Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מיקרוסקופיה קלה של דינמיקת לב מהירה בעוברי דגי זברה

Published: August 13, 2021 doi: 10.3791/62741
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Morgridge Institute for Research, Madison, WI

Summary

אנו מתארים כלים ממוטבים לחקר לב דג הזברה ב- vivo עם מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות של יריעת אור. באופן ספציפי, אנו מציעים קווים מהונדסים לב בהיר ולהציג טכניקות הטמעה עדינות חדשות ושתקה להימנע מומים התפתחותיים ולב. צינור איסוף וניתוח נתונים אפשרי המותאם להדמיית לב מסופק גם כן.

Abstract

מחקר הלב העוברי נהנה מאוד מהתקדמות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית מהירה של יריעת אור ויואו (LSFM). בשילוב עם ההתפתחות החיצונית המהירה, הגנטיקה המתיחה והתמרנות של דג הזברה, דניו ריו, LSFM סיפק תובנות על צורת הלב ותפקוד ברזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה ללא פוטוטוקסיה משמעותית או הלבנת תמונות. הדמיה של לבבות פועמים מאתגרת טכניקות קיימות להכנת מדגם ומיקרוסקופיה. יש לשמור על דגימה בריאה בשדה ראייה מכווץ ולרכוש תמונות אולטרה-מהירות כדי לפתור את פעימות הלב. כאן אנו מתארים כלים ופתרונות ממוטבים לחקר לב דג הזברה ב- vivo. אנו מדגימים את היישומים של קווים מהונדסים בהירים לתיוג המרכיבים הלבביים ומציגים טכניקות הטמעה ושתקה חדשניות המונעות מומים התפתחותיים ושינויים בקצב הלב. אנו מציעים גם צינור רכישת נתונים וניתוח מותאם להדמיית לב. כל זרימת העבודה המוצגת כאן מתמקדת בהדמיית לב עוברי של דגי זברה, אך ניתן ליישם אותה גם על דגימות וניסויים שונים אחרים.

Introduction

כדי לחשוף את האירועים המורכבים ואת האינטראקציות בלב הפועם מוקדם, הדמיה vivo של האיבר כולו נדרש. עם פוטוטוקסיות מינימלית 1,2,3, הלבנת פוטו4 נמוכה ומהירות גבוהה, מיקרוסקופיה של יריעות אור התפתחה ככלי ההדמיה העיקרי להתפתחות עוברית ולבית5,6. הוא סיפק תובנות על צורת הלב ותפקוד ברזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה7,8,9 ואיפשר לחוקרים לדמיין ולעקוב אחר חלקים מתויגים פלואורסצנטיים של הלב במהירות גבוהה, לחקור כוחות המודינמיים, ולעקוב אחר התפתחות הלב ישירות בתוך הגוף של עוברים מתפתחים6,10,11,12.

כדי להגביל במדויק ובאופן רב את דגי הזברה בתחום הראייה, קיימים מגוון פרוטוקולי הטבעה עבור יריעות אור, לטווח הקצר והארוך, כמו גם מדגם יחיד או רב-מדגם13,14,15,16,17,18,19. הפרוטוקול הנפוץ ביותר כרוך בלימובילציה של טריקאין והרכבת אגרוז בתוך צינור זכוכית או פלסטיק. עם זאת, מכיוון שקצב הלב יכול להשתנות עקב הטמפרטורה, חומר ההרדמה והחומר המשובץ המשמשים20,21,22, הדמיית לב דגי זברה דורשת פרוטוקולים ספציפיים ועדינים כדי להבטיח את בריאות המדגם6,8,11,12,20,21,22,23 . להדמיה לטווח קצר (עד שעה), ניתן להרדים את הדג ב-130 מ"ג/ל' טריקאין ולהטמיע אותו בצינורות אתילן פרופילן פלואורינאט (FEP) עם 0.1% תמיסת אגרוז ותקע, כמתואר ב-Weber et al. 201416. עם זאת, כמו tricaine יכול להוביל פגמים התפתחותיים20,22, פרוטוקולים שונים חייבים לשמש הדמיה לטווח ארוך.

כאן אנו מתארים אסטרטגיה חדשה להדמיית לב לטווח ארוך. בעוד יישומי יריעות אור רבים קיימים24, אנו ממליצים להשתמש במדגם תלוי במיקרוסקופ T-SPIM (זיהוי אחד ושתי עדשות תאורה במישור אופקי כאשר המדגם תלוי אנכית במוקד המשותף). זה נותן את חופש התנועה והסיבוב הדרושים למיקום המדגם המדויק. הדגים משותקים על ידי הזרקת 30 pg α-bungarotoxin mRNA בשלב של תא אחד או שניים. α-בנגרוטוקסין הוא ארס נחש המשתק את השרירים מבלי להשפיע על התפתחות הלב וכלי הדם או על הפיזיולוגיה22. להדמיה מדויקת וללא עיוותים, אנו ממליצים על הרכבה של דגים בצינורות העשויים מ- FEP, פולימר עם אינדקס שבירה כמעט זהה למים. אנו דנים כיצד להכין בצורה הטובה ביותר את צינורות FEP על ידי יישור וניקוי אותם לפני ההדמיה. הדגים מותקנים לאחר מכן בצינורות אלה, ראש למטה, במדיה, ואת החלק התחתון של הצינור הוא אטום עם תקע 2% agarose, שבו ראשי דגים לנוח. חיתוך חורים בצינור FEP מקל על החלפת גז ומבטיח צמיחת דגים. ניתן לשמור את הדגים המוטבעים במדיה עד שהם מותקנים על מחזיק דגימה ממש לפני ההדמיה. אנו מציעים גם צינור רכישת נתונים וניתוח להדמיה מהירה לשחזור. יתר על כן, אנו דנים בשימוש של ציטופלסמי לעומת סמן ממברנה קווים מהונדסים עבור תיוג תא לב חזק, כמו גם אפשרויות שונות כדי לעצור את הלב. טכניקות הרכבה אלה מבטיחות את תקינות המדגם תוך מתן אפשרות להגביל את הלב באופן מדויק ורבייה בתחום הראייה.

Protocol

כל הדגים והעוברים של דגי הזברה (דניו ריו) טופלו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים של UW-Madison (IACUC).

1. הכנת דגי זברה

  1. לטפל דגי זברה על פי פרוטוקולים שנקבעו25,26 והנחיות מוסדיות. לגדל דגים בוגרים של קו מהונדס הרצוי (ראה דיון). לאסוף את העוברים ולשמור אותם ב 28 °C (50 °F) בצלחת פטרי מלא מדיום דגים, למשל, E327.
  2. בחר שיטת אי-תנועה (ראה דיון).
    1. אם משתמשים α-bungarotoxin mRNA כדי לשתק את הדג, הזריקו 30 pg mRNA22 לתוך החלמון של עובר שלב אחד או שניים באמצעות מחט זכוכית נשא רכוב על מיקרו-מניפולטור ומחובר picoinjector28.
    2. אם משתמשים בטריקאין, הפוך פתרון מלאי 0.4% חוצץ pH 7.0-7.4 עם בסיס 1 M Tris ולאחסן ב -20 °C עד הדמיה.
  3. שומרים את הביצים בצלחת פטרי ממולאת E3 ב 28 °C (70 °F) ומעבירים את הביצים כל 24 שעות למנה חדשה עם E3 טרי עד הדמיה.
  4. כדי למנוע היווצרות פיגמנט, אם הרקע של דג הזברה אינו לבקן, העבר דגים במהירות של 24 שעות לאחר ההפריה (hpf) לצלחת E3 חדשה עם מעכב טירוסינאז 0.2 מ"מ 1- פניל 2-תיוריה (ראו דיון).

2. הכנת צינורות FEP

Figure 1
איור 1: ניקוי ויישור של צינורות FEP. (א) צינורות FEP על תוף כבלים. (ב) צינורות FEP לפני יישור. (ג) צינורות FEP בצינורות זכוכית ופלדה אוטומטית בטוח. (ד) שטיפה של צינורות FEP לאחר יישור וקירור. (ה) צינור FEP לחתוך לגודל של צינור צנטריפוגה עבור sonication. (ו) שטיפה של צינורות FEP לאחר sonication. (ז) אחסון צינורות FEP מנוקים ומיישרים בצינור צנטריפוגה. (ח) חיתוך צינור FEP לפני הדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. יישר את צינורות FEP (איור 1a,b) על-ידי הצבתם בצינורות בטוחים לכוס או פלדה (איור 1c) בקוטר הפנימי הנכון כדי להתאים לצינורות FEP, בדרך כלל 1.6 או 2.4 מ"מ, ו- autoclave ל- 180 °C למשך 2 שעות. תן את הצינורות להתקרר בטמפרטורת החדר לפחות 5 שעות. לאחר מכן, להסיר מן הצינורות יישור.
    הערה: השתמש בכפפות בעת מניפולציה הצינורות ולעבוד עם צינורות 50 ס"מ בכל פעם.
  2. נקה את צינורות FEP.
    הערה: מזרקים עם קצה מחט קהה של גודל צינור FEP הפנימי מומלץ לבטיחות, אבל מחט רגילה תעבוד.
    1. שטפו את הצינורות עם 1 M NaOH פעמיים עם מזרק של 50 מ"ל (איור 1d).
    2. חותכים את צינורות FEP לגודל של צינור צנטריפוגה 50 מ"ל עם סכין גילוח (איור 1e), מניחים צינורות חתוכים בצינורות צנטריפוגות מלאים ב- 0.5 M NaOH, ומוסיפים אותם באולטרסאונד למשך 10 דקות.
    3. יש לשטוף את צינורות ה-FEP עם H2O מזוקק כפול, ואז לחזור על שטיפה עם 70% אתנול (איור 1f).
    4. העבר צינורות 70% אתנול ו ultrasonicate במשך 10 דקות.
    5. שטפו את הצינורות ב-H2O מזוקק כפול ואחסנו אותם בצינורות צנטריפוגות ב-H2O מזוקק כפול (איור 1g).

3. הכנת מנה של 2% אגרוז

  1. בבקבוק זכוכית, להמיס אבקת אגרוז נקודת התכה נמוכה ב- E3. מחממים את התמיסה במיקרוגל ומערבבים אותה כל 20 s, עד שכל האבקה מומסת.
  2. יוצקים אגרוז לתוך צלחת פטרי או פלסטיק כדי להפוך את מעיל 1-2 ממ. חכה עד שאגורז יתגבש.
  3. לאחסון, יש לשפוך בעדינות E3 על החלק העליון של אגר כדי למנוע ייבוש. עוטפים בסרט פרפין ושומרים ב-4 מעלות צלזיוס.

4. הכנת הטמעת מדיה

  1. הכינו מספיק E3 כדי למלא את תא הדגימה.
    הערה: הימנע משימוש במתיל כחול אם המדיה נמצאת במגע עם עדשות אובייקטיביות.
  2. אם אתם משתמשים בטריקאין, הפשירו את תמיסת המניות והוסיפו 0.02% טריקיין ל-E3.

5. הרכבה לדוגמה

Figure 2
איור 2: הרכבה עוברית בצינור FEP. (א) דגים ללא פיגמנטים מרדים במדיה גוברת. (ב) מזרק עם מחט קצה קהה וצינור FEP מחובר. (ג) ברגע שהמדיה והדגים נלקחים בצינור FEP, חותכים את הצינור בקצה המחט. (ד) טבילת הצינור החתוך לתוך צלחת מצופה 2% agarose כדי לסתום את סופו. (ה) דג זברה בצינור FEP מחובר. (ו) לחתוך בעדינות את צינור FEP ב 30° כדי ליצור חורים חילופי גז. (ז) צינור FEP עם ארבעה חורים מעל דג זברה מוטבע. (ח) ערכה של דג זברה מוטבע בצינור FEP. חורים ותקע אגר מסומנים. (i) דגי זברה משובצים מרובים מוכנים להדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. בעזרת פיפטה מזכוכית חד פעמית, העבירו דגים למדיה המשובצת (איור 2a). אם משתמשים בטריקסיין, מעבירים דגים לצלחת פטרי מלאה ב-E3 המכיל טריקאין, 10 דקות לפני ההדמיה. בשני המקרים, צפה תחת סטריאומיקרוסקופ כדי לוודא שהדגים הפסיקו לנוע ושהלב פועם במהירות דומה בהשוואה לשליטה.
  2. חותכים את צינור FEP לאורך האידיאלי בעזרת סכין גילוח (איור 1h).
    הערה: יש להתאים את האורך למחזיק הדגימה של המיקרוסקופ; האורך הטיפוסי הוא כ -3 ס"מ.
  3. הכן מזרק עם צינורית קצה קהה. מלאו את המזרק באוויר, ואז הררו את צינור ה-FEP על המחט ושטפו בעדינות את כל המים הנותרים על ידי ריקון המזרק (איור 2b).
    הערה: הימנעו מלעשות בועות על ידי שטיפה איטית של האוויר.
  4. עם צינור FEP רכוב מזרק, הראשון, לקחת את המדיה כדי למלא את צינור FEP, ואז לקחת את ראש העובר למטה. שמור את ראש הדג קרוב ככל האפשר לקצה הצינור. הימנע עושה כל בועות; אם קיימת בועה, יש להשליך את הדגימה.
  5. בעזרת סכין גילוח, חתכו בזהירות את צינור ה-FEP בקצה הצינורית או המחט הקהים (איור 2c).
  6. יש להשליך כל נוזל על החלק העליון של המנה מצופה אגר. יש לצלול את צינור ה-FEP היישר לתוך אגר (איור 2d). סובב את הצינור והוציא אותו כדי לשחרר את התקע ממיטת אגרוז.
  7. תחת סטריאוסקופ, אמת את נוכחותו של תקע אגר בקצה הצינור (איור 2e).
  8. להדמיה ארוכת טווח, לחתוך 3-5 חורים לתוך צינור FEP בכל כיוון קרדינלי, לפחות 5 מ"מ מעל סוף הדג.
    1. מתחת לסטריאוסקופ, השתמשו בסכין גילוח בניצב לציר הצינור כדי לבצע חתך של 30° בצינור ה-FEP עד להגעה למדיה ההרכבה (איור 2f).
    2. בצעו חתך שני ב-180° כדי ליצור חור (איור 2 גרם, שעה).
  9. מעבירים את ראש העובר המותקן למטה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה ב-1.5 מ"ל עם מדיית הטמעה עד שהוא מוכן לתמונה (איור 2i).

6. מיקום מדגם

Figure 3
איור 3: תא דגימה. (א) צינור FEP מותקן על מחזיק מדגם. (ב) תא המדגם עם שלבים ויעדים. (ג) תצוגה עליונה של תא הדגימה המלא במדיה, עם מטרה של תאורה וזיהוי בתצורת T-SPIM. (ד) מחזיק הדגימה מותקן על המיקרוסקופ, עם המדגם בתא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: מיקום עובר להדמיית לב. (א) 24 כ"ס Tg (kdrl:Hsa.HRAS-mCherry) דגי זברה עם עיניים לא מיושרות. (א') אותו דג, עם עיניים מיושרות. (ב) אותם דגים הסתובבו -100 ° ו (b') -50 ° להדמיית לב אופטימלית. (ג) דג זברה 48 כ"ס עם עיניים לא מיושרות. (ג') אותו דג, עם עיניים מיושרות. (ד) אותם דגים מסתובבים ב-30° להדמיית לב אופטימלית. חצים שחורים מצביעים על לב. סרגל קנה מידה 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. במיקרוסקופ, הרכיבו את צינור ה-FEP במחזיק המדגם (איור 3a) ומלאו את תא ההדמיה במדיה משובצת (איור 3b,c). לאחר מכן, הניחו את מחזיק המדגם על הבמה כשהדגימה טובלת בתא (איור 3d).
  2. תבדוק את תקינות הדגימה. הערכה חזותית של קצב הלב כדי להעריך את בריאות הדגים הכללית, שכן קצב לב ספציפי תלוי בשלבים ובטמפרטורה, על ידי השוואה לדגי בקרה שאינם מותקנים. אם פעימות הלב איטיות מדי, השליכו את הדגים.
    הערה: הקפד טיפול עדין בעוברים, העברה זהירה להטמעת מדיה, הדמיה מיד לאחר ההטבעה, הימנעות משינויי טמפרטורה מהירים, הימנעות מטריקאין והורדת זמן החשיפה לטריקאין.
  3. להדמיה ניתנת לשחזור, השתמש תמיד באותה תנוחת דגימה. מומלץ ליישר את העיניים ואת ההדמיה בזווית.
  4. סובב את הדג כך ששתי העיניים (איור 4a,ג) נמצאות במישור המוקד (איור 4a',c')
  5. מעמדה זו, סובבו עוד יותר את הדגים במהירות של כ-50°-100 ° בכיוון השעון להדמיה של 24 כ"ס (איור 4b, b'), וכ-20°-30° נגד כיוון השעון להדמיית 48 כ"ס (איור 4d).
    הערה: הלב המוקדם, לפני 30 כ"ס, יכול להיות קשה לתמונה בשל מיקומו הנסתר (איור 4b).

7. רכישת תמונות

  1. בחרו את צד התאורה המעניק את איכות התמונה הטובה ביותר והתאמו את עוצמת הלייזר לכל דג.
    הערה: הקלט את כוח הלייזר המשמש לניתוח תמונה עוקב.
  2. בכל מישור z, להקליט 4-5 פעימות לב ב 300 פריימים לשנייה (fps) או יותר.
    הערה: ניתן לחתוך את שדה הראייה כדי להגביר את מהירות הרכישה. לדוגמה, ב 48 כ"ס הלב זברה פעימות פעמיים עד שלוש פעמים בשנייה, ולכן, ב 300 fps, בין 300 ל 600 מסגרות נדרשים לרכוש ארבע עד שש פעימות לב.
  3. כדי להקליט את הלב הפועם, הזז את המדגם צעד אחד דרך גיליון האור. השתמש z-spacing של 1-2 מיקרומטר, המכסה את כל עומק הלב.

8. עיבוד תמונה

  1. סנכרן סרט מוקלט כדי לשחזר לב 4D (x,y,z, time) באמצעות תוסף פיג'י (תמונה J229,30) כפי שתואר בעבר6.
  2. כדי לחקור נתונים וליצור סרטים של לב דג הזברה המעובד, טען את קובץ 4D (x,y,z, זמן) לתוך תוכנת עיבוד תלת-ממדית.

Representative Results

Figure 5
איור 5: לב דג הזברה עם 48 כ"ס. (א) עדיין של מסגרת z אחת, מבט חיצוני-גחוני של 48 כ"ס Tg (kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:lck-EGFP) דג זברה, בתמונה עם LSFM, (ב) שחזור תלת-ממדי של ערימות סרט, לחתוך את התצוגה דרך האטריום. (ג) מונטאז' של ארבע פריימים על פעימת לב מלאה במישור Z אחד. תרשימי עוגה מציינים את השעה במהלך פעימות הלב. סרגל קנה מידה 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

רשמנו את הלב הפועם של Tg (kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:lck-EGFP) דגי זברה על פי הפרוטוקול המפורט לעיל (איור 5). יריעת אור לייזר 488 ננומטר וגיליון אור לייזר 561 ננומטר האירו את הדגימה בו זמנית. הפלואורסצנטיות הנפלטת זוהתה בניצב באמצעות עדשה אובייקטיבית 16x/0.8 W ומצלמת מוליך למחצה של תחמוצת מתכת מדעית (sCMOS).

ב 48 כ"ס, הלב רק עבר לולאה ויש לו שני תאים, החדר ואת האטריום אבל עדיין לא לפתח שסתומים. בסרטים שלנו, מבני הלב השונים כגון דרכי זרימה, חדר, תעלת atrioventricular (AVC), אטריום ומסלול זרימה ניתנים להבחנה בקלות (איור 5a, b). נתונים אלה מראים את ההכאה המדויקת וחושפים את ההתנגשויות המורכבות בין שתי שכבות התאים של הלב: שריר הלב, שכבת שריר חד-תאית מתכווצת ומייצרת כוח (איור 5c, אדום), והאנדוקרדיום, שכבת תא בודדת המחברת את הלב למסקולטור (איור 5c, ציאן).

שחזור פעימות הלב ב x, y,z (3D) + זמן (4D) + צבע (5D) בוצע על פי מיקוליט ואח '6. השחזור מבוסס על שתי השערות: תנועת הלב חוזרת על עצמה, ויש לרכוש נתונים עם z-step קטן. הפלט הוא פעימת לב יחידה משוחזרת ב 5D, מדידה 30 GB עד 80 GB לדופק. כדי לעבד את הנתונים, השתמשנו בכלי הקוד הפתוח החינמי FluoRender לעיבוד מעמיק31 מכיוון שהוא תוכנן להתמודד עם ערכות נתונים רב-ממדיות ולעבד בקלות סרטים 5D של שכבות תאים ושכבות בודדות (איור 5b).

Discussion

קווים מהונדסים לתמונה של הלב

Figure 6
איור 6: השוואה בין קווים מהונדסים של דגי זברה ציטופלסמיים וסמן ממברנה. מבט חיצוני-גחוני של לבבות דגי זברה עם 48 כ"ס בתמונה עם LSFM. חצים לבנים מציינים מבנים הנראים רק עם קו מהונדס סמן ממברנה. (א) אות Tg(kdrl:EGFP)32 בציאן בלב ו-(א') בחדר. (ב) Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:dsRed)33 אות באדום בלב ו-(ב') בחדר. ( c,c') מיזוג של שניהם Tg (kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:dsRed) ו Tg (kdrl:EGFP) אות. סרגל קנה מידה 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הדמיית לב דג הזברה דורשת תיוג מדויק של תאי הלב. בעוד עובי שריר הלב הוא קבוע יחסית בכל התאים, תאים אנדוקרדיים הם עבים סביב הגרעין אבל יש בליטות ממברנה דקה, באזורים מסוימים דק יותר מ 2 מיקרומטר. קווים מהונדסים ציטופלסמיים כגון Tg(kdrl:EGFP)32 מתייגים ביעילות את האזורים סביב גרעיני אנדוקרדי, אך רחוק יותר, הציטופלסמה הדקה אולי לא פולטת מספיק פוטונים לגילוי עם זמני חשיפה כה קצרים, מה שמוביל לחורים מלאכותיים בנתונים (איור 6a). לעומת זאת, קווים מהונדסים של סמן ממברנה כגון Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry)33 יכולים לתייג ביעילות את האנדוקרדיום ולחשוף פרטים נוספים (איור 6b,c). עבור כל ניסוי, בחר בקפידה את הקו הטרנסגני המתאים ביותר.

פירוק דגי זברה
הבחירה בטכניקת ההשתקה תלויה באורך הניסוי ובגיל הדגים לדימוי. Tricaine שימש בדרך כלל עבור השתקת דגי זברה, בעיקר בשל קלות השימוש שלה. ואכן, פשוט הוספת 130 מ"ג / ליטר tricaine למדיית הדגים תוצאות להרדים שלהם ב 10 דקות. כפי שהוא יכול להוביל פגמים התפתחותיים ולהשפיע על פיזיולוגיה הלב20,22, אנו ממליצים להשתמש tricaine רק עבור ניסויים קצרים (פחות מ 30 דקות). להדמיה ארוכה יותר, זריקות mRNA α-בנגרוטוקסין בשלב של תא אחד או שניים משתקות דגים עד 3 ימים לאחר ההפריה (dpf) מבלי להשפיע על התפתחות הלב וכלי הדם או על פיזיולוגיה22.

בחירת צינורות FEP הנכונים
צינורות FEP זמינים בקוטרים ועוביים שונים. כדי לדמיין 0-5 דג dpf, 0.8 מ"מ הוא קוטר פנימי טוב; בחר או קיר עבה 0.8 x 1.6 מ"מ צינורות או קיר דק 0.8 x 1.2 מ"מ צינורות. אנו ממליצים על צינורות דקים; עם זאת, קירות עבים יותר מציעים יציבות ונוקשות מוגברות, אשר יכול להיות חשוב אם תא המדגם יש מדיה זורמת שיכול לשבש ולהזיז צינור דק. עבור דגימות גדולות יותר, 1.6 x 2.4 מ"מ ו 2 x 3 מ"מ ניתן להשתמש.

חילופי טמפרטורה וגז
היבט חיוני של רווחתו של עובר דג הזברה הוא הטמפרטורה. באופן אידיאלי, לשמור על הדגים ב 28 °C (5 °F) תוך הדמיה, כמו הטמפרטורה של הסביבה משפיעה על ההתפתחות ואת קצב הלב34.

מניסיוננו, החלפת חמצן דרך תקע אגרוז 2% שומרת רק על קצב לב יציב עד 3-4 dpf. לכן, חיתוך חורים בצינור מבטיח דיפוזיה חמצן. זה יכול להיות גם הכרחי עבור משלוח סמים לדגימה אם תרצה.

השעיית פעימות לב.
מהירויות הרכישה המהירות של מיקרוסקופים של יריעות אור מאובזרות כראוי מאפשרות הקלטה של הלב הפועם ב- vivo. עם זאת, כדי לרכוש z-stack ללא הפרעה, אפשר להאט או לעצור את הלב. עם זאת, עצירת הלב מובילה הרפיה שריר הלב ועלול לגרום לקריסת הלב6. השעיית פעימות לב יכולה להיעשות באמצעות מורפולינוס, טמפרטורות נמוכות, מעכב של התכווצות שרירים או אופטוגנטיקה. לכל אחת מהשיטות האלה יש את החסרונות שלה ויש להעריך אותן בקפידה עבור כל ניסוי.

הזרקת 4 ננוגרם של לב שקט (sih) מורפולינו בשלב תא אחד יכול לעצור את פעימות הלב על ידי מיקוד הגן tnnt2a חיוני עבור היווצרות sarcomere35. דגי זברה sih אין פעימות לב רק לשרוד עד 7 dpf, כאשר העוברים מתחילים להסתמך על דם במחזור עבור חמצון. כמו מורפוגנזה הלב מונע על ידי כוחות גנטיים וביומכניים36, דגים אלה מציגים מומים בלב סביב 3 dpf.

כמו הזרימה של Ca2+ הוא רגיש לטמפרטורה, הטמפרטורה משפיעה על קצב הלב בדגי זברה עובריים21. כתוצאה מכך, הורדת הטמפרטורה בתא ההדמיה מאטה את פעימות הלב. עצירת פעימות הלב דורשת טמפרטורות מתחת ל -15 מעלות צלזיוס. כמו דגי זברה נשמרים בדרך כלל ב 28 °C (5 °F), טמפרטורות נמוכות כאלה ניתן לשמור רק לתקופות קצרות (פחות מ 10 דקות).

תרופות כגון מעכבים כימיים של התכווצויות שרירים, 2,3-Bu-tanedione 2-monoxime (BDM), ניתן להוסיף למדיה דג זברה (50 nM37,38) כדי להשעות את פעימות הלב באופן זמני. BDM נוח לשימוש כפי שהוא מפסיק התכווצות הלב בפחות מ 15 דקות והוא יכול להיות שטף כדי לשחזר את תפקוד הלב. עם זאת, כמו BDM משנה את פוטנציאל הפעולה הלב, יש להשתמש בו בזהירות37.

לבסוף, הלב של דגי זברה מהונדסים המבטאים תעלות יונים מגודרות אור או משאבות כגון channelrhodopsin או הלוהודופסין בשריר הלב שלהם ניתן לתמרן ולעצור על ידי הארת קוצב הלב בדרכי הזרימה עם אור39,7,40,41,9.

Outlook
הכלים והפתרונות הממוטבים שהוצגו לחקר לב דג הזברה ב-vivo מאפשרים הדמיה ארוכת טווח ועדינה של דינמיקת לב אולטרה-מהיר. ניתן להתאים את ההטבעה לדוגמה כך שתתאים לאומדות הדמיה שונות, כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית, מיקרוסקופיה דו-פוטונית או טומוגרפיה של הקרנה אופטית (OPT). מיקרוסקופיה של יריעת אור, לעומת זאת, היא ככל הנראה הטכניקה המועדפת המציעה חתך אופטי במהירות מספקת כדי ללכוד את הדינמיקה של הלב. בעוד פרוטוקול זה מתמקד בהדמיית לב עוברי של דגי זברה, אנו מאמינים שניתן ליישם אותו גם על דגימות וניסויים שונים אחרים. יהיה מעניין לראות בעתיד אם ניתן להשתמש בטכניקות הטמעה והדמיה דומות גם בשלבים מאוחרים יותר במהלך ההתפתחות כאשר הלב מוסתר יותר והזחל פחות שקוף.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים למדלין נויפלד על האיור באיור 2h. עבודה זו נתמכה על ידי אגודת מקס פלאנק, מכון מורגרידג' למחקר, יוזמת צ'אן צוקרברג ותוכנית המדע של הגבול האנושי (HFSP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5mL Eppendorf Eppendorf 22364111 To carry embedded samples
15mL Falcon tubes Falcon 352095 To carry embedded samples
50mL centrifuge tubes Falcon 352070 50ml tubes for sonication step, and storing cleaned, straightened FEP tubes
50mL syringe BD 309654 50ml syringe for FEP  cleaning
Agarose, low gelling temperature Sigma Aldrich 39346-81-1 To make plug
Blunt Tip Needles, 21 gauge VWR 89500-304 Blunt end needle for 0.8 inner diameter FEP tube
Borosilicate glass tube McMaster-Carr 8729K33 Tubing for FEP tube straightening 9.5mm outer diameter, 5.6 inner diameter, 30cm long, other sizes available
Borosilicate glass tube McMaster-Carr 8729K31 Tubing for FEP tube straightening 6.35mm outer diameter, 4mm inner diameter, 30cm long, other sizes available
Conventional needles, 21 Gauge BD 305165 Conventional needle for 0.8 inner diameter FEP tube
Disposable glass pipette Grainger 52NK56 To transfer fish, use with pipette pump
E3 medium for zebrafish embryos
Ethanol Sigma Aldrich 64-17-5 Ethanol for FEP cleaning
FEP tube, 0.8 / 1.2 mm ProLiquid 2001048 FEP tube with thin wall, other sizes available
FEP tube, 0.8 / 1.6 mm Bola S1815-04 FEP tube with thick wall, other sizes available
FEP tube, 2/3mm BGB 211581 Large FEP tube with thick wall, other sizes available
Hot Hand Rubber Mitt Cole-Parmer 691000 To carry hot equipment after autoclaving
Omnifix 1mL Syringes B Braun 9161406V 1ml syringe for embedding
Petri dish, small Dot Scientific PD-94050 To make agarose plug
Pipette pumps Argos Technologies 04395-05 To transfer fish, use with disposable glass pipette
PTU Sigma Aldrich 103-85-5 Also known as:
N-Phenylthiourea, 1-Phenyl-2-thiourea, Phenylthiocarbamide
Razor blades Azpack 11904325 To cut FEP tubes
Sodium Hydroxide Dot Scientific DSS24000 NaOH for FEP cleaning
Tricaine Sigma Aldrich E10521 Also known as: MS-222,
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, Tricaine

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoebe, R. A., et al. Controlled light-exposure microscopy reduces photobleaching and phototoxicity in fluorescence live-cell imaging. Nature Biotechnology. 25 (2), 249-253 (2007).
  2. Jenielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. Journal of Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
  3. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
  4. Reynaud, E. G., Kržič, U., Greger, K., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy: more dimensions, more photons, and less photodamage. Human Frontier Science Program Journal. 2 (5), 266-275 (2008).
  5. Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 566-572 (2011).
  6. Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nat Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
  7. Arrenberg, A. B., Stainier, D. Y., Baier, H., Huisken, J. Optogenetic control of cardiac function. Science. 330 (6006), 971-974 (2010).
  8. Trivedi, V., et al. Dynamic structure and protein expression of the live embryonic heart captured by 2-photon light sheet microscopy and retrospective registration. Biomed Optics Express. 6 (6), 2056-2066 (2015).
  9. Weber, M., et al. Cell-accurate optical mapping across the entire developing heart. eLife. Yelon, D. 6, 28307 (2017).
  10. Weber, M., Huisken, J. In vivo imaging of cardiac development and function in zebrafish using light sheet microscopy. Swiss Medical Weekly. 145, 14227 (2015).
  11. Fei, P., et al. Cardiac light-sheet fluorescent microscopy for multi-scale and rapid imaging of architecture and function. Science Reports. 6 (1), 1-12 (2016).
  12. Felker, A., et al. Continuous addition of progenitors forms the cardiac ventricle in zebrafish. Nature Communication. 9 (1), 1-14 (2018).
  13. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), New York, NY. 1007-1009 (2004).
  14. Keller, P. J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. Life sciences require the third dimension. Current Opinion in Cell Biology. 18 (1), 117-124 (2006).
  15. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
  16. Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer mounting for long-term light sheet microscopy of zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (84), e51119 (2014).
  17. Berndt, F., Shah, G., Power, R. M., Brugués, J., Huisken, J. Dynamic and non-contact 3D sample rotation for microscopy. Nature Communications. 9 (1), 1-7 (2018).
  18. Daetwyler, S., Günther, U., Modes, C. D., Harrington, K., Huisken, J. Multi-sample SPIM image acquisition, processing. and analysis of vascular growth in zebrafish. Development. , 173757 (2019).
  19. Keomanee-Dizon, K., Fraser, S. E., Truong, T. V. A versatile, multi-laser twin-microscope system for light-sheet imaging. Review of Scientific Instruments. 91 (5), 053703 (2020).
  20. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), Cambridge, England. 3242-3247 (2012).
  21. Gierten, J., et al. Automated high-throughput heartbeat quantification in medaka and zebrafish embryos under physiological conditions. Science Reports. 10 (1), 1-12 (2020).
  22. Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved long-term imaging of embryos with genetically encoded α-bungarotoxin. PLOS ONE. 10 (8), 0134005-0134015 (2015).
  23. Taylor, J. M., et al. Adaptive prospective optical gating enables day-long 3D time-lapse imaging of the beating embryonic zebrafish heart. Nature Communication. 10 (1), 1-15 (2019).
  24. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nature Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
  25. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
  26. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
  27. Cold Spring Harbor. E3 medium (for zebrafish embryos). Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 66449 (2011).
  28. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  31. FluoRender. , Available from: www.fluorender.com (2020).
  32. Jin, S. -W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. -N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132 (23), 5199-5209 (2005).
  33. Chi, N. C., et al. Foxn4 directly regulates tbx2b expression and atrioventricular canal formation. Genes and Development. 22 (6), 734-739 (2008).
  34. Scott, G. R., Johnston, I. A. Temperature during embryonic development has persistent effects on thermal acclimation capacity in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 14247-14252 (2012).
  35. Sehnert, A. J., et al. Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility. Nature Genetics. 31 (1), 106-110 (2002).
  36. Sidhwani, P., Yelon, D. Fluid forces shape the embryonic heart: Insights from zebrafish. Current Topics in Developmental Biology. Wellik, D. M. 132, Academic Press. Chapter 11 395-416 (2019).
  37. Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cell Physiology and Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
  38. Chow, R. W. -Y., Lamperti, P., Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. following endocardial tissue movements via cell photoconversion in the zebrafish embryo. Journal of Visualized Experiments. (132), e57290 (2018).
  39. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proccedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  40. Knollmann, B. C. Pacing lightly: optogenetics gets to the heart. Nature Methods. 7 (11), 889-891 (2010).
  41. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7 (11), 897-900 (2010).

Tags

ביולוגיה גיליון 174
מיקרוסקופיה קלה של דינמיקת לב מהירה בעוברי דגי זברה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schlaeppi, A., Graves, A., Weber,… More

Schlaeppi, A., Graves, A., Weber, M., Huisken, J. Light Sheet Microscopy of Fast Cardiac Dynamics in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (174), e62741, doi:10.3791/62741 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter