Summary
Hier wird ein Protokoll zur Quantifizierung und Erzeugung dynamischer Bilder der mesenchymalen Stammzell (MSC) vermittelten Regulation der Makrophagen (MΦ) Phagozytose von nicht opsonisierten Hefepartikeln (Zymosan) vorgestellt, die zu einem pH-empfindlichen fluoreszierenden Molekül konjugiert sind.
Abstract
Mesenchymale Stammzellen (MSC) wurden traditionell auf ihre regenerativen Eigenschaften untersucht, aber in jüngster Zeit standen ihre immunregulatorischen Eigenschaften im Vordergrund. Sie interagieren mit und regulieren die Aktivität von Immunzellen. Der Schwerpunkt dieser Studie liegt auf der MSC-Regulation der phagozytären Aktivität von Makrophagen. Makrophagen (MΦ) Phagozytose ist ein wichtiger Teil der angeborenen Reaktion des Immunsystems auf infektionen, und die Mechanismen, durch die MSC diese Reaktion modulieren, werden aktiv untersucht. Hier wird eine Methode zur Untersuchung der MΦ-Phagozytose von nicht opsonisierten Zymosanpartikeln vorgestellt, die in Kokultur mit MSC zu einem pH-empfindlichen fluoreszierenden Molekül konjugiert sind. Wenn die phagozytische Aktivität zunimmt und die markierten Zymosanpartikel in der sauren Umgebung des Phagolysosoms eingeschlossen sind, erhöht sich die Fluoreszenzintensität des pH-empfindlichen Moleküls. Mit den entsprechenden Anregungs- und Emissionswellenlängen wird die phagozytische Aktivität mit einem Fluoreszenzspektrophotometer gemessen und kinetische Daten werden als Änderungen der relativen Fluoreszenzeinheiten über einen Zeitraum von 70 Minuten dargestellt. Um diese quantitativen Daten zu unterstützen, wird die Veränderung der phagozytischen Aktivität mittels dynamischer Bildgebung visualisiert. Die Ergebnisse dieser Methode zeigen, dass MSC in Kokultur die MΦ-Phagozytose von nicht opsonisiertem Zymosan sowohl von naivem als auch von IFN-γ MΦ verbessert. Diese Daten ergänzen das aktuelle Wissen über die MSC-Regulation des angeborenen Immunsystems. Diese Methode kann in zukünftigen Untersuchungen angewendet werden, um die zugrunde liegenden zellulären und molekularen Mechanismen vollständig abzugrenzen.
Introduction
Mesenchymale Stammzellen (MSC) sind Vorläuferzellen, aus denen Bindegewebszellen entstehen. MSC sind in adulten Säugetiergeweben vorhanden und können aus dem Knochenmark isoliert werden1. Aufgrund ihrer immunmodulatorischen Eigenschaften werden diese Zellen umfassend untersucht2. Frühe Studien konzentrierten sich auf die MSC-Regulation von T-Zellen3,4,5,6, aber in jüngerer Zeit hat ihre Regulation von Makrophagenzellen (MΦ), einer wichtigen zellulären Komponente der angeborenen Immunität, erhöhte Aufmerksamkeit erhalten7,8,9,10,11,12,13,14 . Die Bedeutung der MSC-MΦ-Interaktion bei der Behandlung entzündlicher Erkrankungen wird durch die Tatsache unterstrichen, dass die Depletion von Monozyten/Makrophagen die therapeutischen Wirkungen von MSC in Tiermodellenaufhebt 8. Hier liegt der Fokus auf der Zellkontakt-Interaktion des MSC mit MΦ. MSC haben die Fähigkeit, den Phänotyp von MΦ zu regulieren, indem sie den Wechsel von entzündlichen zu entzündungshemmenden Reaktionen fördern, was zu Gewebereparaturaktivitätenführt 8,9,10,11, und es wurde viel getan, um diese Regulationsmechanismen zu demonstrieren. Unter anderen Umständen kann MSC eine MΦ-getriebene Entzündungsreaktion12,13 unterstützen oder verschlimmern und die phagozytische Aktivität von MΦverbessern 14,15. Es besteht jedoch ein kritischer Mangel an vorhandenen Daten, die die Mechanismen und die Bedingungen identifizieren, unter denen MSC die phagozytische Aktivität von MΦ regulieren.
MΦ haben Familien von Rezeptoren, die entweder opsonisierte (Antikörper oder Komplement-beschichtete) oder nicht-opsonisierte Pathogene erkennen, die zu Phagozytose führen16. Die Aktivierung und Aktivität der letzteren ist weniger gut untersucht17. In einer nicht-entzündlichen In-vitro-Umgebung verstärken MSC die MΦ-Phagozytose von nicht opsonisierten Krankheitserregern13. Die Erkennung von nicht-opsonisierten Krankheitserregern durch MΦ kann jedoch nach Exposition gegenüber einer entzündlichen Umgebung, die von Lymphozyten während einer adaptiven Immunantwort produziert wird, reduziert werden. IFN-γ, das von natürlichen Killerzellen und Effektor-Lymphozyten freigesetzt wird, hat eine hemmende Wirkung auf die MΦ-Phagozytose von nicht opsonisierten Partikeln18. Ein Kokulturmodell wurde entwickelt, um die Mechanismen der MSC-Direktkontaktregulation der MΦ-Phagozytose zu untersuchen. Ziel des hier vorgestellten Experiments ist es, festzustellen, ob MSC die MΦ-Phagozytose von nicht-opsonisierten Erregern regulieren, nachdem MΦ IFN-γ ausgesetzt wurde (Abbildung 1).
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Protocol
HINWEIS: Alle Mediumsvorbereitungs- und Zellkulturtechniken werden unter aseptischen Bedingungen unter Verwendung einer Biosicherheitswerkbank mit laminarer Strömung durchgeführt. Alle beschriebenen Kulturinkubationsschritte werden mit einem Inkubator durchgeführt, der eine Atmosphäre von 37 °C, 5%CO2und 95% Luftfeuchtigkeit aufrechterhält.
1. Zellkultur
- Vorbereitung des Wachstumsmediums
- Für MSC und LADMAC fügen Sie 50 ml FBS und 5 ml 100x Antibiotikum / Antimykotikum-Mischung zu 500 ml DMEM mit hohem Glukosegehalt hinzu.
- Für den MΦ werden 50 ml FBS, 100 ml LADMAC-Zustandsmedium (hergestellt nach den Schritten von Abschnitt 1.2) und 5 ml 100-fache Antibiotikamischung zu 500 ml DMEM mit hohem Glukosegehalt hinzugefügt.
HINWEIS: LADMAC-Zellen produzieren einen koloniestimulierenden Faktor (CSF-1), der notwendig ist, um das Wachstum der MΦ-Zellen zu unterstützen.
- Vorbereitung von LADMAC konditioniertem Medium
- Um LADMAC-Zellen aus gefrorenem Bestand zu säen, werden 19 ml Wachstumsmedium aus Abschnitt 1.1 in jeden der fünf mit T75 cm2 behandelten Zellkulturkolben gegeben und für 15 min in den Zellkulturinkubator gegeben, um sich auf 37 °C auszugleichen.
- In der Zwischenzeit ein Aliquot von 106 gefrorenen Zellen schnell auftauen, indem Sie in einem 37 °C warmen Wasserbad für 2-3 min oder bis es aufgetaut ist. Geben Sie die Zellen zu 9 mL frischem MSC-Wachstumsmedium in einem sterilen konischen Röhrchen mit 15 mL oder 50 ml und zentrifugieren Sie bei 125 x g in einem schwingenden Eimerrotor für 5 min.
- Aspirieren oder dekantieren Sie den Überstand, fügen Sie 5 ml frisches Wachstumsmedium hinzu und pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um das Zellpellet wieder zu versenken.
- 1 ml der Zellsuspension in jeden der fünf T75 cm2-Kolben mit einer sterilen serologischen Pipette geben und in den Zellkultur-Inkubator geben.
- Fügen Sie alle 2-3 Tage zusätzliche 10 ml Medium über einen Zeitraum von 7-10 Tagen hinzu. Dann sammeln Sie die Zellen und den Überstand in sterilen 50 ml konischen Röhrchen mit einer sterilen serologischen Pipette und Zentrifuge bei 125 x g für 5 min.
- Trennen Sie den Überstand vom Zellpellet und filtern Sie den Überstand mit einer sterilen 0,2 μm sterilen Einweg-Vakuumfiltereinheit.
- Entfernen Sie die Saugerbaugruppe aus der Verpackung und verbinden Sie sie mit einem Vakuumschlauch mit der Saugpumpe. Gießen Sie den Überstand in das obere Fach und ersetzen Sie die Abdeckung. Schalten Sie die Saugpumpe ein, um in das untere Fach zu filtern.
- Aliquots durch Pipettieren in 50 ml sterile konische Röhrchen vorbereiten und bei -20 °C lagern.
- Um das Zellpellet einzufrieren, in Gefriermedium bei 106 Zellen/ml resuspendieren, in einen Gefrierbehälter geben und dann in einen Gefrierschrank -80 °C legen. Nach 24 h in den LN2-Speicher überführen.
- Vermehrung von Zellen in Vorbereitung auf die Kokultur
- Um MSC- und MΦ-Zellen aus dem gefrorenen Bestand zu säen, werden 9 ml geeignetes Wachstumsmedium, das in Abschnitt 1.1 zubereitet wurde, in jedes der vier mit 100 mm Zellkultur behandelten Schalen für jeden Zelltyp ausgeglichen und für 15 min in den Zellkulturinkubator gegeben.
- In der Zwischenzeit die Aliquots von 106 gefrorenen Zellen schnell auftauen, indem Sie sie in einem 37 °C warmen Wasserbad für 2-3 min oder bis zum Auftauen inkubieren. Dann fügen Sie die aufgetauten MSC-Zellen zu 9 ml frischem MSC-Wachstumsmedium hinzu und fügen Sie die aufgetauten MΦ-Zellen zu 9 ml frischem MΦ-Wachstumsmedium in 15 oder 50 ml sterilen konischen Röhrchen hinzu und zentrifugieren Sie bei 125 x g im schwingenden Eimerrotor für 5 minuten.
- Aspirieren oder dekantieren Sie den Überstand und resuspen sie jedes Pellet in 4 ml des entsprechenden frischen Wachstumsmediums, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren. Zu jeder der vier 100 mm Schalen für jeden Zelltyp, die in Schritt 1.3.1 ausgeglichen wurden, wird 1 ml der Zellsuspension gegeben.
- Bringen Sie das Geschirr mit den Zellen in den Inkubator zurück. Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage, bis 70% -80% konfluent sind.
2. MSC in experimentelle Gerichte säen, Tag 1
HINWEIS: Entwerfen Sie vor der Aussaat des MSC das experimentelle 96-Well-Plattenlayout für die Fluoreszenzspektrophotometrie und den Kammerobjektträger für die dynamische Bildgebung. Flankieren Sie für die 96-Well-Platte experimentelle Wells mit Wells, die Zellen enthalten, verwenden Sie sie jedoch nicht im Assay. Markieren Sie mindestens vier Vertiefungen, die für den Reagenzien-Rohling (RBL) verwendet werden sollen. Siehe Tabelle 1 für eine Beispiel-96-Well-Vorlage und Tabelle 2 für ein Beispiel für eine 4-Well-Kammer-Slide-Vorlage. Schwarze oder weiße 96-Well-Platten mit klarem Boden werden empfohlen. Ein 1,5 mm Borosilikatglaskammerobjektträger ist optimal, aber die Anzahl der Kammern kann je nach Studiendesign eingestellt werden. Ein zusammenfassendes Flussdiagramm der folgenden Methoden ist in Abbildung 2enthalten.
- Bei 70% -80% Konfluenz das Wachstumsmedium aus den Kulturen in 100 mm Schalen absaugen und 5 ml PBS hinzufügen, um die MSC zu isolieren.
- Aspirieren Sie das PBS, geben Sie 2 ml 0,05% Trypsin / EDTA hinzu und legen Sie es für 3-5 min in den Kulturinkubator.
- Überprüfen Sie nach 3 Minuten die Zellablösung mit einem inversen Mikroskop. Wenn die Zellen getrennt sind, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Wenn nicht, setzen Sie die Inkubation für weitere 1-2 min fort. Nicht länger als 5-6 min inkubieren.
- Geben Sie 5 ml frisches Wachstumsmedium in die Schale mit den abgelösten Zellen. Spülen Sie die Schale mit der Trypsin /Medium-Mischung und sammeln Sie die Zellen in einem sauberen, sterilen 50 ml konischen Röhrchen mit einer sterilen serologischen Pipette.
- Zentrifuge für 5 min bei 125 x g. Aspirieren Sie den Überstand und resuspen sie das Zellpellet in 10 ml frischem Wachstumsmedium, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren.
- Um die Zellen zu zählen, fügen Sie 10 μL der Zellsuspension zu 30 μL 0,4% Trypanblaulösung in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen hinzu. Dann werden 10 μL der Mischung unter dem Deckglas einer Hämozytometer-Zählkammer pipettiert.
- Zählen Sie mit einem inversen oder Hellfeldmikroskop mit dem 10-fachen Objektiv die ungefärbten (lebensfähigen) Zellen in vier der 1 mm2 Quadrate. Berechnen Sie die Zellzahl mit der Formel: zellen/ml = Zellzahl/# 1 mm2 Quadrate x Verdünnungsfaktor x 104.
HINWEIS: In diesem Beispiel beträgt die Anzahl der gezählten 1 mm2 Quadrate vier und der Verdünnungsfaktor 4. - Verwenden Sie die Gleichung C1V1 =C2 V2,um eine 1 x 105 Zellen/ml Suspension zu berechnen und herzustellen. Bereiten Sie 1 ml Zell-/ml-Suspension für jede Säule der zu befüllenden 96-Well-Platte und 0,75 mL für jede Kammer des 4-Well-Kammerobjektträgers vor, die gemäß dem Plattendesign gefüllt werden soll.
ANMERKUNG:C1 = Zellzahl,V1 = was berechnet wird,C2 = 1 x 105,V2 = 5,50 ml. - Bestimmen SieV1, subtrahieren Sie es von den gewünschten 5,50 ml des Gesamtvolumens, um das Volumen des frischen Mediums zu bestimmen, das zur Herstellung der Suspension benötigt wird. Das Volumen der Zellen(V1)aus der ursprünglichen Suspension zum Volumen des frischen Mediums für insgesamt 5,50 ml mit 1 x 105 Zellen/ml hinzu.
- Fügen Sie 100 μL 1 x 105 Zellen / ml Suspension zu jeder Vertiefung der 96-Well-Platte gemäß dem Plattendesign mit einem Mehrkanal-Mikropipettor und 530 μL zu jedem der Vertiefungen des Kammerschlittens mit einer Mikropipette gemäß dem Plattendesign hinzu. Über Nacht inkubieren.
HINWEIS: Für dieses Experiment werden MSC in den Spalten 1, 2, 3 und 6 der 96-Well-Platte (Tabelle 1) und den Wellen 1 und 2 der 4-Well-Kammerschlitten (Tabelle 2) plattiert. Daher werden mindestens 5,50 ml einer 1 x 105 Zellen/ml Suspension hergestellt. MΦ bei 80% Konfluenz werden mit Entzündungsmediatoren am selben Tag behandelt, an dem die MSC in die Versuchsplatten eingesät werden.
3. Aktivieren Sie den MΦ mit IFN-γ, Tag 1
- Bereiten Sie das Aktivierungsmedium und den IFN-γ Vorrat vor.
- Für 200 ml Aktivierungsmedium 40 mg BSA zu 200 ml serumfreiem DMEM mit hohem Glukosegehalt und sterilem Filter mit einer sterilen Einweg-Vakuumfiltereinheit von 0,2 μm hinzufügen.
- Um 0,1% BSA/ PBS herzustellen, fügen Sie 20 mg BSA zu 20 ml PBS hinzu. Wirbel zum Auflösen. Verwenden Sie einen sterilen 0,2-μm-Spritzenfilter, um in ein sauberes, steriles 50 ml konisches Röhrchen zu filtern.
- Fügen Sie 1 ml der sterilen 0,1% BSA/PBS-Lösung zu 100 μg lyophilisierter IFN-γ hinzu, um eine Stammlösung von 100 μg/ml zu erhalten. In 50 μL Aliquots bei -20 °C lagern.
- Aktivieren Sie den MΦ mit IFN-γ
- Fügen Sie 2,5 μL von 100 μg/ml IFN-γ-Material für jeden 1 mL des benötigten Mediums hinzu. Bereiten Sie für jede zu aktivierende 100-mm-Schale 10 ml Aktivierungsmedium mit IFN-γ in einer Konzentration von 250 ng/ml vor.
- Aspirieren Sie das Wachstumsmedium aus den MΦ-Kulturen und ersetzen Sie es durch 5 ml des Aktivierungsmediums ohne IFN- γ zum Spülen.
- Aspirieren Sie das zum Spülen verwendete Medium und ersetzen Sie es durch 10 ml IFN- γ ergänztes Aktivierungsmedium für die experimentelle Schale und durch 10 ml nicht ergänztes Aktivierungsmedium für die Kontrolle. Inkubieren Sie die Kulturen für 16-24 h.
4. Isolieren Sie das MΦ und bereiten Sie die Co-Kulturen vor, Tag 2
- Entfernen Sie das Aktivierungsmedium aus den MΦ-Zellen und ersetzen Sie es durch 5 ml frisches Wachstumsmedium. Kratzen Sie vorsichtig mit einem Cell Lifter und sammeln Sie die Zellen in einem 50 ml konischen Rohr.
- Zählen Sie die Zellen unter Verwendung des Trypanblauausschlusses und der Hämozytometrie, wie für MSC in den Schritten 2.6-2.7 beschrieben.
- Unter Verwendung der Gleichung in den Schritten 2.8-2.9 werden zwei getrennte Suspensionen von 2 x 105 Zellen/ml hergestellt, eine mit Zellen aus der Kontroll- und eine mit Zellen aus den behandelten MΦ-Kulturen.
HINWEIS: Bereiten Sie 1 ml Zell-/ml-Suspension für jede Säule der zu befüllenden 96-Well-Platte und 0,75 mL für jede Kammer des 4-Well-Kammerobjektträgers vor, die gemäß dem Plattendesign gefüllt werden soll. - Saugen Sie das Medium vorsichtig aus den experimentellen Vertiefungen der 96-Well-Platte, die MSC enthält. Unter Verwendung einer Mehrkanal-Mikropipette werden 100 μL der behandelten und der Kontroll-MΦ-Zellsuspensionen in die entsprechenden experimentellen Vertiefungen mit und ohne MSC gemäß dem Plattendesign gegeben. Über Nacht inkubieren.
- Saugen Sie das Medium vorsichtig aus dem MSC-haltigen 4-Well-Kammerobjektträger ab und geben Sie mit einer Mikropipette 530 μL MΦ-Zellsuspension entsprechend dem Design in die entsprechenden Vertiefungen. Über Nacht inkubieren.
5. Phagozytose-Assay, kinetische fluoreszierende 96-Well-Plattenlesung, Tag 3
- Festlegen der Assay-Parameter
- Schalten Sie am Tag des Assays den Leuchtstoffplattenleser ein und stellen Sie die Temperatur des Systems auf 37 °C ein.
- Öffnen Sie die System Pro-Software und überprüfen Sie das Instrumentensymbol in der oberen linken Ecke, um festzustellen, ob das Gerät an den Computer angeschlossen ist. Wenn der rote Kreis mit einer Linie sichtbar ist, klicken Sie auf das Instrumentensymbol und wählen Sie das Instrument im Popup-Fenster aus, um die Verbindung herzustellen.
- Wählen Sie Neues Experiment aus, um auf das Popup-Fenster Plate Setup Helper zuzugreifen. Wählen Sie im Menü Plate Setup Helper die Option Configure Your Acquisition Settings (Erfassungseinstellungen konfigurieren)aus.
- Wählen Sie Monochromator aus dem Einstellungsmenü für die optische Konfiguration. Wählen Sie FL (Fluoreszenz) für den Lesemodus und Kinetic für den Lesetyp.
- Klicken Sie im selben Konfigurationsfenster unter Kategorieauf Wellenlängen, und legen Sie dann die Bandbreiten auf 9 nm für die Anregung und 15 nm für die Emission fest.
- Legen Sie die Anzahl der Wellenlängenpaare auf 1 fest. Stellen Sie die Wellenlängen LM1 auf 510 nm für die Anregung und auf 540 nm für die Emission ein.
- Fahren Sie mit den Kategorien fort und wählen Sie als Nächstes Plattentyp aus. Wählen Sie die Option aus, die dem verwendeten Plattentyp entspricht.
HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Auswahl mit dem Plattentyp übereinstimmt. Die Lesehöhen werden vom System entsprechend der Auswahl eingestellt. - Wählen Sie als Nächstes Lesebereich aus und markieren Sie den Bereich der 96-Well-Platte, die im experimentellen Design enthalten ist.
- Wählen Sie PMT und Optik, setzen Sie PMT Gain auf High und Flashes per Read auf 6. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben Von unten lesen, wenn Sie eine durchsichtige Bodenplatte verwenden.
- Wählen Sie Timing und stellen Sie Intervalle von 10 Minuten über einen Zeitraum von 70 Minuten ein.
- Wählen Sie Schüttelnaus, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Vor dem ersten Lesen, und legen Sie den Wert auf 5 s fest. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Zwischen den Lesevorgängen, und stellen Sie ihn auf 3 s ein. Stellen Sie die Schüttelintensität sowohl auf Niedrig als auch auf Linear ein.
- Schließen Sie das Fenster. Wenn das Fenster Plate Set-Up Helper angezeigt wird, wählen Sie Configure Your Plate Layout (Plattenlayout konfigurieren)aus. Markieren Sie die BL-Vertiefungen des Plattendesigns und klicken Sie auf Plattenrohling.
- Markieren Sie jede der experimentellen Zeilen, klicken Sie auf Hinzufügen, benennen Sie die Gruppe und wählen Sie dann eine Farbe aus.
- Wählen Sie unter dem Plattenentwurf unter Zuweisungsoptionen die Option Serie, definieren Sie dann die Reihe im Fenster und klicken Sie auf OK. Wiederholen Sie den Vorgang für jede Gruppe.
- Bereiten Sie die Zymosan-Suspension vor
- Während Sie darauf warten, dass die Systemtemperatur 37 °C erreicht, resuspendieren Sie 1 mg Zymosanpartikel in 5 ml des Lebendzell-Bildgebungsmediums.
- Geben Sie 1 ml Lebendzell-Bildgebungsmedium in die Durchstechflasche, die die Partikel enthält, und sammeln Sie sie in einem Glaskulturröhrchen. Spülen Sie die Durchstechflasche mit einer zusätzlichen Bildlösung von 1 ml ab und geben Sie sie in dasselbe Glasröhrchen, um sicherzustellen, dass alle Partikel übertragen werden. Fügen Sie 3 ml zusätzliche Bildgebungslösung hinzu, um eine Partikelsuspension von 0,2 mg / ml zu erhalten.
- Wirbel mit schnellen Impulsen für 30-60 s. Verwenden Sie dann einen Sondenschallgerät, um mit 60 schnellen Impulsen zu beschallen.
HINWEIS: Es ist sehr wichtig, eine homogene Suspension von Partikeln zu erzeugen und die Suspension nicht zu lange sitzen zu lassen, bevor sie zu den experimentellen Vertiefungen hinzugefügt wird. Verklumpungen treten schnell wieder auf. Abhängig von der Quelle, der Behandlung und der Dichte von MΦ muss möglicherweise die Partikeldichte pro Zelle optimiert werden. In den vorgestellten Studien wurden konjugierte Zymosanpartikel verwendet. Es sind jedoch auch konjugierte E. coli und S. aureus erhältlich.
- Während Sie darauf warten, dass die Systemtemperatur 37 °C erreicht, resuspendieren Sie 1 mg Zymosanpartikel in 5 ml des Lebendzell-Bildgebungsmediums.
- Fügen Sie Zymosan hinzu und lesen Sie den Teller
- Das Medium aus den experimentellen Vertiefungen absaugen und 1x mit 100 μL der Live-Cell-Imaging-Lösung abspülen. Spülen Sie die RBL-Vertiefungen auch mit der Live-Cell-Imaging-Lösung.
- Die Lebendzell-Bildgebungslösung wird aus experimentellen und RBL-Vertiefungen abgesaugt und durch 100 μL der in Abschnitt 5.2 hergestellten Zymosan-Partikelsuspension ersetzt.
- Öffnen Sie das Plattenfach des Fluoreszenzlesers über die Touchpad-Oberfläche. Stellen Sie die Platte ohne Deckel in die Schale mit dem A1-Well in der oberen linken Ecke. Schließen Sie das Fach über das Touchpad und klicken Sie im oberen Menü auf die grüne Schaltfläche Lesen.
- Wenn der Lesevorgang abgeschlossen ist, speichern Sie die Datei im entsprechenden Ordner und exportieren Sie die Daten in einem Tabellenkalkulationsformat, indem Sie auf Datei klicken und Exportierenauswählen.
- Berechnen Sie die mittlere ± SEM-relativen Fluoreszenz für jede Replikationsgruppe zu jedem Zeitpunkt (10 min, 20 min, 30 min usw.) in der Tabelle (Ergänzende Datei 1) und übertragen Sie die Daten an die Grafiksoftware.
- Verwenden Sie ein Liniendiagrammformat, um die Daten darzustellen, und wenden Sie eine Bidirektionale ANOVA (Time x Treatment/MSC als Faktoren) an, gefolgt von Tukeys Multiple-Comparisons-Test, um Unterschiede zwischen einzelnen Gruppen zu bestimmen.
HINWEIS: Bereiten Sie die dynamische Bildgebungsplatte für die Zeitraffer-Bildaufnahme vor, während die 96-Well-Platten gelesen werden. Stellen Sie sicher, dass die dynamische Bildgebung mit der Analyse jeweils einer experimentellen Vertiefung fortfährt.
6. Phagozytose-Assay, dynamische Bildgebung, Tag 3
- Schalten Sie das Imaging-System und den Computer ein. Doppelklicken Sie, um die Software zu öffnen. Wählen Sie den Pro-Programmmodus aus.
- Überprüfen Sie den Bühnenbereich, um sicherzustellen, dass keine Proben vorhanden sind und nichts die Bewegung der Bühne behindert. Klicken Sie dann auf Jetzt kalibrieren.
- Aktivieren Sie im Menü Inkubation in der Seitenleiste auf der rechten Seite das Kontrollkästchen neben H Unit XL und stellen Sie es auf 37 °C ein.
HINWEIS: Warten Sie, bis die Inkubationsstufe fast die Temperatur erreicht hat, bevor Sie die Proben für die Bildgebung vorbereiten. - Spülen Sie die erste Versuchsbohrung mit 750 μL bildgebendem Medium ab und ersetzen Sie sie durch 400 μL der in Abschnitt 5.2 hergestellten Zymosan-Partikelsuspension. Lassen Sie die verbleibenden Vertiefungen im Wachstumsmedium.
HINWEIS: Es kann notwendig sein, die Partikelsuspension kurzzeitig erneut zu wirbeln und zu beschallen, wenn sie sich länger als 15 min eingependelt hat. - Legen Sie den Objektträger auf die inkubierte Stufe des Bildgebungssystems. Stellen Sie einen Timer auf 10 Min.
- Verwenden Sie die Imaging-Software, wählen Sie Brightfield auf der Registerkarte Locate aus, und klicken Sie dann im Systemkonfigurationsfenster unten auf das Okularsymbol. Verwenden Sie mit dem 10-fachen Objektiv das Okular und den Fokussierknopf, um auf die Zellen zu fokussieren.
- Wählen Sie die Registerkarte Erfassung aus, verwenden Sie das Dropdown-Menü Experiment, und wählen Sie dann einen Satz von Wellenlängen aus, der den EGFP-Filtersatz für 509 nm Anregung und 533 nm Emissionswellenlängen des pH-empfindlichen Farbstoffs enthält.
- Wenn der Timer noch ~ 2 Minuten entfernt ist, verwenden Sie die Software, um das Ziel auf 20x zu ändern, indem Sie auf das 20x-Symbol im Zielmenü klicken.
- Klicken Sie auf das Menü Kanäle, wählen Sie EGFP-Filter und verwenden Sie das Menü Exposition, um die Belichtungszeit auf 400 ms einzustellen, um das pH-empfindliche grüne Fluorophor zu erkennen, sobald es im Phagolysosom eingeschlossen ist.
- Klicken Sie auf Live und passen Sie den Fokus mit dem Fokussierknopf an.
- Klicken Sie auf Stopp, um das Licht auszuschalten, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben der Versuchseinstellung Zeitraffer oben.
- Wählen Sie im Menü Fokussierstrategie die Option Software-Autofokusaus. Wählen Sie im Dropdown-Menü im Menü Autofokus die Option Einstellungen für "Smart und Grob", um die Zeit der Belichtung mit Licht zu verkürzen, während der Autofokus läuft.
- Stellen Sie im Menü Zeitraffer die gewünschte Anzahl der Aufnahmen auf 30-60 und die Intervallzeit auf 1 Min.
- Nachdem die Zeitrafferparameter eingestellt wurden und nach 10 Minuten Der Zugabe von Partikeln zum ersten Bohrloch, klicken Sie auf die Schaltfläche Experiment starten, um mit der Erfassung zu beginnen.
- Wenn der Erwerb mit dem ersten Versuchsbohrloch abgeschlossen ist, wiederholen Sie die Schritte 6.4-6.12 für jedes der verbleibenden Versuchsbohrungen.
- Speichern Sie alle Experimentdateien mit dem Datum und den Parametern im Titel im entsprechenden Ordner.
- Schließen Sie die Software. Öffnen Sie die Software im Verarbeitungsmodus erneut und exportieren Sie die Dateien im MP4-Format über das Menü Exportieren.
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Representative Results
Nach der Berechnung der mittleren ± REM für jede Gruppe zu allen Zeitpunkten werden die Daten im Liniendiagrammformat mit der Y-Achse als relative Fluoreszenzintensität und der X-Achse als Zeit dargestellt. Ergänzende Datei 1 enthält ein Beispiel für Rohdaten aus einem kinetischen Lesen der 96-Well-Platte in einem Tabellenkalkulationsformat.
In dieser Studie zeigen die in Abbildung 3Aund Tabelle 3 dargestellten optimalen Ergebnisse, dass 1) die Kokultur mit MSC die phagozytische Aktivität des Makrophagen erhöht, 2) die IFN-y-Behandlung die Aktivität des Makrophagen reduziert und 3) die Kokultur mit MSC die phagozytische Aktivität von MΦ teilweise rettet. Optimale Zelldichten sind in diesen Studien von entscheidender Bedeutung, und wenn MΦ mit einer zu niedrigen Dichte plattiert sind, können Änderungen der Fluoreszenzintensität nicht nachgewiesen werden (Abbildung 3B). Abbildung 3C stellt Daten aus einer Studie dar, in der die MΦ mit einer zu hohen Dichte plattiert wurden und die Fluoreszenzintensität in allen Gruppen schnell erhöht ist und Unterschiede nicht erkannt werden können. Die dynamischen Bildgebungsvideos bestätigen, dass die Änderungen der Fluoreszenzintensität auf eine Phagozytose und nicht auf eine Versauerung des Mediums zurückzuführen sind. Sie liefern auch qualitative Daten und eine visuelle Darstellung der Rate und des Ausmaßes der phagozytischen Aktivität (Abbildung 4).
Abbildung 1: Eine Illustration, die die zentrale Frage der vorgestellten Daten darstellt, nämlich "Kann MSC die phagozytische Aktivität von IFN-γ behandeltem MΦ wiederherstellen?". Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Überblick über den Workflow des Kokultur- und Phagozytose-Assays. Ein Überblick über den Workflow zur quantitativen und qualitativen Analyse der MΦ-Phagozytose-Aktivität in Kokultur mit MSC. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative quantitative Daten aus der kinetischen Lektüre, die optimale und suboptimale Ergebnisse liefert. In (A) sind die Daten repräsentativ für ein Experiment mit optimaler MΦ-Zelldichte, in (B) sind die Daten repräsentativ für ein Experiment mit suboptimal zu niedriger MΦ-Zelldichte und in (C) sind die Daten repräsentativ für ein Experiment mit suboptimal zu hoher MΦ-Zelldichte. Die in relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) gemessene relative Fluoreszenzintensität wird auf der Y-Achse aufgetragen, während die Zeit auf der X-Achse aufgetragen wird. Beachten Sie die Unterschiede im Bereich der RFU zwischen optimalen und suboptimalen Experimenten. In A, MSC teilweise Rettung MΦ phagozytische Aktivität in der Einstellung von IFN-γ Unterdrückung über einen Zeitraum von 70 minuten. Die RFU wird als Mittelwert ± SEM, n = 6 dargestellt. Die Analyse wurde unter Verwendung des Tukey-Tests mit mehreren Vergleichen nach einer signifikanten Zwei-Wege-ANOVA, Interaktionseffekt P = 0,0001, Zeiteffekt P = 0,0001 und Behandlungs-/MSC-Effekt P = 0,0001 durchgeführt. Symbole kennzeichnen die Ergebnisse mehrerer Vergleichstests. * = signifikanter Unterschied zwischen MSC/MΦ + IFN- γ vs MΦ + IFN-γ, Ŧ = signifikanter Unterschied zwischen MΦ vs MΦ + IFN-γ und † = signifikanter Unterschied zwischen MSC/MΦ vs MΦ. Detaillierte Ergebnisse der Mehrfachvergleichstests finden Sie in Tabelle 3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Dynamische Bildgebungsvideos, die eine visuelle Bestätigung des zellspezifischen Anstiegs der Fluoreszenz durch saure Aktivierung markierter Zymosanpartikel nach Einbau in das MΦ-Phagolysosom liefern. Die Zeitraffereinstellungen wurden alle 1 Minute über einen Zeitraum von 30 Minuten mit einer Belichtungszeit von 400 ms und dem EGFP-Filterset erfasst. (A) MΦ in Monokultur, (B) MΦ in Kokultur mit MSC, (C) MΦ behandelt mit IFN-γ (250 ng/ml) und (D) MΦ behandelt mit IFN-γ (250 ng/ml) in Kokultur mit MSC. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| Ein | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| B | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| C | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| D | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| E | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| F | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| G | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| H | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL |
Tabelle 1: Beispiel für ein 96-Well-Plattendesign. CBL - Zelle leer; MSC - gesetzter Tag 1; MΦ+ behandelt und MΦ unbehandelt ausgesät Tag 2; RBL-Reagenz-Blindstoff am Assay-Tag 3 zugegeben.
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ |
Tabelle 2: Beispiel für ein 4-Well-Kammer-Schlittendesign. MSC - plattiert Tag 1; MΦ+ behandelt und MΦ unbehandelt plattiert Tag 2.
| Tukeys Mehrfachvergleichstest | Mittlerer Diff. | 95,00% CI des Diffs. | Unterhalb der Schwelle? | Zusammenfassung | Angepasster P-Wert |
| 0 Minuten | |||||
| MSC/MΦ gegen MΦ | -3871 | -9495 bis 1754 | Nein | Ns | 0.2836 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 720.3 | -4904 bis 6345 | Nein | Ns | 0.9873 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | -77.17 | -5702 bis 5548 | Nein | Ns | >0.9999 |
| 10 Minuten | |||||
| MSC/MΦ gegen MΦ | -3466 | -9091 bis 2159 | Nein | Ns | 0.3817 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 2326 | -3299 bis 7950 | Nein | Ns | 0.7062 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 992 | -4633 bis 6617 | Nein | Ns | 0.968 |
| 20 Minuten | |||||
| MSC/MΦ gegen MΦ | -1311 | -6936 bis 4314 | Nein | Ns | 0.9303 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 3315 | -2310 bis 8940 | Nein | Ns | 0.422 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 3146 | -2478 bis 8771 | Nein | Ns | 0.4689 |
| 30 Minuten | |||||
| MSC/MΦ gegen MΦ | 384.8 | -5240 bis 6010 | Nein | Ns | 0.998 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 2313 | -3312 bis 7937 | Nein | Ns | 0.7098 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 8726 | 3101 bis 14350 | Ja | *** | 0.0005 |
| 40 Minuten | |||||
| MSC/MΦ gegen MΦ | 2247 | -3377 bis 7872 | Nein | Ns | 0.7278 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 4913 | -712.2 bis 10537 | Nein | Ns | 0.1101 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 16521 | 10896 bis 22145 | Ja | **** | <0.0001 |
| 50 Minuten | |||||
| MSC/MΦ gegen MΦ | 5657 | 32,12 bis 11282 | Ja | * | 0.0481 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 4932 | -692.9 bis 10557 | Nein | Ns | 0.1079 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 19083 | 13458 bis 24708 | Ja | **** | <0.0001 |
| 60 Minuten | |||||
| MSC/MΦ gegen MΦ | 12376 | 6752 bis 18001 | Ja | **** | <0.0001 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 9361 | 3736 bis 14986 | Ja | *** | 0.0002 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 24748 | 19123 bis 30373 | Ja | **** | <0.0001 |
| 70 Minuten | |||||
| MSC/MΦ gegen MΦ | 13770 | 8145 bis 19395 | Ja | **** | <0.0001 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 11987 | 6362 bis 17612 | Ja | **** | <0.0001 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 27264 | 21639 bis 32888 | Ja | **** | <0.0001 |
Tabelle 3: Detaillierte statistische Analyse der in Abbildung 3Adargestellten Daten . Ergebnisse der mehrfachen Vergleichstests von Tukey nach einer signifikanten Bidirektional-ANOVA von Daten, die in Abbildung 3Adargestellt sind.
Ergänzende Datei 1: Eine repräsentative Tabellenkalkulationsdatei mit kinetischen Rohdaten aus einem optimalen Experiment. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die Analyse der Phagozytose unter Verwendung von Biopartikeln, die an einen pH-empfindlichen Farbstoff konjugiert sind, ist ein relativ neues Werkzeug, das sich gegenüber herkömmlichen fluoreszenzmarkierten Partikeln als vorteilhaft erwiesen hat12,19,20. Bei herkömmlichen fluoreszenzmarkierten Partikeln ist nur eine Endpunktanalyse möglich. Der Nachweis erfolgt mit Fluoreszenzmikroskopie und/oder Spektrofluorometrie nach dem Waschen oder Abschrecken von Partikeln, die nicht vom Phagoozyten aufgenommen wurden. Quantitative Daten aus der Spektrofluorometrie haben das Potenzial, nicht verschlungene Partikel nachzuweisen, und die Bildanalyse zur Quantifizierung nur intrazellulärer Partikel ist mühsam und zeitaufwendig mit herkömmlichen fluoreszierenden Mikroskopiesystemen14. Biopartikel, die an pH-empfindliche Farbstoffe konjugiert sind, fluoreszieren nur in einer sauren Umgebung wie dem Phagolysosom, und daher sind die mühsamen Wasch- und Löschschritte unnötig14. Darüber hinaus bieten pH-sensitive markierte Biopartikel den Vorteil, dass sie kinetische Daten liefern, die mit FITC oder anderen Fluorophor-konjugierten Biopartikeln nicht leicht erfasst werden könnten.
Studien, die dieses neue Tool verwenden, haben Durchflusszytometrie und / oder Bildgebungsplattformen verwendet, um eine quantitative und kinetische Messung der Phagozytaktivität zu generieren19,20,21. Die Durchflusszytometrie ist vorteilhaft, wenn eine begrenzte Phagozytpopulation vorliegt oder wenn man an einer Sortierung für nachgeschaltete Analysen wie genetische Screens19interessiert ist. Es ist bekannt, dass MSC den MΦ-Phänotyp sowohl durch direkten Kontakt als auch durch lösliche Faktoren regulieren. Vorläufige Studien haben gezeigt, dass konditioniertes Medium aus MSC die MΦ-Phagozytose unterdrückt, und daher wurde dieses Protokoll entwickelt, um die Veränderungen der phagozytischen Aktivität von MΦ in direkter Kokultur mit MSC zu bestimmen. Unter diesen Bedingungen sind die Spektrofluorometrie zur Quantifizierung und die dynamische Bildgebung zur Visualisierung und Bestätigung der phagozytischen Aktivität am besten geeignet.
Entscheidend für den Erfolg dieser Methoden ist die Optimierung der Zelldichten. Die MSC müssen mit einer Dichte plattiert werden, die einen optimalen Zellkontakt mit den MΦ-Zellen ermöglicht. MΦ muss in Mono- und Co-Kulturen mit einer Dichte ausgesät werden, die nicht nur einen optimalen Kontakt, sondern auch eine optimale Fluoreszenzdetektion ermöglicht. Eine zu geringe Dichte führt zu einem geringen Einbau in das Phagolysosom und zu kleinen oder flachen Veränderungen der relativen Fluoreszenzeinheiten (Abbildung 3B). Wenn MΦ mit einer zu hohen Dichte ausgesät werden, nimmt die Phagozytose schnell zu und der Nachweis von Unterschieden zwischen gruppen wird maskiert (Abbildung 3C). Die Optimierung der Konzentration von pH-sensitiven Farbstoff-markierten Zymosanpartikeln pro Zellzahl ist ebenfalls von entscheidender Bedeutung. Vorbereitende Experimente sollten durchgeführt werden, um die Zelldichten von MSC und MΦ und die Anzahl der Partikel pro MΦ-Zelle zu optimieren. Zusätzlich sollten diese Optimierungsschritte unternommen werden, wenn andere markierte Biopartikel wie E. coli oder S. aureusverwendet werden.
Das geeignete Bildgebungsmedium ist ebenfalls entscheidend. Das Medium für beide Methoden sollte ein gepuffertes Medium sein und kein Phenolrot enthalten. Phenolrot schaltet die Erkennung der Fluoreszenzemission stumm. Außerdem aktiviert jeder Zusatzstoff oder Zustand, der das Medium ansäuern kann, vorzeitig die markierten Partikel und führt einen erhöhten Hintergrund ein. Der Reagenzien-Rohling ist entscheidend für die Identifizierung der möglichen Versauerung des Mediums.
Diese Protokolle können nicht nur verwendet werden, um die MSC-Regulation der MΦ-Phagozytose einer Vielzahl von pH-sensitiven Biopartikeln zu untersuchen, sondern die Methode kann auch auf eine Vielzahl von Kokulturmodellen angewendet werden, die Neutrophile und andere Phagozyten umfassen. Darüber hinaus können mit diesem Modell Moleküle und Signalwege, die im Verdacht stehen, an der kontaktvermittelten Regulation der phagozytären Aktivität von Makrophagen beteiligt zu sein, über siRNA- oder CRISPR-vermittelte Downregulation untersucht werden, um vermutete molekulare Ziele zu validieren oder zu widerlegen. Mögliche Ziele sind Adhäsionsmoleküle, phagozytische Rezeptoren und Integrinmoleküle.
Die Arbeit mit diesen Methoden wird neue Informationen über die Signalmechanismen aufdecken, die den erhöhten phagozytischen Reaktionen von MΦ nach Zellkontaktinteraktionen mit MSC zugrunde liegen, wodurch unser Verständnis der Rolle von MSC bei der Regulierung der angeborenen Immunität verbessert wird. Studien wie diese befassen sich mit einem wenig untersuchten Gebiet und werden ein vollständiges Bild des Einflusses von MSC auf die Makrophagenaktivität liefern, der für ein vollständiges Verständnis ihrer Rolle bei der Immunität notwendig ist.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom NSF Major Research Instrument-Mechanismus unter den Fördernummern 1626093 und 1919583 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Black Polystyrene Microplate | MilliporeSigma | CLS3603-48EA | |
| 0.4% trypan blue solution | MilliporeSigma | T8154-20ML | |
| 15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 339653 | |
| 4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | ThermoFisher | 155382PK | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco | ThermoFisher | 15240096 | |
| Axiobserver 7 Imaging System | Zeiss | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MilliporeSigma | A8806-1G | |
| Cell lifter | MilliporeSigma | CLS3008-100EA | |
| Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75 cm2, canted neck, with cap, filtered | MilliporeSigma | C7231-120EA | |
| D1 ORL UVA [D1] | ATCC | CRL-12424 | Mouse MSC Cell Line |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Hemocytometer | FisherScientific | 02-671-51B | |
| I-11.15 | ATCC | CRL-2470 | Mouse MΦ Cell Line |
| LADMAC Cell Line | ATCC | CRL-2420 | LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1). |
| Live-Cell Imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010031 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate | ThermoFisher | P35365 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Preprotech | 315-05 | |
| Spectramax i3X | Molecular Devices | ||
| Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 µm | ThermoFisher | 568-0020 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 micrometer | ThermoFisher | 723-2520 | |
| Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm | MilliporeSigma | CLS430167-100EA | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher | 25300054 |
References
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