Summary
我们描述了用光片荧光显微镜 在体内 研究斑马鱼心脏的优化工具。具体而言，我们建议使用明亮的心脏转基因系，并提出新的温和嵌入和固定技术，以避免发育和心脏缺陷。还提供了适用于心脏成像的可能的数据采集和分析管道。
Abstract
胚胎心脏研究极大地受益于快速 体内 光片荧光显微镜（LSFM）的进步。结合斑马鱼的快速外部发育，可处理的遗传学和半透明性， Danio rerio，LSFM以高空间和时间分辨率提供了对心脏形态和功能的见解，没有显着的光毒性或光漂白。心脏跳动的成像对现有的样品制备和显微镜技术提出了挑战。需要在狭窄的视野中保持健康的样本，并获得超快的图像以解析心跳。在这里，我们描述了在体内研究斑马鱼心脏的优化工具和 解决方案。我们展示了明亮的转基因系在标记心脏成分方面的应用，并提出了新颖的温和嵌入和固定技术，以避免发育缺陷和心率变化。我们还提出了一种适用于心脏成像的数据采集和分析管道。这里介绍的整个工作流程侧重于斑马鱼胚胎心脏成像，但也可以应用于各种其他样品和实验。
Introduction
为了揭示早期跳动心脏中的复杂事件和相互作用，需要对整个器官进行体内成像。凭借其最小的光毒性1，2，3，低光漂白4和高速，光片显微镜已发展成为胚胎和心脏发育的主要成像工具5，6。它以高空间和时间分辨率7，8，9提供了对心脏形态和功能的见解，并使研究人员能够以高速成像和跟踪荧光标记的心脏部位，研究血动力，并直接跟踪发育中的胚胎体内的心脏发育6，10，11，12。
为了精确和可重复地限制斑马鱼在视野中，存在各种用于光片的嵌入方案，短期和长期，以及单样本或多样本13，14，15，16，17，18，19。最常见的方案涉及三卡因固定和琼脂糖安装在玻璃或塑料管内。然而，由于温度、麻醉剂和所使用的包埋材料，心率可能会发生变化20、21、22，斑马鱼心脏成像需要具体、温和的实验方案来确保样品健康6，8、11、12、20、21、22、23.对于短期成像（长达一小时），可以将鱼麻醉在130 mg / L三卡因中，并将其嵌入含0.1%琼脂糖溶液和塞子的氟化乙烯丙烯（FEP）管中，如Weber等人201416所述。然而，由于三卡因可导致发育缺陷20，22，因此必须使用不同的方案进行长期成像。
在这里，我们描述了一种长期心脏成像的新策略。虽然存在许多光片实现24，但我们建议在T-SPIM显微镜中使用悬挂样品（一个检测和两个照明透镜在水平面上，样品垂直悬挂在公共焦点中）。这为精确的样品定位提供了必要的移动和旋转自由度。通过在单细胞或双细胞阶段注射30pg α-bungarotoxin mRNA来固定鱼。α-bungarotoxin是一种蛇毒，可麻痹肌肉而不影响心血管发育或生理学22。为了获得精确、无失真的成像，我们建议将鱼镶嵌在由FEP制成的管子中，FEP是一种折射率几乎与水相同的聚合物。我们讨论了如何在成像之前通过拉直和清洁FEP管来最好地准备FEP管。然后将鱼头朝下安装在这些管子中，放在介质中，并用2%琼脂糖塞密封管的底部，鱼头放在该塞子上。在FEP管上切割孔有助于气体交换并确保鱼的生长。嵌入的鱼可以保存在培养基中，直到在成像前安装到样品架上。我们还建议使用数据采集和分析管道，以实现可重复的高速成像。此外，我们讨论了使用细胞质与膜标记转基因系进行稳健的心脏细胞标记，以及停止心脏的不同选择。这些安装技术可确保样品的健康，同时允许在视野中精确且可重复地约束心脏。
Protocol
所有斑马鱼（Danio rerio）成人和胚胎均按照威斯康星大学麦迪逊分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的协议进行处理。
1. 斑马鱼的制备
- 根据既定协议25，26 和机构指南处理斑马鱼。繁殖所需转基因品系的成鱼（见讨论）。收集胚胎并将其保存在28°C的培养皿中，其中装有鱼类培养基，例如E327。
- 选择一种固定方法（参见讨论）。
- 如果使用α-bungarotoxin mRNA固定鱼，则使用安装在显微操纵器上并连接到picoinjector28的孔玻璃针将30 pg mRNA22注射到单细胞或两个细胞阶段胚胎的蛋黄中。
- 如果使用三卡因，用1 M Tris碱缓冲至pH 7.0-7.4%的0.4%储备溶液，并储存在-20°C直至成像。
- 将鸡蛋保存在28°C的E3填充培养皿中，每24小时将鸡蛋转移到具有新鲜E3的新培养皿中，直到成像。
- 为了防止色素形成，如果斑马鱼的背景不是白化病，请在受精后24小时（hpf）将鱼转移到具有0.2mM酪氨酸酶抑制剂1-苯基2-硫脲的新E3培养皿中（见讨论）。
2. FEP管的制备
图 1：FEP 管清洁和矫直。 （a） 电缆卷筒上的 FEP 管。（b） 矫直前的 FEP 管。（c） 玻璃和钢制高压灭菌器安全管中的FEP管。（d） 在矫直和冷却后冲洗FEP管。（e） 将FEP管切割成离心管的大小，以便进行超声处理。（f） 超声处理后FEP管冲洗。（g） 将清洁和拉直的FEP管储存在离心管中。（h） 在成像前切割FEP管。 请点击此处查看此图的放大版本。
- 通过将FEP管（图1a，b）放置在玻璃或钢高压灭菌器安全管（图1c）中以正确的内径以适合FEP管（通常为1.6或2.4 mm）并高压灭菌器至180°C2小时，从而拉直FEP管（图1a，b）。让管子在室温下冷却至少5小时。然后，从矫直管中取出。
注意：操作管子时使用手套，一次使用50厘米的管子。 - 清洁 FEP 管。
注意：为了安全起见，建议使用具有内部FEP管尺寸钝针尖的注射器，但常规针头可以正常工作。- 用50 mL注射器用1 M NaOH冲洗试管两次（图1d）。
- 用剃须刀片将FEP管切割成50mL离心管的大小（图1e），将切割的管放入0.5M NaOH填充的离心管中，并超声观察10分钟。
- 用双蒸馏H2 O冲洗FEP管，然后用70%乙醇重复冲洗（图1f）。
- 将管转移到70%乙醇中并超声10分钟。
- 用双蒸馏H2 O冲洗试管，并将其储存在双蒸馏H 2 O的离心管中（图1g）。
3. 制备2%琼脂糖菜
- 在玻璃瓶中，将低熔点琼脂糖粉末溶解在E3中。在微波炉中加热溶液并每20秒搅拌一次，直到所有粉末溶解。
- 将琼脂糖倒入玻璃或塑料培养皿中，制成1-2毫米的涂层。等到琼脂糖凝固。
- 储存时，轻轻地将E3倒在琼脂的顶部以防止干燥。包裹在石蜡膜中，并保持在4°C。
4. 嵌入介质的制备
- 准备足够的E3来填充样品室。
注：如果介质与物镜接触，请避免使用甲基蓝。 - 如果使用三卡因，解冻储备溶液并向E3中添加0.02%的三卡因。
5. 样品安装
图2：胚胎在FEP管中安装（a）在安装介质中麻醉的无色素鱼。（b） 带有钝端针和FEP管的注射器。（c） 一旦介质和鱼被吸入FEP管中，在针的边缘切割管子。（d） 将切好的管浸入涂有2%琼脂糖的培养皿中，以堵塞其末端。（e） 塞住FEP管中的斑马鱼。（f） 以30°的角度轻轻切割FEP管以形成气体交换孔。（g）在嵌入斑马鱼上方有四个孔的FEP管。（h） 将斑马鱼嵌入FEP管的方案。指示孔和琼脂塞。（i） 多条嵌入的斑马鱼，准备成像。请点击此处查看此图的放大版本。
- 使用一次性玻璃移液器将鱼转移到嵌入介质中（图2a）。如果使用三卡因，请在成像前10分钟将鱼转移到装有含三卡因E3的培养皿中。在这两种情况下，在立体显微镜下观察，以验证与对照组相比，鱼停止移动并且心脏以相似的速度跳动。
- 用剃须刀片将FEP管切割成理想长度（图1h）。
注：长度应根据显微镜的样品架进行调整;典型长度约为3厘米。 - 准备一个带有钝端套管的注射器。用空气填充注射器，然后将FEP管安装到针头上，并通过清空注射器轻轻冲洗掉任何剩余的水（图2b）。
注意：通过缓慢冲洗空气来避免产生气泡。 - 使用注射器安装的FEP管，首先，拿起培养基填充FEP管，然后向下取下胚胎头。保持鱼头尽可能靠近管端。避免产生任何气泡;如果存在气泡，请丢弃样品。
- 用剃须刀片小心地切开钝端套管或针头边缘的FEP管（图2c）。
- 丢弃琼脂涂层盘顶部的任何液体。将FEP管直接插入琼脂中（图2d）。旋转管子并将其取出，以从琼脂糖床中释放插头。
- 在立体镜下，验证管末端是否存在琼脂塞（图2e）。
- 对于长期成像，在每个基本方向上切入FEP管中的3-5个孔，至少在鱼的末端上方5毫米处。
- 在立体镜下，使用垂直于管轴的剃须刀片在FEP管中切开30°，直到到达安装介质（图2f）。
- 以180°进行第二次切割以形成一个孔（图2g，h）。
- 将安装的胚胎头向下转移到带有包埋培养基的1.5mL微量离心管中，直到准备好成像（图2i）。
6. 样品定位
图3：样品室。 （a）安装在样品架上的FEP管。（b） 带有载物台和物镜的样品室。（c） 充满介质的样品室的俯视图，具有T-SPIM配置的照明和检测目标。（d）样品架安装在显微镜上，样品在腔室中。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：用于心脏成像的胚胎定位。 （a）24 hpf Tg（kdrl：Hsa.HRAS-mCherry）斑马鱼眼睛未对齐。（a'）同样的鱼，眼睛对齐。（b）同一条鱼旋转-100°和（b'）-50°以获得最佳心脏成像。（c） 眼睛未对准的48马力斑马鱼。（c'）同样的鱼，眼睛对齐。（d） 同一条鱼旋转30°，以获得最佳心脏成像。黑色箭头指向心脏。比例尺 100 μm .请点击此处查看此图的放大版本。
- 在显微镜下，将FEP管安装在样品架中（图3a），并用嵌入介质填充成像室（图3b，c）。接下来，将样品架放在载物台上，样品浸入腔室（图3d）。
- 检查样品的运行状况。通过与未安装的对照鱼进行比较，目视评估心率以评估整体鱼类健康状况，因为特定的心率取决于阶段和温度。如果心跳太慢，丢弃鱼。
注意：确保轻柔地处理胚胎，小心转移到嵌入培养基，嵌入后立即成像，避免快速温度变化，避免三卡因，并降低暴露于三卡因的时间。 - 对于可重复的成像，请始终使用相同的样品位置。建议对准眼睛并以一定角度成像。
- 旋转鱼，使两只眼睛（图4a，c）在焦平面上（图4a'，c'）
- 从该位置，进一步顺时针旋转鱼约50°-100°进行24 hpf成像（图4b，b'），逆时针旋转约20°-30°以进行48 hpf成像（图4d）。
注意：早期心脏，在30 hpf之前，由于其隐藏位置而难以成像（图4b）。
7. 图像采集
- 选择可提供最佳图像质量的照明侧，并根据每条鱼调整激光功率。
注：记录用于后续图像分析的激光功率。 - 在每个 z 平面上，以每秒 300 帧 （fps） 或更高的速度记录 4-5 个检测信号。
注：可以裁剪视野以提高采集速度。例如，在48 hpf下，斑马鱼的心脏每秒跳动两到三次，因此，在300 fps时，需要300到600帧才能获得四到六个心跳。 - 要记录跳动的心脏，请逐步移动样品穿过光片。使用1-2μm的z间距，覆盖整个心脏深度。
8. 图像处理
- 如前所述，同步录制的短片，使用斐济（图像 J229，30）插件重建 4D（x，y，z，时间）心脏6。
- 要浏览数据并生成渲染斑马鱼心脏的电影，请将4D文件（x，y，z，时间）加载到3D渲染软件中。
Representative Results
图5：48马力的斑马鱼心脏。 （a）一个 z帧的静止图像，48 hpf Tg（kdrl：Hsa.HRAS-mCherry; myl7：lck-EGFP）斑马鱼的前腹视图，用LSFM成像，（b）电影堆栈的3D重建，通过中庭的切视图。（c） 在一个z平面上全心跳的四帧蒙太奇。饼图指示检测信号期间的时间。比例尺 50 μm。 请单击此处查看此图的放大版本。
根据上面详述的协议，我们记录了Tg（kdrl：Hsa.HRAS-mCherry; myl7：lck-EGFP）斑马鱼的48 hpf跳动的心脏（图5）。488 nm和561 nm激光片同时照亮了样品。使用16x/ 0.8 W物镜和科学金属氧化物半导体（sCMOS）相机垂直检测发射的荧光。
在48 hpf时，心脏刚刚经历循环，有两个腔室，心室和心房，但尚未发育瓣膜。在我们的电影中，很容易区分不同的心脏结构，如流入道，心室，房室（AVC），心房和流出轨道（图5a，b）。这些数据显示了心脏两个细胞层之间的精确跳动并揭示了复杂的相互作用：心肌，收缩和产生力的单细胞肌肉层（图5c，红色）和心内膜，连接心脏和脉管系统的单细胞层（图5c，青色）。
根据Mickoleit等人6，以x，y，z（3D）+时间（4D）+颜色（5D）进行心跳重建。重建基于两个假设：心脏的运动是重复的，并且应该通过一个小的z步长来获取数据。输出是 5D 中重建的单个检测信号，每个检测信号的测量值为 30 GB 到 80 GB。为了渲染数据，我们使用免费的开源工具FluoRender进行深度渲染31 ，因为它旨在处理多维数据集，并轻松渲染细胞层和单个层的5D电影（图5b）。
Discussion
用于对心脏成像的转基因细胞系
图6：细胞质和膜标记斑马鱼转基因品系的比较。 用LSFM成像的48 hpf斑马鱼心脏的前腹视图。白色箭头表示仅通过膜标记转基因线可见的结构。（a） Tg（kdrl：EGFP）32 信号在心脏呈青色，（a'） 在心室中。（b） Tg（kdrl：Hsa.HRAS-mCherry; myl7：dsRed）33 信号在心脏呈红色，（b'） 在心室中。（ c，c'） 合并 Tg（kdrl：Hsa.HRAS-mCherry; myl7：dsRed） 和 Tg（kdrl：EGFP） 信号。比例尺 50 μm。 请单击此处查看此图的放大版本。
对斑马鱼心脏进行成像需要精确的心脏细胞标记。虽然整个细胞的心肌厚度相对恒定，但心内膜细胞在细胞核周围较厚，但具有薄膜突起，在某些区域薄于2μm。细胞质转基因系如Tg（kdrl：EGFP）32 有效地标记了心内膜核周围的区域，但更远的地方，薄细胞质可能无法发出足够的光子，无法在如此短的曝光时间内检测到，从而导致数据中的人造孔（图6a）。相比之下，膜标记转基因系如Tg（kdrl：Hsa.HRAS-mCherry）33 可以有效地标记心内膜并揭示更多细节（图6b，c）。对于每个实验，仔细选择最合适的转基因品系。
斑马鱼固定
固定技术的选择取决于实验的长度和鱼的成像年龄。三卡因通常用于斑马鱼固定，主要是因为它的易用性。事实上，只需向鱼培养基中添加130 mg / L三卡因即可在10分钟内麻醉。由于它可能导致发育缺陷并影响心脏生理学20，22，我们建议仅在短期实验（少于30分钟）中使用三卡因。对于更长的成像效果，在单细胞或双细胞阶段注射α-bungarotoxin mRNA可在受精后3天内使鱼瘫痪，而不会影响心血管发育或生理学22。
选择合适的 FEP 管
FEP管有各种直径和厚度可供选择。要成像0-5 dpf鱼，0.8毫米是一个很好的内径;选择厚壁 0.8 x 1.6 mm 管或薄壁 0.8 x 1.2 mm 管。我们建议使用薄壁管;然而，较厚的壁提供了更高的稳定性和刚度，如果样品室具有可能破坏和移动细管的流动介质，则这可能很重要。对于较大的样品，可以使用1.6 x 2.4 mm和2 x 3 mm。
温度和气体交换
斑马鱼胚胎健康的一个重要方面是温度。理想情况下，在成像时将鱼保持在28.5°C，因为环境的温度会影响发育和心率34。
根据我们的经验，通过2%琼脂糖塞的氧气交换只能保持稳定的心率，直到3-4 dpf。因此，在管子上切孔可确保氧气扩散。如果需要，也可以将药物输送到样品中。
暂停心跳。
适当配备的光片显微镜的快速采集速度允许 记录体内跳动的心脏。然而，要获得不受干扰的z-stack，可以减慢或停止心脏。然而，停止心脏会导致心肌放松，并可能导致心脏塌陷6。心跳悬浮液可以通过使用吗啉，低温，肌肉收缩抑制剂或光遗传学来完成。这些方法都有其缺点，必须针对每个实验进行仔细评估。
在一个细胞阶段注射4 ng 沉默心脏（sih） 吗啉可以通过靶向对肉瘤形成至关重要的基因 tnnt2a 来停止心跳35。 sih 斑马鱼没有心跳，只能存活到7 dpf，当胚胎开始依赖循环血液进行氧合时。由于心脏形态发生是由遗传和生物力学力量36驱动的，这些鱼在3 dpf左右出现心脏畸形。
由于Ca2 + 的流量对温度敏感，温度会影响胚胎斑马鱼的心率21。因此，降低成像室中的温度会减慢心跳。停止心跳需要低于15°C的温度。 由于斑马鱼通常保持在28.5°C，因此这种低温只能保持短时间（不到10分钟）。
药物如肌肉收缩的化学抑制剂，2，3-丁二酮2-一氧化二肟（BDM），可以添加到斑马鱼培养基（50 nM37，38）中暂时暂停心跳。BDM使用方便，因为它在15分钟内停止心脏收缩，并且可以洗掉以恢复心脏功能。然而，由于BDM会改变心脏动作电位，因此必须谨慎使用37。
最后，通过用光照射入路的起搏器来操纵和停止在其心肌中表达光门离子通道或泵（如通道视紫红质或卤素视紫红质）的转基因斑马鱼的心脏39，7，40，41，9。
展望
所提出的用于 在体内 研究斑马鱼心脏的优化工具和解决方案允许对超快心脏动力学进行长期，温和的成像。样品包埋可以适应不同的成像方式，例如共聚焦显微镜，双光子显微镜或光学投影断层扫描（OPT）。然而，光片显微镜可能是首选技术，它以足以捕获心脏动力学的速度提供光学切片。虽然该协议侧重于斑马鱼胚胎心脏成像，但我们相信它也可以应用于各种其他样品和实验。将来，如果类似的嵌入和成像技术也可以在发育过程中的后期阶段使用，当心脏更隐蔽，幼虫半透明性更低时，这将是一件有趣的事情。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢 Madelyn Neufeld 在图 2h 中的插图。这项工作得到了马克斯普朗克学会，莫格里奇研究所，陈扎克伯格倡议和人类前沿科学计划（HFSP）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5mL Eppendorf | Eppendorf | 22364111 | To carry embedded samples |
| 15mL Falcon tubes | Falcon | 352095 | To carry embedded samples |
| 50mL centrifuge tubes | Falcon | 352070 | 50ml tubes for sonication step, and storing cleaned, straightened FEP tubes |
| 50mL syringe | BD | 309654 | 50ml syringe for FEP cleaning |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma Aldrich | 39346-81-1 | To make plug |
| Blunt Tip Needles, 21 gauge | VWR | 89500-304 | Blunt end needle for 0.8 inner diameter FEP tube |
| Borosilicate glass tube | McMaster-Carr | 8729K33 | Tubing for FEP tube straightening 9.5mm outer diameter, 5.6 inner diameter, 30cm long, other sizes available |
| Borosilicate glass tube | McMaster-Carr | 8729K31 | Tubing for FEP tube straightening 6.35mm outer diameter, 4mm inner diameter, 30cm long, other sizes available |
| Conventional needles, 21 Gauge | BD | 305165 | Conventional needle for 0.8 inner diameter FEP tube |
| Disposable glass pipette | Grainger | 52NK56 | To transfer fish, use with pipette pump |
| E3 medium for zebrafish embryos | |||
| Ethanol | Sigma Aldrich | 64-17-5 | Ethanol for FEP cleaning |
| FEP tube, 0.8 / 1.2 mm | ProLiquid | 2001048 | FEP tube with thin wall, other sizes available |
| FEP tube, 0.8 / 1.6 mm | Bola | S1815-04 | FEP tube with thick wall, other sizes available |
| FEP tube, 2/3mm | BGB | 211581 | Large FEP tube with thick wall, other sizes available |
| Hot Hand Rubber Mitt | Cole-Parmer | 691000 | To carry hot equipment after autoclaving |
| Omnifix 1mL Syringes | B Braun | 9161406V | 1ml syringe for embedding |
| Petri dish, small | Dot Scientific | PD-94050 | To make agarose plug |
| Pipette pumps | Argos Technologies | 04395-05 | To transfer fish, use with disposable glass pipette |
| PTU | Sigma Aldrich | 103-85-5 | Also known as: N-Phenylthiourea, 1-Phenyl-2-thiourea, Phenylthiocarbamide |
| Razor blades | Azpack | 11904325 | To cut FEP tubes |
| Sodium Hydroxide | Dot Scientific | DSS24000 | NaOH for FEP cleaning |
| Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | Also known as: MS-222, Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, Tricaine |
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