Summary
Vi beskriver optimerede værktøjer til at studere zebrafisk hjerte in vivo med lys ark fluorescens mikroskopi. Specifikt foreslår vi lyse hjertetransgenic linjer og præsenterer nye blide indlejrings- og immobiliseringsteknikker, der undgår udviklings- og hjertefejl. Der findes også en mulig dataindsamlings- og analysepipeline, der er tilpasset hjertebilleddannelse.
Abstract
Embryonale hjerteforskning har i høj grad nydt godt af fremskridt inden for hurtig in vivo lysplade fluorescensmikroskopi (LSFM). Kombineret med den hurtige eksterne udvikling, tractable genetik, og translucency af zebrafisk, Danio rerio, LSFM har leveret indsigt i hjerteform og funktion ved høj rumlig og tidsmæssig opløsning uden væsentlig fototoksicitet eller photobleaching. Billeddannelse af bankende hjerter udfordrer eksisterende prøveforberedelse og mikroskopiteknikker. Man er nødt til at opretholde en sund prøve i et indsnævret synsfelt og erhverve ultrahurtige billeder for at løse hjerteslag. Her beskriver vi optimerede værktøjer og løsninger til at studere zebrafisk hjerte in vivo. Vi demonstrerer anvendelser af lyse transgene linjer til mærkning af hjertebestanddelene og præsenterer nye blide indlejrings- og immobiliseringsteknikker, der undgår udviklingsmæssige defekter og ændringer i pulsen. Vi foreslår også en dataindsamlings- og analysepipeline tilpasset hjertebilleddannelse. Hele arbejdsgangen, der præsenteres her, fokuserer på zebrafisk embryonal hjertebilleddannelse, men kan også anvendes på forskellige andre prøver og eksperimenter.
Introduction
For at afdække de komplekse begivenheder og interaktioner i det tidlige bankende hjerte kræves in vivo-billeddannelse af hele organet. Med sin minimale fototoksicitet1,2,3, lav fotobleaching4, og høj hastighed, lys ark mikroskopi har udviklet sig som den primære billeddannelse værktøj til embryonale og hjerte udvikling5,6. Det har givet indsigt i hjerteform og funktion ved en høj rumlig og tidsmæssig opløsning7,8,9 og har gjort det muligt for forskere at afbilde og spore fluorescerende mærkede dele af hjertet ved høj hastighed, studere hæmodynamiske kræfter og følge hjerteudviklingen direkte inde i kroppen af udviklende embryoner6,10,11,12.
For præcist og reproducert begrænse zebrafisk i synsfeltet findes der på kort og lang sigt en række integreringsprotokoller for lysark samt enkelt- eller multiprøve13,14,15,16,17,18,19. Den mest almindelige protokol indebærer tricain immobilisering og agarose montering inde i et glas eller plastrør. Men da pulsen kan ændre sig på grund af temperaturen, bedøvelsen og indlejringsmateriale, der anvendes20,21,22, kræver zebrafisk hjertebilleddannelse specifikke, blide protokoller for at sikre prøvesundhed6,8,11,12,20,21,22,23 . For kortsigtet billeddannelse (op til en time) kan man bedøve fisken i 130 mg/L tricain og indlejre den i fluorerede ethylenpropylenrør (FEP) med 0,1% agaroseopløsning og et stik, som beskrevet i Weber et al. 201416. Men, som tricain kan føre til udviklingsmæssige defekter20,22, forskellige protokoller skal anvendes til langsigtet billeddannelse.
Her beskriver vi en ny strategi for langvarig hjertebilleddannelse. Mens mange lysark implementeringer findes24, anbefaler vi at bruge en hængende prøve i en T-SPIM mikroskop (en detektion og to belysning linser i et vandret plan med prøven hængende lodret i det fælles fokus). Dette giver den nødvendige bevægelses- og rotationsfrihed til den præcise prøvepositionering. Fisken immobiliseres ved at injicere 30 pg α-bungarotoxin mRNA på et- eller tocellet stadium. α-bungarotoxin er en slangegift, der lammer musklerne uden at påvirke hjerte-kar-udvikling eller fysiologi22. For præcis, distortion-fri billeddannelse anbefaler vi montering af fisk i rør lavet af FEP, en polymer med et brydningsindeks næsten identisk med vand. Vi diskuterer, hvordan man bedst forbereder FEP-rørene ved at rette og rense dem før billeddannelse. Fisken monteres derefter i disse rør, hovedet ned, i medierne, og bunden af røret er forseglet med en 2% agarose stik, hvor fiskehoveder hviler. Skæring huller i FEP rør letter gas udveksling og sikrer fisk vækst. Den indlejrede fisk kan opbevares i medier, indtil den monteres på en prøveholder lige før billeddannelse. Vi foreslår også en dataindsamlings- og analysepipeline til reproducerbar højhastighedsbilleddannelse. Yderligere diskuterer vi brugen af cytoplasmisk versus membranmarkør transgene linjer til robust hjertecellemærkning samt forskellige muligheder for at stoppe hjertet. Disse monteringsteknikker sikrer prøvesundheden, samtidig med at hjertet kan begrænse hjertet præcist og reproducerbart på synsfeltet.
Protocol
Alle zebrafisk (Danio rerio) voksne og embryoner blev håndteret i overensstemmelse med protokoller godkendt af UW-Madison Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Forberedelse af zebrafisk
- Håndtere zebrafisk i henhold til etablerede protokoller25,26 og institutionelle retningslinjer. Race voksen fisk af ønskede transgene linje (se Diskussion). Saml embryonerne og opbevar dem ved 28 °C i en petriskål fyldt med fiskemedium, f.eks.
- Vælg en metode til immobilisering (se Diskussion).
- Hvis du bruger α-bungarotoxin mRNA til at immobilisere fisken, injicere 30 pg mRNA22 i æggeblomme af en- eller to-cellede fase embryoner ved hjælp af en boreglas nål monteret på en mikromanipulator og forbundet til en picoinjector28.
- Hvis du bruger tricain, skal du fremstille 0,4 % lageropløsning, der bufferes til pH 7,0-7,4 med 1 M Tris-base og opbevares ved -20 °C indtil billeddannelse.
- Opbevar æggene i en E3 fyldt petriskål ved 28 °C, og overfør æggene hver 24. time til en ny ret med frisk E3, indtil de billeddannelser er billeddannelse.
- For at forhindre pigmentdannelse, hvis zebrafiskens baggrund ikke er albino, overføres fisk ved 24 timer efter befrugtning (hpf) til en ny E3-skål med 0,2 mM tyrosinasehæmmer 1- phenyl 2-thiourea (se Diskussion).
2. Fremstilling af FEP rør
Figur 1: FEP rørrensning og glatning. a) FEP-rør på en kabeltromle. b) FEP-rør, inden der rettes op. c) FEP-rør i glas- og stål autoklavesikker slange. d) Skylning af FEP-rørene efter glatning og afkøling. e) FEP-rør skåret til størrelsen af et centrifugerør til sonikering. f) Skylning af FEP-rør efter sonikering. g) Opbevaring af de rensede og rettede FEP-rør i et centrifugerør. h) Skæring af FEP-røret før billeddannelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Ret FEP-rørene (figur 1a,b) ved at placere dem i en glas- eller stål autoklavesikker slange (figur 1c) med den korrekte indvendige diameter, der passer til FEP-rør, normalt 1,6 eller 2,4 mm, og autoklave til 180 °C i 2 timer. Lad rørene køle ned ved stuetemperatur i mindst 5 timer. Fjern derefter fra glatterørene.
BEMÆRK: Brug handsker, når du manipulerer rørene, og arbejd med 50 cm slanger ad gangen. - Rengør FEP-rørene.
BEMÆRK: Sprøjter med stump nålspids af den indre FEP-rørstørrelse anbefales af sikkerhedsmæssige årsager, men en almindelig nål vil virke.- Skyl rørene med 1 M NaOH to gange med en 50 mL sprøjte (Figur 1d).
- Skær FEP rør til størrelsen af en 50 mL centrifuge rør med et barberblad (Figur 1e), placere udskårne rør i 0,5 M NaOH fyldt centrifuge rør, og ultralyde dem i 10 min.
- Skyl FEP-rørene med dobbeltdestilleret H2O, og gentag derefter skylning med 70% ethanol (Figur 1f).
- Overfør rør til 70% ethanol og ultralyd i 10 min.
- Skyl rørene med dobbeltdestilleret H2O, og opbevar dem i centrifugerør i dobbeltdestilleret H2O (figur 1g).
3. Tilberedning af 2% agaroseskål
- I en glaskolbe opløses lavt smeltepunktspulver i E3. Varm opløsningen i en mikrobølgeovn og rør den hver 20 s, indtil alt pulver er opløst.
- Hæld agarose i et glas eller plast Petriskål for at lave en 1-2 mm frakke. Vent, indtil agarose er størknet.
- For at opbevare skal du forsigtigt hælde E3 på toppen af agaren for at forhindre tørring. Wrap i paraffin film og holde på 4 °C.
4. Forberedelse af indlejringsmedier
- Forbered nok E3 til at fylde prøvekammeret.
BEMÆRK: Undgå at bruge methylblåt, hvis mediet er i kontakt med objektive linser. - Hvis du bruger tricain, optø lageropløsning og tilsæt 0,02% tricain til E3.
5. Prøvemontering
Figur 2: Embryomontering i FEP-rør. a) Bedøvet pigmentfri fisk i monteringsmedier. b) En sprøjte med stump endenål og FEP-rør påsat. c) Når medier og fisk er taget op i FEP-røret, skæres røret i kanten af nålen. d) Dypning af det afskårne rør i en skål, der er belagt med 2 % agarose for at sætte enden på. e) En zebrafisk i et tilsluttet FEP-rør. f) Skær forsigtigt FEP-røret ved 30° for at skabe gasbytningshuller. g) FEP-rør med fire huller over en indbygget zebrafisk. h) Ordning af en zebrafisk indlejret i et FEP-rør. Huller og agarprop er angivet. (i) Flere indlejrede zebrafisk klar til billeddannelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Med en engangsglaspipette overføres fisk til indlejringsmedier (figur 2a). Hvis du bruger tricain, overføre fisk til Petri parabol fyldt med tricain-holdige E3, 10 min før billeddannelse. I begge tilfælde skal du se under et stereomikroskop for at kontrollere, at fisken holdt op med at bevæge sig, og at hjertet slår med samme hastighed sammenlignet med kontrollen.
- Skær FEP-røret i den ideelle længde med et barberblad (Figur 1h).
BEMÆRK: Længden skal justeres til mikroskopets prøveholder. den typiske længde er ca. 3 cm. - Forbered en sprøjte med en stump ende kanyle. Fyld sprøjten med luft, monter derefter FEP-røret på nålen, og skyl forsigtigt eventuelt resterende vand ud ved at tømme sprøjten (figur 2b).
BEMÆRK: Undgå at lave bobler ved langsomt at skylle luften ud. - Med sprøjten monteret FEP rør, først tage op medier til at fylde FEP rør, derefter tage et embryo hoved ned. Hold fiskehovedet så tæt på rørafslutningen som muligt. Undgå at lave bobler; Hvis der er en boble til stede, skal prøven kasseres.
- Med et barberblad skæres FEP-røret forsigtigt i kanten af den stumpe endekant eller nål (Figur 2c).
- Kassér væske på toppen af den agarbelagte ret. Dyk FEP-røret direkte ind i agaren (figur 2d). Drej røret og tag det ud for at slippe stikket ud af agarose sengen.
- Under et stereoskop skal agarstikket være til stede for enden af røret (figur 2e).
- For langsigtet billeddannelse skæres 3-5 huller ind i FEP-røret i hver kardinalretning, mindst 5 mm over fiskens ende.
- Under et stereoskop skal du bruge et barberblad vinkelret på rørets akse til at foretage et snit på 30° i FEP-røret, indtil det når monteringsmediet (figur 2f).
- Lav et andet snit ved 180° for at skabe et hul (Figur 2g,h).
- Overfør monteret embryohoved ned i et 1,5 mL mikrocentrifugerør med integreringsmedier, indtil de er klar til at blive afbildet (figur 2i).
6. Prøvepositionering
Figur 3: Prøvekammer. a) FEP-rør monteret på en prøveholder. b) Prøvekammeret med faser og mål. c) Topvisning af det mediefyldte prøvekammer med belysnings- og detektionsmål i en T-SPIM-konfiguration. d) Prøveholder monteret på mikroskopet med prøven i kammeret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Embryo positionering for hjertebilleddannelse. (a) 24 hkf Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry) zebrafisk med øjne forkert justeret. a)) Samme fisk, med lukkede øjne. (b) Samme fisk roteret -100 ° og (b') -50 ° for optimal hjertescanning. c) 48 hkf zebrafisk med øjnene forkert justeret. c') Samme fisk, med lukkede øjne. d) Samme fisk roteret med 30° for optimal hjertescanning. Sorte pile peger mod hjertet. Skalalinje 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Ved mikroskopet monteres FEP-røret i prøveholderen (figur 3a) og billedkammeret fyldes med integreringsmedier (figur 3b,c). Placer derefter prøveholderen på scenen med prøven dyppet i kammeret (figur 3d).
- Tjek prøvens helbred. Visuelt vurdere puls til at evaluere den samlede fisk wellness, som specifikke puls er fase og temperatur afhængig, ved at sammenligne med ikke-monteret kontrol fisk. Hvis hjerteslaget er for langsomt, skal du kassere fisken.
BEMÆRK: Sørg for blid håndtering af embryoner, omhyggelig overførsel til indlejringsmedier, billeddannelse umiddelbart efter indlejring, undgå hurtige temperaturændringer, undgå tricain og sænke eksponeringstiden for tricain. - Brug altid den samme prøveposition for reproducerbar billeddannelse. Det anbefales at justere øjnene og billeddannelsen i en vinkel.
- Roter fisken, så begge øjne (figur 4a,c) er i fokusplanet (figur 4a',c')
- Fra denne position roteres fisken yderligere ca. 50 °-100 ° med uret for 24 hk billeddannelse (Figur 4b, b') og ca. 20°-30° mod uret for 48 hkf billeddannelse (Figur 4d).
BEMÆRK: Det tidlige hjerte, før 30 hkf, kan være svært at forestille sig på grund af dets skjulte position (Figur 4b).
7. Billedopkøb
- Vælg den belysning side, der giver den bedste billedkvalitet og tilpasse laser magt til hver fisk.
BEMÆRK: Registrer den lasereffekt, der bruges til efterfølgende billedanalyse. - På hver z-plan, optage 4-5 hjerteslag på 300 billeder i sekundet (fps) eller mere.
BEMÆRK: Synsfeltet kan beskæres for at øge anskaffelseshastigheden. For eksempel ved 48 hk slår zebrafiskhjertet to til tre gange i sekundet, derfor kræves mellem 300 og 600 rammer ved 300 og 600 rammer for at erhverve fire til seks hjerteslag. - Hvis du vil optage det bankende hjerte, skal prøven flyttes trinvist gennem lysarket. Brug en z-afstand på 1-2 μm, der dækker hele dybden af hjertet.
8. Billedbehandling
- Synkroniser optaget film for at rekonstruere et 4D (x,y,z, tid) hjerte ved hjælp af et Fiji (Image J229,30) plugin som tidligere beskrevet6.
- Hvis du vil udforske data og generere film af det gengivne zebrafiskhjerte, skal du indlæse 4D-filen (x,y,z, tid) i en 3D-gengivelsessoftware.
Representative Results
Figur 5: Zebrafiskens hjerte på 48 hkf. (a) Stadig af en z-ramme, forreste-ventral visning af 48 hkf Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:lck-EGFP) zebrafisk, afbilledet med LSFM, (b) 3D rekonstruktion af film stakke, skåret udsigt gennem atrium. (c) Montage af fire rammer over en fuld hjerteslag på en z-plan. Cirkeldiagrammer angiver tiden under hjerteslag. Skalalinje 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Vi har registreret de 48 hkf bankende hjerte af Tg (kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:lck-EGFP) zebrafisk i henhold til protokollen beskrevet ovenfor (Figur 5). En 488 nm og en 561 nm laser lys ark belyst prøven samtidigt. Den udsendte fluorescens blev opdaget vinkelret ved hjælp af en 16x/0.8 W objektiv linse og en videnskabelig metaloxid halvleder (sCMOS) kamera.
Ved 48 hkf har hjertet netop gennemgået looping og har to kamre, ventrikel og atrium, men har endnu ikke udviklet ventiler. I vores film er de forskellige hjertestrukturer som indløbskanalen, ventrikel, atrioventrikulær kanal (AVC), atrium og udstrømningsspor let at skelne (Figur 5a, b). Disse data viser de præcise slå og afslører komplekseinteraktioner mellem hjertets to cellelag: myokardiet, en enkeltcellet muskellag ordregivende og generatingforce (Figur 5c, rød), og endocardium, en enkelt celle lag, der forbinder hjertet til vaskulatur (Figur 5c, cyan).
Hjerteslag rekonstruktion i x,y,z (3D) + tid (4D) + farve (5D) blev udført i henhold til Mickoleit et al.6. Rekonstruktionen er baseret på to hypoteser: hjertets bevægelse er gentagen, og data skal erhverves med et lille z-trin. Udgangen er en rekonstrueret enkelt hjerteslag i 5D, måling 30 GB til 80 GB per hjerteslag. For at gengive dataene brugte vi det gratis open source-værktøj FluoRender til dybdegengivelse31 , da det var designet til at håndtere flerdimensionelle datasæt og gengiver nemt 5D-film af både cellelag og individuelle lag (Figur 5b).
Discussion
Transgene linjer til billede af hjertet
Figur 6: Sammenligning af cytoplasma- og membranmarkør zebrafisk transgene linjer. Forreste-ventrale udsigt over 48 hkf zebrafisk hjerter afbilledet med LSFM. Hvide pile angiver strukturer, der kun er synlige med en transgen linje med membranmarkør. a) Tg(kdrl:EGFP)32 signal i cyan i hjertet og (a)) i ventrikel. b) Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:dsRed)33 signal i rødt i hjertet og (b') i ventrikel. ( c,c') sammenlægning af både Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:dsRed) og Tg(kdrl:EGFP) signal. Skalalinje 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Imaging zebrafisk hjerte kræver præcis hjerte-celle mærkning. Mens myokardietykkelsen er relativt konstant i hele cellerne, er endocardialceller tykke omkring kernen, men har tynde membranbejydelser, i nogle regioner tyndere end 2 μm. Cytoplasmatiske transgene linjer som Tg(kdrl:EGFP)32 mærker effektivt regionerne omkring endocardiale kerner, men længere væk udsender det tynde cytoplasma måske ikke nok fotoner til at blive opdaget med så korte eksponeringstider, hvilket fører til kunstige huller i dataene (Figur 6a). I modsætning hertil kan membranmarkørtransgene linjer som Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry)33 effektivt mærke endocardium og afsløre flere detaljer (Figur 6b, c). For hvert eksperiment skal du omhyggeligt vælge den mest hensigtsmæssige transgene linje.
Zebrafisk immobilisering
Valget af immobiliseringsteknik afhænger af eksperimentets længde og fiskens alder til billede. Tricain har ofte været anvendt til zebrafisk immobilisering, for det meste på grund af dens brugervenlighed. Faktisk blot at tilføje 130 mg / L tricain til fiskemedierne resulterer i deres bedøvelse i 10 min. Da det kan føre til udviklingsmæssige defekter og påvirke hjertefysiologi20,22, anbefaler vi kun at bruge tricain til korte eksperimenter (mindre end 30 min). For længere billeddannelse, α-bungarotoxin mRNA injektioner på en- eller to-cellet fase lammer fisk op til 3 dage efter befrugtning (dpf) uden at påvirke hjerte-kar-udvikling eller fysiologi22.
Valg af de rigtige FEP-rør
FEP rør fås i forskellige diametre og tykkelser. Til billede 0-5 dpf fisk, 0,8 mm er en god indre diameter; vælg enten tyk væg 0,8 x 1,6 mm rør eller tynd væg 0,8 x 1,2 mm rør. Vi anbefaler tyndvæggede rør; Tykkere vægge giver dog øget stabilitet og stivhed, hvilket kan være vigtigt, hvis prøvekammeret har flydende medier, der kan forstyrre og flytte et tyndt rør. Til større prøver kan der anvendes 1,6 x 2,4 mm og 2 x 3 mm.
Temperatur- og gasudvekslinger
Et væsentligt aspekt af zebrafiskembrynets velbefindende er temperaturen. Ideelt set skal du holde fisken på 28,5 °C under billeddannelse, da miljøets temperatur påvirker udvikling og puls34.
Det er vores erfaring, ilt udveksling gennem 2% agarose stikket kun opretholder en stabil puls indtil 3-4 dpf. Derfor sikrer skæring af huller i røret iltspredning. Det kan også være nødvendigt for lægemiddellevering til prøven, hvis det ønskes.
Suspension af hjerteslag.
De hurtige anskaffelseshastigheder for passende udstyrede lysarkmikroskoper gør det muligt at registrere det bankende hjerte in vivo. Men for at erhverve en uforstyrret z-stack, kan man bremse eller stoppe hjertet. Men, stoppe hjertet fører til hjertemusklen afslapning og kan resultere i sammenbruddet af hjertet6. Hjerteslag suspension kan gøres ved hjælp af morpholinos, lave temperaturer, en hæmmer af muskelsammentrækning eller optogenetik. Disse metoder har hver deres ulemper og skal evalueres omhyggeligt for hvert eksperiment.
Injektionen af 4 ng af tavse hjerte (sih) morpholino på den ene celle fase kan stoppe hjerteslag ved at målrette genet tnnt2a afgørende for sarcomere dannelse35. sih zebrafisk har ikke et hjerteslag og overlever kun indtil 7 dpf, når embryonerne begynder at stole på cirkulerende blod til iltning. Da hjertemorfogenese er drevet af både genetiske og biomekaniske kræfter36, disse fisk nuværende hjerte misdannelser omkring 3 dpf.
Da strømmen af Ca2+ er temperaturfølsom, påvirker temperaturen pulsen hos embryonale zebrafisk21. Derfor sænker temperaturen i billedkammeret hjerteslag. Standsning af hjerteslag kræver temperaturer under 15 °C. Da zebrafisk normalt holdes på 28,5 °C, kan sådanne lave temperaturer kun opretholdes i korte perioder (mindre end 10 min).
Lægemidler såsom kemiske hæmmere af muskelsammentrækninger, 2,3-Bu-garvetion 2-monoxime (BDM), kan føjes til zebrafisk medier (50 nM37,38) til at suspendere hjerteslag midlertidigt. BDM er praktisk at bruge, da det stopper hjertesammentrækning på under 15 minutter og kan vaskes væk for at genoprette hjertefunktionen. Men da BDM ændrer hjertevirkningspotentialet, skal det bruges med en forsigtighed37.
Endelig kan hjertet af transgene zebrafisk, der udtrykker lysportede ionkanaler eller pumper som channelrhodopsin eller halorhodopsin i deres myokardie, manipuleres og stoppes ved at belyse pacemakeren ved indløbskanalen med lys39,7,40,41,9.
Outlook
De præsenterede optimerede værktøjer og løsninger til at studere zebrafisk hjerte in vivo tillader langsigtet, blid billeddannelse af ultrahurtig hjertedynamik. Prøven indlejring kan tilpasses til forskellige billeddannelsesmetoder, såsom konfokal mikroskopi, to-foton mikroskopi, eller optisk projektion tomografi (OPT). Lysplademikroskopi er dog sandsynligvis den foretrukne teknik, der tilbyder optisk sektion med en hastighed, der er tilstrækkelig til at fange hjertets dynamik. Mens denne protokol fokuserer på zebrafisk embryonale hjerte imaging, vi mener, at det også kunne anvendes til forskellige andre prøver og eksperimenter. Det bliver interessant at se i fremtiden, om lignende indlejrings- og billeddannelsesteknikker også kan bruges på senere stadier under udviklingen, når hjertet er mere skjult og larven mindre gennemsigtig.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Madelyn Neufeld for illustrationen i figur 2h. Dette arbejde blev støttet af Max Planck Society, Morgridge Institute for Research, Chan Zuckerberg Initiative og Human Frontier Science Program (HFSP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5mL Eppendorf | Eppendorf | 22364111 | To carry embedded samples |
| 15mL Falcon tubes | Falcon | 352095 | To carry embedded samples |
| 50mL centrifuge tubes | Falcon | 352070 | 50ml tubes for sonication step, and storing cleaned, straightened FEP tubes |
| 50mL syringe | BD | 309654 | 50ml syringe for FEP cleaning |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma Aldrich | 39346-81-1 | To make plug |
| Blunt Tip Needles, 21 gauge | VWR | 89500-304 | Blunt end needle for 0.8 inner diameter FEP tube |
| Borosilicate glass tube | McMaster-Carr | 8729K33 | Tubing for FEP tube straightening 9.5mm outer diameter, 5.6 inner diameter, 30cm long, other sizes available |
| Borosilicate glass tube | McMaster-Carr | 8729K31 | Tubing for FEP tube straightening 6.35mm outer diameter, 4mm inner diameter, 30cm long, other sizes available |
| Conventional needles, 21 Gauge | BD | 305165 | Conventional needle for 0.8 inner diameter FEP tube |
| Disposable glass pipette | Grainger | 52NK56 | To transfer fish, use with pipette pump |
| E3 medium for zebrafish embryos | |||
| Ethanol | Sigma Aldrich | 64-17-5 | Ethanol for FEP cleaning |
| FEP tube, 0.8 / 1.2 mm | ProLiquid | 2001048 | FEP tube with thin wall, other sizes available |
| FEP tube, 0.8 / 1.6 mm | Bola | S1815-04 | FEP tube with thick wall, other sizes available |
| FEP tube, 2/3mm | BGB | 211581 | Large FEP tube with thick wall, other sizes available |
| Hot Hand Rubber Mitt | Cole-Parmer | 691000 | To carry hot equipment after autoclaving |
| Omnifix 1mL Syringes | B Braun | 9161406V | 1ml syringe for embedding |
| Petri dish, small | Dot Scientific | PD-94050 | To make agarose plug |
| Pipette pumps | Argos Technologies | 04395-05 | To transfer fish, use with disposable glass pipette |
| PTU | Sigma Aldrich | 103-85-5 | Also known as: N-Phenylthiourea, 1-Phenyl-2-thiourea, Phenylthiocarbamide |
| Razor blades | Azpack | 11904325 | To cut FEP tubes |
| Sodium Hydroxide | Dot Scientific | DSS24000 | NaOH for FEP cleaning |
| Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | Also known as: MS-222, Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, Tricaine |
References
- Hoebe, R. A., et al. Controlled light-exposure microscopy reduces photobleaching and phototoxicity in fluorescence live-cell imaging. Nature Biotechnology. 25 (2), 249-253 (2007).
- Jenielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. Journal of Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
- Reynaud, E. G., Kržič, U., Greger, K., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy: more dimensions, more photons, and less photodamage. Human Frontier Science Program Journal. 2 (5), 266-275 (2008).
- Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 566-572 (2011).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nat Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
- Arrenberg, A. B., Stainier, D. Y., Baier, H., Huisken, J. Optogenetic control of cardiac function. Science. 330 (6006), 971-974 (2010).
- Trivedi, V., et al. Dynamic structure and protein expression of the live embryonic heart captured by 2-photon light sheet microscopy and retrospective registration. Biomed Optics Express. 6 (6), 2056-2066 (2015).
- Weber, M., et al. Cell-accurate optical mapping across the entire developing heart. eLife. Yelon, D. 6, 28307 (2017).
- Weber, M., Huisken, J. In vivo imaging of cardiac development and function in zebrafish using light sheet microscopy. Swiss Medical Weekly. 145, 14227 (2015).
- Fei, P., et al. Cardiac light-sheet fluorescent microscopy for multi-scale and rapid imaging of architecture and function. Science Reports. 6 (1), 1-12 (2016).
- Felker, A., et al. Continuous addition of progenitors forms the cardiac ventricle in zebrafish. Nature Communication. 9 (1), 1-14 (2018).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), New York, NY. 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. Life sciences require the third dimension. Current Opinion in Cell Biology. 18 (1), 117-124 (2006).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
- Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer mounting for long-term light sheet microscopy of zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (84), e51119 (2014).
- Berndt, F., Shah, G., Power, R. M., Brugués, J., Huisken, J. Dynamic and non-contact 3D sample rotation for microscopy. Nature Communications. 9 (1), 1-7 (2018).
- Daetwyler, S., Günther, U., Modes, C. D., Harrington, K., Huisken, J. Multi-sample SPIM image acquisition, processing. and analysis of vascular growth in zebrafish. Development. , 173757 (2019).
- Keomanee-Dizon, K., Fraser, S. E., Truong, T. V. A versatile, multi-laser twin-microscope system for light-sheet imaging. Review of Scientific Instruments. 91 (5), 053703 (2020).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), Cambridge, England. 3242-3247 (2012).
- Gierten, J., et al. Automated high-throughput heartbeat quantification in medaka and zebrafish embryos under physiological conditions. Science Reports. 10 (1), 1-12 (2020).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved long-term imaging of embryos with genetically encoded α-bungarotoxin. PLOS ONE. 10 (8), 0134005-0134015 (2015).
- Taylor, J. M., et al. Adaptive prospective optical gating enables day-long 3D time-lapse imaging of the beating embryonic zebrafish heart. Nature Communication. 10 (1), 1-15 (2019).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nature Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Cold Spring Harbor. E3 medium (for zebrafish embryos). Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 66449 (2011).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- FluoRender. , Available from: www.fluorender.com (2020).
- Jin, S. -W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. -N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132 (23), 5199-5209 (2005).
- Chi, N. C., et al. Foxn4 directly regulates tbx2b expression and atrioventricular canal formation. Genes and Development. 22 (6), 734-739 (2008).
- Scott, G. R., Johnston, I. A. Temperature during embryonic development has persistent effects on thermal acclimation capacity in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 14247-14252 (2012).
- Sehnert, A. J., et al. Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility. Nature Genetics. 31 (1), 106-110 (2002).
- Sidhwani, P., Yelon, D. Fluid forces shape the embryonic heart: Insights from zebrafish. Current Topics in Developmental Biology. Wellik, D. M. 132, Academic Press. Chapter 11 395-416 (2019).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cell Physiology and Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
- Chow, R. W. -Y., Lamperti, P., Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. following endocardial tissue movements via cell photoconversion in the zebrafish embryo. Journal of Visualized Experiments. (132), e57290 (2018).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proccedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Knollmann, B. C. Pacing lightly: optogenetics gets to the heart. Nature Methods. 7 (11), 889-891 (2010).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7 (11), 897-900 (2010).
