Summary
Une méthode d’extraction du cofacteur F420 à partir de cultures pures a été optimisée pour la séparation chromatographique liquide et l’analyse de la longueur de la queue F420 dans des échantillons de culture pure et d’environnement.
Abstract
Le cofacteur F420 joue un rôle central en tant que porteur d’hydrure dans le métabolisme primaire et secondaire de nombreux taxons bactériens et archéaux. Le cofacteur est surtout connu pour son rôle dans la méthanogenèse, où il facilite les réactions thermodynamiquement difficiles. Comme la longueur de la queue de polyglutamate varie d’un organisme à l’autre, les analyses de profil de longueur pourraient être un outil puissant pour distinguer et caractériser différents groupes et voies dans divers habitats. Ici, le protocole décrit l’extraction et l’optimisation de la détection du cofacteur F420 en appliquant l’extraction en phase solide combinée à une analyse par chromatographie liquide à haute performance indépendante des approches culturelles ou biologiques moléculaires. La méthode a été appliquée pour obtenir des informations supplémentaires sur l’expression du cofacteur F420 à partir de communautés microbiennes dans les sols, les boues anaérobies et les cultures pures et a été évaluée par des expériences de pic. Ainsi, l’étude a réussi à générer différents profils de longueur de queue F420 pour les méthanogènes hydrogénotrophes et acétoclastiques dans des cultures pures méthanogènes contrôlées ainsi qu’à partir d’échantillons environnementaux tels que les boues et les sols de digesteurs anaérobies.
Introduction
F420 est un cofacteur répandu mais souvent négligé, qui fonctionne comme un transporteur d’hydrure à deux électrons obligatoire dans les processus métaboliques primaires et secondaires des archées et des bactéries1,2. F420 est une 5-déazaflavine et structurellement similaire aux flavines, ses propriétés chimiques et biologiques étant plus comparables à celles du NAD+ ou du NADP+. En raison de la substitution de l’azote par du carbone à la position 5 du cycle isoalloxazine, il s’agit d’un puissant réducteur, présentant ainsi un faible potentiel redox standard de -340 mV1,3. F420 comprend un cycle de 5-déazaflavine et un liant 2-phospho-L-lactate (F420-0). Une queue d’oligoglutamate contenant n+1 monomères de glutamate peut être attachée à la molécule (F420-n+1)4.
Pendant longtemps, le cofacteur F420 a été uniquement associé aux archées et aux actinobactéries. Cela a été largement renversé. Des analyses récentes ont révélé que le F420 est réparti entre divers organismes anaérobies et aérobies des phyla Proteobacteria, Chloroflexi, et potentiellement Firmicutes habitant une myriade d’habitats comme les sols, les lacs et l’intestin humain1,5. En 2019, Braga et al.6, ont montré que la protéobactérie Paraburkholderia rhizoxinica produit un dérivé unique de F420, contenant un 3-phosphoglycérate au lieu d’une queue de 2-phospholactate, qui pourrait être répandu dans divers habitats. Dans le domaine Archaea, F420 a été trouvé dans plusieurs lignées, y compris methanogenic7, methanotrophic8,9 et sulfate-reducing orders10, et est censé être produit dans Thaumarchaeota11. F420 est surtout connu comme une coenzyme redox essentielle dans la méthanogenèse hydrogénotrophe et méthylotrophique. La forme réduite de F420 (F420H2) fonctionne comme un donneur d’électrons pour la réduction de la méthylènetétrahydrométhanoptérine (méthylène-H4MPT, Mer) et du méthényl-H4MPT12,13. Il peut également être utilisé comme transporteur d’électrons dans les voies de transport d’électrons indépendantes de H2 de méthanogènes contenant des cytochromes12,14. De plus, la forme oxydée de F420 a une fluorescence bleu-vert caractéristique lors de l’excitation à 420 nm, ce qui facilite la détection microscopique des méthanogènes (Figure 1). En raison de son faible potentiel redox, F420 facilite (i) la réduction exogène d’un large spectre de composés organiques autrement récalcitrants ou toxiques, (ii) la synthèse d’antibiotiques tétracycline et de lincosamide ou de phytotoxines chez les streptomycètes (phylum Actinobacteria), et (iii) la résistance au stress oxydatif ou nitrosatif ou à d’autres conditions défavorables chez les mycobactéries (phylum Actinobacteria)1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. Par conséquent, les oxydoréductases dépendantes de la F420 sont des biocatalyseurs prometteurs à des fins industrielles et pharmaceutiques ainsi que pour la bioremédiation des environnements contaminés1,23. Malgré ces découvertes récentes, les rôles exacts du cofacteur F420 sont encore marginalement connus chez les Actinobactéries ou d’autres phyla bactériens.
Il existe au moins trois voies pour la biosynthèse F4202,6,24. Au début, la voie de biosynthèse est divisée en une biosynthèse de la 5-déazaflavine et une branche du métabolisme du 2-phospholactate. La partie réactive de la molécule F420 est synthétisée via la FO-synthase en utilisant les substrats tyrosine et 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pyrimidinedione. Le résultat est le niveau de riboflavine chromophore FO. Dans la branche du métabolisme du lactate actuellement acceptée, le L-lactate est phosphorylé en 2-phospho-L-lactate par une L-lactate kinase (CofB); Le 2-phospho-L-lactate, à son tour, est guanylé en L-lactyl-2-diphospho-5'-guanosine par la 2-phospho-L-lactate guanylyltransférase (CofC). Dans l’étape suivante, la L-lactyl-2-diphospho-5'-guanosine est liée à la FO par une 2-phospho-L-lactate transférase (CofD) pour former F420-02. Enfin, l’enzyme F420-0:ɣ-glutamyl ligase (CofE) ligate les monomères du glutamate en F420-0, formant le cofacteur final6 en nombre variable23,25. Différents organismes présentent des modèles différents dans le nombre de résidus de glutamate attachés, avec des queues plus courtes trouvées pour les méthanogènes que dans les mycobactéries2,25,26. Généralement, les méthanogènes montrent des longueurs de queue de deux à trois, avec jusqu’à cinq dans le méthanogène acétoclastique, Methanosarcina sp., tandis que les longueurs de queue trouvées dans Mycobacterium sp. variaient de cinq à sept résidus de glutamate2,25,26,27. Cependant, des résultats récents ont montré que la F420 à longue chaîne se lie aux oxydoréductases dépendantes de la F420 avec une affinité plus élevée que la F420 à chaîne courte; de plus, la F420 à longue chaîne liée augmente l’affinité du substrat mais diminue le taux de renouvellement des enzymes respectives23.
La détection du cofacteur F420 est souvent basée sur sa fluorescence. Ainsi, ses dérivés oligo-glutamate ont été séparés à l’aide de la phase inversée (RP)-HPLC27,28. Récemment, Ney et al. ont utilisé l’hydroxyde de tétrabutylammonium comme réactif d’appariement d’ions pour la queue de glutamate chargée négativement afin d’améliorer la séparation sur RP-HLPC avec succès5. Nous présentons ici une méthode pour la préparation d’échantillons, la lyse ultérieure, l’extraction, la purification, la séparation et la quantification du cofacteur F420 non seulement à partir de cultures pures, mais également à partir de différents échantillons environnementaux (sols et boues de digesteur).
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Protocol
REMARQUE: L’extraction et l’analyse du cofacteur F420 est un processus en trois étapes comprenant la lyse de l’échantillon, la pré-purification du cofacteur via l’extraction en phase solide (SPE) et la détection des cofacteurs via IP-RP-HPLC (IP-RP-HPLC) avec détection de fluorescence. Avant de commencer, préparez les matériaux et les réactifs comme indiqué dans le tableau 1.
1. Lyse de l’échantillon
- Ajouter jusqu’à 5 g d’échantillon aux tubes appropriés (p. ex., tubes coniques de 50 mL).
- Ajouter 5 mL du tampon de lyse (2x solution mère, tableau 1) aux échantillons.
- Porter à un volume final de 10 mL avec de l’eau distillée pour atteindre une concentration finale de 0,5 g·mL-1.
- Vortex les échantillons dilués pendant 20 s.
- Autoclave pendant 30 min à 121 °C.
- Pour les échantillons secs comme le sol forestier, porter à un volume final de 20 mL avec de l’eau distillée après autoclavage et vortex l’échantillon dilué.
ATTENTION : L’augmentation de la température pendant l’autoclavage peut provoquer l’éclatement des tubes.
2. Pré-purification du cofacteur F 420 par extraction en phase solide (SPE)
REMARQUE: Toutes les étapes de SPE sont effectuées à température ambiante
- Refroidir les échantillons à la température ambiante.
- Centrifuger les échantillons autoclavés pendant 5 min à 11 000 x g.
- Préparer des colonnes SPE de 5 mL remplies de 100 mg de sorbant polymère à anions faibles en mode mixte.
- Conditionner l’échangeur d’anions avec 3 mL de méthanol (solution conditionnelle, tableau 1).
- Équilibrer l’échangeur d’anions avec 3 mL d’eau distillée (solution d’équilibration, tableau 1).
- Chargez jusqu’à 9,0 mL du surnageant du lysat centrifugé sur la colonne SPE.
- Laver les impuretés avec 5 mL d’acétate d’ammonium de 25 mM (solution de lavage SPE 1, tableau 1).
- Laver les impuretés avec 5 mL de méthanol (solution de lavage SPE 2, tableau 1).
- Éluez le cofacteur F420 dans 1,0 mL de tampon d’élution (tableau 1).
REMARQUE: Préparez un tampon d’élution frais. En raison du vide appliqué et de la pression de vapeur élevée du tampon d’élution, les volumes d’élution peuvent différer d’un échantillon à l’autre. Afin de garantir le même volume final dans tous les échantillons, il est recommandé de peser les récipients de collecte avant et après l’élution et de calculer le volume d’élution effectif. Équilibrez les différences par l’ajout d’un tampon d’élution.
3. Détection du cofacteur F420
- Réglez le four à 40 °C et le détecteur de fluorescence à 420 nm de longueur d’onde d’extinction et à 470 nm de longueur d’onde d’émission. Réaliser la séparation via le mode gradient en utilisant les phases mobiles A et B (Tableau 1): 0-3 min: 26% B; 3-24 min: 26%-50% B; 24-25 min: 50% B; 25-27 min: 50%-26% B; 27-35 min: 26% B à un débit de 0,75 mL·min-1.
REMARQUE : Garantir l’équilibrage des conditions de la colonne avant l’injection des échantillons en rinçant la colonne au moins avec 3 volumes de colonne de 74 % de phase mobile A et de 26 % de phase B mobile (tableau 1).- Filtrer les échantillons élués du SPE dans des flacons HPLC à l’aide d’un filtre PTFE d’une taille de pores de 0,22 μm.
REMARQUE: Les filtres en PTFE avec une taille de pore de 0,22 μm sont recommandés. - Injecter 50 μL de l’échantillon élué sur le système HPLC pour analyser la composition et la concentration du cofacteur F420 .
REMARQUE: Comme aucune norme quantitative n’est utilisée dans ce protocole, les échantillons et les variantes doivent être comparés par zone de crête.
- Filtrer les échantillons élués du SPE dans des flacons HPLC à l’aide d’un filtre PTFE d’une taille de pores de 0,22 μm.
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Representative Results
Des cultures pures de Methanosarcina thermophila et de Methanoculleus thermophilus, deux archées méthanogènes thermophiles, ont été cultivées dans des milieux appropriés comme décrit précédemment29,30. Pour Methanosarcina thermophila, le méthanol a été utilisé comme source d’énergie, tandis que Methanoculleus thermophilus a été cultivé sur H2/CO2. La croissance a été vérifiée par une évaluation microscopique, tandis que l’activité a été examinée par mesure du méthane (CH4) par chromatographie en phase gazeuse comme décrit précédemment31. Des cultures pures ont été utilisées pour l’extraction du cofacteur F420 selon le protocole présenté. En outre, des échantillons environnementaux comprenant des échantillons provenant de boues de réacteurs au biogaz mésophiles (station d’épuration des eaux usées, Zirl, Autriche; pour plus de détails sur les paramètres des boues, veuillez vous référer à32), une prairie utilisée à des fins agricoles (Innsbruck, Autriche) et des sols forestiers (Lans, Autriche) ont été prélevés à l’automne 2020 pour l’extraction et l’analyse du cofacteur F420.
La croissance des cultures pures a été vérifiée par microscopie (Figure 1), le CH4 produit étant analysé par chromatographie en phase gazeuse pendant 14 jours d’incubation (données non présentées). L’efficacité de l’extraction du cofacteur F420 à partir de cultures pures a été testée en appliquant différentes stratégies de désintégration: battement à l’aide de battements céramiques de 0,5 à 1,0 mm, traitement par ultrasons et désintégration pression-température à l’aide d’une pression de 121 ° C et 1,2 bar (autoclavage). L’efficacité maximale de l’extraction est devenue apparente en utilisant un traitement pression-température en appliquant un tampon tel que décrit dans la section du protocole et a donc été appliquée pour toutes les expériences ultérieures (figure 2). Les tests d’efficacité d’extraction ont été effectués par addition standard de différents volumes d’une culture de Methanoculleus thermophilus en bonne croissance. En outre, la comparaison de différents échantillons et variantes était basée sur la zone de crête des chromatogrammes.
Par la suite, les extraits cellulaires ont été soumis à une procédure d’extraction en phase solide (SPE). À cette fin, différents échangeurs d’ions ont été testés. Il s’est avéré qu’un sorbant polymère à mode mixte d’anion faible produisait la plus grande quantité de cofacteur F420 après l’élution. En outre, différents tampons d’élution et solutions de lavage ont été testés et ont montré les meilleurs résultats pour l’acétate d’ammonium de 25 mM comme tampon de lavage et un mélange de NH3 dans le méthanol comme tampon d’élution. Le méthanol de l’étape d’élution pourrait être échangé après l’élution avec de l’eau via un traitement sous vide-température.
L’analyse HPLC du cofacteur F420 a été testée avec différentes colonnes C18 avec les meilleurs résultats pour la configuration du système obtenus au cours de l’étude présentée avec une colonne NX C18. Une norme contenant une distribution connue de dérivés de F420 avec une longueur de queue de glutamate variable a été utilisée à des fins de référence. Cette norme a été aimablement fournie par le professeur Colin Jackson de l’Université nationale australienne. L’analyse de la longueur de la queue du glutamate a révélé des différences dans la concentration globale du cofacteur F420 et la distribution de la longueur de la queue F420 des cultures pures méthanogènes et des échantillons environnementaux (figure 3).
| Tampon | Composition |
| Tampon de lyse (2x solution mère) | 200 mM de dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4) 50 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) 1 % (p/v) de polysorbate 80 (Interpolation 80) ajusté à un pH de 7,0 avec une solution d’hydroxyde de sodium de 5 M |
| Solution de conditionnement SPE | Méthanol (qualité CLHP) |
| Solution d’équilibrage SPE | Eau distillée 0,2 μm filtrée |
| Solution de lavage SPE 1 | Acétate d’ammonium de 25 mM |
| Solution de lavage SPE 2 | Méthanol (qualité CLHP) |
| Tampon d’élution SPE | 2 % (v/v) d’ammoniac dans le méthanol en diluant une solution aqueuse d’ammoniac de 20 % à 25 % dans du méthanol |
| HPLC mobile phase A | 10 mM d’hydroxyde de tétrabutylammonium (TBAH) 20 mM d’hydrogénophosphate de di-ammonium ((NH4)2HPO4) ajusté à un pH de 7,0 avec de l’acide phosphorique à 85 % |
| HPLC mobile phase B | Acétonitrile (grade HPLC) |
Tableau 1 : Composition tampon et phase mobile pour l’extraction en phase solide (SPE) et l’analyse HPLC.
Figure 1 : Culture pure méthanogène fluorescente. Visualisation de Methanosarcina thermophila par microscopie à contraste de phase (A) et par microscopie à fluorescence (B) lorsque le cofacteur F420 est excité par la lumière UV (excitation à 395-440 nm et émission à 475-495 nm). Barre d’échelle : 10 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Ajout standard. Zone de crête du cofacteur F420 récupéré après SPE à partir de 1,0 g de matrice enrichie avec différents volumes de cultures de M. thermophilus. La matrice a été modifiée avec 0 μL, 250 μL, 500 μL, 750 μL et 1000 μL de culture et soumise à différentes stratégies de désintégration: battement, traitement par ultrasons et désintégration pression-température (autoclavage). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Distribution de la longueur de la queue du glutamate. Distribution de la longueur de la queue du cofacteur F420 des cultures pures et des échantillons environnementaux. De haut en bas : prairie (sol), forêt (sol), réacteur mésophile au biogaz, culture pure de M. thermophilus et culture pure de M. thermophila. L’absorbance relative a été calculée par normalisation sur le pic le plus élevé du chromatogramme montré. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Pour l’évaluation du cofacteur F420 à partir de cultures pures méthanogènes, une évaluation microscopique peut être effectuée pour visualiser la croissance et l’activité (microscopie à fluorescence) des micro-organismes impliqués (Figure 1). Pour les échantillons provenant d’environnements naturels, l’utilisation de la microscopie pour détecter ou quantifier F420 est limitée en raison des interférences avec d’autres micro-organismes fluorescents, des particules organiques et inorganiques. Dans ce contexte, l’extraction de F420 et l’analyse fluorométrique ultérieure à l’aide de la CLHP, comme décrit précédemment5, peuvent non seulement fournir des informations sur la concentration globale du cofacteur F420 , mais également sur la distribution de la longueur de la queue du polygutamate.
Pour l’extraction du cofacteur F420, un traitement pression-température s’est avéré très efficace (Figure 2) et est conforme aux résultats précédents5,27,33. Grâce à cette méthode et à l’application d’un système de lyse tampon phosphate comprenant de l’EDTA et du polysorbate, les concentrations les plus élevées de cofacteur F420 ont été obtenues à partir de cultures pures méthanogènes contenant des concentrations élevées du facteur. De plus (et en comparaison avec les autres méthodes de perturbation cellulaire testées), le traitement pression-température est facilement applicable et permet d’économiser de la matière.
Spe a été effectué pour permettre une analyse HPLC en aval visant à déterminer la distribution de la longueur de la queue du polyglutamate cofacteur F420 dans un échantillon. Parmi les différents échangeurs d’ions, un sorbant polymère à mode mixte d’anions faibles a montré les meilleures performances et permet une liaison efficace du cofacteur F420 à la matrice à des fins de lavage ainsi que son retrait ultérieur de la matrice d’extraction après le lavage des sous-produits indésirables. À cette fin, le méthanol de base s’est avéré le meilleur.
Grâce à la méthode présentée, diverses cultures pures et échantillons environnementaux ont pu être analysés de manière reproductible en ce qui concerne le cofacteur F420 (figure 3). Même des échantillons tels que des sols ou des boues contenant de fortes proportions de sous-produits indésirables pourraient être analysés selon la procédure présentée. Par conséquent, l’analyse en aval par CLHP a été mise en œuvre avec succès pour analyser la concentration totale de F420 et la distribution de longueur des queues de polyglutamate des dérivés de F420 . La détection de niveaux élevés de F420 dans le sol et d’autres échantillons soutient Ney et el.5, qui ont proposé que le cofacteur soit répandu dans les bactéries aérobies du sol sur la base d’analyses génomiques et métagénomiques.
Pour résumer, il s’agit du premier protocole visant à extraire et à analyser le cofacteur F420 non seulement à partir de cultures pures, mais également à partir d’échantillons environnementaux tels que le sol ou les boues. L’étape la plus critique dans l’extraction du F420 à partir d’échantillons environnementaux est le SPE nécessaire pour le pré-nettoyage des lysats pour une analyse HPLC ultérieure. Le protocole présenté sera utile pour les projets futurs visant à dévoiler le rôle du F420 dans divers environnements et bioprocédés.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions chaleureusement le professeur Colin Jackson pour son soutien avec le cofacteur purifié F420. Cette recherche a été soutenue par le Fonds tyrolien pour la science (TWF) et l’Universität Innsbruck (Publikationsfonds). Nous reconnaissons grandement le soutien de GPS, HK, SB, GG et HB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave | |||
| Biocompatible HPLC system equipped with gradient modul, oven and fluorescence detector | Shimadzu | HPLC system | |
| Centrifuge and rotor for 50 mL “Falcon” tubes (11.000 rcf) and appropriate tubes | |||
| HPLC Column: Gemini NX C18, 5 μm, 150 x 3 mm | Phenomenex | HPLC column | |
| PTFE filter (pore size 0.22 µm) to remove particulate matter prior HPLC analysis | |||
| Resin for SPE: Strata-X-AW 33 μm as weak anion mixed-mode polymeric sorbent | Phenomenex | weak anion mixed-mode polymeric sorbent | |
| Vacuum manifold for SPE and appropriate collection tubes | SPE equipment | ||
| Vortex mixer |
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