Summary
Apresentado aqui é um protocolo para quantificar e produzir imagens dinâmicas de células-tronco mesenquimais (MSC) regulação mediada de fagocitose macrófago (MΦ) de partículas de levedura não opssonizada (zymosan) que são conjugadas a uma molécula fluorescente sensível ao pH.
Abstract
As células-tronco mesenquimais (MSC) têm sido tradicionalmente estudadas para suas propriedades regenerativas, mas, mais recentemente, suas características imunoregulatórias têm estado na vanguarda. Eles interagem e regulam a atividade das células imunes. O foco deste estudo é a regulação do MSC da atividade fagocítica do macrófago. A fagocitose macrófago (MΦ) é uma parte importante da resposta do sistema imunológico inato à infecção, e os mecanismos pelos quais a MSC modula essa resposta estão sob investigação ativa. Apresentado aqui é um método para estudar a fagocitose de MΦ de partículas de zimosã não opssonizadas conjugadas a uma molécula fluorescente sensível ao pH enquanto em co-cultura com MSC. À medida que a atividade fagocítica aumenta e as partículas de zimosã rotuladas são fechadas dentro do ambiente ácido do fagolico, a intensidade de fluorescência da molécula sensível ao pH aumenta. Com os comprimentos de onda de excitação e emissão adequados, a atividade fagocítica é medida usando um espectrofotômetro fluorescente e os dados cinéticos são apresentados como alterações em unidades fluorescentes relativas durante um período de 70 minutos. Para suportar esses dados quantitativos, a mudança na atividade fagocítica é visualizada por meio de imagens dinâmicas. Os resultados utilizando este método demonstram que, quando na co-cultura, o MSC melhora a fagocitose de zymosan não opssonizado tanto ingênua quanto ifn-γ tratada MΦ. Esses dados se somam ao conhecimento atual da regulação do MSC do sistema imunológico inato. Este método pode ser aplicado em investigações futuras para delinear totalmente os mecanismos celulares e moleculares subjacentes.
Introduction
Células-tronco mesenquimais (MSC) são células progenitoras que dão origem a células de tecido conjuntivo. O MSC está presente em tecidos mamíferos adultos e pode ser isolado da medulaóssea 1. Devido às suas propriedades imunomodulatórias, essas células são amplamente estudadas2. Estudos iniciais focados na regulação do MSC das células T3,4,5,6, mas mais recentemente, sua regulação das células macrófagos (MΦ), um dos principais componentes celulares da imunidade inata, tem recebido maior atenção7,8,9,10,11,12,13,14 . A importância da interação MSC-MΦ no tratamento da doença inflamatória é sublinhada pelo fato de que o esgotamento dos monócitos/macrófagos revoga os efeitos terapêuticos do MSC nos modelosanimais 8. Aqui, o foco é a interação de contato celular do MSC com MΦ. A MSC tem a capacidade de regular o fenótipo de MΦ promovendo a mudança de respostas inflamatórias para anti-inflamatórias, levando a atividades de reparação tecidual8,9,10,11, e muito tem sido feito para demonstrar esses mecanismos regulatórios. Em outras circunstâncias, o MSC pode suportar ou exacerbar uma resposta inflamatória orientada por MΦ12,13 e melhorar a atividade fagocítica MΦ14,15. No entanto, há uma falta crítica de dados existentes que identifica os mecanismos pelos quais e as condições sob as quais o MSC regula a atividade fagocítica MΦ.
MΦ tem famílias de receptores que reconhecem ou o opsonizados (anticorpo ou complemento revestido) ou patógenos não opssonizados que levam à fagocitose16. A ativação e atividade deste último é menos bem estudada17. Em um ambiente in vitro não inflamatório, o MSC aprimora a fagocitose de maçom de patógenos não opssonizados13. No entanto, o reconhecimento de patógenos não opssonizados por MΦ pode ser reduzido após a exposição a um ambiente inflamatório produzido por linfócitos durante uma resposta imune adaptativa. IFN-γ, liberada por células assassinas naturais e linfócitos efeitos, tem um efeito inibidor na fagocitose de MΦ de partículas não opssonizadas18. Um modelo de cocultura foi desenvolvido para estudar os mecanismos da regulação de contato direto do MSC da fagocitose MΦ. O objetivo do experimento aqui apresentado é determinar se o MSC regula a fagocitose de mφ de patógenos não opssonizados após mΦ ter sido exposto a IFN-γ (Figura 1).
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Protocol
NOTA: Todas as técnicas de preparação média e cultura celular são realizadas sob condições assépticas usando um armário de biossegurança com fluxo laminar. Todas as etapas de incubação da cultura descritas são realizadas utilizando-se uma incubadora projetada para manter uma atmosfera de 37 °C, 5% de CO2e 95% de umidade.
1. Cultura celular
- Preparação do meio de crescimento
- Para MSC e LADMAC, adicione 50 mL de FBS e 5 mL de mistura antibiótico/antimíctico de 100x a 500 mL de DMEM de alta glicose.
- Para o MΦ, adicione 50 mL de FBS, 100 mL de meio de condição LADMAC (preparado seguindo as etapas da seção 1.2), e 5 mL de 100x mistura de antibióticos a 500 mL de alta glicose DMEM.
NOTA: As células LADMAC produzem fator estimulante para colônias (CSF-1) necessário para suportar o crescimento das células MΦ.
- Preparação do meio condicionado LADMAC
- Às células LADMAC de sementes de estoque congelado, adicione 19 mL de meio de crescimento da seção 1.1 em cada um dos cinco frascos tratados de cultura celular T75 cm2 e coloque na incubadora de cultura celular por 15 minutos para equilibrar até 37 °C.
- Enquanto isso, descongele rapidamente uma alíquota de 106 células congeladas incubando em um banho de água de 37 °C por 2-3 min ou até que seja descongelado. Adicione as células a 9 mL de meio de crescimento MSC fresco em um tubo cônico estéril de 15 mL ou 50 mL e centrífuga a 125 x g em um rotor de balde balançando por 5 minutos.
- Aspire ou decante o supernascedor, adicione 5 mL de meio de crescimento fresco, e gentilmente pipeta para cima e para baixo para resuspensar a pelota celular.
- Adicione 1 mL da suspensão celular a cada um dos cinco frascos T75 cm2 usando uma pipeta sorológica estéril e coloque-os na incubadora de cultura celular.
- A cada 2-3 dias, adicione um adicional de 10 mL de médio durante um período de 7-10 dias. Em seguida, colete as células e o supernaente em tubos cônicos estéreis de 50 mL usando uma pipeta sorológica estéril e centrífuga a 125 x g por 5 min.
- Separe o supernatante da pelota celular e o filtro estéril do supernatante usando uma unidade de filtro de vácuo de uso único estéril de 0,2 μm.
- Remova o conjunto aspirador da embalagem e conecte usando tubos de vácuo à bomba do aspirador. Despeje o sobrenatante no compartimento superior e substitua a tampa. Ligue a bomba do aspirador para filtrar no compartimento inferior.
- Prepare as alíquotas ao pipetar em tubos cônicos estéreis de 50 mL e armazene a -20 °C.
- Para congelar a pelota celular, resuspende em meio de congelamento a 106 células/mL, coloque em um recipiente de congelamento e, em seguida, coloque-os em um congelador de -80 °C. Após 24 horas, transfira para armazenamento LN2.
- Propagar células em preparação para a co-cultura
- Para as células MSC e MΦ de sementes do estoque congelado, equilibre 9 mL de meio de crescimento adequado preparado na seção 1.1 em cada um dos quatro pratos tratados de cultura celular de 100 mm para cada tipo de célula e coloque na incubadora de cultura celular por 15 minutos.
- Enquanto isso, descongele rapidamente as alíquotas de 106 células congeladas incubando-as em um banho de água de 37 °C por 2-3 min ou até descongelar. Em seguida, adicione as células MSC descongeladas a 9 mL de meio de crescimento MSC fresco e adicione as células MΦ descongeladas ao meio de crescimento MΦ fresco de 9 mL em tubos cônicos estéreis de 15 ou 50 mL e centrífuga a 125 x g no rotor de balde balançando por 5 minutos.
- Aspire ou decante o supernaspe e resuspenque cada pelota em 4 mL do meio de crescimento fresco apropriado, tubondo suavemente para cima e para baixo. Adicione 1 mL da suspensão celular a cada um dos quatro pratos de 100 mm para cada tipo de célula que foram equilibrados na etapa 1.3.1.
- Devolva os pratos com células para a incubadora. Mude o meio a cada 2-3 dias até 70%-80% confluente.
2. Sementes MSC em pratos experimentais, Dia 1
NOTA: Antes de semear o MSC, projete o layout experimental da placa de 96 poços para espectrofotometria fluorescente e o slide da câmara para imagens dinâmicas. Para a placa de 96 poços, flanqueia poços experimentais com poços contendo células, mas não os usam no ensaio. Marque pelo menos quatro poços a serem usados para o reagente em branco (RBL). Consulte a Tabela 1 para um modelo de 96 poços e tabela 2 para um exemplo de um modelo de slide de câmara de 4 poços. Recomenda-se placas pretas ou brancas de 96 poços com fundo claro. Um slide de câmara de vidro borossilicato de 1,5 mm é ótimo, mas o número de câmaras pode ser ajustado dependendo do desenho do estudo. Um fluxograma sumário dos métodos a seguir está incluído na Figura 2.
- Com 70%-80% de confluência, aspire o meio de crescimento das culturas em pratos de 100 mm e adicione 5 mL de PBS para isolar o MSC.
- Aspire o PBS, adicione 2 mL de 0,05% de trippsina/EDTA, e coloque-o na incubadora de cultura por 3-5 min.
- Após 3 minutos, verifique o desprendimento celular usando um microscópio invertido. Se as células forem separadas, continuem para o próximo passo; se não, continue a incubação por mais 1-2 min. Não incubar por mais de 5-6 min.
- Adicione 5 mL de meio de crescimento fresco ao prato com as células separadas. Enxágüe o prato usando a mistura trypsin/média e colete células em um tubo cônico limpo e estéril de 50 mL usando uma pipeta sorológica estéril.
- Centrífuga por 5 min a 125 x g. Aspire o supernasce e resuspenque a pelota celular em 10 mL de meio de crescimento fresco, tubos suavemente para cima e para baixo.
- Para contar as células, adicione 10 μL da suspensão celular a 30 μL de solução azul trypan de 0,4% em um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL. Em seguida, pipeta 10 μL da mistura sob a tampa de uma câmara de contagem de hemócito.
- Utilizando um microscópio de campo invertido ou brilhante, com o objetivo de 10x, conte as células não manchadas (viáveis) em quatro dos quadrados de 1 mm2. Calcule o número celular usando a fórmula: células/mL = contagem celular/# 1 mm2 quadrados x fator de diluição x 104.
NOTA: Para este exemplo, o número de quadrados de 1 mm2 contados é quatro, e o fator de diluição é 4. - Use a equação C1V1 = C2V2 para calcular e preparar uma suspensão de 1 x 105 células/mL. Prepare 1 mL de suspensão celular/mL para cada coluna da placa de 96 poços a ser preenchida e 0,75 mL para cada câmara do slide de câmara de 4 poços a ser preenchida de acordo com o desenho da placa.
NOTA: C1 = contagem celular, V1 = o que está sendo calculado, C2 = 1 x 105, V2 = 5,50 mL. - Determine V1, subtraia-o dos 5,50 mL desejados do volume total para determinar o volume do meio fresco necessário para preparar a suspensão. Adicione o volume de células (V1) da suspensão original ao volume de meio fresco para um total de 5,50 mL com 1 x 105 células/mL.
- Adicione 100 μL de suspensão de 1 x10 5 células/mL a cada poço da placa de 96 poços de acordo com o desenho da placa usando um micropipettor multicanal e 530 μL para cada um dos poços do slide da câmara usando uma micropipette de acordo com o desenho da placa. Incubar durante a noite.
NOTA: Para este experimento, o MSC é emplacado nas colunas 1, 2, 3 e 6 da placa de 96 poços(Tabela 1) e os poços 1 e 2 do slide de câmara de 4 poços(Tabela 2). Portanto, pelo menos 5,50 mL de uma suspensão de 1 x 105 células/mL é preparado. MΦ com 80% de confluência são tratados com mediadores inflamatórios no mesmo dia em que o MSC é semeado nas placas experimentais.
3. Ative o MΦ com ifn-γ, dia 1
- Prepare o estoque médio de ativação e ifn-γ.
- Para 200 mL de meio de ativação, adicione 40 mg de BSA a 200 mL de DMEM de alta glicose sem soro e filtro estéril usando uma unidade de filtro de vácuo de uso único estéril de 0,2 μm.
- Para preparar 0,1% BSA/PBS, adicione 20 mg de BSA a 20 mL de PBS. Vórtice para dissolver. Use um filtro de seringa estéril de 0,2 μm para filtrar em um tubo cônico limpo e estéril de 50 mL.
- Adicione 1 mL da solução Estéril BSA/PBS de 0,1% a 100 μg de IFN-γ liofilizada para alcançar uma solução de estoque de 100 μg/mL. Armazene em 50 alíquotas μL a -20 °C.
- Ative o MΦ com ifn-γ
- Adicione 2,5 μL de 100 μg/mL de estoque ifn-γ para cada 1 mL do meio necessário. Para cada prato de 100 mm a ser ativado, prepare 10 mL de meio de ativação contendo IFN-γ a uma concentração de 250 ng/mL.
- Aspire o meio de crescimento das culturas MΦ e substitua-o por 5 mL do meio de ativação sem IFN- γ enxaguar.
- Aspire o meio utilizado para enxaguar e substituí-lo por 10 mL de IFN- γ meio de ativação suplementado para o prato experimental e com 10 mL de meio de ativação não suplementado para o controle. Incubar as culturas para 16-24 h.
4. Isole o MΦ e prepare as co-culturas, dia 2
- Remova o meio de ativação das células MΦ e substitua-o por 5 mL de meio de crescimento fresco. Raspe suavemente com um levantador de células e colete as células em um tubo cônico de 50 mL.
- Conte as células usando exclusão azul trypan e hemocittometria como descrito para MSC em, etapas 2.6-2.7.
- Usando a equação nas etapas 2.8-2.9, prepare duas suspensões separadas de 2 x 105 células/mL, uma com células do controle e outra com células das culturas MΦ tratadas.
NOTA: Prepare 1 mL de suspensão celular/mL para cada coluna da placa de 96 poços a ser preenchida e 0,75 mL para cada câmara do slide de câmara de 4 poços a ser preenchida de acordo com o desenho da placa. - Aspire suavemente o meio dos poços experimentais da placa de 96 poços contendo MSC. Utilizando uma micropipette multicanal, adicione 100 μL do tratado e as suspensões celulares MΦ de controle nos poços experimentais apropriados com e sem MSC de acordo com o desenho da placa. Incubar durante a noite.
- Aspire suavemente o meio do slide de câmara de 4 poços contendo MSC e, usando uma micropipette, adicione 530 μL de suspensão celular MΦ aos poços apropriados de acordo com o projeto. Incubar durante a noite.
5. Ensaio de fagocitose, kinetic fluorescente 96-well placa de leitura, Dia 3
- Defina os parâmetros de ensaio
- No dia do ensaio, ligue o leitor de placas fluorescentes e coloque a temperatura no sistema a 37 °C.
- Abra o software Pro do sistema e verifique o ícone do instrumento no canto superior esquerdo para determinar se o instrumento está conectado ao computador. Se o círculo vermelho com uma linha estiver visível, clique no ícone do instrumento e escolha o instrumento na janela pop-up para fazer a conexão.
- Selecione Novo experimento para acessar a janela pop-up do Ajudante de Configuração de placas. No menu Auxiliar de Configuração de placas, selecione Configurar suas configurações de aquisição.
- Selecione Monocromático no menu de configurações para a configuração óptica. Selecione FL (fluorescência) para o modo de leitura e Cinética para o tipo de leitura.
- Na mesma janela de configurações, em Categoria,clique em Comprimentos de Ondae, em seguida, defina larguras de banda para 9 nm para excitação e 15 nm para emissão.
- Defina o número de pares de comprimento de onda para 1. Defina os comprimentos de onda LM1 a 510 nm para excitação e 540 nm para emissão.
- Continue através das categorias e selecione Tipo de placa em seguida. Selecione a opção que corresponde ao tipo de placa que está sendo usada.
NOTA: É importante que a seleção corresponda ao tipo de placa. As alturas de leitura são definidas pelo sistema de acordo com a seleção. - Em seguida, selecione Área de Leitura e destaque a área da placa de 96 poços incluída no design experimental.
- Selecione PMT e Óptica,defina ganho pmt para alto e flashes por leitura para 6. Verifique a caixa ao lado de Read from Bottom se usar uma placa de fundo claro.
- Selecione Tempo e definir para intervalos de 10 minutos durante um período de 70 minutos.
- Selecione Shake,verifique a caixa Antes da Primeira Leitura e defina para 5 s. Verifique a caixa Entre Leituras e configurada para 3 s. Definir intensidade de agitação tanto para Baixo quanto linear.
- Feche a janela. Quando a janela do Auxiliar de Configuração da placa aparecer, selecione Configurar o layout da placa. Destaque os poços BL do design da placa e clique em Placa Em Branco.
- Destaque cada uma das linhas experimentais, clique em Adicionar,nomeie o grupo e selecione uma cor.
- Em Opções de Atribuição abaixo do design da placa, selecione Sériee, em seguida, defina a série na janela e clique em OK. Repita para cada grupo.
- Prepare a suspensão zymosan
- Enquanto espera que a temperatura do sistema atinja 37 °C, resuspengem 1 mg de partículas de zimosa em 5 mL do meio de imagem de células vivas.
- Adicione 1 mL de imagem de células vivas ao frasco contendo as partículas e colete-as em um tubo de cultura de vidro. Enxágüe o frasco com um adicional de 1 mL de solução de imagem e transfira para o mesmo tubo de vidro para garantir que todas as partículas sejam transferidas. Adicione 3 mL de solução de imagem adicional para obter uma suspensão de partículas de 0,2 mg/mL.
- Vórtice com pulsos rápidos para 30-60 s. Em seguida, use um sônico sonda para sonicar com 60 pulsos rápidos.
NOTA: É muito importante criar uma suspensão homogênea de partículas e não deixar a suspensão ficar muito tempo antes de adicionar aos poços experimentais. A aglomeração se repete rapidamente. A densidade celular per cell de partículas pode precisar ser otimizada dependendo da fonte, tratamento e densidade do MΦ utilizado. Nos estudos apresentados, foram utilizadas partículas conjugadas de zimossão. No entanto, e. coli conjugado e S. aureus também estão disponíveis.
- Enquanto espera que a temperatura do sistema atinja 37 °C, resuspengem 1 mg de partículas de zimosa em 5 mL do meio de imagem de células vivas.
- Adicione zymosan e leia a placa
- Aspire o meio dos poços experimentais e enxágue 1x com 100 μL da solução de imagem de células vivas. Enxágüe os poços RBL com a solução de imagem de células vivas também.
- Aspire a solução de imagem de células vivas de poços experimentais e RBL e substitua-a por 100 μL da suspensão de partículas zymosan preparada na seção 5.2.
- Abra a bandeja da placa do leitor fluorescente usando a interface touchpad. Coloque a placa, sem a tampa, na bandeja com o A1 bem no canto superior esquerdo. Feche a bandeja usando o touchpad e clique no botão verde Ler no menu superior.
- Quando a leitura estiver concluída, salve o arquivo para a pasta apropriada e exporte os dados em formato de planilha clicando em Arquivo e selecionando Exportar.
- Calcule a fluorescência relativa de ± SEM média para cada grupo de réplica em cada ponto de tempo (10 min, 20 min, 30 min, etc.) na planilha (Arquivo Suplementar 1) e transfira os dados para o software de grafismo.
- Use um formato de gráfico de linha para apresentar os dados e aplique ANOVA bidirecional (Time x Treatment/MSC como fatores) seguido pelo teste de comparações múltiplas de Tukey para determinar diferenças entre grupos individuais.
NOTA: Enquanto a leitura da placa de 96 poços estiver em andamento, prepare a placa de imagem dinâmica para aquisição de imagens com lapso de tempo. Certifique-se de que a imagem dinâmica prossegue com a análise de um poço experimental de cada vez.
6. Ensaio de fagocitose, imagem dinâmica, dia 3
- Ligue o sistema de imagem e o computador. Clique duas vezes para abrir o software. Selecione o modo programa Pro.
- Verifique a área do palco para garantir que nenhuma amostra esteja presente e nada está impedindo o movimento do palco. Em seguida, clique em Calibrar Agora.
- Sob o menu Incubação na barra lateral à direita, verifique a caixa ao lado da Unidade H XL e coloque-a em 37 °C.
NOTA: Aguarde até que o estágio incubado esteja quase à temperatura antes de preparar as amostras para a imagem. - Enxágüe o primeiro poço experimental com 750 μL de meio de imagem e substitua-o por 400 μL da suspensão de partícula zymosan preparada na seção 5.2. Deixe os poços restantes no meio de crescimento.
NOTA: Pode ser necessário vórtice e sonicar a suspensão de partículas novamente brevemente se tiver resolvido por mais de 15 minutos. - Coloque o slide no estágio incubado do sistema de imagem. Estabeleça um temporizador para 10 minutos.
- Use o software de imagem, selecione Brightfield sob a guia Localizar e clique no ícone da ocular na janela de configuração do sistema abaixo. Com o objetivo de 10x no lugar, use a ocular e o botão de foco para focar nas células.
- Selecione a guia Aquisição, use o menu suspenso do Experimento e selecione um conjunto de comprimentos de onda que inclui o conjunto de filtroS EGFP para acomodar comprimentos de onda de 509 nm de 533 nm do corante sensível ao pH.
- Quando houver ~2 minutos restantes no temporizador, use o software para alterar o objetivo para 20x clicando no ícone de 20x no menu objetivo.
- Clique no menu Canais, selecione filtros EGFP e use o menu Exposição para definir o tempo de exposição a 400 ms para detectar o fluoróforo verde sensível ao pH uma vez que tenha sido incluído no phagolysosome.
- Clique em Live e ajuste o foco usando o botão de foco.
- Clique em Parar para desligar a luz e marque a caixa ao lado da configuração experimental time-lapse na parte superior.
- No menu Estratégia de Foco selecione Software Autofoco. A partir da queda no menu Foco Automático, selecione configurações inteligentes e grosseiras para reduzir o tempo de exposição à luz enquanto o foco automático estiver em execução.
- No menu Time-Lapse, defina o número desejado de aquisições para 30-60 e o intervalo para 1 min.
- Após os parâmetros de lapso de tempo serem definidos e após 10 minutos de adição de partículas ao primeiro poço, clique no botão Iniciar experimento para começar a aquisição.
- Quando a aquisição estiver concluída usando o primeiro poço experimental, repita as etapas 6.4-6.12 para cada um dos poços experimentais restantes.
- Salve todos os arquivos de experimento com a data e parâmetros no título para a pasta apropriada.
- Feche o software. Reabra o software no modo processamento e exporte os arquivos no formato MP4 usando o menu Exportar.
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Representative Results
Após calcular a média ± SEM para cada grupo em todos os pontos de tempo, os dados são apresentados em formato gráfico de linha com o eixo Y como a Intensidade Fluorescente Relativa e o eixo X como Tempo. O Arquivo Suplementar 1 fornece um exemplo de dados brutos de uma leitura cinética da placa de 96 poços em formato de planilha.
Neste estudo, os resultados ideais apresentados na Figura 3A, e na Tabela 3 demonstram que 1) a cocultura com MSC potencializa a atividade fagocítica do macrófago, 2) O tratamento IFN-y reduz a atividade do macrófago, e 3) a co-cultura com MSC resgata parcialmente a atividade fagocítica MΦ. As densidades celulares ideais são críticas nesses estudos, e quando o MΦ é banhado a uma densidade muito baixa, não se pode detectar alterações na intensidade da fluorescência(Figura 3B). A Figura 3C representa dados de um estudo onde o MΦ foi banhado a uma densidade muito alta e a intensidade da fluorescência é elevada rapidamente em todos os grupos, e as diferenças não podem ser discernidas. Os vídeos dinâmicos de imagem confirmam que as alterações de intensidade fluorescente resultam de fagocitose e não acidificação do meio. Também fornecem dados qualitativos e uma representação visual da taxa e extensão da atividade fagocítica(Figura 4).
Figura 1: Uma ilustração que retrata a questão central dos dados apresentados, que é "O MSC pode recuperar a atividade fagocítica do IFN-γ tratado MΦ?". Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Visão geral do fluxo de trabalho de ensaio de cocultura e fagocitose. Um esboço do fluxo de trabalho para análise quantitativa e qualitativa da atividade de fagocitose de MΦ na cocultura com o MSC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Dados quantitativos representativos da leitura cinética demonstrando resultados ótimos e subótimos. Em ( A ),osdados são representativos de um experimento com a densidade celular MΦ ideal, em (B) os dados são representativos de um experimento com densidade celular MΦ muito baixa, e em (C), os dados são representativos de um experimento com densidade celular MΦ subótimal muito alta. A intensidade relativa de fluorescência medida em unidades fluorescentes relativas (RFU) é traçada no eixo Y, enquanto o tempo é traçado no eixo X. Observe as diferenças na gama de RFU entre os experimentos ideais e sub-ideais. Em A,o MSC resgata parcialmente a atividade fagocítica de MΦ no ajuste da supressão de IFN-γ durante um período de 70 min. A RFU é apresentada como média ± o SEM, n = 6. A análise foi realizada utilizando-se o teste de múltiplas comparações de Tukey após um significativo efeito ANOVA bidirecional P = 0,0001, Efeito tempo P = 0,0001 e efeito Tratamento/MSC P = 0,0001. Símbolos denotam resultados de múltiplos testes de comparação. * = diferença significativa entre MSC/MΦ + IFN- γ vs MΦ + IFN-γ, Ŧ = diferença significativa entre MΦ vs MΦ + IFN-γ, e † = diferença significativa entre MSC/MΦ vs MΦ. Consulte a Tabela 3 para obter resultados detalhados dos múltiplos testes de comparação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Vídeos dinâmicos de imagem que fornecem confirmação visual do aumento específico das células na fluorescência da ativação ácida de partículas zymosanas rotuladas após a incorporação no phagolysosome MΦ. As configurações de lapso de tempo foram aquisições a cada 1 minuto durante um período de 30 minutos usando um tempo de exposição de 400 ms e o conjunto de filtros EGFP. (A) MΦ em monocultura, (B) MΦ em co-cultura com MSC, (C) MΦ tratado com IFN-γ (250 ng/mL) e(D) MΦ tratado com IFN-γ (250 ng/mL) em co-cultura com MSC. Clique aqui para baixar este Arquivo.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| Um | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| B | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| C | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| D | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| E | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| F | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| G | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| H | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL |
Tabela 1: Exemplo de um design de placa de 96 poços. CBL - Célula em branco; MSC - semeado dia 1; MΦ+ tratado e MΦ sem tratamento semeado dia 2; Reagente RBL adicionado no dia 3 do ensaio.
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ |
Tabela 2: Exemplo de um design de slide de câmara de 4 poços. MSC - banhado dia 1; MΦ+ tratado e MΦ não tratado banhado dia 2.
| Teste de múltiplas comparações de Tukey | Diff malvado. | IC 95,00% de difusão. | Abaixo do limiar? | Resumo | Valor P ajustado |
| 0 minutos | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | -3871 | -9495 a 1754 | Não | Ns | 0.2836 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 720.3 | -4904 a 6345 | Não | Ns | 0.9873 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | -77.17 | -5702 a 5548 | Não | Ns | >0,9999 |
| 10 minutos | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | -3466 | -9091 a 2159 | Não | Ns | 0.3817 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 2326 | -3299 a 7950 | Não | Ns | 0.7062 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 992 | -4633 a 6617 | Não | Ns | 0.968 |
| 20 minutos | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | -1311 | -6936 a 4314 | Não | Ns | 0.9303 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 3315 | -2310 a 8940 | Não | Ns | 0.422 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 3146 | -2478 a 8771 | Não | Ns | 0.4689 |
| 30 min. | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | 384.8 | -5240 a 6010 | Não | Ns | 0.998 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 2313 | -3312 a 7937 | Não | Ns | 0.7098 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 8726 | 3101 a 14350 | Sim | *** | 0.0005 |
| 40 min. | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | 2247 | -3377 a 7872 | Não | Ns | 0.7278 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 4913 | -712,2 a 10537 | Não | Ns | 0.1101 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 16521 | 10896 a 22145 | Sim | **** | <0.0001 |
| 50 min. | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | 5657 | 32.12 a 11282 | Sim | * | 0.0481 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 4932 | -692,9 a 10557 | Não | Ns | 0.1079 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 19083 | 13458 a 24708 | Sim | **** | <0.0001 |
| 60 min. | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | 12376 | 6752 a 18001 | Sim | **** | <0.0001 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 9361 | 3736 a 14986 | Sim | *** | 0.0002 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 24748 | 19123 a 30373 | Sim | **** | <0.0001 |
| 70 min. | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | 13770 | 8145 a 19395 | Sim | **** | <0.0001 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 11987 | 6362 a 17612 | Sim | **** | <0.0001 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 27264 | 21639 a 32888 | Sim | **** | <0.0001 |
Tabela 3: Análise estatística detalhada dos dados apresentados na Figura 3A. Resultados dos múltiplos testes de comparação de Tukey após uma ANOVA bidirecional significativa de dados apresentados na Figura 3A.
Arquivo complementar 1: Um arquivo de planilha representativo de dados cinéticos brutos de um experimento ideal. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
A análise da fagocitose utilizando biopartículas conjugadas a um corante sensível ao pH é uma ferramenta relativamente nova que tem se mostrado vantajosa sobre partículas tradicionais rotuladas fluorescentes12,19,20. Com partículas tradicionais rotuladas por fluorescentes, apenas a análise de ponto final é viável. A detecção é realizada com microscopia fluorescente e/ou espectrofluorometria após a lavagem ou sacieçação de partículas que não tenham sido tomadas pelo fagocito. Dados quantitativos derivados da espectrofluorometria têm o potencial de detectar partículas não engolidas, e a análise de imagens para quantificar apenas partículas intracelulares é tediosa e demorada usando sistemas tradicionais de microscopia fluorescente14. As biopartículas conjugadas aos corantes sensíveis ao pH fluorescem apenas em um ambiente ácido, como o fagolysosome, e, portanto, as tediosas etapas de lavagem e saciamento são desnecessárias14. Além disso, as biopartículas rotuladas sensíveis ao pH fornecem a vantagem de fornecer dados cinéticos que não seriam adquiridos facilmente com fitc ou outras biopartículas conjugadas por fluoróforos.
Estudos que utilizam esta nova ferramenta têm utilizado citometria de fluxo e/ou plataformas de imagem para gerar uma medição quantitativa e cinética da atividade faócito19,20,21. A citometria de fluxo é vantajosa se houver uma população de fagocites limitado ou se estiver interessado em classificar para análises a jusante, como telas genéticas19. MsC é conhecido por regular o fenótipo MΦ através do contato direto e através de fatores solúveis. Estudos preliminares mostraram que o meio condicionado da MSC suprimiu a fagocitose de MΦ e, portanto, este protocolo foi projetado para determinar as mudanças na atividade fagocítica MΦ enquanto em co-cultura direta com o MSC. Nessas condições, a espectrofluormetria para quantificar e imagens dinâmicas para visualizar e confirmar a atividade fagocítica são as mais apropriadas.
Fundamental para o sucesso desses métodos é a otimização das densidades celulares. O MSC precisa ser banhado a uma densidade que permita o contato celular ideal com as células MΦ. MΦ precisa ser semeado em mono e co-culturas em uma densidade que não só permite o contato ideal, mas também permite a detecção ideal de fluorescência. A baixa densidade de uma densidade resultará em baixa incorporação no phagolysosome e pequenas ou pequenas ou planas alterações em unidades fluorescentes relativas(Figura 3B). Se mΦ são semeados em uma densidade muito alta, a fagocitose aumenta rapidamente, e a detecção de diferenças entre os grupos é mascarada(Figura 3C). Otimizar a concentração de partículas de zymosan rotuladas com tinta sensível ao pH por número celular também é fundamental. Experimentos preliminares devem ser realizados para otimizar as densidades celulares de MSC e MΦ, e o número de partículas por célula MΦ. Além disso, essas medidas de otimização devem ser tomadas se outras biopartículas rotuladas forem utilizadas, como E. coli ou S. aureus.
O meio de imagem apropriado também é crítico. O meio para ambos os métodos deve ser um meio tamponado e não deve conter o vermelho fenol. O vermelho fenol silenciará a detecção da emissão fluorescente. Além disso, qualquer aditivo ou condição que possa acidificar o meio ativará prematuramente as partículas rotuladas e introduzirá fundo elevado. O reagente em branco é fundamental para identificar a acidificação potencial do meio.
Não só esses protocolos podem ser usados para investigar a regulação da FAagocitose de MΦ de uma variedade de biopartículas sensíveis ao pH, mas o método também pode ser aplicado a uma variedade de modelos de co-cultura que incluem neutrófilos e outros fagocitos. Além disso, usando este modelo, moléculas e vias suspeitas de estarem envolvidas na regulação mediada pelo contato celular da atividade fagocítica de macrófago podem ser sondadas via siRNA ou CRISPR mediada para validar ou refutar alvos moleculares suspeitos. Os alvos potenciais incluem moléculas de adesão, receptores fagocíticos e moléculas de integrin.
O trabalho utilizando esses métodos descobrirá novas informações sobre os mecanismos de sinalização subjacentes ao aumento das respostas fagocíticas do MΦ após interações de contato celular com o MSC, promovendo assim nossa compreensão do papel que o MSC desempenha na regulação da imunidade inata. Estudos como esses abordam uma área pouco estudada e produzirão um quadro completo da influência que a MSC tem sobre a atividade macrófago, o que é necessário para uma compreensão plena de seu papel na imunidade.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo mecanismo NSF Major Research Instrument sob números de subvenções 1626093 e 1919583.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Black Polystyrene Microplate | MilliporeSigma | CLS3603-48EA | |
| 0.4% trypan blue solution | MilliporeSigma | T8154-20ML | |
| 15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 339653 | |
| 4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | ThermoFisher | 155382PK | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco | ThermoFisher | 15240096 | |
| Axiobserver 7 Imaging System | Zeiss | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MilliporeSigma | A8806-1G | |
| Cell lifter | MilliporeSigma | CLS3008-100EA | |
| Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75 cm2, canted neck, with cap, filtered | MilliporeSigma | C7231-120EA | |
| D1 ORL UVA [D1] | ATCC | CRL-12424 | Mouse MSC Cell Line |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Hemocytometer | FisherScientific | 02-671-51B | |
| I-11.15 | ATCC | CRL-2470 | Mouse MΦ Cell Line |
| LADMAC Cell Line | ATCC | CRL-2420 | LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1). |
| Live-Cell Imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010031 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate | ThermoFisher | P35365 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Preprotech | 315-05 | |
| Spectramax i3X | Molecular Devices | ||
| Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 µm | ThermoFisher | 568-0020 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 micrometer | ThermoFisher | 723-2520 | |
| Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm | MilliporeSigma | CLS430167-100EA | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher | 25300054 |
References
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