formule: cellen/ml = celtelling/# 1 mm2 kwadraten x verdunningsfactor x 104.
OPMERKING: Voor dit voorbeeld is het aantal getelde 1 mm2 vierkanten vier en de verdunningsfactor 4. - Gebruik de vergelijking C1V1 = C2V2 om een suspensie van 1 x 105 cellen/ml te berekenen en voor te bereiden. Bereid 1 ml cel/ml suspensie voor elke kolom van de 96-putplaat die moet worden gevuld en 0,75 ml voor elke kamer van de 4-putkamerschuif die moet worden gevuld volgens het plaatontwerp.
OPMERKING: C1 = celgetal, V1 = wat wordt berekend, C2 = 1 x 105, V2 = 5,50 ml. - Bepaal V1, trek het af van de gewenste 5,50 ml van het totale volume om het volume van het verse medium te bepalen dat nodig is om de suspensie te bereiden. Voeg het volume cellen (V1) van de oorspronkelijke suspensie toe aan het volume vers medium voor een totaal van 5,50 ml met 1 x 105 cellen / ml.
- Voeg 100 μL van 1 x 105 cel / ml suspensie toe aan elke put van de 96-putplaat volgens het plaatontwerp met behulp van een meerkanaals micropipettor en 530 μL aan elk van de putten van de kamerschuif met behulp van een micropipette volgens het plaatontwerp. Incubeer 's nachts.
OPMERKING: Voor dit experiment zijn MSC verguld in kolommen 1, 2, 3 en 6 van de 96-putplaat (tabel 1) en putten 1 en 2 van de 4-putkamerschuif (tabel 2). Daarom wordt ten minste 5,50 ml van een suspensie van 1 x10 5 cellen / ml bereid. MΦ bij 80% confluentie worden behandeld met ontstekingsmediatoren op dezelfde dag dat de MSC in de experimentele platen worden gezaaid.
3. Activeer de MΦ met IFN-γ, dag 1
- Bereid het activeringsmedium en IFN-γ voorraad voor.
- Voeg voor 200 ml activeringsmedium 40 mg BSA toe aan 200 ml serumvrije dmem met hoge glucose en steriel filter met behulp van een steriele vacuümfiltereenheid voor eenmalig gebruik van 0,2 μm.
- Om 0,1% BSA/PBS te bereiden, voegt u 20 mg BSA toe aan 20 ml PBS. Vortex om op te lossen. Gebruik een steriel spuitfilter van 0,2 μm om in een schone, steriele conische buis van 50 ml te filteren.
- Voeg 1 ml van de steriele 0,1% BSA/PBS-oplossing toe aan 100 μg gelyofiliseerde IFN-γ om een voorraadoplossing van 100 μg/ml te bereiken. Bewaren in 50 μL aliquots bij -20 °C.
- Activeer de MΦ met IFN-γ
- Voeg 2,5 μL van 100 μg/ml IFN-γ voorraad toe voor elke 1 ml van het benodigde medium. Bereid voor elke 100 mm schotel die moet worden geactiveerd 10 ml activeringsmedium met IFN-γ in een concentratie van 250 ng / ml.
- Aspirateer het groeimedium uit de MΦ culturen en vervang het door 5 ml van het activeringsmedium zonder IFN-γ om te spoelen.
- Aspirateer het medium dat wordt gebruikt voor het spoelen en vervang het door 10 ml IFN-γ aangevuld activeringsmedium voor de experimentele schotel en door 10 ml niet-aangevuld activeringsmedium voor de controle. Incubeer de culturen gedurende 16-24 uur.
4. Isoleer de MΦ en bereid de co-culturen voor, Dag 2
- Verwijder het activeringsmedium uit de MΦ-cellen en vervang het door 5 ml vers groeimedium. Schraap voorzichtig met een cellifter en verzamel de cellen in een conische buis van 50 ml.
- Tel de cellen met behulp van trypan blauwe uitsluiting en hemocytometrie zoals beschreven voor MSC in stap 2.6-2.7.
- Bereid met behulp van de vergelijking in stappen 2.8-2.9 twee afzonderlijke suspensies van 2 x10 5 cellen / ml, één met cellen uit de controle en één met cellen uit de behandelde MΦ-culturen.
OPMERKING: Bereid 1 ml cel/ml suspensie voor elke kolom van de 96-putplaat die moet worden gevuld en 0,75 ml voor elke kamer van de 4-putkamerschuif die moet worden gevuld volgens het plaatontwerp. - Aspirateer het medium voorzichtig uit de experimentele putten van de 96-putplaat met MSC. Voeg met behulp van een meerkanaals micropipette 100 μL van de behandelde en de controle MΦ-celsuspensies toe in de juiste experimentele putten met en zonder MSC volgens het plaatontwerp. Incubeer 's nachts.
- Adem het medium voorzichtig op uit de 4-putkamerschuif met MSC en voeg met behulp van een micropipette 530 μL MΦ-celsuspensie toe aan de juiste putten volgens het ontwerp. Incubeer 's nachts.
5. Fagocytosetest, kinetische fluorescerende 96-well plaat afgelezen, dag 3
- Stel de testparameters in
- Zet op de dag van de test de fluorescerende plaatlezer aan en stel de temperatuur op het systeem in op 37 °C.
- Open de System Pro-software en controleer het instrumentpictogram in de linkerbovenhoek om te bepalen of het instrument op de computer is aangesloten. Als de rode cirkel met een lijn zichtbaar is, klikt u op het instrumentpictogram en kiest u het instrument in het pop-upvenster om de verbinding te maken.
- Selecteer Nieuw experiment om het pop-upvenster Plate Set-Up Helper te openen. Selecteer in het menu Plate Set-Up Helper de optie Uw acquisitie-instellingen configureren.
- Selecteer Monochromator in het instellingenmenu voor de optische configuratie. Selecteer FL (fluorescentie) voor de leesmodus en Kinetic voor het leestype.
- Klik in hetzelfde configuratievenster onder Categorieop Golflengten en stel vervolgens bandbreedtesin op 9 nm voor excitatie en 15 nm voor emissie.
- Stel het aantal golflengteparen in op 1. Stel de golflengten LM1 in op 510 nm voor excitatie en op 540 nm voor emissie.
- Ga verder met de categorieën en selecteer Vervolgens Plaattype. Selecteer de optie die overeenkomt met het type plaat dat wordt gebruikt.
OPMERKING: Het is belangrijk dat de selectie overeenkomt met het type plaat. De leeshoogtes worden door het systeem ingesteld op basis van de selectie. - Selecteer vervolgens Leesgebied en markeer het gebied van de 96-putplaat die is opgenomen in het experimentele ontwerp.
- Selecteer PMT en Optica,stel PMT Gain in op Hoog en Flashes per read op 6. Vink het vakje naast Lezen vanaf onder aan aan als u een doorzichtige bodemplaat gebruikt.
- Selecteer Timing en stel in op intervallen van 10 minuten over een periode van 70 minuten.
- Selecteer Schudden, schakel het selectievakje Voor eerste lezing in en stel in op 5 s. Vink het vakje Tussen leest aan en stel in op 3 s. Stel de schudintensiteit in voor zowel Laag als Lineair.
- Sluit het venster. Wanneer het venster Plate Set-Up Helper verschijnt, selecteert u Uw plaatlay-out configureren. Markeer de BL-putten van het plaatontwerp en klik op Plate Blank.
- Markeer elk van de experimentele rijen, klik op Toevoegen,geef de groep een naam en selecteer een kleur.
- Selecteer onder Toewijzingsopties onder het plaatontwerp de optie Serieen definieer vervolgens de reeks in het venster en klik op OK. Herhaal dit voor elke groep.
- Bereid de zymosan suspensie
- Terwijl u wacht tot de systeemtemperatuur 37 °C bereikt, resuspendeert u 1 mg zymosandeeltjes in 5 ml van het levende-celbeeldvormingsmedium.
- Voeg 1 ml levendcellig beeldmedium toe aan de injectieflacon met de deeltjes en verzamel ze in een glazen kweekbuis. Spoel de injectieflacon af met een extra beeldoplossing van 1 ml en breng deze over naar dezelfde glazen buis om ervoor te zorgen dat alle deeltjes worden overgebracht. Voeg 3 ml extra beeldoplossing toe om een deeltjessuspensie van 0,2 mg/ml te bereiken.
- Vortex met snelle pulsen voor 30-60 s. Gebruik vervolgens een sonde sonicator om sonica te soniceren met 60 snelle pulsen.
OPMERKING: Het is erg belangrijk om een homogene suspensie van deeltjes te creëren en de suspensie niet te lang te laten zitten voordat deze aan de experimentele putten wordt toegevoegd. Het klonteren komt snel terug. Het deeltje per celdichtheid moet mogelijk worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de bron, behandeling en dichtheid van de gebruikte MΦ. In de gepresenteerde studies werden geconjugeerde zymosandeeltjes gebruikt. Geconjugeerde E. coli en S. aureus zijn echter ook beschikbaar.
- Terwijl u wacht tot de systeemtemperatuur 37 °C bereikt, resuspendeert u 1 mg zymosandeeltjes in 5 ml van het levende-celbeeldvormingsmedium.
- Voeg zymosan toe en lees de plaat
- Aspiraleer het medium uit de experimentele putten en spoel 1x met 100 μL van de live-cell imaging oplossing. Spoel de RBL-putten ook af met de live-cell imaging-oplossing.
- Spirateer de live-cell imaging-oplossing uit experimentele en RBL-putten en vervang deze door 100 μL van de suspensie van het zymosandeeltje, bereid in sectie 5.2.
- Open de plaatlade van de fluorescerende lezer met behulp van de touchpad-interface. Zet de plaat, zonder deksel, in het bakje met de A1 goed in de linkerbovenhoek. Sluit de lade met behulp van het touchpad en klik op de groene knop Lezen in het bovenste menu.
- Wanneer het lezen is voltooid, slaat u het bestand op in de juiste map en exporteert u de gegevens in een spreadsheetindeling door op Bestand te klikken en Exporterente selecteren .
- Bereken de gemiddelde ± sem relatieve fluorescentie voor elke replicatiegroep op elk tijdstip (10 min, 20 min, 30 min, enz.) in de spreadsheet(aanvullend bestand 1)en breng de gegevens over naar grafische software.
- Gebruik een lijngrafiekformaat om de gegevens te presenteren en pas tweerichtings-ANOVA (Time x Treatment/MSC als factoren) toe, gevolgd door tukey's meervoudige vergelijkingstest om verschillen tussen individuele groepen te bepalen.
OPMERKING: Terwijl de 96-well plaat wordt afgelezen, bereidt u de dynamische beeldvormingsplaat voor op time-lapse beeldacquisitie. Zorg ervoor dat de dynamische beeldvorming verloopt met de analyse van één experimentele put tegelijk.
6. Fagocytose assay, dynamische beeldvorming, dag 3
- Schakel het beeldvormingssysteem en de computer in. Dubbelklik om de software te openen. Selecteer de Pro-programmamodus.
- Controleer het podiumgebied om er zeker van te zijn dat er geen monsters aanwezig zijn en dat niets de beweging van het podium belemmert. Klik vervolgens op Nu kalibreren.
- Schakel onder het menu Incubatie in de zijbalk aan de rechterkant het selectievakje naast H Unit XL in en stel dit in op 37 °C.
OPMERKING: Wacht tot het geïncubeerde stadium bijna op temperatuur is voordat u de monsters voorbereidt voor beeldvorming. - Spoel de eerste experimentele put af met 750 μL beeldmedium en vervang deze door 400 μL van de in punt 5.2 bereide suspensie van het zymosandeeltje. Laat de resterende putten in het groeimedium.
OPMERKING: Het kan nodig zijn om de deeltjessuspensie opnieuw kort te vortexen en soniceren als deze langer dan 15 minuten heeft gesetteld. - Plaats de dia op het geïncubeerde podium van het beeldvormingssysteem. Stel een timer in voor 10 min.
- Gebruik de beeldvormingssoftware, selecteer Brightfield onder het tabblad Zoeken en klik vervolgens op het oculairpictogram in het onderstaande systeemconfiguratievenster. Met het 10x-objectief op zijn plaats, gebruikt u het oculair en de scherpstelknop om op de cellen te focussen.
- Selecteer het tabblad Acquisitie, gebruik het vervolgkeuzemenu Experiment en selecteer vervolgens een set golflengten met een EGFP-filterset voor 509 nm excitatie 533 nm emissiegolflengten van de pH-gevoelige kleurstof.
- Wanneer er nog ~ 2 minuten op de timer staat, gebruik dan de software om het objectief te wijzigen in 20x door op het 20x-pictogram in het doelmenu te klikken.
- Klik op het menu Kanalen, selecteer EGFP-filters en gebruik het menu Belichting om de belichtingstijd in te stellen op 400 ms om de pH-gevoelige groene fluorofoor te detecteren zodra deze in het fagolysosoom is ingesloten.
- Klik op Live en pas de scherpstelling aan met de scherpstelknop.
- Klik op Stoppen om het licht uit te schakelen en vink het vakje aan naast de experimentele instelling Time-lapse bovenaan.
- Selecteer in het menu Scherpstelstrategie de optie Software Autofocus. Selecteer in de vervolgkeuzelijst in het menu Autofocus de optie Slimme en grove instellingen om de tijd van blootstelling aan licht te verkorten terwijl de autofocus wordt uitgevoerd.
- Stel in het menu Time-Lapse het gewenste aantal acquisities in op 30-60 en de intervaltijd op 1 min.
- Nadat de time-lapse-parameters zijn ingesteld en na 10 minuten toevoeging van deeltjes aan de eerste put, klikt u op de knop Experiment starten om de acquisitie te starten.
- Wanneer de acquisitie is voltooid met behulp van de eerste experimentele put, herhaalt u stap 6.4-6.12 voor elk van de resterende experimentele putten.
- Sla alle experimentbestanden met de datum en parameters in de titel op in de juiste map.
- Sluit de software. Open de software opnieuw in de verwerkingsmodus en exporteer de bestanden in het MP4-formaat met behulp van het menu Exporteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na het berekenen van het gemiddelde ± SEM voor elke groep op alle tijdstippen, worden de gegevens gepresenteerd in lijngrafiekformaat met de Y-as als de relatieve fluorescerende intensiteit en de X-as als tijd. Aanvullend bestand 1 biedt een voorbeeld van onbewerkte gegevens uit een kinetische lezing van de 96-well plaat in een spreadsheetformaat.
In deze studie tonen de optimale resultaten in figuur 3Aen tabel 3 aan dat 1) co-cultuur met MSC de fagocytische activiteit van de macrofaag verbetert, 2) IFN-y-behandeling de activiteit van de macrofaag vermindert en 3) co-cultuur met MSC MΦ fagocytische activiteit gedeeltelijk redt. Optimale celdichtheden zijn van cruciaal belang in deze studies en wanneer MΦ op een te lage dichtheid worden geplateerd, kunnen veranderingen in fluorescentie-intensiteit niet worden gedetecteerd(figuur 3B). Figuur 3C geeft gegevens weer van een studie waarbij de MΦ met een te hoge dichtheid werden geplateerd en de fluorescentie-intensiteit in alle groepen snel is verhoogd en verschillen niet kunnen worden onderscheiden. De dynamische beeldvormingsvideo's bevestigen dat de fluorescerende intensiteitsveranderingen het gevolg zijn van fagocytose en niet van verzuring van het medium. Ze bieden ook kwalitatieve gegevens en een visuele weergave van de snelheid en omvang van fagocytische activiteit(figuur 4).
Figuur 1: Een illustratie van de centrale vraag van de gepresenteerde gegevens, namelijk "Kan MSC de fagocytische activiteit van IFN-γ behandelde MΦ herstellen?". Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Overzicht van de co-cultuur en fagocytose assay workflow. Een overzicht van de workflow voor kwantitatieve en kwalitatieve analyse van MΦ fagocytose-activiteit in co-cultuur met MSC. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve kwantitatieve gegevens van de kinetische aflezing van optimale en suboptimale resultaten. In (A) zijn gegevens representatief voor een experiment met optimale MΦ-celdichtheid, in (B) zijn gegevens representatief voor een experiment met suboptimale te lage MΦ-celdichtheid en in (C) zijn gegevens representatief voor een experiment met suboptimale te hoge MΦ-celdichtheid. De relatieve fluorescentie-intensiteit gemeten in relatieve fluorescerende eenheden (RFU) wordt uitgezet op de Y-as, terwijl de tijd wordt uitgezet op de X-as. Let op de verschillen in het bereik van RFU tussen optimale en suboptimale experimenten. In Aredt MSC MΦ fagocytische activiteit gedeeltelijk in de setting van IFN-γ-onderdrukking gedurende een periode van 70 minuten. De RFU wordt gepresenteerd als gemiddelde ± de SEM, n = 6. De analyse werd uitgevoerd met behulp van Tukey's meervoudige vergelijkingstest na een significante tweerichtings-ANOVA, interactie-effect P = 0,0001, tijdeffect P = 0,0001 en behandeling / MSC-effect P = 0,0001. Symbolen geven de resultaten van meerdere vergelijkingstests aan. * = significant verschil tussen MSC/MΦ + IFN- γ vs MΦ + IFN-γ, Ŧ = significant verschil tussen MΦ vs MΦ + IFN-γ, en † = significant verschil tussen MSC/MΦ vs MΦ. Zie tabel 3 voor gedetailleerde resultaten van de meervoudige vergelijkingstests. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Dynamische beeldvormingsvideo's die visuele bevestiging geven van de celspecifieke toename van fluorescentie door zure activering van gelabelde zymosandeeltjes na incorporatie in het MΦ-fagolysosoom. Time-lapse-instellingen werden elke 1 minuut over een periode van 30 minuten overgenomen met behulp van een belichtingstijd van 400 ms en de EGFP-filterset. (A) MΦ in monocultuur, (B) MΦ in cocultuur met MSC, (C) MΦ behandeld met IFN-γ (250 ng/ml) en (D) MΦ behandeld met IFN-γ (250 ng/ml) in cocultuur met MSC. Klik hier om dit bestand te downloaden.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| Een | CBL | msc/mφ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| B | CBL | msc/mφ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| C | CBL | msc/mφ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| D | CBL | msc/mφ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| E | CBL | msc/mφ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| F | CBL | msc/mφ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| G | CBL | msc/mφ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| H | CBL | msc/mφ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL |
Tabel 1: Voorbeeld van een 96-well plaatontwerp. CBL - Cel leeg; MSC - gezaaide dag 1; MΦ+ behandeld en MΦ onbehandeld gezaaid dag 2; RBL-reagens blanco toegevoegd op testdag 3.
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| msc/mφ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ |
Tabel 2: Voorbeeld van een 4-well kamer dia ontwerp. MSC - vergulde dag 1; MΦ+ behandeld en MΦ onbehandeld dag 2.
| Tukey's meerdere vergelijkingen test | Gemene Diff. | 95,00% BI diff. | Onder de drempel? | Samenvatting | Aangepaste P-waarde |
| 0 minuten | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | -3871 | -9495 tot 1754 | Nee | Ns | 0.2836 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 720.3 | -4904 tot 6345 | Nee | Ns | 0.9873 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | -77.17 | -5702 tot 5548 | Nee | Ns | >0,9999 |
| 10 minuten | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | -3466 | -9091 tot 2159 | Nee | Ns | 0.3817 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 2326 | -3299 tot 7950 | Nee | Ns | 0.7062 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 992 | -4633 tot 6617 | Nee | Ns | 0.968 |
| 20 minuten | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | -1311 | -6936 tot 4314 | Nee | Ns | 0.9303 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 3315 | -2310 tot 8940 | Nee | Ns | 0.422 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 3146 | -2478 tot 8771 | Nee | Ns | 0.4689 |
| 30 minuten | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | 384.8 | -5240 tot 6010 | Nee | Ns | 0.998 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 2313 | -3312 tot 7937 | Nee | Ns | 0.7098 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 8726 | 3101 tot 14350 | Ja | *** | 0.0005 |
| 40 minuten | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | 2247 | -3377 tot 7872 | Nee | Ns | 0.7278 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 4913 | -712,2 tot 10537 | Nee | Ns | 0.1101 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 16521 | 10896 tot 22145 | Ja | **** | <0.0001 |
| 50 minuten | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | 5657 | 32,12 tot 11282 | Ja | * | 0.0481 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 4932 | -692,9 tot 10557 | Nee | Ns | 0.1079 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 19083 | 13458 tot 24708 | Ja | **** | <0.0001 |
| 60 minuten | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | 12376 | 6752 tot 18001 | Ja | **** | <0.0001 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 9361 | 3736 tot 14986 | Ja | *** | 0.0002 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 24748 | 19123 tot 30373 | Ja | **** | <0.0001 |
| 70 minuten | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | 13770 | 8145 tot 19395 | Ja | **** | <0.0001 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 11987 | 6362 tot 17612 | Ja | **** | <0.0001 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 27264 | 21639 tot 32888 | Ja | **** | <0.0001 |
Tabel 3: Gedetailleerde statistische analyse van de gegevens in figuur 3A. Resultaten van Tukey's meerdere vergelijkingstests na een significante tweerichtings-ANOVA van gegevens gepresenteerd in figuur 3A.
Aanvullend bestand 1: Een representatief spreadsheetbestand met onbewerkte kinetische gegevens van een optimaal experiment. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analyse van fagocytose met behulp van biodeeltjes geconjugeerd tot een pH-gevoelige kleurstof is een relatief nieuw hulpmiddel dat voordelig is gebleken ten opzichte van traditionele fluorescerend gelabelde deeltjes12,19,20. Met traditionele fluorescerend gelabelde deeltjes is alleen eindpuntanalyse mogelijk. Detectie wordt uitgevoerd met fluorescerende microscopie en/of spectrofluormetrie na het wassen of blussen van deeltjes die niet door de fagocyt zijn opgenomen. Kwantitatieve gegevens afgeleid van spectrofluormetrie hebben het potentieel om niet-verzwelde deeltjes te detecteren, en beeldanalyse om alleen intracellulaire deeltjes te kwantificeren is vervelend en tijdrovend met behulp van traditionele fluorescerende microscopiesystemen14. Biodeeltjes geconjugeerd aan pH-gevoelige kleurstoffen fluoresceren alleen in een zure omgeving zoals het fagolysosoom, en daarom zijn de vervelende was- en blusstappen onnodig14. Bovendien bieden pH-gevoelige gelabelde biodeeltjes het voordeel dat ze kinetische gegevens leveren die niet gemakkelijk zouden kunnen worden verkregen met FITC of andere fluorofoor-geconjugeerde biodeeltjes.
Studies met behulp van deze nieuwe tool hebben flowcytometrie en / of beeldvormingsplatforms gebruikt om een kwantitatieve en kinetische meting van fagocytenactiviteit19,20,21te genereren. Flowcytometrie is voordelig als er een beperkte fagocytenpopulatie is of als men geïnteresseerd is in sortering voor downstream-analyses zoals genetische schermen19. Van MSC is bekend dat het het MΦ-fenotype reguleert door zowel direct contact als door oplosbare factoren. Voorlopige studies hebben aangetoond dat geconditioneerd medium van MSC MΦ-fagocytose onderdrukte, en daarom is dit protocol ontworpen om de veranderingen in MΦ fagocytische activiteit te bepalen terwijl in directe co-cultuur met MSC. Onder deze omstandigheden zijn spectrofluormetrie om te kwantificeren en dynamische beeldvorming om fagocytische activiteit te visualiseren en te bevestigen het meest geschikt.
Cruciaal voor het succes van deze methoden is de optimalisatie van celdichtheden. De MSC moet worden geplateerd met een dichtheid die optimaal celcontact met de MΦ-cellen mogelijk maakt. MΦ moet worden gezaaid in mono- en coculturen met een dichtheid die niet alleen optimaal contact mogelijk maakt, maar ook optimale fluorescentiedetectie mogelijk maakt. Een te lage dichtheid zal resulteren in een lage opname in het fagolysosoom en kleine of vlakke veranderingen in relatieve fluorescerende eenheden (figuur 3B). Als MΦ bij een te hoge dichtheid worden gezaaid, neemt fagocytose snel toe en wordt detectie van verschillen tussen groepen gemaskeerd (figuur 3C). Het optimaliseren van de concentratie van pH-gevoelige kleurstof gelabelde zymosan deeltjes per celnummer is ook van cruciaal belang. Voorbereidende experimenten moeten worden uitgevoerd om de celdichtheden van MSC en MΦ en het aantal deeltjes per MΦ-cel te optimaliseren. Bovendien moeten deze optimalisatiestappen worden genomen als andere gelabelde biodeeltjes worden gebruikt, zoals E. coli of S. aureus.
Het juiste beeldvormingsmedium is ook van cruciaal belang. Het medium voor beide methoden moet een gebufferd medium zijn en mag geen fenolrood bevatten. Fenolrood dempt de detectie van de fluorescerende emissie. Ook zal elk additief of aandoening die het medium kan verzuren, de gelabelde deeltjes voortijdig activeren en een verhoogde achtergrond introduceren. De reagens blanco is van cruciaal belang voor het identificeren van de potentiële verzuring van het medium.
Deze protocollen kunnen niet alleen worden gebruikt om MSC-regulatie van MΦ-fagocytose van een verscheidenheid aan pH-gevoelige biodeeltjes te onderzoeken, maar de methode kan ook worden toegepast op een verscheidenheid aan co-cultuurmodellen die neutrofielen en andere fagocyten omvatten. Bovendien kunnen door dit model te gebruiken moleculen en routes waarvan wordt vermoed dat ze betrokken zijn bij celcontactgemedieerde regulatie van macrofaag fagocytische activiteit worden onderzocht via siRNA of CRISPR-gemedieerde down-regulatie om verdachte moleculaire doelen te valideren of te weerleggen. Mogelijke doelwitten zijn adhesiemoleculen, fagocytische receptoren en integrinemoleculen.
Werk met behulp van deze methoden zal nieuwe informatie onthullen over de signaleringsmechanismen die ten grondslag liggen aan de verhoogde fagocytische responsen van MΦ na celcontactinteracties met MSC, waardoor ons begrip van de rol die MSC speelt bij het reguleren van aangeboren immuniteit wordt bevorderd. Studies zoals deze richten zich op een onderbelicht gebied en zullen een volledig beeld geven van de invloed die MSC heeft op macrofaagactiviteit, wat nodig is voor een volledig begrip van hun rol in immuniteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het NSF Major Research Instrument-mechanisme onder subsidienummers 1626093 en 1919583.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Black Polystyrene Microplate | MilliporeSigma | CLS3603-48EA | |
| 0.4% trypan blue solution | MilliporeSigma | T8154-20ML | |
| 15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 339653 | |
| 4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | ThermoFisher | 155382PK | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco | ThermoFisher | 15240096 | |
| Axiobserver 7 Imaging System | Zeiss | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MilliporeSigma | A8806-1G | |
| Cell lifter | MilliporeSigma | CLS3008-100EA | |
| Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75 cm2, canted neck, with cap, filtered | MilliporeSigma | C7231-120EA | |
| D1 ORL UVA [D1] | ATCC | CRL-12424 | Mouse MSC Cell Line |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Hemocytometer | FisherScientific | 02-671-51B | |
| I-11.15 | ATCC | CRL-2470 | Mouse MΦ Cell Line |
| LADMAC Cell Line | ATCC | CRL-2420 | LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1). |
| Live-Cell Imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010031 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate | ThermoFisher | P35365 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Preprotech | 315-05 | |
| Spectramax i3X | Molecular Devices | ||
| Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 µm | ThermoFisher | 568-0020 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 micrometer | ThermoFisher | 723-2520 | |
| Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm | MilliporeSigma | CLS430167-100EA | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher | 25300054 |
References
- Phinney, D. G., Prockop, D. J. Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair--current views. Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).
- Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation. Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).
- Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease. Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).
- Giuliani, M., et al. Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation. PLoS One. 6 (5), 19988 (2011).
- Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells. Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).
- Luz-Crawford, P., et al. Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (3), 65 (2013).
- Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), 10088 (2010).
- Nemeth, K., et al. marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).
- Maggini, J., et al. Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile. PLoS One. 5 (2), 9252 (2010).
- Takizawa, N., et al. marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture. Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).
- Kim, J., Hematti, P. Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages. Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).
- Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 56 (2015).
- Cho, D. I., et al. Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages. Experimental Molecular Medicine. 46, 70 (2014).
- Fernandez, N., et al. Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response. Stem Cells International. 2017, 5846257 (2017).
- Jackson, M. V., et al. Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS. Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).
- Chaplin, D. D.
- Lim, J., et al. Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages. Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).
- Wang, Z., et al. Interferon-γ inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway. Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).
- Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts. Biotechniques. 68, 245-250 (2020).
- Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
- Takahashi, D., et al. Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE. Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).
