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Biology

Zebrafish भ्रूण में फास्ट कार्डियक गतिशीलता की लाइट शीट माइक्रोस्कोपी

Published: August 13, 2021 doi: 10.3791/62741
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Morgridge Institute for Research, Madison, WI

Summary

हम प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ विवो में ज़ेब्राफ़िश दिल का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित उपकरणों का वर्णन करते हैं। विशेष रूप से, हम उज्ज्वल कार्डियक ट्रांसजेनिक लाइनों का सुझाव देते हैं और नई कोमल एम्बेडिंग और स्थिरीकरण तकनीकों को प्रस्तुत करते हैं जो विकास और हृदय दोषों से बचते हैं। कार्डियक इमेजिंग के लिए अनुकूलित एक संभावित डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण पाइपलाइन भी प्रदान की जाती है।

Abstract

भ्रूण कार्डियक अनुसंधान को विवो लाइट शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (एलएसएफएम) में तेजी से प्रगति से बहुत फायदा हुआ है। तेजी से बाहरी विकास, असभ्य आनुवांशिकी, और zebrafish, Danio rerio की पारभासी के साथ संयुक्त, LSFM कार्डियक रूप में अंतर्दृष्टि और महत्वपूर्ण phototoxicity या photobleaching के बिना उच्च स्थानिक और अस्थायी संकल्प पर कार्य दिया है. दिल की धड़कन की इमेजिंग मौजूदा नमूना तैयारी और माइक्रोस्कोपी तकनीकों को चुनौती देती है। किसी को देखने के एक संकुचित क्षेत्र में एक स्वस्थ नमूना बनाए रखने और दिल की धड़कन को हल करने के लिए अल्ट्राफास्ट छवियों को प्राप्त करने की आवश्यकता है। यहां हम विवो में ज़ेब्राफ़िश दिल का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित उपकरणों और समाधानों का वर्णन करते हैं। हम कार्डियक घटकों को लेबल करने के लिए उज्ज्वल ट्रांसजेनिक लाइनों के अनुप्रयोगों का प्रदर्शन करते हैं और उपन्यास कोमल एम्बेडिंग और स्थिरीकरण तकनीकों को प्रस्तुत करते हैं जो विकासात्मक दोषों और हृदय गति में परिवर्तन से बचते हैं। हम कार्डियक इमेजिंग के लिए अनुकूलित एक डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण पाइपलाइन का भी प्रस्ताव करते हैं। यहां प्रस्तुत पूरा वर्कफ़्लो ज़ेब्राफ़िश भ्रूण हृदय इमेजिंग पर केंद्रित है, लेकिन इसे विभिन्न अन्य नमूनों और प्रयोगों पर भी लागू किया जा सकता है।

Introduction

शुरुआती धड़कन दिल में जटिल घटनाओं और बातचीत को उजागर करने के लिए, पूरे अंग के विवो इमेजिंग में आवश्यक है। अपने न्यूनतम फोटोटॉक्सिसिटी 1,2,3, कम फोटोब्लीचिंग 4, और उच्च गति के साथ, प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी भ्रूण और हृदय विकास के लिए प्राथमिक इमेजिंग उपकरण के रूप में विकसित हुई है5,6। इसने एक उच्च स्थानिक और अस्थायी संकल्प 7,8,9 पर कार्डियक रूप और कार्य में अंतर्दृष्टि प्रदान की है और शोधकर्ताओं को उच्च गति पर दिल के फ्लोरोसेंटली लेबल वाले हिस्सों को छवि और ट्रैक करने, हेमोडायनामिक बलों का अध्ययन करने और सीधे विकासशील भ्रूण के शरीर के अंदर हृदय के विकास का पालन करने की अनुमति दी है6,10,11,12।

देखने के क्षेत्र में ज़ेब्राफ़िश को ठीक से और पुन: सक्षम करने के लिए, प्रकाश शीट के लिए विभिन्न प्रकार के एम्बेडिंग प्रोटोकॉल मौजूद हैं, लघु और लंबी अवधि के लिए, साथ ही साथ एकल या बहु-नमूना 13,14,15,16,17,18,19। सबसे आम प्रोटोकॉल में एक ग्लास या प्लास्टिक ट्यूब के अंदर ट्राइकेन स्थिरीकरण और एगारोज़ माउंटिंग शामिल है। हालांकि, जैसा कि तापमान, एनेस्थेटिक्स और एम्बेडिंग सामग्री के कारण हृदय गति बदल सकती है20,21,22, ज़ेबराफ़िश कार्डियक इमेजिंग को नमूना स्वास्थ्य सुनिश्चित करने के लिए विशिष्ट, कोमल प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है6,8,11,12,20,21,22,23 . अल्पकालिक इमेजिंग (एक घंटे तक) के लिए, कोई भी मछली को 130 मिलीग्राम / एल ट्राइकेन में एनेस्थेटिक कर सकता है और इसे फ्लोरिनेटेड एथिलीन प्रोपलीन (एफईपी) ट्यूबों में 0.1% एगारोज़ समाधान और एक प्लग के साथ एम्बेड कर सकता है, जैसा कि वेबर एट अल। हालांकि, जैसा कि ट्राइकेन विकासात्मक दोषों को जन्म दे सकता है20,22, दीर्घकालिक इमेजिंग के लिए विभिन्न प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाना चाहिए।

यहां हम दीर्घकालिक कार्डियक इमेजिंग के लिए एक नई रणनीति का वर्णन करते हैं। जबकि कई प्रकाश शीट कार्यान्वयन मौजूद हैं24, हम एक टी-एसपीआईएम माइक्रोस्कोप में एक फांसी के नमूने का उपयोग करने की सलाह देते हैं (एक क्षैतिज विमान में एक पहचान और दो रोशनी लेंस सामान्य फोकस में लंबवत रूप से लटकते हुए नमूने के साथ)। यह सटीक नमूना स्थिति के लिए आंदोलन और रोटेशन की आवश्यक स्वतंत्रता देता है। मछली को एक या दो-सेल चरण में 30 पीजी α-बुंगारोटॉक्सिन एमआरएनए इंजेक्ट करके स्थिर किया जाता है। α-बुंगारोटॉक्सिन एक सांप का जहर है जो हृदय विकास या शरीर विज्ञान को प्रभावित किए बिना मांसपेशियों को पंगु बना देता है22। सटीक, विरूपण-मुक्त इमेजिंग के लिए, हम एफईपी से बने ट्यूबों में बढ़ते मछली की सिफारिश करते हैं, जो पानी के लगभग समान अपवर्तक सूचकांक के साथ एक बहुलक है। हम चर्चा करते हैं कि इमेजिंग से पहले उन्हें सीधा और साफ करके एफईपी ट्यूबों को सबसे अच्छा कैसे तैयार किया जाए। मछली को तब इन ट्यूबों में रखा जाता है, मीडिया में सिर नीचे, और ट्यूब के निचले हिस्से को 2% एगारोज़ प्लग के साथ सील कर दिया जाता है, जिस पर मछली के सिर आराम करते हैं। एफईपी ट्यूब में छेद काटना गैस विनिमय की सुविधा प्रदान करता है और मछली के विकास को सुनिश्चित करता है। एम्बेडेड मछली को मीडिया में तब तक रखा जा सकता है जब तक कि इमेजिंग से ठीक पहले नमूना धारक पर माउंट न हो जाए। हम पुनरुत्पादक उच्च गति इमेजिंग के लिए एक डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण पाइपलाइन का भी सुझाव देते हैं। इसके अलावा, हम मजबूत दिल सेल लेबलिंग के लिए साइटोप्लाज्मिक बनाम झिल्ली मार्कर ट्रांसजेनिक लाइनों के उपयोग पर चर्चा करते हैं, साथ ही साथ दिल को रोकने के लिए विभिन्न विकल्पों पर भी चर्चा करते हैं। ये बढ़ते तकनीकें नमूना स्वास्थ्य को सुनिश्चित करती हैं, जबकि हृदय को ठीक से सीमित करने की अनुमति देती हैं और दृश्य के क्षेत्र में पुनरुत्पादित होती हैं।

Protocol

सभी ज़ेबराफ़िश (डैनियो रेरियो) वयस्कों और भ्रूणों को यूडब्ल्यू-मैडिसन इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार संभाला गया था।

1. ज़ेबराफ़िश की तैयारी

  1. स्थापित प्रोटोकॉल 25,26 और संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार ज़ेब्राफ़िश को संभालें। वांछित ट्रांसजेनिक लाइन की नस्ल वयस्क मछली (चर्चा देखें)। भ्रूण को इकट्ठा करें और उन्हें मछली के माध्यम से भरे पेट्री डिश में 28 डिग्री सेल्सियस पर रखें, उदाहरण के लिए, E327।
  2. immobilization की एक विधि चुनें (चर्चा देखें)।
    1. यदि मछली को स्थिर करने के लिए α-बुंगारोटॉक्सिन एमआरएनए का उपयोग करते हैं, तो एक या दो-सेल चरण भ्रूण की जर्दी में 30 पीजी एमआरएनए 22 को इंजेक्ट करें, जो एक माइक्रोमैनिपुलेटर पर घुड़सवार बोर ग्लास सुई का उपयोग करता है और एक पिकोइनजेक्टर 28 से जुड़ा होता है।
    2. यदि tricaine का उपयोग कर रहे हैं, 0.4% स्टॉक समाधान 1 M Tris आधार के साथ पीएच 7.0-7.4 के लिए buffered और इमेजिंग तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. अंडे को 28 डिग्री सेल्सियस पर एक ई 3 भरे पेट्री डिश में रखें और अंडे को हर 24 घंटे में ताजा ई 3 के साथ एक नए पकवान में स्थानांतरित करें जब तक कि इमेजिंग न हो।
  4. वर्णक गठन को रोकने के लिए, यदि ज़ेब्राफ़िश पृष्ठभूमि अल्बिनो नहीं है, तो मछली को 24 घंटे के बाद निषेचन (एचपीएफ) पर 0.2 एमएम टायरोसिनेस इनहिबिटर 1- फिनाइल 2-थायोयूरिया के साथ एक नए ई 3 डिश में स्थानांतरित करें (चर्चा देखें)।

2. FEP ट्यूबों की तैयारी

Figure 1
चित्रा 1: FEP ट्यूब सफाई और straightening. (ए) एक केबल ड्रम पर FEP ट्यूब. (ख) सीधा करने से पहले एफईपी ट्यूब। (ग) कांच और इस्पात आटोक्लेव-सुरक्षित टयूबिंग में एफईपी ट्यूब। (घ) सीधे होने और ठंडा होने के बाद एफईपी ट्यूबों का फ्लशिंग। (ङ) एफईपी ट्यूब sonication के लिए एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के आकार के लिए कटौती. (च) sonication के बाद FEP ट्यूबों की फ्लशिंग। (छ) एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में साफ और सीधी एफईपी ट्यूबों का भंडारण। (ज) इमेजिंग से पहले एफईपी ट्यूब को काटना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. FEP ट्यूबों (चित्रा 1a,b) को एक ग्लास या स्टील आटोक्लेव-सुरक्षित टयूबिंग (चित्रा 1c) में रखकर FEP ट्यूबों को सीधा करें, FEP ट्यूबों को फिट करने के लिए सही आंतरिक व्यास के साथ, आमतौर पर 1.6 या 2.4 मिमी, और 2 घंटे के लिए 180 डिग्री सेल्सियस तक आटोक्लेव। ट्यूबों को कम से कम 5 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर ठंडा होने दें। फिर, सीधे ट्यूबों से निकालें।
    नोट: ट्यूबों में हेरफेर करते समय दस्ताने का उपयोग करें और एक समय में 50 सेमी टयूबिंग के साथ काम करें।
  2. FEP ट्यूबों को साफ करें।
    नोट: आंतरिक एफईपी ट्यूब आकार के कुंद सुई टिप के साथ सिरिंज सुरक्षा के लिए अनुशंसित हैं, लेकिन एक नियमित सुई काम करेगी।
    1. एक 50 mL सिरिंज (चित्रा 1 डी) के साथ दो बार 1 M NaOH के साथ ट्यूब फ्लश.
    2. एक रेजर ब्लेड (चित्रा 1e) के साथ एक 50 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के आकार के लिए FEP ट्यूबों में कटौती, 0.5 M NaOH भरे सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में कटौती ट्यूबों जगह, और ultrasonicate उन्हें 10 मिनट के लिए।
    3. डबल-आसुत H2O के साथ FEP ट्यूबों को फ्लश करें, फिर 70% इथेनॉल (चित्रा 1f) के साथ फ्लशिंग को दोहराएं।
    4. 70% इथेनॉल और ultrasonicate के लिए 10 मिनट के लिए ट्यूबों को स्थानांतरित करें।
    5. डबल-आसुत H2O के साथ ट्यूबों को फ्लश करें और उन्हें डबल-आसुत H2O (चित्रा 1 g) में सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्टोर करें।

3. 2% agarose पकवान की तैयारी

  1. एक ग्लास फ्लास्क में, E3 में कम पिघलने बिंदु agarose पाउडर भंग. घोल को माइक्रोवेव में गर्म करें और इसे हर 20 सेकंड में हिलाएं, जब तक कि सभी पाउडर भंग न हो जाएं।
  2. एक गिलास या प्लास्टिक पेट्री डिश में agarose डालो एक 1-2 मिमी कोट बनाने के लिए. जब तक agarose solidified है प्रतीक्षा करें।
  3. स्टोर करने के लिए, धीरे से सूखने को रोकने के लिए आगर के शीर्ष पर ई 3 डालें। पैराफिन फिल्म में लपेटें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।

4. एम्बेडिंग मीडिया की तैयारी

  1. नमूना कक्ष को भरने के लिए पर्याप्त E3 तैयार करें।
    नोट: मिथाइल ब्लू का उपयोग करने से बचें यदि मीडिया उद्देश्य लेंस के संपर्क में है।
  2. यदि tricaine का उपयोग कर, स्टॉक समाधान पिघलना और E3 करने के लिए 0.02% tricaine जोड़ें.

5. नमूना बढ़ते

Figure 2
चित्र 2: एफईपी ट्यूब में भ्रूण बढ़ते हुए। (ए) बढ़ते मीडिया में एनेस्थेटिक वर्णक-मुक्त मछली। (ख) कुंद अंत सुई और एफईपी ट्यूब के साथ एक सिरिंज संलग्न. (ग) एक बार जब एफईपी ट्यूब में मीडिया और मछली को लिया जाता है, तो सुई के किनारे पर ट्यूब को काट लें। (घ) कटी हुई ट्यूब को 2% एगारोज़ के साथ लेपित डिश में डुबोना ताकि इसके अंत को प्लग किया जा सके। (ङ) प्लग किए गए एफईपी ट्यूब में एक ज़ेब्राफ़िश। (च) गैस-विनिमय छेद बनाने के लिए एफईपी ट्यूब को धीरे-धीरे 30 डिग्री पर काटें। (छ) एक एम्बेडेड ज़ेब्राफ़िश के ऊपर चार छेदों के साथ एफईपी ट्यूब। (ज) एफईपी ट्यूब में एम्बेडेड एक जेब्राफ़िश की योजना। छेद और अगर प्लग इंगित कर रहे हैं. (i) इमेजिंग के लिए तैयार मल्टीपल एम्बेडेड ज़ेब्राफ़िश। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. एक डिस्पोजेबल ग्लास पिपेट के साथ, एम्बेडिंग मीडिया (चित्रा 2 ए) में मछली स्थानांतरित करें। यदि ट्राइकेन का उपयोग कर रहे हैं, तो इमेजिंग से 10 मिनट पहले ट्राइकेन युक्त ई 3 से भरे पेट्री डिश में मछली स्थानांतरित करें। दोनों मामलों में, यह सत्यापित करने के लिए एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत देखें कि मछली ने चलना बंद कर दिया है और नियंत्रण की तुलना में दिल समान गति से धड़क रहा है।
  2. एक रेजर ब्लेड (चित्रा 1h) के साथ आदर्श लंबाई के लिए FEP ट्यूब काटें।
    नोट: लंबाई माइक्रोस्कोप के नमूना धारक के लिए समायोजित किया जाना चाहिए; विशिष्ट लंबाई के बारे में 3 सेमी है.
  3. एक कुंद अंत प्रवेशनी के साथ एक सिरिंज तैयार करें। सिरिंज को हवा से भरें, फिर सुई पर एफईपी ट्यूब को माउंट करें और सिरिंज को खाली करके किसी भी शेष पानी को धीरे से बाहर निकालें (चित्रा 2 बी)।
    नोट: धीरे-धीरे हवा को बाहर निकालकर बुलबुले बनाने से बचें।
  4. सिरिंज घुड़सवार एफईपी ट्यूब के साथ, पहले, एफईपी ट्यूब को भरने के लिए मीडिया को लें, फिर एक भ्रूण सिर नीचे ले जाएं। मछली के सिर को जितना संभव हो सके ट्यूब एंड के करीब रखें। किसी भी बुलबुले बनाने से बचें; यदि कोई बुलबुला मौजूद है, तो नमूना छोड़ दें।
  5. एक रेजर ब्लेड के साथ, ध्यान से कुंद अंत प्रवेशनी या सुई (चित्रा 2 सी) के किनारे पर एफईपी ट्यूब काटें।
  6. अगर-लेपित पकवान के शीर्ष पर किसी भी तरल को छोड़ दें। FEP ट्यूब सीधे आगर में डुबकी (चित्रा 2 डी). ट्यूब घुमाएं और इसे बाहर ले जाने के लिए agarose बिस्तर से प्लग जारी करने के लिए.
  7. एक स्टीरियोस्कोप के तहत, ट्यूब के अंत में आगर प्लग की उपस्थिति को सत्यापित करें (चित्रा 2e)।
  8. लंबी अवधि की इमेजिंग के लिए, प्रत्येक कार्डिनल दिशा में एफईपी ट्यूब में 3-5 छेद काटें, मछली के अंत से कम से कम 5 मिमी ऊपर।
    1. एक स्टीरियोस्कोप के तहत, बढ़ते मीडिया (चित्रा 2 एफ) तक पहुंचने तक एफईपी ट्यूब में 30 डिग्री चीरा बनाने के लिए ट्यूब की धुरी के लंबवत एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें।
    2. एक छेद बनाने के लिए 180 ° पर एक दूसरा कट बनाएं (चित्रा 2 g, h)।
  9. स्थानांतरण एक 1.5 mL माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में नीचे एक 1.5 mL माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एम्बेडिंग मीडिया के साथ जब तक छवि के लिए तैयार (चित्रा 2i).

6. नमूना स्थिति

Figure 3
चित्रा 3: नमूना कक्ष. (a) FEP ट्यूब एक नमूना धारक पर घुड़सवार. (ख) चरणों और उद्देश्यों के साथ नमूना कक्ष। (ग) टी-एसपीआईएम विन्यास में रोशनी और पहचान के उद्देश्य के साथ मीडिया से भरे नमूना कक्ष का शीर्ष दृश्य। (घ) नमूना धारक माइक्रोस्कोप पर लगाया गया, कक्ष में नमूने के साथ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: हृदय इमेजिंग के लिए भ्रूण की स्थिति। (a) 24 hpf Tg (kdrl: Hsa.HRAS-mCherry) zebrafish आंखों के साथ misaligned। (क') एक ही मछली, आंखों के साथ संरेखित। (ख) इष्टतम हृदय इमेजिंग के लिए एक ही मछली -100 ° और (b') -50 ° घुमाया जाता है। (ग) 48 एचपीएफ जेब्राफ़िश जिसकी आंखें गलत हैं। (ग') एक ही मछली, आंखों के साथ संरेखित। (घ) इष्टतम हृदय इमेजिंग के लिए एक ही मछली को 30° से घुमाया जाता है। काले तीर दिल की ओर इशारा करते हैं। स्केल बार 100 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

  1. माइक्रोस्कोप पर, नमूना धारक (चित्रा 3a) में FEP ट्यूब माउंट करें और एम्बेडिंग मीडिया (चित्रा 3b, c) के साथ इमेजिंग कक्ष को भरें। इसके बाद, नमूना धारक को कक्ष में डुबकी लगाने वाले नमूने के साथ मंच पर रखें (चित्रा 3 डी)।
  2. नमूने के स्वास्थ्य की जांच करें। समग्र मछली कल्याण का मूल्यांकन करने के लिए नेत्रहीन हृदय गति का आकलन करें, क्योंकि विशिष्ट हृदय गति गैर-घुड़सवार नियंत्रण मछली की तुलना में चरण और तापमान पर निर्भर है। यदि दिल की धड़कन बहुत धीमी है, तो मछली को छोड़ दें।
    नोट: भ्रूण की कोमल हैंडलिंग सुनिश्चित करें, मीडिया को एम्बेड करने के लिए सावधानीपूर्वक स्थानांतरण, एम्बेड करने के तुरंत बाद इमेजिंग, तेजी से तापमान परिवर्तन से बचें, ट्राइकेन से बचें, और ट्राइकेन के लिए एक्सपोज़र समय को कम करें।
  3. पुन: प्रस्तुत करने योग्य इमेजिंग के लिए, हमेशा एक ही नमूना स्थिति का उपयोग करें। आंखों को संरेखित करने और एक कोण पर इमेजिंग की सिफारिश की जाती है।
  4. मछली को घुमाएं ताकि दोनों आंखें (चित्रा 4a,c) फोकल प्लेन में हों (चित्र 4a', c')
  5. उस स्थिति से, आगे मछली को 24 एचपीएफ इमेजिंग (चित्रा 4 बी, बी') के लिए लगभग 50 डिग्री -100 डिग्री दक्षिणावर्त घुमाएं, और 48 एचपीएफ इमेजिंग (चित्रा 4 डी) के लिए लगभग 20 डिग्री -30 डिग्री वामावर्त।
    नोट: शुरुआती दिल, 30 एचपीएफ से पहले, इसकी छिपी हुई स्थिति (चित्रा 4 बी) के कारण छवि बनाना मुश्किल हो सकता है।

7. छवि अधिग्रहण

  1. रोशनी पक्ष है कि सबसे अच्छा छवि गुणवत्ता देता है और हर मछली के लिए लेजर शक्ति अनुकूलित का चयन करें।
    नोट:: बाद की छवि विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली लेजर शक्ति रिकॉर्ड करें।
  2. प्रत्येक जेड-प्लेन में, 300 फ्रेम प्रति सेकंड (एफपीएस) या उससे अधिक पर 4-5 दिल की धड़कन रिकॉर्ड करें।
    नोट:: देखने के क्षेत्र अधिग्रहण की गति बढ़ाने के लिए फसली किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, 48 एचपीएफ पर ज़ेब्राफ़िश दिल प्रति सेकंड दो से तीन बार धड़कता है, इसलिए, 300 एफपीएस पर, 300 और 600 फ्रेम के बीच चार से छह दिल की धड़कन प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं।
  3. धड़कते दिल को रिकॉर्ड करने के लिए, नमूना को प्रकाश शीट के माध्यम से चरणबद्ध रूप से ले जाएं। 1-2 μm के z-spacing का उपयोग करें, जो दिल की पूरी गहराई को कवर करता है।

8. छवि प्रसंस्करण

  1. एक फिजी (छवि J229,30) प्लगइन का उपयोग कर एक 4 डी (x,y,z, समय) दिल के पुनर्निर्माण के लिए रिकॉर्ड की गई फिल्म सिंक्रनाइज़ करें जैसा कि पहले वर्णित 6 था।
  2. डेटा का पता लगाने और रेंडर किए गए ज़ेब्राफ़िश दिल की फिल्मों को उत्पन्न करने के लिए, 4 डी फ़ाइल (एक्स, वाई, जेड, समय) को 3 डी रेंडरिंग सॉफ़्टवेयर में लोड करें।

Representative Results

Figure 5
चित्रा 5: 48 hpf zebrafish दिल। (ए) अभी भी एक जेड-फ्रेम का, 48 एचपीएफ टीजी (केडीआरएल: एचएसए.एचआरएस-एमचेरी; myl7: lck-EGFP) ज़ेब्राफ़िश का पूर्वकाल-वेंट्रल दृश्य, एलएसएफएम के साथ चित्रित, (बी) फिल्म स्टैक का 3 डी पुनर्निर्माण, एट्रियम के माध्यम से कट व्यू। (ग) एक जेड-प्लेन पर एक पूर्ण दिल की धड़कन पर चार फ्रेम का असेंबल। पाई चार्ट दिल की धड़कन के दौरान समय को इंगित करते हैं। स्केल बार 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

हमने ऊपर दिए गए प्रोटोकॉल के अनुसार टीजी (kdrl: Hsa.HRAS-mCherry; myl7: lck-EGFP) zebrafish के 48 hpf धड़कते दिल को दर्ज किया है (चित्रा 5)। एक 488 एनएम और एक 561 एनएम लेजर लाइट शीट ने नमूने को एक साथ रोशन किया। उत्सर्जित प्रतिदीप्ति को 16x/0.8 W उद्देश्य लेंस और एक वैज्ञानिक धातु ऑक्साइड अर्धचालक (sCMOS) कैमरे का उपयोग करके लंबवत रूप से पता लगाया गया था।

48 एचपीएफ पर, दिल सिर्फ लूपिंग से गुजरा है और इसमें दो कक्ष हैं, वेंट्रिकल और एट्रियम लेकिन अभी तक वाल्व विकसित नहीं हुए हैं। हमारी फिल्मों में, विभिन्न हृदय संरचनाएं जैसे कि प्रवाह पथ, वेंट्रिकल, एट्रियोवेंट्रिकुलर नहर (एवीसी), एट्रियम और बहिर्वाह ट्रैक आसानी से अलग-अलग हैं (चित्रा 5ए, बी)। ये डेटा सटीक धड़कन दिखाते हैं और दिल की दो सेल परतों के बीच जटिल इंटरैक्शन को प्रकट करते हैं: मायोकार्डियम, एक एकल-सेल मांसपेशी परत अनुबंध और जनरेटफोर्स (चित्रा 5 सी, लाल), और एंडोकार्डियम, एक एकल सेल परत जो दिल को वास्कुलचर से जोड़ती है (चित्रा 5 सी, सियान)।

X, y, z (3D) + समय (4D) + रंग (5D) में दिल की धड़कन पुनर्निर्माण Mickoleit et al.6 के अनुसार किया गया था। पुनर्निर्माण दो परिकल्पनाओं पर आधारित है: दिल की गति दोहरावदार है, और डेटा को एक छोटे से जेड-चरण के साथ प्राप्त किया जाना चाहिए। आउटपुट 5 डी में एक पुनर्निर्मित एकल दिल की धड़कन है, जो दिल की धड़कन प्रति 30 जीबी से 80 जीबी तक मापता है। डेटा को रेंडर करने के लिए, हमने गहराई से रेंडरिंग 31 के लिए मुफ्त, ओपन-सोर्स टूल फ्लूओरेंडर का उपयोग किया क्योंकि इसे बहुआयामी डेटासेट को संभालने के लिए डिज़ाइन किया गया था और आसानी से सेल परतों और व्यक्तिगत परतों (चित्रा 5 बी) दोनों की 5 डी फिल्में प्रदान करता है।

Discussion

ट्रांसजेनिक लाइनों दिल की छवि के लिए

Figure 6
चित्रा 6: साइटोप्लाज्मिक- और झिल्ली-मार्कर ज़ेब्राफ़िश ट्रांसजेनिक लाइनों की तुलना। पूर्वकाल-ventral 48 hpf zebrafish दिल के दृश्य LSFM के साथ चित्रित. सफेद तीर केवल झिल्ली-मार्कर ट्रांसजेनिक लाइन के साथ दिखाई देने वाली संरचनाओं को इंगित करते हैं। (ए) टीजी (केडीआरएल: ईजीएफपी) 32 दिल में सियान में संकेत और (ए)) वेंट्रिकल में। (b) Tg (kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:dsRed)33 संकेत दिल में लाल रंग में और (b') वेंट्रिकल में। ( c,c') Tg (kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:dsRed) और Tg(kdrl:EGFP) सिग्नल दोनों का विलय। स्केल बार 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

ज़ेब्राफ़िश दिल की इमेजिंग के लिए सटीक दिल-सेल लेबलिंग की आवश्यकता होती है। जबकि मायोकार्डियल मोटाई पूरी कोशिकाओं में अपेक्षाकृत स्थिर होती है, एंडोकार्डियल कोशिकाएं नाभिक के चारों ओर मोटी होती हैं, लेकिन कुछ क्षेत्रों में 2 μm से पतली झिल्ली प्रोट्रूशन होती हैं। साइटोप्लाज्मिक ट्रांसजेनिक लाइनें जैसे टीजी (केडीआरएल: ईजीएफपी) 32 प्रभावी रूप से एंडोकार्डियल नाभिक के आसपास के क्षेत्रों को लेबल करती हैं, लेकिन आगे, पतली साइटोप्लाज्म इस तरह के छोटे एक्सपोजर समय के साथ पता लगाने के लिए पर्याप्त फोटॉनों का उत्सर्जन नहीं कर सकती है, जिससे डेटा में कृत्रिम छेद होते हैं (चित्रा 6 ए)। इसके विपरीत, झिल्ली मार्कर ट्रांसजेनिक लाइनें जैसे कि Tg (kdrl: Hsa.HRAS-mCherry) 33 प्रभावी रूप से एंडोकार्डियम को लेबल कर सकती हैं और अधिक विवरण प्रकट कर सकती हैं (चित्रा 6b, c)। प्रत्येक प्रयोग के लिए, ध्यान से सबसे उपयुक्त ट्रांसजेनिक लाइन चुनें।

ज़ेब्राफ़िश स्थिरीकरण
immobilization तकनीक का विकल्प प्रयोग की लंबाई और छवि के लिए मछली की उम्र पर निर्भर करता है। ट्राइकेन का उपयोग आमतौर पर ज़ेब्राफ़िश स्थिरीकरण के लिए किया जाता है, ज्यादातर इसके उपयोग में आसानी के कारण। दरअसल, मछली मीडिया में बस 130 मिलीग्राम / एल ट्राइकेन जोड़ने से 10 मिनट में उनके एनेस्थेटाइजेशन में परिणाम होता है। जैसा कि यह विकासात्मक दोषों को जन्म दे सकता है और हृदय शरीर विज्ञान 20,22 को प्रभावित कर सकता है, हम केवल छोटे प्रयोगों (30 मिनट से कम) के लिए ट्राइकेन का उपयोग करने की सलाह देते हैं। लंबे समय तक इमेजिंग के लिए, एक या दो-सेल चरण में α-बुंगारोटॉक्सिन एमआरएनए इंजेक्शन कार्डियोवैस्कुलर विकास या शरीर विज्ञान को प्रभावित किए बिना निषेचन (डीपीएफ) के बाद 3 दिनों तक मछली को पंगु बना देता है22।

सही FEP ट्यूब का चयन
एफईपी ट्यूब विभिन्न व्यास और मोटाई में उपलब्ध हैं। छवि 0-5 डीपीएफ मछली के लिए, 0.8 मिमी एक अच्छा आंतरिक व्यास है; या तो मोटी दीवार 0.8 x 1.6 मिमी ट्यूब या पतली दीवार 0.8 x 1.2 मिमी ट्यूबों का चयन करें। हम पतली दीवारों वाली ट्यूबों की सिफारिश करते हैं; हालांकि, मोटी दीवारें बढ़ी हुई स्थिरता और कठोरता प्रदान करती हैं, जो महत्वपूर्ण हो सकती हैं यदि नमूना कक्ष में बहता हुआ मीडिया है जो एक पतली ट्यूब को बाधित और स्थानांतरित कर सकता है। बड़े नमूनों के लिए, 1.6 x 2.4 मिमी और 2 x 3 मिमी का उपयोग किया जा सकता है।

तापमान और गैस एक्सचेंजों
ज़ेब्राफ़िश भ्रूण की भलाई का एक अनिवार्य पहलू तापमान है। आदर्श रूप से, इमेजिंग करते समय मछली को 28.5 डिग्री सेल्सियस पर रखें, क्योंकि पर्यावरण का तापमान विकास और हृदय गति को प्रभावित करता है।

हमारे अनुभव में, 2% agarose प्लग के माध्यम से ऑक्सीजन विनिमय केवल 3-4 dpf तक एक स्थिर हृदय गति बनाए रखता है। इसलिए, ट्यूब में छेद काटने से ऑक्सीजन का प्रसार सुनिश्चित होता है। यह भी आवश्यक हो सकता है यदि वांछित नमूना करने के लिए दवा वितरण के लिए.

दिल की धड़कन का निलंबन।
उचित रूप से सुसज्जित प्रकाश शीट माइक्रोस्कोप की तेजी से अधिग्रहण गति विवो में धड़कन दिल की रिकॉर्डिंग की अनुमति देती है। हालांकि, एक अबाधित जेड-स्टैक प्राप्त करने के लिए, कोई भी दिल को धीमा या रोक सकता है। हालांकि, दिल को रोकने से दिल की मांसपेशियों में छूट मिलती है और इसके परिणामस्वरूप दिल 6 का पतन हो सकता है। दिल की धड़कन निलंबन morpholinos, कम तापमान, मांसपेशियों के संकुचन या optogenetics के एक अवरोधक का उपयोग करके किया जा सकता है। इन विधियों में से प्रत्येक की अपनी कमियां हैं और प्रत्येक प्रयोग के लिए सावधानीपूर्वक मूल्यांकन किया जाना चाहिए।

एक सेल चरण में मूक दिल (सिह) मॉर्फोलिनो के 4 एनजी का इंजेक्शन सार्कोमेर गठन के लिए महत्वपूर्ण जीन tnnt2a को लक्षित करके दिल की धड़कन को रोक सकता है35। सिह ज़ेब्राफ़िश में दिल की धड़कन नहीं होती है और केवल 7 डीपीएफ तक जीवित रहती है, जब भ्रूण ऑक्सीकरण के लिए परिसंचारी रक्त पर भरोसा करना शुरू कर देते हैं। जैसा कि हृदय मोर्फोजेनेसिस आनुवांशिक और बायोमैकेनिकल बलों दोनों द्वारा संचालित होता है, ये मछलियां 3 डीपीएफ के आसपास हृदय विकृतियों को प्रस्तुत करती हैं।

जैसा कि Ca2+ का प्रवाह तापमान संवेदनशील है, तापमान भ्रूण zebrafish21 में हृदय गति को प्रभावित करता है। नतीजतन, इमेजिंग चैंबर में तापमान को कम करने से दिल की धड़कन धीमी हो जाती है। दिल की धड़कन को रोकने के लिए 15 डिग्री सेल्सियस से नीचे के तापमान की आवश्यकता होती है। जैसा कि ज़ेबराफ़िश को आमतौर पर 28.5 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है, इसलिए इस तरह के कम तापमान को केवल संक्षिप्त अवधि (10 मिनट से कम) के लिए बनाए रखा जा सकता है।

मांसपेशियों के संकुचन के रासायनिक अवरोधक, 2,3-Bu-tanedione 2-monoxime (BDM) जैसी दवाओं को अस्थायी रूप से दिल की धड़कन को निलंबित करने के लिए ज़ेब्राफ़िश मीडिया (50 nM37,38) में जोड़ा जा सकता है। बीडीएम का उपयोग करना सुविधाजनक है क्योंकि यह 15 मिनट से कम समय में दिल के संकुचन को रोकता है और कार्डियक फ़ंक्शन को बहाल करने के लिए धोया जा सकता है। हालांकि, जैसा कि बीडीएम कार्डियक एक्शन पोटेंशियल को बदल देता है, इसका उपयोग सावधानी 37 के साथ किया जाना चाहिए।

अंत में, ट्रांसजेनिक ज़ेबराफ़िश के दिल को प्रकाश-गेटेड आयन चैनलों या पंपों जैसे कि चैनलरोडोप्सिन या हैलोरोडोप्सिन को उनके मायोकार्डियम में व्यक्त करने के लिए हेरफेर किया जा सकता है और प्रकाश 39,7,40,41,9 के साथ प्रवाह पथ पर पेसमेकर को रोशन करके रोका जा सकता है।

दृष्टिकोण
प्रस्तुत अनुकूलित उपकरण और समाधान विवो में ज़ेब्राफ़िश दिल का अध्ययन करने के लिए अल्ट्राफास्ट कार्डियक गतिशीलता के दीर्घकालिक, कोमल इमेजिंग की अनुमति देते हैं। नमूना एम्बेडिंग को विभिन्न इमेजिंग तौर-तरीकों के अनुरूप अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे कि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी, दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी, या ऑप्टिकल प्रोजेक्शन टोमोग्राफी (ओपीटी)। लाइट शीट माइक्रोस्कोपी, हालांकि, संभवतः पसंदीदा तकनीक है जो दिल की गतिशीलता को पकड़ने के लिए पर्याप्त गति से ऑप्टिकल सेक्शनिंग प्रदान करती है। जबकि यह प्रोटोकॉल ज़ेब्राफ़िश भ्रूण हृदय इमेजिंग पर केंद्रित है, हमारा मानना है कि इसे विभिन्न अन्य नमूनों और प्रयोगों पर भी लागू किया जा सकता है। भविष्य में यह देखना दिलचस्प होगा कि क्या इसी तरह की एम्बेडिंग और इमेजिंग तकनीकों का उपयोग विकास के दौरान बाद के चरणों में भी किया जा सकता है जब दिल अधिक छिपा हुआ होता है और लार्वा कम पारभासी होता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम चित्र2h में चित्रण के लिए Madelyn Neufeld धन्यवाद. इस काम को मैक्स प्लैंक सोसाइटी, मोर्ग्रिज इंस्टीट्यूट फॉर रिसर्च, चैन जुकरबर्ग इनिशिएटिव और ह्यूमन फ्रंटियर साइंस प्रोग्राम (एचएफएसपी) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5mL Eppendorf Eppendorf 22364111 To carry embedded samples
15mL Falcon tubes Falcon 352095 To carry embedded samples
50mL centrifuge tubes Falcon 352070 50ml tubes for sonication step, and storing cleaned, straightened FEP tubes
50mL syringe BD 309654 50ml syringe for FEP  cleaning
Agarose, low gelling temperature Sigma Aldrich 39346-81-1 To make plug
Blunt Tip Needles, 21 gauge VWR 89500-304 Blunt end needle for 0.8 inner diameter FEP tube
Borosilicate glass tube McMaster-Carr 8729K33 Tubing for FEP tube straightening 9.5mm outer diameter, 5.6 inner diameter, 30cm long, other sizes available
Borosilicate glass tube McMaster-Carr 8729K31 Tubing for FEP tube straightening 6.35mm outer diameter, 4mm inner diameter, 30cm long, other sizes available
Conventional needles, 21 Gauge BD 305165 Conventional needle for 0.8 inner diameter FEP tube
Disposable glass pipette Grainger 52NK56 To transfer fish, use with pipette pump
E3 medium for zebrafish embryos
Ethanol Sigma Aldrich 64-17-5 Ethanol for FEP cleaning
FEP tube, 0.8 / 1.2 mm ProLiquid 2001048 FEP tube with thin wall, other sizes available
FEP tube, 0.8 / 1.6 mm Bola S1815-04 FEP tube with thick wall, other sizes available
FEP tube, 2/3mm BGB 211581 Large FEP tube with thick wall, other sizes available
Hot Hand Rubber Mitt Cole-Parmer 691000 To carry hot equipment after autoclaving
Omnifix 1mL Syringes B Braun 9161406V 1ml syringe for embedding
Petri dish, small Dot Scientific PD-94050 To make agarose plug
Pipette pumps Argos Technologies 04395-05 To transfer fish, use with disposable glass pipette
PTU Sigma Aldrich 103-85-5 Also known as:
N-Phenylthiourea, 1-Phenyl-2-thiourea, Phenylthiocarbamide
Razor blades Azpack 11904325 To cut FEP tubes
Sodium Hydroxide Dot Scientific DSS24000 NaOH for FEP cleaning
Tricaine Sigma Aldrich E10521 Also known as: MS-222,
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, Tricaine

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जीव विज्ञान अंक 174
Zebrafish भ्रूण में फास्ट कार्डियक गतिशीलता की लाइट शीट माइक्रोस्कोपी
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Schlaeppi, A., Graves, A., Weber,… More

Schlaeppi, A., Graves, A., Weber, M., Huisken, J. Light Sheet Microscopy of Fast Cardiac Dynamics in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (174), e62741, doi:10.3791/62741 (2021).

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