Summary
Qui viene presentato un protocollo per quantificare e produrre immagini dinamiche della regolazione mediata da cellule staminali mesenchimali (MSC) della fagocitosi macrofagica (MΦ) di particelle di lievito non opsonizzato (zymosan) coniugate a una molecola fluorescente sensibile al pH.
Abstract
Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono state tradizionalmente studiate per le loro proprietà rigenerative, ma più recentemente, le loro caratteristiche immunoregolatrici sono state in prima linea. Interagiscono e regolano l'attività delle cellule immunitarie. Il focus di questo studio è la regolazione MSC dell'attività fagocitica dei macrofagi. La fagocitosi dei macrofagi (MΦ) è una parte importante della risposta del sistema immunitario innato alle infezioni e i meccanismi attraverso i quali MSC modula questa risposta sono in fase di studio attivo. Qui viene presentato un metodo per studiare la fagocitosi MΦ di particelle di zimosan non opsonizzate coniugate a una molecola fluorescente sensibile al pH mentre sono in co-coltura con MSC. Man mano che l'attività fagocitica aumenta e le particelle di zimosane etichettate sono racchiuse nell'ambiente acido del fagolisiosoma, aumenta l'intensità di fluorescenza della molecola sensibile al pH. Con le opportune lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione, l'attività fagocitica viene misurata utilizzando uno spettrofotometro fluorescente e i dati cinetici vengono presentati come cambiamenti nelle unità fluorescenti relative per un periodo di 70 minuti. Per supportare questi dati quantitativi, il cambiamento nell'attività fagocitica viene visualizzato utilizzando l'imaging dinamico. I risultati che utilizzano questo metodo dimostrano che quando in co-coltura, MSC migliora la fagocitosi MΦ dello zimosan non opsonizzato di MΦ trattato sia naïve che IFN-γ. Questi dati si aggiungono alle attuali conoscenze sulla regolazione MSC del sistema immunitario innato. Questo metodo può essere applicato in indagini future per delineare completamente i meccanismi cellulari e molecolari sottostanti.
Introduction
Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono cellule progenitrici che danno origine a cellule del tessuto connettivo. Le MSC sono presenti nei tessuti dei mammiferi adulti e possono essere isolate dal midollo osseo1. A causa delle loro proprietà immunomodulatorie, queste cellule sono ampiamente studiate2. I primi studi si sono concentrati sulla regolazione MSC delle cellule T3,4,5,6 ma più recentemente, la loro regolazione delle cellule macrofagiche (MΦ), una delle principali componenti cellulari dell'immunità innata, ha ricevuto maggiore attenzione7,8,9,10,11,12,13,14 . L'importanza dell'interazione MSC-MΦ nel trattamento della malattia infiammatoria è sottolineata dal fatto che l'esaurimento dei monociti/macrofagi abroga gli effetti terapeutici della MSC nei modelli animali8. Qui, il focus è l'interazione di contatto cellulare dell'MSC con MΦ. MSC hanno la capacità di regolare il fenotipo di MΦ promuovendo il passaggio da risposte infiammatorie a anti-infiammatorie, portando ad attività di riparazione tissutale8,9,10,11, e molto è stato fatto per dimostrare questi meccanismi regolatori. In altre circostanze, MSC può supportare o esacerbare una risposta infiammatoria guidata da MΦ12,13 e migliorare l'attività fagocitica MΦ14,15. Tuttavia, vi è una mancanza critica di dati esistenti che identifichino i meccanismi e le condizioni in cui MSC regola l'attività fagocitica di MΦ.
MΦ hanno famiglie di recettori che riconoscono patogeni opsonizzati (anticorpi o complementi rivestiti) o non opsonizzati che portano alla fagocitosi16. L'attivazione e l'attività di quest'ultimo è meno ben studiata17. In un ambiente non infiammatorio in vitro, MSC migliora la fagocitosi MΦ di agenti patogeni non opsonizzati13. Tuttavia, il riconoscimento di patogeni non opsonizzati da parte di MΦ può essere ridotto dopo l'esposizione a un ambiente infiammatorio prodotto dai linfociti durante una risposta immunitaria adattativa. IFN-γ, rilasciato da cellule natural killer e linfociti effettori, ha un effetto inibitorio sulla fagocitosi MΦ di particelle non opsonizzate18. È stato sviluppato un modello di co-coltura per studiare i meccanismi di regolazione del contatto diretto MSC della fagocitosi MΦ. L'obiettivo dell'esperimento qui presentato è determinare se MSC regola la fagocitosi MΦ di agenti patogeni non opsonizzati dopo che MΦ è stato esposto a IFN-γ (Figura 1).
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Protocol
NOTA: Tutte le tecniche di preparazione del mezzo e di coltura cellulare vengono eseguite in condizioni asettiche utilizzando un armadio di biosicurezza con flusso laminare. Tutte le fasi di incubazione della coltura descritte vengono effettuate utilizzando un incubatore progettato per mantenere un'atmosfera di 37 °C, 5% CO2e 95% di umidità.
1. Coltura cellulare
- Preparazione del terreno di coltura
- Per MSC e LADMAC, aggiungere 50 ml di FBS e 5 ml di miscela antibiotica/antimicotica 100x a 500 ml di DMEM ad alto contenuto di glucosio.
- Per l'MΦ, aggiungere 50 mL di FBS, 100 mL di mezzo di condizione LADMAC (preparato seguendo i passaggi del paragrafo 1.2) e 5 mL di miscela antibiotica 100x a 500 mL di DMEM ad alto contenuto di glucosio.
NOTA: le cellule LADMAC producono il fattore stimolante le colonie (CSF-1) necessario per supportare la crescita delle cellule MΦ.
- Preparazione del mezzo condizionato LADMAC
- Per seminare cellule LADMAC da stock congelati, aggiungere 19 mL di terreno di coltura dal punto 1.1 in ciascuno dei cinque palloni trattati con colture cellulari T75 cm2 e metterli nell'incubatore di colture cellulari per 15 minuti per equilibrare a 37 °C.
- Nel frattempo, scongelare rapidamente un'aliquota di10 6 cellule congelate incubando in un bagno d'acqua a 37 °C per 2-3 minuti o fino a quando non viene scongelato. Aggiungere le celle a 9 mL di terreno di coltura MSC fresco in un tubo conico sterile da 15 mL o 50 mL e centrifugare a 125 x g in un rotore a benna oscillante per 5 minuti.
- Aspirare o decantare il surnatante, aggiungere 5 ml di terreno di coltura fresco e pipettare delicatamente su e giù per ricaspendare il pellet cellulare.
- Aggiungere 1 mL di sospensione cellulare a ciascuno dei cinque palloni T75 cm2 utilizzando una pipetta sierologica sterile e metterli nell'incubatore di colture cellulari.
- Ogni 2-3 giorni, aggiungere altri 10 ml di media in un periodo di 7-10 giorni. Quindi, raccogliere le cellule e il surnatante in tubi conici sterili da 50 ml utilizzando una pipetta sierologica sterile e centrifuga a 125 x g per 5 minuti.
- Separare il surnatante dal pellet cellulare e filtrare sterile il surnatante utilizzando un'unità filtrante a vuoto monouso sterile da 0,2 μm.
- Rimuovere il gruppo aspiratore dalla confezione e collegarlo tramite tubo sottovuoto alla pompa dell'aspiratore. Versare il surnatante nello scomparto superiore e sostituire il coperchio. Accendere la pompa dell'aspiratore per filtrare nel compartimento inferiore.
- Preparare le aliquote mediante pipettaggio in tubi conici sterili da 50 mL e conservare a -20 °C.
- Per congelare il pellet cellulare, riconsegreire nel mezzo di congelamento a10 6 celle/ml, metterlo in un contenitore di congelamento e quindi metterli in un congelatore a -80 °C. Dopo 24 ore, trasferire al deposito LN2.
- Propagare le cellule in preparazione per la co-coltura
- Per seminare le cellule MSC e MΦ dallo stock congelato, equilibrare 9 mL di terreno di coltura appropriato preparato nel paragrafo 1.1 in ciascuna delle quattro stoviglie trattate con colture cellulari da 100 mm per ciascun tipo di cellula e collocarle nell'incubatore di colture cellulari per 15 minuti.
- Nel frattempo, scongelare rapidamente le aliquote di10 6 cellule congelate incubandole in un bagno d'acqua a 37 °C per 2-3 minuti o fino a quando non si sono appena scongelate. Quindi, aggiungere le celle MSC scongelate a 9 mL di terreno di coltura MSC fresco e aggiungere le celle MΦ scongelate a 9 mL di terreno di crescita MΦ fresco in tubi conici sterili da 15 o 50 mL e centrifugare a 125 x g nel rotore a benna oscillante per 5 minuti.
- Aspirare o decantare il surnatante e ricaspenare ogni pellet in 4 mL del mezzo di crescita fresco appropriato pipettando delicatamente su e giù. Aggiungere 1 mL di sospensione cellulare a ciascuna delle quattro parabole da 100 mm per ciascun tipo di cella che sono state bilanciate al punto 1.3.1.
- Restituire i piatti con le cellule all'incubatrice. Cambiare il mezzo ogni 2-3 giorni fino al 70% -80% confluente.
2. Sementi MSC in piatti sperimentali, Giorno 1
NOTA: Prima di seminare l'MSC, progettare il layout sperimentale della piastra a 96 pozzi per la spettrofotometria fluorescente e la diapositiva della camera per l'imaging dinamico. Per la piastra a 96 pozzi, affiancare pozzi sperimentali con pozzi contenenti cellule ma non utilizzarli nel saggio. Contrassegnare almeno quattro pozzi da utilizzare per il reagente in bianco (RBL). Vedere la Tabella 1 per un modello di esempio a 96 pozzeni e la Tabella 2 per un esempio di modello di diapositiva a camera a 4 pozzeli. Si consigliano piastre nere o bianche a 96 pozzetti con fondo trasparente. Una slitta in camera di vetro borosilicato da 1,5 mm è ottimale, ma il numero di camere può essere regolato in base al progetto dello studio. Un diagramma di flusso riepilogativi dei metodi seguenti è incluso nella Figura 2.
- Con una confluenza del 70%-80%, aspirare il terreno di crescita dalle colture in piatti da 100 mm e aggiungere 5 ml di PBS per isolare l'MSC.
- Aspirare il PBS, aggiungere 2 ml di tripsina allo 0,05% / EDTA e metterlo nell'incubatore di colture per 3-5 minuti.
- Dopo 3 minuti, controllare il distacco cellulare utilizzando un microscopio invertito. Se le celle sono staccate, continuare con il passaggio successivo; in caso contrario, continuare l'incubazione per altri 1-2 minuti. Non incubare più a lungo di 5-6 min.
- Aggiungere 5 ml di terreno di coltura fresco al piatto con le cellule staccate. Risciacquare il piatto con la miscela tripsina/media e raccogliere le cellule in un tubo conico pulito e sterile da 50 ml utilizzando una pipetta sierologica sterile.
- Centrifuga per 5 min a 125 x g. Aspirare il surnatante e risusediare il pellet cellulare in 10 ml di terreno di coltura fresco tubando delicatamente su e giù.
- Per contare le cellule, aggiungere 10 μL della sospensione cellulare a 30 μL di soluzione blu di tripano allo 0,4% in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL. Quindi, pipettare 10 μL della miscela sotto il coperchio di una camera di conteggio dell'emocitometro.
- Utilizzando un microscopio a campo invertito o luminoso, con l'obiettivo 10x, contare le cellule non macchiate (vitali) in quattro dei quadrati 2 da1 mm. Calcola il numero di cella usando la formula: celle/mL = conteggio celle/# 1 mm2 quadrati x fattore di diluizione x 104.
NOTA: per questo esempio, il numero di 1 mm2 quadrati contati è quattro e il fattore di diluizione è 4. - Utilizzare l'equazione C1V1 = C2V2 per calcolare e preparare una sospensione 1 x10 5 celle/mL. Preparare 1 mL di cella/mL di sospensione per ogni colonna della piastra a 96 pozzi da riempire e 0,75 mL per ogni camera della slitta a 4 pozzi da riempire secondo il design della piastra.
NOTA: C1 = conteggio delle celle, V1 = ciò che viene calcolato, C2 = 1 x 105, V2 = 5,50 ml. - Determinare V1, sottrarlo dai 5,50 ml desiderati del volume totale per determinare il volume del mezzo fresco necessario per preparare la sospensione. Aggiungere il volume di celle (V1) dalla sospensione originale al volume del mezzo fresco per un totale di 5,50 ml con 1 x 105 celle/ml.
- Aggiungere 100 μL di sospensione 1 x10 5 celle/mL a ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti in base al design della piastra utilizzando un micropipettor multicanale e 530 μL a ciascuno dei pozzetti della slitta della camera utilizzando una micropipetta in base al design della piastra. Incubare durante la notte.
NOTA: per questo esperimento, gli MSC sono placcati nelle colonne 1, 2, 3 e 6 della piastra a 96 pozzi (Tabella 1) e nei pozzi 1 e 2 della slitta a camera a 4 pozzi (Tabella 2). Pertanto, vengono preparati almeno 5,50 mL di una sospensione 1 x10 5 celle/mL. MΦ all'80% di confluenza vengono trattati con mediatori infiammatori lo stesso giorno in cui le MSC vengono seminate nelle piastre sperimentali.
3. Attiva l'MΦ con IFN-γ, Giorno 1
- Preparare il mezzo di attivazione e lo stock γ IFN.
- Per 200 mL di mezzo di attivazione, aggiungere 40 mg di BSA a 200 mL di DMEM ad alto contenuto di glucosio privo di siero e filtro sterile utilizzando un'unità filtrante a vuoto monouso sterile da 0,2 μm.
- Per preparare lo 0,1% di BSA/PBS, aggiungere 20 mg di BSA a 20 ml di PBS. Vortice per dissolversi. Utilizzare un filtro a siringa sterile da 0,2 μm per filtrare in un tubo conico pulito e sterile da 50 ml.
- Aggiungere 1 mL della soluzione sterile allo 0,1% di BSA/PBS a 100 μg di IFN-γ liofilizzato per ottenere una soluzione stock di 100 μg/mL. Conservare in aliquote da 50 μL a -20 °C.
- Attivare l'MΦ con IFN-γ
- Aggiungere 2,5 μL di 100 μg/mL di stock ifn-γ per ogni 1 mL del mezzo necessario. Per ogni piatto da 100 mm da attivare, preparare 10 mL di mezzo di attivazione contenente IFN-γ ad una concentrazione di 250 ng/mL.
- Aspirare il terreno di crescita dalle colture MΦ e sostituirlo con 5 mL del mezzo di attivazione senza IFN-γ risciacquare.
- Aspirare il mezzo utilizzato per il risciacquo e sostituirlo con 10 mL di IFN-γ mezzo di attivazione integrato per il piatto sperimentale e con 10 mL di mezzo di attivazione non integrato per il controllo. Incubare le colture per 16-24 ore.
4. Isolare il MΦ e preparare le co-colture, Giorno 2
- Rimuovere il mezzo di attivazione dalle cellule MΦ e sostituirlo con 5 mL di terreno di crescita fresco. Raschiare delicatamente con un sollevatore di celle e raccogliere le cellule in un tubo conico da 50 ml.
- Contare le cellule usando l'esclusione blu del tripano e l'emocitometria come descritto per MSC nei passaggi 2.6-2.7.
- Usando l'equazione nei passaggi 2.8-2.9, preparare due sospensioni separate di 2 x10 5 celle/ mL, una con cellule del controllo e una con cellule delle colture MΦ trattate.
NOTA: Preparare 1 mL di cella/mL di sospensione per ogni colonna della piastra a 96 pozzi da riempire e 0,75 mL per ogni camera della slitta a 4 pozzi da riempire secondo il design della piastra. - Aspirare delicatamente il mezzo dai pozzi sperimentali della piastra a 96 pozzi contenente MSC. Utilizzando una micropipetta multicanale, aggiungere 100 μL delle sospensioni cellulari MΦ trattate e di controllo nei pozzetti sperimentali appropriati con e senza MSC in base al design della piastra. Incubare durante la notte.
- Aspirare delicatamente il mezzo dal vetrino a camera a 4 pozzetti contenente MSC e, utilizzando una micropipetta, aggiungere 530 μL di sospensione cellulare MΦ ai pozzetti appropriati in base al progetto. Incubare durante la notte.
5. Saggio di fagocitosi, lettura della piastra cinetica fluorescente a 96 pozzi, giorno 3
- Impostare i parametri del test
- Il giorno del test, accendere il lettore di piastre fluorescenti e impostare al computer la temperatura del sistema a 37 °C.
- Aprire il software Pro di sistema e controllare l'icona dello strumento nell'angolo in alto a sinistra per determinare se lo strumento è collegato al computer. Se il cerchio rosso con una linea è visibile, fare clic sull'icona dello strumento e scegliere lo strumento nella finestra pop-up per effettuare la connessione.
- Selezionare Nuovo esperimento per accedere alla finestra pop-up Plate Set-Up Helper. Dal menu Plate Set-Up Helper, selezionare Configura le impostazioni di acquisizione.
- Selezionare Monocromatore dal menu delle impostazioni per la configurazione ottica. Selezionare FL (fluorescenza) per la modalità di lettura e Kinetic per il tipo di lettura.
- Nella stessa finestra delle configurazioni, in Categoria,fare clic su Lunghezze d'onda,quindi impostare le larghezze di banda su 9 nm per l'eccitazione e 15 nm per l'emissione.
- Impostare il numero di coppie di lunghezze d'onda su 1. Impostare le lunghezze d'onda LM1 a 510 nm per l'eccitazione e a 540 nm per l'emissione.
- Continuare tra le categorie e selezionare Tipo di piastra successiva. Selezionare l'opzione corrispondente al tipo di piastra utilizzato.
NOTA: è importante che la selezione corrisponda al tipo di piastra. Le altezze di lettura sono impostate dal sistema in base alla selezione. - Quindi, selezionare Area di lettura ed evidenziare l'area della piastra a 96 pozzi inclusa nel progetto sperimentale.
- Selezionare PMT e Ottica, impostare PMT Gain su High e Flash per lettura su 6. Seleziona la casella accanto a Leggi dal basso se usi una piastra trasparente.
- Selezionare Temporizzazione e impostare intervalli di 10 minuti per un periodo di 70 minuti.
- Selezionare Agita, selezionare la casella Prima della prima lettura e impostare per 5 s. Selezionare la casella Tra le letture e impostare per 3 s. Impostate l'intensità del frullato sia per Basso che per Lineare.
- Chiudi la finestra. Quando viene visualizzata la finestra Plate Set-Up Helper, selezionare Configura il layout della piastra. Evidenziare i pozzi BL del design della piastra e fare clic su Plate Blank.
- Evidenziare ciascuna delle righe sperimentali, fare clic su Aggiungi, denominare il gruppo e quindi selezionare un colore.
- In Opzioni di assegnazione sotto il design della piastra, selezionare Serie, quindi definire la serie nella finestra e fare clic su OK. Ripetere l'operazione per ogni gruppo.
- Preparare la sospensione di zymosan
- In attesa che la temperatura del sistema raggiunga i 37 °C, riconsepare 1 mg di particelle di zymosan in 5 mL del mezzo di imaging a cellule vive.
- Aggiungere 1 mL di mezzo di imaging a cellule vive al flaconcino contenente le particelle e raccoglierle in un tubo di coltura di vetro. Risciacquare il flaconcino con un ulteriore 1 mL di soluzione di imaging e trasferirlo nello stesso tubo di vetro per assicurarsi che tutte le particelle vengano trasferite. Aggiungere 3 mL di soluzione di imaging aggiuntiva per ottenere una sospensione di particelle di 0,2 mg/mL.
- Vortice con impulsi rapidi per 30-60 s. Quindi, utilizzare un sonicatore a sonda per sonicare con 60 impulsi rapidi.
NOTA: È molto importante creare una sospensione omogenea di particelle e non lasciare che la sospensione rimanga troppo a lungo prima di aggiungerla ai pozzeggi sperimentali. L'aggregazione si ripete rapidamente. Potrebbe essere necessario ottimizzare la densità della particella per cella a seconda della fonte, del trattamento e della densità di MΦ utilizzata. Negli studi presentati sono state utilizzate particelle di zimosan coniugate. Tuttavia, sono disponibili anche E. coli e S. aureus coniugati.
- In attesa che la temperatura del sistema raggiunga i 37 °C, riconsepare 1 mg di particelle di zymosan in 5 mL del mezzo di imaging a cellule vive.
- Aggiungere zymosan e leggere la piastra
- Aspirare il mezzo dai pozzi sperimentali e risciacquare 1x con 100 μL della soluzione di imaging a cellule vive. Risciacquare anche i pozzi RBL con la soluzione di imaging a cellule vive.
- Aspirare la soluzione di imaging a cellule vive da pozzi sperimentali e RBL e sostituirla con 100 μL della sospensione di particelle di zymosan preparata al punto 5.2.
- Aprire il vassoio della piastra del lettore fluorescente utilizzando l'interfaccia touchpad. Impostare la piastra, senza coperchio, nel vassoio con il pozzetti A1 nell'angolo in alto a sinistra. Chiudi il vassoio utilizzando il touchpad e fai clic sul pulsante verde Leggi nel menu in alto.
- Al termine della lettura, salvare il file nella cartella appropriata ed esportare i dati in formato foglio di calcolo facendo clic su File e selezionando Esporta.
- Calcola la fluorescenza relativa ± SEM per ciascun gruppo di replica in ogni punto temporale (10 min, 20 min, 30 min, ecc.) nel foglio di calcolo (File supplementare 1) e trasferisci i dati al software di grafici.
- Utilizzare un formato grafico a linee per presentare i dati e applicare ANOVA bidirezionale (Time x Treatment/MSC come fattori) seguito dal test di confronto multiplo di Tukey per determinare le differenze tra i singoli gruppi.
NOTA: mentre la lettura della piastra a 96 pozzetti è in corso, preparare la piastra di imaging dinamico per l'acquisizione di immagini time-lapse. Assicurarsi che l'imaging dinamico proceda con l'analisi di un pozzo sperimentale alla volta.
6. Saggio di fagocitosi, imaging dinamico, Giorno 3
- Accendere il sistema di imaging e il computer. Fare doppio clic per aprire il software. Selezionare la modalità programma Pro.
- Controllare l'area del palco per assicurarsi che non siano presenti campioni e che nulla impedisca il movimento del palco. Quindi, fai clic su Calibra ora.
- Sotto il menu Incubazione nella barra laterale a destra, seleziona la casella accanto a H Unit XL e impostala su 37 °C.
NOTA: attendere che la fase incubata sia quasi alla temperatura prima di preparare i campioni per l'imaging. - Risciacquare il primo pozzo sperimentale con 750 μL di mezzo di imaging e sostituirlo con 400 μL della sospensione di particelle di zimosan preparata nel paragrafo 5.2. Lasciare i restanti pozzi nel mezzo di crescita.
NOTA: Potrebbe essere necessario vorticosamente e sonicare nuovamente la sospensione di particelle brevemente se si è stabilizzata per più di 15 minuti. - Posizionare il vetrino sullo stadio incubato del sistema di imaging. Imposta un timer per 10 minuti.
- Utilizzare il software di imaging, selezionare Brightfield nella scheda Individua, quindi fare clic sull'icona dell'oculare nella finestra di configurazione del sistema sottostante. Con l'obiettivo 10x in posizione, utilizzare l'oculare e la manopola di messa a fuoco per mettere a fuoco le cellule.
- Selezionare la scheda Acquisizione, utilizzare il menu a discesa Esperimento, quindi selezionare un set di lunghezze d'onda che include il filtro EGFP impostato per adattarsi alle lunghezze d'onda di emissione di 533 nm di eccitazione a 509 nm del colorante sensibile al pH.
- Quando c'è ~ 2 min rimasto sul timer, utilizzare il software per cambiare l'obiettivo a 20x facendo clic sull'icona 20x nel menu obiettivo.
- Fare clic sul menu Canali, selezionare Filtri EGFP e utilizzare il menu Esposizione per impostare il tempo di esposizione a 400 ms per rilevare il fluoroforo verde sensibile al pH una volta che è stato racchiuso nel fagolisiosoma.
- Fare clic su Live e regolare la messa a fuoco utilizzando la manopola di messa a fuoco.
- Fai clic su Stop per spegnere la luce e seleziona la casella accanto all'impostazione sperimentale Time-lapse in alto.
- Nel menu Strategia di messa a fuoco selezionare Messa a fuoco automatica software. Dal menu a discesa nel menu Messa a fuoco automatica, selezionare Impostazioni smart e grossolane per ridurre il tempo di esposizione alla luce mentre l'autofocus è in esecuzione.
- Nel menu Time-Lapse, impostare il numero desiderato di acquisizioni su 30-60 e il tempo di intervallo su 1 min.
- Dopo aver impostato i parametri time-lapse e dopo 10 minuti di aggiunta di particelle al primo pozzo, fare clic sul pulsante Avvia esperimento per iniziare l'acquisizione.
- Quando l'acquisizione è completa utilizzando il primo pozzo sperimentale, ripetere i passaggi 6.4-6.12 per ciascuno dei pozzi sperimentali rimanenti.
- Salva tutti i file dell'esperimento con la data e i parametri nel titolo nella cartella appropriata.
- Chiudere il software. Riapri il software in modalità elaborazione ed esporta i file in formato MP4 utilizzando il menu Esporta.
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Representative Results
Dopo aver calcolato la ± SEM media per ciascun gruppo in tutti i punti temporali, i dati vengono presentati in formato grafico a linee con l'asse Y come intensità fluorescente relativa e l'asse X come tempo. Il file supplementare 1 fornisce un esempio di dati grezzi da una lettura cinetica della piastra a 96 pozzetti in formato foglio di calcolo.
In questo studio, i risultati ottimali presentati in Figura 3Ae Tabella 3 dimostrano che 1) la co-coltura con MSC migliora l'attività fagocitica del macrofago, 2) il trattamento IFN-y riduce l'attività del macrofago e 3) la co-coltura con MSC salva parzialmente l'attività fagocitica di MΦ. Le densità cellulari ottimali sono fondamentali in questi studi e quando gli MΦ sono placcati a una densità troppo bassa, non è possibile rilevare variazioni dell'intensità di fluorescenza (Figura 3B). La figura 3C rappresenta i dati di uno studio in cui gli MΦ sono stati placcati a densità troppo elevata e l'intensità di fluorescenza è elevata rapidamente in tutti i gruppi e le differenze non possono essere individuate. I video di imaging dinamico confermano che i cambiamenti di intensità fluorescente derivano dalla fagocitosi e non dall'acidificazione del mezzo. Forniscono inoltre dati qualitativi e una rappresentazione visiva della velocità e dell'entità dell'attività fagocitica (Figura 4).
Figura 1: Un'illustrazione che illustra la domanda centrale dei dati presentati, che è "MSC può recuperare l'attività fagocitica di IFN-γ trattato MΦ?". Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Panoramica del flusso di lavoro del test di co-coltura e fagocitosi. Cenni sul flusso di lavoro per l'analisi quantitativa e qualitativa dell'attività di fagocitosi MΦ in co-coltura con MSC. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Dati quantitativi rappresentativi della cinetica che mostrano risultati ottimali e non ottimali. In (A), i dati sono rappresentativi di un esperimento con densità cellulare MΦ ottimale, in (B) i dati sono rappresentativi di un esperimento con densità cellulare MΦ non ottimale troppo bassa, e in (C), i dati sono rappresentativi di un esperimento con densità cellulare MΦ non ottimale troppo alta. L'intensità di fluorescenza relativa misurata in unità fluorescenti relative (RFU) è tracciata sull'asse Y, mentre il tempo è tracciato sull'asse X. Si notino le differenze nella gamma di RFU tra esperimenti ottimali e sub-ottimali. In A, MSC salva parzialmente l'attività fagocitica di MΦ nell'impostazione della soppressione dell'IFN-γ per un periodo di 70 minuti. L'RFU è presentato come media ± SEM, n = 6. L'analisi è stata eseguita utilizzando il test di confronto multiplo di Tukey dopo un significativo ANOVA bidirezionale, effetto interazione P = 0,0001, effetto tempo P = 0,0001 e effetto trattamento / MSC P = 0,0001. I simboli indicano i risultati di più test di confronto. * = differenza significativa tra MSC/MΦ + IFN- γ vs MΦ + IFN-γ, Ŧ = differenza significativa tra MΦ vs MΦ + IFN-γ e † = differenza significativa tra MSC/MΦ vs MΦ. Vedere la Tabella 3 per i risultati dettagliati dei test di confronto multipli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Video di imaging dinamico che forniscono conferma visiva dell'aumento della fluorescenza cellula-specifica dall'attivazione acida di particelle di zymosan etichettate dopo l'incorporazione nel fagolisiosoma MΦ. Le impostazioni di time-lapse sono state l'acquisizione ogni 1 minuto per un periodo di 30 minuti utilizzando un tempo di esposizione di 400 ms e il set di filtri EGFP. (A) MΦ in monocoltura, (B) MΦ in cocoltura con MSC, (C) MΦ trattati con IFN-γ (250 ng/mL) e (D) MΦ trattati con IFN-γ (250 ng/mL) in co-coltura con MSC. Fare clic qui per scaricare questo file.
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| Un | CBL · | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL · | RBL · | |||||
| B | CBL · | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL · | RBL · | |||||
| C | CBL · | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL · | RBL · | |||||
| D | CBL · | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL · | RBL · | |||||
| E | CBL · | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL · | RBL · | |||||
| F | CBL · | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL · | RBL · | |||||
| G | CBL · | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL · | RBL · | |||||
| H | CBL · | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL · | RBL · |
Tabella 1: Esempio di un design della piastra a 96 pozzetti. CBL - Cella vuota; MSC - seeded giorno 1; MΦ+ trattati e MΦ non trattati seme giorno 2; Reagente RBL in bianco aggiunto il giorno 3 del test.
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ |
Tabella 2: Esempio di progettazione di una slitta a 4 pozzette. MSC - placcato giorno 1; MΦ+ trattati e MΦ non trattati placcati giorno 2.
| Test di confronti multipli di Tukey | Diff. medio | 95,00% CI di diff. | Sotto soglia? | Sommario | Valore P rettificato |
| 0 minuti | |||||
| MSC/MΦ vs MΦ | -3871 | -dal 9495 al 1754 | No | Ns | 0.2836 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs MΦ + IFN-γ | 720.3 | Da -4904 a 6345 | No | Ns | 0.9873 |
| MΦ vs MΦ + IFN-γ | -77.17 | Da -5702 a 5548 | No | Ns | >0,9999 |
| 10 minuti | |||||
| MSC/MΦ vs MΦ | -3466 | Da -9091 a 2159 | No | Ns | 0.3817 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs MΦ + IFN-γ | 2326 | Da -3299 a 7950 | No | Ns | 0.7062 |
| MΦ vs MΦ + IFN-γ | 992 | Da -4633 a 6617 | No | Ns | 0.968 |
| 20 minuti | |||||
| MSC/MΦ vs MΦ | -1311 | Da -6936 a 4314 | No | Ns | 0.9303 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs MΦ + IFN-γ | 3315 | Da -2310 a 8940 | No | Ns | 0.422 |
| MΦ vs MΦ + IFN-γ | 3146 | Da -2478 a 8771 | No | Ns | 0.4689 |
| 30 minuti | |||||
| MSC/MΦ vs MΦ | 384.8 | Da -5240 a 6010 | No | Ns | 0.998 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs MΦ + IFN-γ | 2313 | Da -3312 a 7937 | No | Ns | 0.7098 |
| MΦ vs MΦ + IFN-γ | 8726 | Da 3101 a 14350 | Sì | *** | 0.0005 |
| 40 minuti | |||||
| MSC/MΦ vs MΦ | 2247 | Da -3377 a 7872 | No | Ns | 0.7278 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs MΦ + IFN-γ | 4913 | Da -712,2 a 10537 | No | Ns | 0.1101 |
| MΦ vs MΦ + IFN-γ | 16521 | Da 10896 a 22145 | Sì | **** | <0,0001 |
| 50 minuti | |||||
| MSC/MΦ vs MΦ | 5657 | 32.12 a 11282 | Sì | * | 0.0481 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs MΦ + IFN-γ | 4932 | Da -692,9 a 10557 | No | Ns | 0.1079 |
| MΦ vs MΦ + IFN-γ | 19083 | Da 13458 a 24708 | Sì | **** | <0,0001 |
| 60 minuti | |||||
| MSC/MΦ vs MΦ | 12376 | Da 6752 a 18001 | Sì | **** | <0,0001 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs MΦ + IFN-γ | 9361 | Dal 3736 al 14986 | Sì | *** | 0.0002 |
| MΦ vs MΦ + IFN-γ | 24748 | Dal 19123 al 30373 | Sì | **** | <0,0001 |
| 70 minuti | |||||
| MSC/MΦ vs MΦ | 13770 | Da 8145 a 19395 | Sì | **** | <0,0001 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs MΦ + IFN-γ | 11987 | Da 6362 a 17612 | Sì | **** | <0,0001 |
| MΦ vs MΦ + IFN-γ | 27264 | Da 21639 a 32888 | Sì | **** | <0,0001 |
Tabella 3: Analisi statistica dettagliata dei dati presentati nella Figura 3A. Risultati dei test di confronto multipli di Tukey dopo un significativo ANOVA bidirezionale di dati presentati nella Figura 3A.
File supplementare 1: un file di foglio di calcolo rappresentativo di dati cinetici grezzi da un esperimento ottimale. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
L'analisi della fagocitosi utilizzando bioparticelle coniugate ad un colorante sensibile al pH è uno strumento relativamente nuovo che si è dimostrato vantaggioso rispetto alle tradizionali particelle etichettate fluorescentmente12,19,20. Con le tradizionali particelle etichettate fluorescenti, è possibile solo l'analisi del punto finale. La rilevazione viene effettuata con microscopia fluorescente e/o spettrofluorometria dopo il lavaggio o la tempra di particelle che non sono state assorbite dal fagocita. I dati quantitativi derivati dalla spettrofluorometria hanno il potenziale per rilevare particelle non inghiottite e l'analisi delle immagini per quantificare solo le particelle intracellulari è noiosa e richiede molto tempo utilizzando i tradizionali sistemi di microscopia fluorescente14. Le bioparticelle coniugate a coloranti sensibili al pH fluoresce solo in un ambiente acido come il fagolisiosoma e, pertanto, le noiose fasi di lavaggio e spegnimento non sono necessarie14. Inoltre, le bioparticelle etichettate sensibili al pH offrono il vantaggio di fornire dati cinetici che non verrebbero acquisiti facilmente con FITC o altre bioparticelle coniugate con fluoroforo.
Gli studi che utilizzano questo nuovo strumento hanno impiegato citometria a flusso e/o piattaforme di imaging per generare una misurazione quantitativa e cinetica dell'attività dei fagociti19,20,21. La citometria a flusso è vantaggiosa se esiste una popolazione limitata di fagociti o se si è interessati all'ordinamento per analisi a valle come gli screening genetici19. MSC sono noti per regolare il fenotipo MΦ attraverso il contatto diretto e attraverso fattori solubili. Studi preliminari hanno dimostrato che il mezzo condizionato da MSC sopprimeva la fagocitosi MΦ e, pertanto, questo protocollo è stato progettato per determinare i cambiamenti nell'attività fagocitica MΦ durante la co-coltura diretta con MSC. In queste condizioni, la spettrofluorometria per quantificare e l'imaging dinamico per visualizzare e confermare l'attività fagocitica sono più appropriate.
Fondamentale per il successo di questi metodi è l'ottimizzazione delle densità cellulari. L'MSC deve essere placcato a una densità che consenta un contatto ottimale della cella con le celle MΦ. MΦ deve essere seminato in mono e co-colture a una densità che non solo consenta un contatto ottimale, ma consenta anche un rilevamento ottimale della fluorescenza. Una densità troppo bassa comporterà una bassa incorporazione nel fagolisiosoma e cambiamenti piccoli o piatti nelle unità fluorescenti relative (Figura 3B). Se gli MΦ vengono seminati a densità troppo elevata, la fagocitosi aumenta rapidamente e il rilevamento delle differenze tra i gruppi viene mascherato (Figura 3C). Anche l'ottimizzazione della concentrazione di particelle di zimosane etichettate con colorante sensibile al pH per numero di cellule è fondamentale. Dovrebbero essere eseguiti esperimenti preliminari per ottimizzare le densità cellulari di MSC e MΦ e il numero di particelle per cella MΦ. Inoltre, queste misure di ottimizzazione dovrebbero essere prese se vengono utilizzate altre bioparticelle etichettate, come E. coli o S. aureus.
Anche il mezzo di imaging appropriato è fondamentale. Il mezzo per entrambi i metodi dovrebbe essere un mezzo tamponato e non dovrebbe contenere rosso fenolo. Il rosso fenolo silenzierà il rilevamento dell'emissione fluorescente. Inoltre, qualsiasi additivo o condizione in grado di acidificare il mezzo attiverà prematuramente le particelle etichettate e introdurrà uno sfondo elevato. Il reagente in bianco è fondamentale per identificare la potenziale acidificazione del mezzo.
Non solo questi protocolli possono essere utilizzati per studiare la regolazione MSC della fagocitosi MΦ di una varietà di bioparticelle sensibili al pH, ma il metodo può anche essere applicato a una varietà di modelli di co-coltura che includono neutrofili e altri fagociti. Inoltre, utilizzando questo modello, molecole e percorsi sospettati di essere coinvolti nella regolazione mediata dal contatto cellulare dell'attività fagocitica dei macrofagi possono essere sondati tramite siRNA o down-regulation mediata da CRISPR per convalidare o confutare sospetti bersagli molecolari. I potenziali bersagli includono molecole di adesione, recettori fagocitici e molecole di integrina.
Il lavoro che utilizza questi metodi scoprirà nuove informazioni riguardanti i meccanismi di segnalazione alla base dell'aumento delle risposte fagocitiche di MΦ a seguito di interazioni di contatto cellulare con MSC, promuovendo così la nostra comprensione del ruolo che MSC svolge nella regolazione dell'immunità innata. Studi come questi affrontano un'area poco studiata e produrranno un quadro completo dell'influenza che msc ha sull'attività dei macrofagi, che è necessaria per una piena comprensione del loro ruolo nell'immunità.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal meccanismo NSF Major Research Instrument nell'ambito dei numeri di sovvenzione 1626093 e 1919583.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Black Polystyrene Microplate | MilliporeSigma | CLS3603-48EA | |
| 0.4% trypan blue solution | MilliporeSigma | T8154-20ML | |
| 15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 339653 | |
| 4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | ThermoFisher | 155382PK | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco | ThermoFisher | 15240096 | |
| Axiobserver 7 Imaging System | Zeiss | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MilliporeSigma | A8806-1G | |
| Cell lifter | MilliporeSigma | CLS3008-100EA | |
| Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75 cm2, canted neck, with cap, filtered | MilliporeSigma | C7231-120EA | |
| D1 ORL UVA [D1] | ATCC | CRL-12424 | Mouse MSC Cell Line |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Hemocytometer | FisherScientific | 02-671-51B | |
| I-11.15 | ATCC | CRL-2470 | Mouse MΦ Cell Line |
| LADMAC Cell Line | ATCC | CRL-2420 | LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1). |
| Live-Cell Imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010031 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate | ThermoFisher | P35365 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Preprotech | 315-05 | |
| Spectramax i3X | Molecular Devices | ||
| Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 µm | ThermoFisher | 568-0020 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 micrometer | ThermoFisher | 723-2520 | |
| Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm | MilliporeSigma | CLS430167-100EA | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher | 25300054 |
References
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