Summary
Vi beskriver optimerade verktyg för att studera zebrafisk hjärtat in vivo med ljus ark fluorescensmikroskopi. Specifikt föreslår vi ljusa hjärt transgena linjer och presenterar nya milda inbäddning och immobilisering tekniker som undviker utvecklingsmässiga och hjärtfel. En möjlig dataförvärvs- och analyspipeline anpassad till hjärtavbildning tillhandahålls också.
Abstract
Embryonal hjärtforskning har haft stor nytta av framsteg inom snabb in vivo ljus ark fluorescensmikroskopi (LSFM). I kombination med zebrafiskens snabba externa utveckling, dragbara genetik och genomskinlighet, Danio rerio, har LSFM levererat insikter om hjärtform och funktion vid hög rumslig och tidsmässig upplösning utan signifikant fototoxicitet eller fotobleaching. Avbildning av bultande hjärtan utmanar befintliga provberedning och mikroskopitekniker. Man måste behålla ett hälsosamt prov i ett trångt synfält och skaffa ultrasnabba bilder för att lösa hjärtslagen. Här beskriver vi optimerade verktyg och lösningar för att studera zebrafiskhjärtat in vivo. Vi visar tillämpningar av ljusa transgena linjer för märkning av hjärt beståndsdelar och presenterar nya mild inbäddning och immobilisering tekniker som undviker utvecklingsmässiga defekter och förändringar i hjärtfrekvens. Vi föreslår också en dataförvärvs- och analyspipeline anpassad till hjärtavbildning. Hela arbetsflödet som presenteras här fokuserar på zebrafisk embryonal hjärtavbildning men kan också tillämpas på olika andra prover och experiment.
Introduction
För att avslöja de komplexa händelserna och interaktionerna i det tidiga bultande hjärtat krävs in vivo-avbildning av hela organet. Med sin minimala fototoxicitet1,2,3, låg fotobleaching4 och hög hastighet har ljusplåtsmikroskopi utvecklats som det primära bildverktyget för embryonal och hjärtutveckling5,6. Det har gett insikter om hjärtform och funktion med hög rumslig och temporal upplösning7,8,9 och har gjort det möjligt för forskare att avbilda och spåra fluorescerande märkta delar av hjärtat i hög hastighet, studera hemodynamiska krafter och följa hjärtutvecklingen direkt inuti kroppen av att utveckla embryon6,10,11,12.
För att exakt och reproducerbart begränsa zebrafisken i synfältet finns det en mängd olika inbäddningsprotokoll för ljusplåt, på kort och lång sikt, samt enstaka eller flera prover13,14,15,16,17,18,19. Det vanligaste protokollet innebär trikain immobilisering och agarose montering inuti ett glas eller plaströr. Men eftersom hjärtfrekvensen kan ändras på grund av temperatur, bedövningsmedel och inbäddningsmaterial som används20,21,22, kräver zebrafisk hjärtavbildning specifika, milda protokoll för att säkerställa provhälsa6,8,11,12,20,21,22,23 . För kortvarig avbildning (upp till en timme) kan man bedöva fisken i 130 mg/L trikain och bädda in den i fluorerade etylenpropylenrör (FEP) med 0,1% agaroslösning och en plugg, som beskrivs i Weber et al. 201416. Men eftersom trikain kan leda till utvecklingsmässiga defekter20,22, måste olika protokoll användas för långsiktig avbildning.
Här beskriver vi en ny strategi för långsiktig hjärt imaging. Även om många ljusplåtsimplementeringar finns24 rekommenderar vi att du använder ett hängande prov i ett T-SPIM-mikroskop (en detektering och två belysningslinser i ett horisontellt plan med provet hängande vertikalt i det gemensamma fokuset). Detta ger den nödvändiga rörelse- och rotationsfriheten för den exakta provpositionering. Fisken immobiliseras genom att injicera 30 pg α-bungarotoxin mRNA på en- eller tvåcellsstadiet. α-bungarotoxin är ett ormgift som förlamar muskler utan att påverka kardiovaskulär utveckling eller fysiologi22. För exakt, distorsionsfri avbildning rekommenderar vi montering av fisk i rör av FEP, en polymer med ett brytningsindex som är nästan identiskt med vatten. Vi diskuterar hur man bäst förbereder FEP-rören genom att räta ut och rengöra dem före avbildning. Fisken monteras sedan i dessa rör, huvudet ner, i media, och botten av röret förseglas med en 2% agaroseplugg, på vilken fiskhuvuden vilar. Att skära hål i FEP-röret underlättar gasutbytet och säkerställer fisktillväxt. Den inbäddade fisken kan förvaras i media tills den monteras på en provhållare precis före avbildning. Vi föreslår också en dataförvärv och analys pipeline för reproducerbara höghastighets imaging. Vidare diskuterar vi användningen av cytoplasmic kontra membran markör transgena linjer för robust hjärtcell märkning, liksom olika alternativ för att stoppa hjärtat. Dessa monteringstekniker säkerställer provhälsa samtidigt som de gör det möjligt att begränsa hjärtat exakt och reproducerbart inom synfältet.
Protocol
Alla vuxna och embryon från zebrafisk (Danio rerio) hanterades i enlighet med protokoll som godkänts av UW-Madison Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Beredning av zebrafisk
- Hantera zebrafisk enligt fastställda protokoll25,26 och institutionella riktlinjer. Odla vuxen fisk av önskad transgen linje (se Diskussion). Samla embryona och förvara dem vid 28 °C i en Petriskål fylld med fiskmedium, t.ex. E327.
- Välj en metod för immobilisering (se Diskussion).
- Om du använder α-bungarotoxin mRNA för att immobilisera fisken, injicera 30 pg mRNA22 i äggulan på en- eller tvåcelliga stegembryon med hjälp av en borrglasnål monterad på en mikromanipulator och ansluten till en picoinjector28.
- Vid användning av trikain, gör 0,4% lagerlösning buffrad till pH 7,0-7,4 med 1 M Tris-bas och förvara vid -20 °C tills avbildningen.
- Förvara äggen i en E3-fylld Petri-skål vid 28 °C och överför äggen var 24:e timme till en ny skål med färsk E3 tills de avbildas.
- För att förhindra pigmentbildning, om zebrafiskbakgrunden inte är albino, överför fisk vid 24 h efter befruktning (hpf) till en ny E3-maträtt med 0,2 mM tyrosinashämmare 1- fenyl 2-thiourea (se Diskussion).
2. Beredning av FEP-rör
Bild 1: Rengöring och uträtning av FEP-rör. b) FEP-rör före uträtning. c) FEP-rör i autoklavsäkra slangar av glas och stål. d) Spolning av FEP-rören efter uträtning och nedkylning. e) FEP-röret skärs till storleken på ett centrifugrör för ultraljudsbehandling. f) Spolning av FEP-rör efter ultraljudsbehandling. g) Förvaring av de rengjorda och uträtade FEP-rören i ett centrifugrör. h) Kapning av FEP-röret före avbildning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
- Räta ut FEP-rören (figur 1a b) genom att placera dem i en autoklavsäker slang av glas eller stål (figur 1c) med rätt innerdiameter för att passa FEP-rör, vanligtvis 1,6 eller 2,4 mm, och autoklav till 180 °C för 2 timmar. Låt rören svalna i rumstemperatur i minst 5 timmar. Ta sedan bort från uträtningsrören.
OBS: Använd handskar när du manipulerar rören och arbeta med 50 cm slangar åt gången. - Rengör FEP-rören.
OBS: Sprutor med trubbig nålspets i den inre FEP-rörstorleken rekommenderas för säkerhet, men en vanlig nål fungerar.- Spola rören med 1 M NaOH två gånger med en 50 ml spruta (bild 1d).
- Skär FEP-rören till storleken av ett 50 ml centrifugrör med ett rakblad (figur 1e), placera skurna rör i 0,5 M NaOH fyllda centrifugrör och ultraljud dem i 10 min.
- Spola FEP-rören med dubbeldestillerad H2O och upprepa sedan spolningen med 70 % etanol (figur 1f).
- Överför rör till 70% etanol och ultraljud i 10 min.
- Spola rören med dubbeldestillerad H2O och förvara dem i centrifugrör i dubbeldestillerad H2O (figur 1g).
3. Beredning av 2% agarosrätt
- Lös upp lågsmältpunktsadagepulver i E3 i en glaskolv. Värm lösningen i en mikrovågsugn och rör om den var 20: e s tills allt pulver är upplöst.
- Häll agaros i ett glas eller plast Petri-skål för att göra en 1-2 mm kappa. Vänta tills agaroset har stelnat.
- För att lagra, häll försiktigt E3 på toppen av agaren för att förhindra torkning. Linda in i paraffinfilm och håll vid 4 °C.
4. Förberedelse av inbäddningsmedier
- Förbered tillräckligt med E3 för att fylla provkammaren.
OBS: Undvik att använda metylblått om mediet är i kontakt med objektiv. - Om du använder trikain, tina lagerlösningen och tillsätt 0,02% trikain till E3.
5. Provmontering
Figur 2: Embryomontering i FEP-rör. a) Sövd pigmentfri fisk i monteringsmedier. b) En spruta med trubbig ändnål och FEP-rör fastsatt. c) När media och fisk har tagits upp i FEP-röret, skär röret vid nålens kant. d) Doppa det skurna röret i en skål belagd med 2% agaros för att täppa till änden. e) En zebrafisk i ett pluggat FEP-rör. f) Skär försiktigt FEP-röret vid 30° för att skapa gasväxlingshål. g) FEP-rör med fyra hål över en inbäddad zebrafisk. h) System för en zebrafisk inbäddad i ett FEP-rör. Hål och agarplugg indikeras. i) Flera inbäddade zebrafiskar redo för avbildning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
- Överför fisk till inbäddningsmedium (figur 2a) med en engångspipetter i glas . Om du använder trikain, överför fisk till Petri-skål fylld med trikainhaltig E3, 10 min före avbildning. I båda fallen, visa under ett stereomikroskop för att verifiera att fisken slutade röra sig och att hjärtat slår med samma hastighet jämfört med kontrollen.
- Skär FEP-röret till den ideala längden med ett rakblad (bild 1h).
OBS: Längden ska justeras till mikroskopets provhållare. den typiska längden är ca 3 cm. - Förbered en spruta med en trubbig ändpadula. Fyll sprutan med luft, montera sedan FEP-röret på nålen och spola försiktigt ut eventuellt återstående vatten genom att tömma sprutan (figur 2b).
OBS: Undvik att göra bubblor genom att långsamt spola ut luften. - Med det spruta monterade FEP-röret, ta först upp media för att fylla FEP-röret och ta sedan upp ett embryohuvud ner. Håll fiskhuvudet så nära röränden som möjligt. Undvik att göra några bubblor; Om det finns en bubbla, kassera provet.
- Skär försiktigt FEP-röret vid kanten av den trubbiga kanylen eller nålen med ett rakblad (bild 2c).
- Kassera eventuell vätska på toppen av den agarbelagda skålen. Doppa FEP-röret rakt in i agaren (bild 2d). Rotera röret och ta ut det för att lossa kontakten från agarosebädden.
- Kontrollera att agarpluggen finns i slutet av röret under ett stereoskop (bild 2e).
- För långsiktig avbildning, skär 3-5 hål i FEP-röret i varje kardinalriktning, minst 5 mm över fiskens ände.
- Använd ett rakblad vinkelrätt mot rörets axel under ett stereoskop för att göra ett 30° snitt i FEP-röret tills det når monteringsmediet (bild 2f).
- Gör ett andra snitt vid 180° för att skapa ett hål (figur 2g,h).
- Överför monterat embryohuvud ner i ett 1,5 ml mikrocentrifugerör med inbäddningsmedium tills det är klart att avbildas (figur 2i).
6. Provpositionering
Bild 3: Provkammare a) FEP-rör monterat på en provhållare. b) Provkammaren med etapper och mål. c) Ovanifrån av den mediefyllda provkammaren, med belysnings- och detektionsmål i en T-SPIM-konfiguration. d) Provhållare monterad på mikroskopet, med provet i kammaren. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Embryopositionering för hjärtavbildning. a) 24 hpf Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry) zebrafisk med felriktade ögon. a') Samma fisk, med ögonen i linje. b) Samma fisk roterade -100 ° och b') -50 ° för optimal hjärtavbildning. c) 48 hpf zebrafisk med felriktade ögon. c') Samma fisk, med ögonen i linje. d) Samma fisk roterad med 30° för optimal hjärtavbildning. Svarta pilar pekar mot hjärtat. Skalstreck 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Montera FEP-röret i provhållaren (figur 3a) i mikroskopet och fyll bildkammaren med inbäddningsmedium (figur 3b,c). Placera sedan provhållaren på scenen med provet doppat i kammaren (figur 3d).
- Kontrollera provets hälsa. Visuellt bedöma hjärtfrekvensen för att utvärdera övergripande fiskhälsa, eftersom specifik hjärtfrekvens är steg- och temperaturberoende, genom att jämföra med icke-monterad kontrollfisk. Om hjärtslagen är för långsamma, kassera fisken.
OBS: Säkerställ skonsam hantering av embryon, noggrann överföring till inbäddning av media, avbildning omedelbart efter inbäddning, undvika snabba temperaturförändringar, undvika trikain och sänka exponeringstiden för trikain. - För reproducerbar avbildning ska du alltid använda samma provposition. Vi rekommenderar att du justerar ögonen och bilden i en vinkel.
- Rotera fisken så att båda ögonen (figur 4a,c) är i fokalplanet (figur 4a'c')
- Från detta läge roterar du fisken ytterligare cirka 50 °-100 ° medurs för 24 hkf-avbildning (figur 4b, b') och cirka 20°-30° moturs för 48 hkf-avbildning (figur 4d).
OBS: Det tidiga hjärtat, före 30 hkf, kan vara svårt att avbilda på grund av dess dolda position (bild 4b).
7. Bildförvärv
- Välj den belysningssida som ger bästa bildkvalitet och anpassa lasereffekten till varje fisk.
OBS: Registrera lasereffekten som används för efterföljande bildanalys. - Vid varje z-plan registrerar du 4-5 hjärtslag vid 300 bilder per sekund (fps) eller mer.
ANM.: Synfältet kan beskäras för att öka förvärvshastigheten. Till exempel, vid 48 hpf slår zebrafiskhjärtat två till tre gånger per sekund, därför krävs mellan 300 och 600 bilder vid 300 och 600 bilder för att förvärva fyra till sex hjärtslag. - För att spela in det bultande hjärtat, flytta provet stegvis genom ljusbladet. Använd ett z-avstånd på 1-2 μm, som täcker hela hjärtats djup.
8. Bildbehandling
- Synkronisera inspelad film för att rekonstruera ett 4D-hjärta (x,y,z, tid) med hjälp av ett Fiji-plugin (Bild J229,30) som tidigare beskrivits6.
- För att utforska data och generera filmer av det renderade zebrafiskhjärtat laddar du 4D-filen (x, y, z, tid) i en 3D-renderingsprogramvara.
Representative Results
Figur 5: Zebrafiskhjärtat på 48 hkf. a) Fortfarande av en z-ram, främre-ventral vy av 48 hpf Tg (kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:lck-EGFP) zebrafisk, avbildad med LSFM, b) 3D-rekonstruktion av filmstaplar, klippt vy genom atriumet. c) Montage av fyra ramar över ett helt hjärtslag vid ett z-plan. Cirkeldiagram visar tiden under hjärtslag. Skalstreck 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Vi har registrerat 48 hpf slå hjärtat av Tg (kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:lck-EGFP) zebrafisk enligt protokollet som beskrivs ovan (figur 5). Ett 488 nm och ett 561 nm laserljusblad belyste provet samtidigt. Den avgivna fluorescens upptäcktes vinkelrätt med hjälp av en 16x/0,8 W objektiv och en vetenskaplig metalloxid halvledare (sCMOS) kamera.
Vid 48 hkf har hjärtat just genomgått looping och har två kammare, ventrikeln och atriumet men har ännu inte utvecklat ventiler. I våra filmer är de olika hjärtstrukturerna som inflöde, ventrikel, atrioventricular canal (AVC), atrium och utflödesspår lätt urskiljbara (figur 5a,b). Dessa data visar den exakta misshandeln och avslöjar komplexainteraktioner mellan hjärtats två celllager: myokardiet, ett encells muskellager som drar ihop sig och genererarforce (figur 5c, röd) och endokardiet, ett enda cellskikt som förbinder hjärtat med vaskulaturen (figur 5c, cyan).
Hjärtslag återuppbyggnaden i x,y,z (3D) + tid (4D) + färg (5D) utfördes enligt Mickoleit et al.6. Rekonstruktionen är baserad på två hypoteser: hjärtats rörelse är repetitiv, och data bör förvärvas med ett litet z-steg. Utdata är ett rekonstruerat enda hjärtslag i 5D, som mäter 30 GB till 80 GB per hjärtslag. För att återge data använde vi det kostnadsfria verktyget FluoRender med öppen källkod för djupgående rendering31 eftersom det var utformat för att hantera flerdimensionella datamängder och enkelt återger 5D-filmer av både celllager och enskilda lager (figur 5b).
Discussion
Transgena linjer för att avbilda hjärtat
Figur 6: Jämförelse av cytoplasmiska och membranmarkörer zebrafisktransgena linjer. Främre-ventral vy av 48 hpf zebrafish hjärtan avbildas med LSFM. Vita pilar indikerar strukturer som endast är synliga med en membranmarkör transgen linje. a) Tg(kdrl:EGFP)32 signal i cyan i hjärtat och a') i ventrikeln. b) Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:dsRed)33 signal i rött i hjärtat och b') i ventrikeln. c,c') sammanslagning av både Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:dsRed) och Tg(kdrl:EGFP) signal. Skalstreck 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Att avbilda zebrafiskhjärtat kräver exakt hjärtcellsmärkning. Medan myokardtjockleken är relativt konstant i hela cellerna, är endokardceller tjocka runt kärnan men har tunna membranutskjutningar, i vissa regioner tunnare än 2 μm. Cytoplasmiska transgena linjer som Tg(kdrl:EGFP)32 märker effektivt regionerna runt endokardkärnor, men längre bort kanske den tunna cytoplasman inte avger tillräckligt med fotoner för att upptäckas med så korta exponeringstider, vilket leder till konstgjorda hål i data (figur 6a). Däremot kan membranmarkörtransgena linjer som Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry)33 effektivt märka endokardiet och avslöja mer detaljer (figur 6b,c). För varje experiment väljer du noggrant den lämpligaste transgena linjen.
Zebrafisk immobilisering
Valet av immobiliseringsteknik beror på experimentets längd och fiskens ålder att avbilda. Trikain har ofta använts för zebrafisk immobilisering, främst på grund av dess användarvänlighet. Faktum är att bara lägga till 130 mg/l tricaine till fiskmedierna resulterar i deras sövdhetisering i 10 min. Eftersom det kan leda till utvecklingsdefekter och påverka hjärtfysiologi20,22 rekommenderar vi att du endast använder trikain för korta experiment (mindre än 30 min). För längre avbildning förlamar α-bungarotoxin mRNA-injektioner vid en- eller tvåcellsstadiet fisken upp till 3 dagar efter befruktning (dpf) utan att påverka kardiovaskulär utveckling eller fysiologi22.
Välja rätt FEP-rör
FEP-rör finns i olika diametrar och tjocklekar. För att avbilda 0-5 dpf fisk är 0,8 mm en bra innerdiameter; välj antingen tjocka väggrör 0,8 x 1,6 mm eller tunna väggrör 0,8 x 1,2 mm. Vi rekommenderar tunnväggiga rör; Tjockare väggar ger dock ökad stabilitet och styvhet, vilket kan vara viktigt om provkammaren har flödande medier som kan störa och flytta ett tunt rör. För större prover kan 1,6 x 2,4 mm och 2 x 3 mm användas.
Temperatur- och gasbyten
En viktig aspekt av zebrafiskeembryons välbefinnande är temperaturen. Helst, håll fisken på 28,5 °C vid avbildning, eftersom miljöns temperatur påverkar utvecklingen och hjärtfrekvensen34.
Enligt vår erfarenhet upprätthåller syreutbytet genom 2% agarosepluggen endast en stabil hjärtfrekvens tills 3-4 dpf. Därför säkerställer skärhål i röret syrediffusion. Det kan också vara nödvändigt för läkemedelsleverans till provet om så önskas.
Avstängning av hjärtslag.
De snabba förvärvshastigheterna för lämpligt utrustade ljusplåtsmikroskop gör det möjligt att registrera det bultande hjärtat in vivo. Men för att förvärva en ostörd z-stack kan man sakta ner eller stoppa hjärtat. Men att stoppa hjärtat leder till hjärtmuskelavslappning och kan leda till att hjärtat kollapsar6. Hjärtslag suspension kan göras genom att använda morfininer, låga temperaturer, en hämmare av muskelkontraktion eller optogenetik. Dessa metoder har var och en sina nackdelar och måste noggrant utvärderas för varje experiment.
Injektionen av 4 ng tyst hjärta (sih) morpholino i ett cellsteg kan stoppa hjärtslagen genom att rikta in sig på genen tnnt2a avgörande för sarkombildning35. sih zebrafish har inte hjärtslag och överlever bara till 7 dpf, när embryona börjar förlita sig på cirkulerande blod för syresättning. Eftersom hjärtat morphogenesis drivs av både genetiska och biomekaniska krafter36, dessa fiskar presenterar hjärtat missbildningar runt 3 dpf.
Eftersom flödet av Ca2+ är temperaturkänsligt påverkar temperaturen hjärtfrekvensen hos embryonala zebrafiskar21. Följaktligen saktar sänkningen av temperaturen i bildkammaren ner hjärtslagen. För att stoppa hjärtslagen krävs temperaturer under 15 °C. Eftersom zebrafisk vanligtvis hålls vid 28,5 °C kan sådana låga temperaturer endast bibehållas under korta perioder (mindre än 10 min).
Läkemedel som kemiska hämmare av muskelsammandragningar, 2,3-Bu-tanedione 2-monoxime (BDM), kan läggas till zebrafiskmediet (50 nM37,38) för att tillfälligt avbryta hjärtslagen. BDM är bekvämt att använda eftersom det stoppar hjärtkontraktion på under 15 minuter och kan tvättas bort för att återställa hjärtfunktionen. Men eftersom BDM ändrar hjärtverkanspotentialen måste den användas med en varning37.
Slutligen kan hjärtat av transgen zebrafisk som uttrycker ljusportade jonkanaler eller pumpar som channelrhodopsin eller halorhodopsin i deras myokardi manipuleras och stoppas genom att belysa pacemakern vid inflödessystemet med ljus39,7,40,41,9.
Framtidsutsikt
De presenterade optimerade verktygen och lösningarna för att studera zebrafiskhjärtat in vivo möjliggör långsiktig, skonsam avbildning av ultrasnabb hjärtdynamik. Provinbäddningen kan anpassas för att passa olika bildframställningsmetoder, såsom konfokal mikroskopi, tvåfotonmikroskopi eller optisk projektionstomografi (OPT). Ljusplåtmikroskopi är dock sannolikt den föredragna tekniken som erbjuder optisk sektionering med en hastighet som är tillräcklig för att fånga hjärtats dynamik. Även om detta protokoll fokuserar på zebrafisk embryonal hjärtbild, tror vi att det också kan tillämpas på olika andra prover och experiment. Det kommer att bli intressant att se i framtiden om liknande inbäddnings- och bildteknik också kan användas i senare skeden under utvecklingen när hjärtat är mer dolt och larven mindre genomskinlig.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Madelyn Neufeld för illustrationen i figur 2h. Detta arbete stöddes av Max Planck Society, Morgridge Institute for Research, Chan Zuckerberg Initiative och Human Frontier Science Program (HFSP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5mL Eppendorf | Eppendorf | 22364111 | To carry embedded samples |
| 15mL Falcon tubes | Falcon | 352095 | To carry embedded samples |
| 50mL centrifuge tubes | Falcon | 352070 | 50ml tubes for sonication step, and storing cleaned, straightened FEP tubes |
| 50mL syringe | BD | 309654 | 50ml syringe for FEP cleaning |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma Aldrich | 39346-81-1 | To make plug |
| Blunt Tip Needles, 21 gauge | VWR | 89500-304 | Blunt end needle for 0.8 inner diameter FEP tube |
| Borosilicate glass tube | McMaster-Carr | 8729K33 | Tubing for FEP tube straightening 9.5mm outer diameter, 5.6 inner diameter, 30cm long, other sizes available |
| Borosilicate glass tube | McMaster-Carr | 8729K31 | Tubing for FEP tube straightening 6.35mm outer diameter, 4mm inner diameter, 30cm long, other sizes available |
| Conventional needles, 21 Gauge | BD | 305165 | Conventional needle for 0.8 inner diameter FEP tube |
| Disposable glass pipette | Grainger | 52NK56 | To transfer fish, use with pipette pump |
| E3 medium for zebrafish embryos | |||
| Ethanol | Sigma Aldrich | 64-17-5 | Ethanol for FEP cleaning |
| FEP tube, 0.8 / 1.2 mm | ProLiquid | 2001048 | FEP tube with thin wall, other sizes available |
| FEP tube, 0.8 / 1.6 mm | Bola | S1815-04 | FEP tube with thick wall, other sizes available |
| FEP tube, 2/3mm | BGB | 211581 | Large FEP tube with thick wall, other sizes available |
| Hot Hand Rubber Mitt | Cole-Parmer | 691000 | To carry hot equipment after autoclaving |
| Omnifix 1mL Syringes | B Braun | 9161406V | 1ml syringe for embedding |
| Petri dish, small | Dot Scientific | PD-94050 | To make agarose plug |
| Pipette pumps | Argos Technologies | 04395-05 | To transfer fish, use with disposable glass pipette |
| PTU | Sigma Aldrich | 103-85-5 | Also known as: N-Phenylthiourea, 1-Phenyl-2-thiourea, Phenylthiocarbamide |
| Razor blades | Azpack | 11904325 | To cut FEP tubes |
| Sodium Hydroxide | Dot Scientific | DSS24000 | NaOH for FEP cleaning |
| Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | Also known as: MS-222, Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, Tricaine |
References
- Hoebe, R. A., et al. Controlled light-exposure microscopy reduces photobleaching and phototoxicity in fluorescence live-cell imaging. Nature Biotechnology. 25 (2), 249-253 (2007).
- Jenielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. Journal of Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
- Reynaud, E. G., Kržič, U., Greger, K., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy: more dimensions, more photons, and less photodamage. Human Frontier Science Program Journal. 2 (5), 266-275 (2008).
- Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 566-572 (2011).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nat Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
- Arrenberg, A. B., Stainier, D. Y., Baier, H., Huisken, J. Optogenetic control of cardiac function. Science. 330 (6006), 971-974 (2010).
- Trivedi, V., et al. Dynamic structure and protein expression of the live embryonic heart captured by 2-photon light sheet microscopy and retrospective registration. Biomed Optics Express. 6 (6), 2056-2066 (2015).
- Weber, M., et al. Cell-accurate optical mapping across the entire developing heart. eLife. Yelon, D. 6, 28307 (2017).
- Weber, M., Huisken, J. In vivo imaging of cardiac development and function in zebrafish using light sheet microscopy. Swiss Medical Weekly. 145, 14227 (2015).
- Fei, P., et al. Cardiac light-sheet fluorescent microscopy for multi-scale and rapid imaging of architecture and function. Science Reports. 6 (1), 1-12 (2016).
- Felker, A., et al. Continuous addition of progenitors forms the cardiac ventricle in zebrafish. Nature Communication. 9 (1), 1-14 (2018).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), New York, NY. 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. Life sciences require the third dimension. Current Opinion in Cell Biology. 18 (1), 117-124 (2006).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
- Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer mounting for long-term light sheet microscopy of zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (84), e51119 (2014).
- Berndt, F., Shah, G., Power, R. M., Brugués, J., Huisken, J. Dynamic and non-contact 3D sample rotation for microscopy. Nature Communications. 9 (1), 1-7 (2018).
- Daetwyler, S., Günther, U., Modes, C. D., Harrington, K., Huisken, J. Multi-sample SPIM image acquisition, processing. and analysis of vascular growth in zebrafish. Development. , 173757 (2019).
- Keomanee-Dizon, K., Fraser, S. E., Truong, T. V. A versatile, multi-laser twin-microscope system for light-sheet imaging. Review of Scientific Instruments. 91 (5), 053703 (2020).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), Cambridge, England. 3242-3247 (2012).
- Gierten, J., et al. Automated high-throughput heartbeat quantification in medaka and zebrafish embryos under physiological conditions. Science Reports. 10 (1), 1-12 (2020).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved long-term imaging of embryos with genetically encoded α-bungarotoxin. PLOS ONE. 10 (8), 0134005-0134015 (2015).
- Taylor, J. M., et al. Adaptive prospective optical gating enables day-long 3D time-lapse imaging of the beating embryonic zebrafish heart. Nature Communication. 10 (1), 1-15 (2019).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nature Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Cold Spring Harbor. E3 medium (for zebrafish embryos). Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 66449 (2011).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- FluoRender. , Available from: www.fluorender.com (2020).
- Jin, S. -W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. -N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132 (23), 5199-5209 (2005).
- Chi, N. C., et al. Foxn4 directly regulates tbx2b expression and atrioventricular canal formation. Genes and Development. 22 (6), 734-739 (2008).
- Scott, G. R., Johnston, I. A. Temperature during embryonic development has persistent effects on thermal acclimation capacity in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 14247-14252 (2012).
- Sehnert, A. J., et al. Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility. Nature Genetics. 31 (1), 106-110 (2002).
- Sidhwani, P., Yelon, D. Fluid forces shape the embryonic heart: Insights from zebrafish. Current Topics in Developmental Biology. Wellik, D. M. 132, Academic Press. Chapter 11 395-416 (2019).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cell Physiology and Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
- Chow, R. W. -Y., Lamperti, P., Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. following endocardial tissue movements via cell photoconversion in the zebrafish embryo. Journal of Visualized Experiments. (132), e57290 (2018).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proccedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Knollmann, B. C. Pacing lightly: optogenetics gets to the heart. Nature Methods. 7 (11), 889-891 (2010).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7 (11), 897-900 (2010).
