Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Lysarkmikroskopi av rask hjertedynamikk i sebrafiskembryoer

Published: August 13, 2021 doi: 10.3791/62741
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Morgridge Institute for Research, Madison, WI

Summary

Vi beskriver optimaliserte verktøy for å studere sebrafiskhjertet in vivo med lysarkfluorescensmikroskopi. Spesielt foreslår vi lyse hjertetransgene linjer og presenterer nye milde innebyggings- og immobiliseringsteknikker som unngår utviklings- og hjertefeil. Det gis også en mulig datainnhentings- og analyserørledning tilpasset hjerteavbildning.

Abstract

Embryonal hjerteforskning har hatt stor nytte av fremskritt i rask in vivo lysplate fluorescensmikroskopi (LSFM). Kombinert med den raske eksterne utviklingen, den gjennomførbare genetikken og gjennomsiktigheten til sebrafisken, Danio rerio, har LSFM levert innsikt i hjerteform og funksjon ved høy romlig og tidsmessig oppløsning uten betydelig fototoksisitet eller fotobleking. Avbildning av bankende hjerter utfordrer eksisterende prøvepreparerings- og mikroskopiteknikker. Man må opprettholde en sunn prøve i et innsnevret synsfelt og skaffe seg ultraraske bilder for å løse hjerterytmen. Her beskriver vi optimaliserte verktøy og løsninger for å studere sebrafiskhjertet in vivo. Vi demonstrerer anvendelsen av lyse transgene linjer for merking av hjertebestanddelene og presenterer nye skånsomme innebyggings- og immobiliseringsteknikker som unngår utviklingsfeil og endringer i hjertefrekvensen. Vi foreslår også en datainnhentings- og analysepipeline tilpasset hjerteavbildning. Hele arbeidsflyten som presenteres her fokuserer på sebrafisk embryonal hjerteavbildning, men kan også brukes på ulike andre prøver og eksperimenter.

Introduction

For å avdekke de komplekse hendelsene og interaksjonene i det tidlige bankende hjertet, er det nødvendig med in vivo-avbildning av hele orgelet. Med sin minimale fototoksisitet1,2,3, lav fotobleaching4, og høy hastighet, har lysarkmikroskopi utviklet seg som det primære bildeverktøyet for embryonal og hjerteutvikling5,6. Det har gitt innsikt i hjerteform og funksjon ved høy romlig og tidsmessig oppløsning7,8,9 og har tillatt forskere å avbilde og spore fluorescerende merkede deler av hjertet i høy hastighet, studere hemodynamiske krefter og følge hjerteutviklingen direkte inne i kroppen av å utvikle embryoer6,10,11,12.

For å nøyaktig og reprodusere sebrafisk innen synsfeltet, finnes det en rekke innbyggingsprotokoller for lysark, på kort og lang sikt, samt enkelt- eller multiprøve13,14,15,16,17,18,19. Den vanligste protokollen innebærer trikain immobilisering og agarose montering inne i et glass eller plastrør. Men ettersom hjertefrekvensen kan endres på grunn av temperatur, bedøvelse og innebyggingsmateriale som brukes20,21,22, krever sebrafisk hjerteavbildning spesifikke, milde protokoller for å sikre prøvehelse6,8,11,12,20,21,22,23 . For kortsiktig avbildning (opptil en time) kan man bedøve fisken i 130 mg/l trikain og legge den inn i fluoriserte etylenpropylenrør (FEP) med 0,1 % agaroseløsning og en plugg, som beskrevet i Weber et al. 201416. Men siden trikain kan føre til utviklingsfeil20,22, må forskjellige protokoller brukes til langsiktig avbildning.

Her beskriver vi en ny strategi for langtids hjerteavbildning. Selv om det finnes mange lysarkimplementeringer24, anbefaler vi at du bruker en hengende prøve i et T-SPIM-mikroskop (ett deteksjons- og to belysningslinser i et horisontalt plan med prøven hengende vertikalt i fellesfokus). Dette gir den nødvendige bevegelses- og rotasjonsfriheten for den nøyaktige prøveposisjoneringen. Fisken immobiliseres ved å injisere 30 pg α-bungarotoxin mRNA på en- eller tocellet stadium. α-bungarotoxin er en slangegifte som lammer muskler uten å påvirke kardiovaskulær utvikling eller fysiologi22. For presis, forvrengningsfri avbildning anbefaler vi å montere fisk i rør laget av FEP, en polymer med en brytningsindeks nesten identisk med vann. Vi diskuterer hvordan du best kan forberede FEP-rørene ved å rette og rengjøre dem før avbildning. Fisken er deretter montert i disse rørene, hodet ned, i media, og bunnen av røret er forseglet med en 2% agarose plugg, hvor fiskehoder hviler. Kutting av hull i FEP-røret letter gassutveksling og sikrer fiskevekst. Den innebygde fisken kan oppbevares i media til den monteres på en prøveholder rett før avbildning. Vi foreslår også en datainnhentings- og analysepipeline for reproduserbar høyhastighetsavbildning. Videre diskuterer vi bruken av cytoplasmatiske versus membranmarkør transgene linjer for robust hjertecellemerking, samt forskjellige alternativer for å stoppe hjertet. Disse monteringsteknikkene sikrer prøvehelse samtidig som hjertet kan begrenses nøyaktig og reproduseres i synsfeltet.

Protocol

Alle sebrafisk (Danio rerio) voksne og embryoer ble håndtert i samsvar med protokoller godkjent av UW-Madison Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Tilberedning av sebrafisk

  1. Håndter sebrafisk i henhold til etablerte protokoller25,26 og institusjonelle retningslinjer. Ras voksenfisk av ønsket transgen linje (se Diskusjon). Samle embryoene og hold dem ved 28 °C i en Petri-tallerken fylt med fiskemedium, for eksempel E327.
  2. Velg en metode for immobilisering (se Diskusjon).
    1. Hvis du bruker α-bungarotoxin mRNA for å immobilisere fisken, injiser 30 pg mRNA22 i eggeplommen av en- eller tocellet stadium embryoer ved hjelp av en boreglassnål montert på en mikromanipulator og koblet til en picoinjector28.
    2. Hvis du bruker trikain, lag 0,4% lagerløsning bufret til pH 7,0-7,4 med 1 M Tris-base og oppbevar ved -20 °C til avbildning.
  3. Oppbevar eggene i en E3 fylt Petri-tallerken ved 28 °C og overfør eggene hver 24.
  4. For å forhindre pigmentdannelse, hvis sebrafiskbakgrunnen ikke er albino, overfør fisk ved 24 timers etterbefruktning (hpf) til en ny E3-tallerken med 0,2 mM tyrosinasehemmer 1-fenyl 2-tiourea (se Diskusjon).

2. Fremstilling av FEP-rør

Figure 1
Figur 1: FEP-rørrengjøring og retting. (a) FEP-rør på en kabeltrommel. (b) FEP-rør før retting. (c) FEP-rør i glass- og stål autoklavsikkert rør. (d) Spyling av FEP-rørene etter retting og avkjøling. (e) FEP-rør kuttet til størrelsen på et sentrifugerør for sonikering. (f) Spyling av FEP-rør etter sonikering. (g) Oppbevaring av de rensede og rettede FEP-rørene i et sentrifugerør. (h) Kutting av FEP-røret før avbildning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Rett UT FEP-rørene (figur 1a,b) ved å plassere dem i en autoklavsikker slange i glass eller stål (figur 1c) med riktig indre diameter for å få plass til FEP-rør, vanligvis 1,6 eller 2,4 mm, og autoklaver til 180 °C i 2 timer. La rørene avkjøles ved romtemperatur i minst 5 timer. Fjern deretter fra retterørene.
    MERK: Bruk hansker når du manipulerer rørene og arbeid med 50 cm slanger om gangen.
  2. Rengjør FEP-rørene.
    MERK: Sprøyter med stump nålespiss av den indre FEP-rørstørrelsen anbefales for sikkerhet, men en vanlig nål vil fungere.
    1. Skyll rørene med 1 M NaOH to ganger med en 50 ml sprøyte (figur 1d).
    2. Klipp FEP-rørene til størrelsen på et 50 ml sentrifugerør med et barberblad (figur 1e), legg kutterør i 0,5 M NaOH fylte sentrifugerør, og ultralyd dem i 10 minutter.
    3. Skyll FEP-rørene med dobbeltdestillert H2O, og gjenta deretter spylingen med 70 % etanol (figur 1f).
    4. Overfør rør til 70% etanol og ultralyd i 10 min.
    5. Skyll rørene med dobbeltdestillert H2O og oppbevar dem i sentrifugerør i dobbeltdestillert H2O (figur 1g).

3. Tilberedning av 2% agarose tallerken

  1. I en glassflaske oppløses lavt smeltepunkt agarose pulver i E3. Varm løsningen i en mikrobølgeovn og rør den hver 20 s, til alt pulver er oppløst.
  2. Hell agarose i en petriskål av glass eller plast for å lage en 1-2 mm frakk. Vent til agarose er størknet.
  3. For å oppbevare, hell forsiktig E3 på toppen av agaren for å forhindre tørking. Pakk inn parafinfilm og hold den ved 4 °C.

4. Utarbeidelse av innebygging av medier

  1. Forbered nok E3 til å fylle prøvekammeret.
    MERK: Unngå å bruke metylblå hvis media er i kontakt med objektive linser.
  2. Hvis du bruker trikain, tine lagerløsning og tilsett 0,02% trikain til E3.

5. Prøvemontering

Figure 2
Figur 2: Embryomontering i FEP-rør. (a) Bedøvet pigmentfri fisk i monteringsmedier. (b) En sprøyte med stump endenål og FEP-rør festet. (c) Når medier og fisk er tatt opp i FEP-røret, kutt røret på kanten av nålen. (d) Dypping av skjærerøret i en tallerken belagt med 2% agarose for å plugge enden. (e) En sebrafisk i et plugget FEP-rør. (f) Skjær FORSIKTIG FEP-røret ved 30° for å lage gassutvekslingshull. (g) FEP-rør med fire hull over en innebygd sebrafisk. (h) Ordning av en sebrafisk innebygd i et FEP-rør. Hull og agarplugg er indikert. (i) Flere innebygde sebrafisk klare for avbildning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Med en engangs glasspipette overfører du fisk til innbyggingsmedier (figur 2a). Hvis du bruker trikain, overfør fisk til Petri-tallerken fylt med trikainholdig E3, 10 min før avbildning. I begge tilfeller, se under et stereomikroskop for å bekrefte at fisken sluttet å bevege seg og at hjertet slår med samme hastighet sammenlignet med kontrollen.
  2. Skjær FEP-røret til den ideelle lengden med et barberblad (figur 1h).
    MERK: Lengden skal justeres til mikroskopets prøveholder; den typiske lengden er ca 3 cm.
  3. Forbered en sprøyte med en stump endekanyle. Fyll sprøyten med luft, monter deretter FEP-røret på kanylen og skyll forsiktig ut eventuelt gjenværende vann ved å tømme sprøyten (figur 2b).
    MERK: Unngå å lage bobler ved å skylle ut luften langsomt.
  4. Med sprøytemontert FEP-rør, ta først opp medier for å fylle FEP-røret, og ta deretter opp et embryohode ned. Hold fiskehodet så nær rørenden som mulig. Unngå å lage noen bobler; Hvis det finnes en boble, kaster du prøven.
  5. Med et barberblad kutter du FORSIKTIG FEP-røret på kanten av den stumpe endekanylen eller nålen (figur 2c).
  6. Kast eventuell væske på toppen av den agarbelagte parabolen. Dypp FEP-røret rett inn i agaren (figur 2d). Roter røret og ta det ut for å løsne pluggen fra agarosesengen.
  7. Under et stereoskop må du kontrollere tilstedeværelsen av agarpluggen på enden av røret (figur 2e).
  8. For langvarig avbildning, kutt 3-5 hull i FEP-røret i hver kardinalretning, minst 5 mm over enden av fisken.
    1. Under et stereoskop bruker du et barberblad vinkelrett på rørets akse for å gjøre et 30° snitt inn i FEP-røret til du når monteringsmediet (figur 2f).
    2. Lag et nytt kutt ved 180° for å lage et hull (figur 2g,h).
  9. Overfør montert embryohode ned i et 1,5 ml mikrosenterrør med innebygde medier til det er klart til bilde (figur 2i).

6. Prøveposisjonering

Figure 3
Figur 3: Prøvekammer. (a) FEP-rør montert på en prøveholder. (b) Prøvekammeret med faser og mål. (c) Toppvisning av det mediefylte prøvekammeret, med belysnings- og deteksjonsmål i en T-SPIM-konfigurasjon. (d) Prøveholder montert på mikroskopet, med prøven i kammeret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Embryoposisjonering for hjerteavbildning. (a) 24 hkf Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry) sebrafisk med feiljustering av øynene. (a') Samme fisk, med øyne justert. (b) Samme fisk rotert -100 ° og (b') -50 ° for optimal hjerteavbildning. (c) 48 hk sebrafisk med feiljusterte øyne. (c') Samme fisk, med øyne justert. (d) Samme fisk rotert med 30° for optimal hjerteavbildning. Svarte piler peker mot hjertet. Skalalinje 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Monter FEP-røret i prøveholderen (figur 3a) ved mikroskopet, og fyll bildekammeret med innebyggingsmedier (figur 3b,c). Plasser deretter prøveholderen på scenen med prøven dyppet i kammeret (figur 3d).
  2. Sjekk tilstanden til prøven. Vurder hjertefrekvensen visuelt for å evaluere generell fiske velvære, da spesifikk hjertefrekvens er scene- og temperaturavhengig, ved å sammenligne med ikke-montert kontrollfisk. Hvis hjerterytmen er for langsom, kast fisken.
    MERK: Sørg for skånsom håndtering av embryoer, forsiktig overføring til innbygging av medier, avbildning umiddelbart etter innbygging, unngå raske temperaturendringer, unngå trikain og senking av eksponeringstiden for trikain.
  3. Bruk alltid samme prøveposisjon for reproduserbar avbildning. Det anbefales å justere øynene og bildet i en vinkel.
  4. Roter fisken slik at begge øynene (figur 4a,c) er i fokusplanet (figur 4a',c')
  5. Fra den posisjonen roterer du fisken ytterligere ca. 50 °-100 ° med klokken for 24 hkf-bildebehandling (figur 4b, b'), og ca. 20°-30° mot klokken i 48 hkf-bildebehandling (figur 4d).
    MERK: Det tidlige hjertet, før 30 hkf, kan være vanskelig å bilde på grunn av sin skjulte posisjon (figur 4b).

7. Bildeoppkjøp

  1. Velg belysningssiden som gir den beste bildekvaliteten og tilpass laserkraften til hver fisk.
    MERK: Ta opp lasereffekten som brukes til etterfølgende bildeanalyse.
  2. Ved hvert z-plan registrerer du 4-5 hjerteslag med 300 bilder per sekund (fps) eller mer.
    MERK: Synsfeltet kan beskjæres for å øke anskaffelseshastigheten. For eksempel, ved 48 hkf slår sebrafiskhjertet to til tre ganger per sekund, derfor, ved 300 fps, er det nødvendig med mellom 300 og 600 rammer for å skaffe fire til seks hjerteslag.
  3. For å registrere det bankende hjertet, beveg prøven trinnvis gjennom lysarket. Bruk en z-avstand på 1-2 μm, som dekker hele hjertets dybde.

8. Bildebehandling

  1. Synkroniser innspilt film for å rekonstruere et 4D-hjerte (x,y,z, tid) ved hjelp av en Fiji (Image J229,30) plugin som tidligere beskrevet6.
  2. For å utforske data og generere filmer av det gjengitte sebrafiskhjertet, last inn 4D-filen (x, y, z, tid) i en 3D-gjengivelsesprogramvare.

Representative Results

Figure 5
Figur 5: Sebrafiskhjertet på 48 hk. (a) Fortsatt av en z-ramme, fremre-ventral visning av 48 hpf Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:lck-EGFP) sebrafisk, avbildet med LSFM, (b) 3D-rekonstruksjon av filmstakker, klipp visning gjennom atriumet. (c) Montasje av fire rammer over full hjerterytme ved ett z-fly. Sektordiagrammer angir tiden under livstegn. Skalalinje 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Vi har registrert det 48 hk bankende hjertet til Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:lck-EGFP) sebrafisk i henhold til protokollen beskrevet ovenfor (figur 5). Et 488 nm og et 561 nm laserlysplate lyste opp prøven samtidig. Den avgitte fluorescensen ble påvist vinkelrett ved hjelp av et objektivt objektiv på 16x/0,8 W og et vitenskapelig metalloksid halvlederkamera (sCMOS).

Ved 48 hkf har hjertet nettopp gjennomgått looping og har to kamre, ventrikelen og atriet, men har ennå ikke utviklet ventiler. I filmene våre skiller de forskjellige hjertestrukturene som innstrømningskanal, ventrikel, atrioventrikkelkanal (AVC), atrium og utløpsspor lett å skille mellom (figur 5a,b). Disse dataene viser nøyaktig slag og avsløring av komplekseinteraksjoner mellom hjertets to cellelag: myokardiet, et encellet muskellag som trekker seg sammen og genererer kraft (figur 5c, rød) og endokardiet, et enkelt cellelag som forbinder hjertet med vaskulaturen (figur 5c, cyan).

Hjerterytmerekonstruksjonen i x,y,z (3D) + tid (4D) + farge (5D) ble utført i henhold til Mickoleit et al.6. Rekonstruksjonen er basert på to hypoteser: hjertets bevegelse er repeterende, og data bør skaffes med et lite z-trinn. Utgangen er et rekonstruert enkelt hjerteslag i 5D, som måler 30 GB til 80 GB per hjerterytme. For å gjengi dataene brukte vi det gratis, åpen kildekode-verktøyet FluoRender for dyptgående gjengivelse31 da det ble designet for å håndtere flerdimensjonale datasett og gjengir enkelt 5D-filmer av både cellelag og individuelle lag (figur 5b).

Discussion

Transgene linjer for å avbilde hjertet

Figure 6
Figur 6: Sammenligning av cytoplasmatiske og membranmarkør sebrafisk transgene linjer. Fremre ventral visning av 48 hk sebrafiskhjerter avbildet med LSFM. Hvite piler indikerer strukturer som bare er synlige med en membranmarkør transgen linje. (a) Tg(kdrl:EGFP)32 signal i cyan i hjertet og (a') i ventrikelen. (b) Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:dsRed)33 signal i rødt i hjertet og (b') i ventrikelen. ( c,c') sammenslåing av både Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:dsRed) og Tg(kdrl:EGFP)-signal. Skalalinje 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Avbildning av sebrafiskhjertet krever presis hjertecellemerking. Mens myokardtykkelsen er relativt konstant gjennom cellene, er endokardielle celler tykke rundt kjernen, men har tynne membranutstikk, i noen regioner tynnere enn 2 μm. Cytoplasmatiske transgene linjer som Tg(kdrl:EGFP)32 merker effektivt regionene rundt endokardiale kjerner, men lenger unna kan det hende at den tynne cytoplasmaen ikke avgir nok fotoner til å bli oppdaget med så korte eksponeringstider, noe som fører til kunstige hull i dataene (figur 6a). I motsetning til dette kan membranmarkørens transgene linjer som Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry)33 effektivt merke endokardiet og avsløre flere detaljer (figur 6b,c). For hvert eksperiment velger du nøye den mest hensiktsmessige transgene linjen.

Sebrafisk immobilisering
Valget av immobiliseringsteknikk avhenger av lengden på eksperimentet og fiskens alder til bilde. Trikain har ofte blitt brukt til sebrafisk immobilisering, hovedsakelig på grunn av brukervennligheten. Faktisk, bare å legge 130 mg / L trikain til fiskemediene resulterer i bedøvelse i 10 min. Da det kan føre til utviklingsfeil og påvirke hjertefysiologi20,22, anbefaler vi at du bare bruker trikain for korte eksperimenter (mindre enn 30 min). For lengre avbildning, α-bungarotoxin mRNA injeksjoner på en- eller to-cellers stadium lammer fisk opptil 3 dager etter befruktning (dpf) uten å påvirke kardiovaskulær utvikling eller fysiologi22.

Velge de riktige FEP-rørene
FEP-rør er tilgjengelige i forskjellige diametre og tykkelser. Til bilde 0-5 dpf fisk er 0,8 mm en god indre diameter; Velg enten tykk vegg 0,8 x 1,6 mm rør eller tynn vegg 0,8 x 1,2 mm rør. Vi anbefaler tynnveggede rør; Tykkere vegger gir imidlertid økt stabilitet og stivhet, noe som kan være viktig hvis prøvekammeret har flytende medier som kan forstyrre og flytte et tynt rør. For større prøver kan du bruke 1,6 x 2,4 mm og 2 x 3 mm.

Temperatur- og gassutveksling
Et viktig aspekt ved sebrafiskembryoens velvære er temperatur. Ideelt sett, hold fisken ved 28,5 °C mens du ser for deg, da miljøets temperatur påvirker utvikling og hjertefrekvens34.

Vår erfaring er at oksygenutveksling gjennom den 2% agarose pluggen bare opprettholder en stabil hjertefrekvens til 3-4 dpf. Derfor sikrer kutting av hull i røret oksygendiffusjon. Det kan også være nødvendig for legemiddellevering til prøven om ønskelig.

Suspensjon av hjerterytme.
De raske oppkjøpshastighetene til passende utstyrte lysarkmikroskoper tillater opptak av det bankende hjertet in vivo. Men for å skaffe seg en uforstyrret z-stabel, kan man bremse eller stoppe hjertet. Å stoppe hjertet fører imidlertid til hjertemuskelavslapping og kan føre til at hjertet kollapser6. Hjerterytme suspensjon kan gjøres ved hjelp av morpholinos, lave temperaturer, en hemmer av muskelkontraksjon eller optogenetikk. Disse metodene har hver sine ulemper og må vurderes nøye for hvert eksperiment.

Injeksjonen av 4 ng stille hjerte (sih) morpholino på ett cellestadium kan stoppe hjerterytmen ved å målrette genet tnnt2a avgjørende for sarcomere formasjon35. sih sebrafisk har ikke hjerteslag og overlever bare til 7 dpf, når embryoene begynner å stole på sirkulerende blod for oksygenering. Ettersom hjertemorfogenese drives av både genetiske og biomekaniske krefter36, presenterer disse fiskene hjertemisdannelser rundt 3 dpf.

Ettersom strømmen av Ca2+ er temperaturfølsom, påvirker temperaturen hjertefrekvensen i embryonal sebrafisk21. Følgelig reduserer senking av temperaturen i bildekammeret hjerterytmen. Stopp av hjerterytmen krever temperaturer under 15 °C. Siden sebrafisk vanligvis holdes ved 28,5 °C, kan slike lave temperaturer bare opprettholdes i korte perioder (mindre enn 10 min).

Legemidler som kjemiske hemmere av muskelsammentrekninger, 2,3-Bu-tanedione 2-monoksim (BDM), kan legges til sebrafiskmediet (50 nM37,38) for å suspendere hjerterytmen midlertidig. BDM er praktisk å bruke da det stopper hjertekontraksjon på under 15 minutter og kan vaskes bort for å gjenopprette hjertefunksjonen. Men ettersom BDM endrer hjertevirkningspotensialet, må det brukes med forsiktighet37.

Til slutt kan hjertet av transgen sebrafisk som uttrykker lysporterte ionkanaler eller pumper som channelrhodopsin eller halorhodopsin i myokardiet, manipuleres og stoppes ved å belyse pacemakeren ved tilsigskanalen med lys39,7,40,41,9.

Utsikt
De presenterte optimaliserte verktøyene og løsningene for å studere sebrafiskhjertet in vivo tillater langsiktig, skånsom avbildning av ultrarask hjertedynamikk. Prøveinnbyggingen kan tilpasses ulike bildemodaliteter, for eksempel konfokal mikroskopi, tofotonmikroskopi eller optisk projeksjonstomografi (OPT). Lysarkmikroskopi er imidlertid sannsynligvis den foretrukne teknikken som tilbyr optisk seksjonering med en hastighet som er tilstrekkelig til å fange hjertets dynamikk. Mens denne protokollen fokuserer på sebrafisk embryonal hjerteavbildning, tror vi at den også kan brukes på ulike andre prøver og eksperimenter. Det vil være interessant å se i fremtiden om lignende innebyggings- og bildeteknikker også kan brukes på senere stadier under utvikling når hjertet er mer skjult og larven mindre gjennomsiktig.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Madelyn Neufeld for illustrasjonen i figur 2h. Dette arbeidet ble støttet av Max Planck Society, Morgridge Institute for Research, Chan Zuckerberg Initiative og Human Frontier Science Program (HFSP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5mL Eppendorf Eppendorf 22364111 To carry embedded samples
15mL Falcon tubes Falcon 352095 To carry embedded samples
50mL centrifuge tubes Falcon 352070 50ml tubes for sonication step, and storing cleaned, straightened FEP tubes
50mL syringe BD 309654 50ml syringe for FEP  cleaning
Agarose, low gelling temperature Sigma Aldrich 39346-81-1 To make plug
Blunt Tip Needles, 21 gauge VWR 89500-304 Blunt end needle for 0.8 inner diameter FEP tube
Borosilicate glass tube McMaster-Carr 8729K33 Tubing for FEP tube straightening 9.5mm outer diameter, 5.6 inner diameter, 30cm long, other sizes available
Borosilicate glass tube McMaster-Carr 8729K31 Tubing for FEP tube straightening 6.35mm outer diameter, 4mm inner diameter, 30cm long, other sizes available
Conventional needles, 21 Gauge BD 305165 Conventional needle for 0.8 inner diameter FEP tube
Disposable glass pipette Grainger 52NK56 To transfer fish, use with pipette pump
E3 medium for zebrafish embryos
Ethanol Sigma Aldrich 64-17-5 Ethanol for FEP cleaning
FEP tube, 0.8 / 1.2 mm ProLiquid 2001048 FEP tube with thin wall, other sizes available
FEP tube, 0.8 / 1.6 mm Bola S1815-04 FEP tube with thick wall, other sizes available
FEP tube, 2/3mm BGB 211581 Large FEP tube with thick wall, other sizes available
Hot Hand Rubber Mitt Cole-Parmer 691000 To carry hot equipment after autoclaving
Omnifix 1mL Syringes B Braun 9161406V 1ml syringe for embedding
Petri dish, small Dot Scientific PD-94050 To make agarose plug
Pipette pumps Argos Technologies 04395-05 To transfer fish, use with disposable glass pipette
PTU Sigma Aldrich 103-85-5 Also known as:
N-Phenylthiourea, 1-Phenyl-2-thiourea, Phenylthiocarbamide
Razor blades Azpack 11904325 To cut FEP tubes
Sodium Hydroxide Dot Scientific DSS24000 NaOH for FEP cleaning
Tricaine Sigma Aldrich E10521 Also known as: MS-222,
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, Tricaine

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoebe, R. A., et al. Controlled light-exposure microscopy reduces photobleaching and phototoxicity in fluorescence live-cell imaging. Nature Biotechnology. 25 (2), 249-253 (2007).
  2. Jenielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. Journal of Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
  3. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
  4. Reynaud, E. G., Kržič, U., Greger, K., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy: more dimensions, more photons, and less photodamage. Human Frontier Science Program Journal. 2 (5), 266-275 (2008).
  5. Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 566-572 (2011).
  6. Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nat Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
  7. Arrenberg, A. B., Stainier, D. Y., Baier, H., Huisken, J. Optogenetic control of cardiac function. Science. 330 (6006), 971-974 (2010).
  8. Trivedi, V., et al. Dynamic structure and protein expression of the live embryonic heart captured by 2-photon light sheet microscopy and retrospective registration. Biomed Optics Express. 6 (6), 2056-2066 (2015).
  9. Weber, M., et al. Cell-accurate optical mapping across the entire developing heart. eLife. Yelon, D. 6, 28307 (2017).
  10. Weber, M., Huisken, J. In vivo imaging of cardiac development and function in zebrafish using light sheet microscopy. Swiss Medical Weekly. 145, 14227 (2015).
  11. Fei, P., et al. Cardiac light-sheet fluorescent microscopy for multi-scale and rapid imaging of architecture and function. Science Reports. 6 (1), 1-12 (2016).
  12. Felker, A., et al. Continuous addition of progenitors forms the cardiac ventricle in zebrafish. Nature Communication. 9 (1), 1-14 (2018).
  13. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), New York, NY. 1007-1009 (2004).
  14. Keller, P. J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. Life sciences require the third dimension. Current Opinion in Cell Biology. 18 (1), 117-124 (2006).
  15. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
  16. Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer mounting for long-term light sheet microscopy of zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (84), e51119 (2014).
  17. Berndt, F., Shah, G., Power, R. M., Brugués, J., Huisken, J. Dynamic and non-contact 3D sample rotation for microscopy. Nature Communications. 9 (1), 1-7 (2018).
  18. Daetwyler, S., Günther, U., Modes, C. D., Harrington, K., Huisken, J. Multi-sample SPIM image acquisition, processing. and analysis of vascular growth in zebrafish. Development. , 173757 (2019).
  19. Keomanee-Dizon, K., Fraser, S. E., Truong, T. V. A versatile, multi-laser twin-microscope system for light-sheet imaging. Review of Scientific Instruments. 91 (5), 053703 (2020).
  20. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), Cambridge, England. 3242-3247 (2012).
  21. Gierten, J., et al. Automated high-throughput heartbeat quantification in medaka and zebrafish embryos under physiological conditions. Science Reports. 10 (1), 1-12 (2020).
  22. Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved long-term imaging of embryos with genetically encoded α-bungarotoxin. PLOS ONE. 10 (8), 0134005-0134015 (2015).
  23. Taylor, J. M., et al. Adaptive prospective optical gating enables day-long 3D time-lapse imaging of the beating embryonic zebrafish heart. Nature Communication. 10 (1), 1-15 (2019).
  24. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nature Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
  25. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
  26. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
  27. Cold Spring Harbor. E3 medium (for zebrafish embryos). Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 66449 (2011).
  28. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  31. FluoRender. , Available from: www.fluorender.com (2020).
  32. Jin, S. -W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. -N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132 (23), 5199-5209 (2005).
  33. Chi, N. C., et al. Foxn4 directly regulates tbx2b expression and atrioventricular canal formation. Genes and Development. 22 (6), 734-739 (2008).
  34. Scott, G. R., Johnston, I. A. Temperature during embryonic development has persistent effects on thermal acclimation capacity in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 14247-14252 (2012).
  35. Sehnert, A. J., et al. Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility. Nature Genetics. 31 (1), 106-110 (2002).
  36. Sidhwani, P., Yelon, D. Fluid forces shape the embryonic heart: Insights from zebrafish. Current Topics in Developmental Biology. Wellik, D. M. 132, Academic Press. Chapter 11 395-416 (2019).
  37. Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cell Physiology and Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
  38. Chow, R. W. -Y., Lamperti, P., Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. following endocardial tissue movements via cell photoconversion in the zebrafish embryo. Journal of Visualized Experiments. (132), e57290 (2018).
  39. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proccedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  40. Knollmann, B. C. Pacing lightly: optogenetics gets to the heart. Nature Methods. 7 (11), 889-891 (2010).
  41. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7 (11), 897-900 (2010).

Tags

Biologi utgave 174
Lysarkmikroskopi av rask hjertedynamikk i sebrafiskembryoer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schlaeppi, A., Graves, A., Weber,… More

Schlaeppi, A., Graves, A., Weber, M., Huisken, J. Light Sheet Microscopy of Fast Cardiac Dynamics in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (174), e62741, doi:10.3791/62741 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter