Longitudinale intravitale beeldvorming door heldere siliconenvensters

Summary

Hier wordt een benadering gepresenteerd voor intravitale beeldvorming op lange termijn met behulp van optisch heldere, siliconen vensters die rechtstreeks op het weefsel / orgaan van belang en de huid kunnen worden gelijmd. Deze ramen zijn goedkoper en veelzijdiger dan andere die momenteel in het veld worden gebruikt, en de chirurgische inbrenging veroorzaakt beperkte ontsteking en leed voor de dieren.

Abstract

Intravitale microscopie (IVM) maakt visualisatie van celbeweging, deling en dood mogelijk bij eencellige resolutie. IVM via chirurgisch ingebrachte beeldvormingsvensters is bijzonder krachtig omdat het longitudinale observatie van hetzelfde weefsel gedurende dagen tot weken mogelijk maakt. Typische beeldvormingsvensters bestaan uit een glazen afdekplaat in een biocompatibel metalen frame dat aan de huid van de muis is gehecht. Deze vensters kunnen de vrije beweging van de muizen verstoren, een sterke ontstekingsreactie uitlokken en falen als gevolg van gebroken glas of gescheurde hechtingen, die allemaal euthanasie kunnen vereisen. Om deze problemen aan te pakken, werden vensters voor beeldvorming van buikorganen en borstklieren op lange termijn ontwikkeld uit een dunne film van polydimethylsiloxaan (PDMS), een optisch helder siliconenpolymeer dat eerder werd gebruikt voor craniale beeldvormingsvensters. Deze vensters kunnen rechtstreeks op de weefsels worden gelijmd, waardoor de tijd die nodig is voor het inbrengen wordt verkort. PDMS is flexibel en draagt bij aan de duurzaamheid bij muizen in de loop van de tijd - tot 35 dagen zijn getest. Longitudinale beeldvorming is beeldvorming van hetzelfde weefselgebied tijdens afzonderlijke sessies. Een roestvrijstalen rooster werd ingebed in de ramen om hetzelfde gebied te lokaliseren, waardoor dynamische processen (zoals involutie van de melkklier) op dezelfde locaties, dagen na elkaar, konden worden gevisualiseerd. Dit siliconenvenster maakte het ook mogelijk om afzonderlijke verspreide kankercellen te volgen die zich in de loop van de tijd ontwikkelen tot micrometastasen. De siliconen ramen die in deze studie worden gebruikt, zijn eenvoudiger in te brengen dan glazen ramen met een metalen frame en veroorzaken een beperkte ontsteking van de afgebeelde weefsels. Bovendien maken ingebedde rasters het mogelijk om hetzelfde weefselgebied eenvoudig te volgen in herhaalde beeldvormingssessies.

Introduction

Intravitale microscopie (IVM), de beeldvorming van weefsels bij verdoofde dieren, biedt inzicht in de dynamiek van fysiologische en pathologische gebeurtenissen bij cellulaire resolutie in intacte weefsels. De toepassingen van deze techniek variëren sterk, maar IVM heeft een belangrijke rol gespeeld op het gebied van kankerbiologie om te helpen ophelderen hoe kankercellen weefsels binnendringen en uitzaaien, interageren met de omliggende micro-omgeving en reageren op geneesmiddelen ^1,2,3. Bovendien is IVM de sleutel geweest tot het bevorderen van het begrip van de complexe mechanismen die immuunresponsen beheersen door inzichten te bieden die complementair zijn aan ex vivo profileringsbenaderingen (bijv. Flowcytometrie). Intravitale beeldvormingsexperimenten hebben bijvoorbeeld details onthuld over immuunfuncties als ze betrekking hebben op celmigratie en cel-celcontact en hebben een platform geboden om spatiotemporale dynamica te kwantificeren als reactie op letsel of infectie 4,5,6,7. Veel van deze processen kunnen ook worden bestudeerd door histologische kleuring, maar alleen IVM maakt het mogelijk om dynamische veranderingen te volgen. In feite, terwijl een histologische sectie een momentopname van het weefsel op een bepaald moment biedt, kan intravitale beeldvorming intercellulaire en subcellulaire gebeurtenissen in hetzelfde weefsel in de loop van de tijd volgen. Met name de vooruitgang in fluorescentielabeling en de ontwikkeling van moleculaire reporters hebben het mogelijk gemaakt moleculaire gebeurtenissen te correleren met cellulair gedrag, zoals proliferatie, dood, beweeglijkheid en interactie met andere cellen of de extracellulaire matrix. De meeste IVM-technieken zijn gebaseerd op fluorescentiemicroscopie, wat vanwege lichtverstrooiing het afbeelden van diepere weefsels een uitdaging maakt. Het weefsel van belang moet daarom vaak chirurgisch worden blootgesteld met een vaak invasieve en terminale procedure. Afhankelijk van de plaats van het orgaan kan het weefsel dus continu worden afgebeeld gedurende een periode variërend van enkele tot 40 h⁸. Als alternatief maakt het chirurgisch inbrengen van een permanent beeldvormingsvenster de beeldvorming van hetzelfde weefsel sequentieel mogelijk gedurende een periode van dagen tot week ^7,9.

De ontwikkeling van nieuwe beeldvormingsvensters is benadrukt als een technologische noodzaak om intravitale beeldvormingsbenaderingen verder te verbeteren¹⁰. Het prototypische intravitale beeldvormingsvenster is een metalen ring met een glazen dekplaat die met hechtingen aan de huid is bevestigd¹¹. Interferentie met vrije beweging, de accumulatie van exsudaat en schade aan de glazen afdekkingslip zijn veel voorkomende problemen bij het gebruik van dergelijke ramen. Bovendien vereist het prototypische venster gespecialiseerde productie en kan de chirurgische procedure uitgebreide training vereisen. Om deze problemen aan te pakken, werd polydimethylsiloxaan (PDMS), een siliconenpolymeer, dat eerder is gebruikt in schedelvensters voor langetermijnbeeldvorming in de hersenen¹², aangepast voor gebruik in beeldvorming van buikorganen en borstklieren. Hier wordt een gedetailleerde methode gepresenteerd voor het genereren van op PDMS gebaseerde siliconenvensters, inclusief hoe het venster rond een roestvrijstalen raster kan worden gegoten om oriëntatiepunten te bieden voor herhaalde beeldvorming van dezelfde weefselgebieden. Verder wordt een eenvoudige, steekvrije chirurgische ingreep beschreven voor het inbrengen van het venster boven buikorganen of de borstklier. Deze nieuwe aanpak overwint enkele van de meest voorkomende problemen met momenteel gebruikte beeldvormingsvensters en verhoogt de toegankelijkheid van longitudinale intravitale beeldvorming.

Protocol

Alle beschreven procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de chirurgische richtlijnen van het Cold Spring Harbor Laboratory en waren goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van het Cold Spring Harbor Laboratory.

1. Het siliconen venster gieten

1. Bereid het siliconenpolymeer (PDMS) door het basiselastomeer en het uithardingsmiddel in een verhouding van 10:1 (v/v) te mengen.
2. Giet een raam door een kleine hoeveelheid PDMS op een steriel, glad oppervlak te deponeren en pas de verhouding tussen volume en oppervlakte aan op de gewenste dikte.
   OPMERKING: Het gebruik van 200 mg polymeeroplossing voor een cirkel met een diameter van 22 mm op het deksel van een 24 goed geplaatst deksel resulteert in een goed compromis tussen raam stevigheid en optische helderheid.
3. Optioneel: Om oriëntatiepunten te bieden voor herhaalde beeldvorming van dezelfde weefselgebieden, drukt u lichtjes een roestvrijstalen rooster in de siliconen nadat het PDMS zich op het gewenste gietoppervlak bevindt.
4. Om luchtbellen te verwijderen, plaatst u het gecoate oppervlak gedurende 45 minuten in een vacuümsiccator om het polymeer te ontgassen.
5. Laat de siliconen ramen in een oven op 80 °C gedurende 45 min uitharden.
6. Scoor het polymeer aan de randen van de mal en pel de uitgeharde ramen voorzichtig van het oppervlak dat wordt gebruikt voor het gieten met een tang.
7. Steriliseer vóór de operatie de ramen door autoclaveren.

2. De muis voorbereiden voor het inbrengen van het siliconenvenster

1. Verdoof de muis in een inductiekamer met 4% (v/v) isofluraan. Verplaats de muis naar een warmhoudkussen op de operatietafel, plaats de muis in het anesthesieneusmasker en verlaag de isofluraanconcentratie tot 2% voor onderhoud tijdens de operatie.
2. Controleer de diepte van de anesthesie door in de tenen van de achterpoten te knijpen. Ga niet verder totdat de muis inactief is en geen teenknijpreflexreactie vertoont.
3. Breng oogheelkundig glijmiddel aan op de ogen om te voorkomen dat ze uitdrogen en trauma voorkomen.
4. Dien preventieve analgesie (buprenorfine 0,05 mg/kg) subcutaan toe.
5. Scheer de operatieplaats en verwijder het haar volledig met een ontharingscrème.
6. Breng povidon-jodiumoplossing (10% v /v) en ethanol (70% v / v) achtereenvolgens 3x aan om de infectie van de operatieplaats te voorkomen.

3. Het inbrengen van een ventraal venster voor beeldvorming in de lever; aanpasbaar voor andere buikorganen (figuur 1)

1. Plaats de muis in rugligging.
2. Maak een incisie van 10 mm vanaf 3 mm van het xiphoid-proces met behulp van een steriele schaar en tang.
3. Verwijder een 1-1,5 cm² deel van de huid langs de middellijn.
4. Gebruik een tweede steriele schaar en tang om een deel van het peritoneum te verwijderen dat iets kleiner is dan het deel van de huid.
5. Optioneel: Om een groter deel van de lever te visualiseren, gebruikt u steriele wattenstaafjes bevochtigd met steriele zoutoplossing om de lever van het diafragma naar beneden te duwen en het falciforme ligament te onthullen dat de lever met het diafragma verbindt. Breek het ligament af en zorg ervoor dat de inferieure vena cava niet wordt doorgesneden.
6. Trek chirurgische lijm op met een spuit van 31 G, breng een kleine hoeveelheid ervan aan op het oppervlak van de lever rond de randen van het in beeld te brengen gebied. Deze lijm creëert een cirkelvormige afdichting, waardoor het middengebied intact blijft voor beeldvorming.
   LET OP: Beperk de lijm tot kleine druppeltjes die een cirkelvormig patroon vormen rond het beeldvormingsgebied. Weefsel dat onmiddellijk in contact komt met de lijm kan niet worden afgebeeld. Het is niet nodig om het weefsel te drogen voordat u de lijm aanbrengt.
   OPMERKING: Alle lijmen op basis van cyanoacrylaat kunnen met succes worden gebruikt voor deze procedure. Chirurgische lijm zorgt voor steriliteit. Voor terminale procedures leveren universele superlijmen goede resultaten op.
7. Plaats het raam met een tang en houd het stevig tegen de lever totdat de lijm is opgedroogd (~ 2 min).
8. Vouw de randen van het raam onder het buikvlies.
9. Deponeer met een spuit een kleine hoeveelheid chirurgische lijm op de randen van het venster die zich nu onder het peritoneum bevinden. Druk met een tang op het peritoneum om het aan het raam vast te zetten.
10. Zet op dezelfde manier een kleine hoeveelheid chirurgische lijm op het peritoneum voordat u met een tang op de huid drukt om deze aan het peritoneum vast te zetten.
    OPMERKING: Indien correct uitgevoerd, moet een cirkelvormig gebied van leverweefsel nu zichtbaar zijn door het venster.
11. Breng lijm aan rond de randen van het venster om een rand te creëren die helpt voorkomen dat de huid teruggroeit over het raam.
    LET OP: Als de procedure wordt uitgevoerd met behulp van steriele chirurgische technieken en het venster wordt gesteriliseerd voordat het wordt ingebracht, is het afdichten van de wond met chirurgische lijm voldoende om infecties te voorkomen. Het niet volgen van de juiste aseptische technieken tijdens chirurgische inbrenging of onvolmaakte sluiting kan echter leiden tot openlijke of subklinische infectie en uitdroging van het weefsel.

4. Het inbrengen van een lateraal venster voor beeldvorming in de lever; compatibel met de gelijktijdige injectie van kankercellen in de poortader (figuur 2)

1. Plaats de muis op de linker zijwaartse decubituspositie
2. Maak een incisie van 10 mm op de rechterflank 3 mm onder de ribbenboog met behulp van een steriele schaar en tang.
3. Verwijder een 1 cm² deel van de huid.
4. Gebruik een tweede steriele schaar en tang om een deel van het peritoneum te verwijderen dat iets kleiner is dan het deel van de huid.
5. Trek chirurgische lijm op met een spuit van 31 G, breng een kleine hoeveelheid ervan aan op het oppervlak van de lever rond de randen van het in beeld te brengen gebied.
   LET OP: Beperk de lijm tot kleine druppeltjes die een cirkelvormig patroon vormen rond het beeldvormingsgebied. Weefsel dat onmiddellijk in contact komt met de lijm kan niet worden afgebeeld.
   OPMERKING: Alle lijmen op basis van cyanoacrylaat kunnen met succes worden gebruikt voor deze procedure. Chirurgische lijm zorgt voor steriliteit. Voor terminale procedures leveren universele superlijmen goede resultaten op.
6. Plaats het raam met een tang en houd het stevig tegen de lever totdat de lijm is opgedroogd (~ 2 min).
7. Vouw de randen van het raam onder het buikvlies.
8. Deponeer met een spuit een kleine hoeveelheid chirurgische lijm op de randen van het venster die zich nu onder het peritoneum bevinden. Druk met een tang op het peritoneum om het aan het raam vast te zetten.
9. Zet op dezelfde manier een kleine hoeveelheid chirurgische lijm op het peritoneum voordat u met een tang op de huid drukt om deze aan het peritoneum vast te zetten.
   OPMERKING: Indien correct uitgevoerd, moet een cirkelvormig gebied van leverweefsel nu zichtbaar zijn door het venster.
10. Breng lijm aan rond de randen van het venster om een rand te creëren die helpt voorkomen dat de huid teruggroeit over het raam.
11. Als een poortaderinjectie nodig is:
    1. Plaats de muis in rugligging.
    2. Maak een incisie van 10 mm vanaf het xiphoid-proces in de huid.
    3. Maak met een tweede steriele schaar en tang een incisie van 10 mm in het peritoneum.
    4. Doop twee wattenstaafjes in steriele zoutoplossing.
    5. Gebruik de wattenstaafjes om de darm voorzichtig op steriel gaas te trekken dat is bevochtigd met steriele zoutoplossing, waarbij u ervoor zorgt dat de oriëntatie niet wordt verdraaid of anderszins wordt verstoord.
    6. Blijf de darm uit de buikholte verplaatsen totdat de poortader zichtbaar is aan de rechterkant van de buik.
    7. Breng een naald van 31-33 G 5-7 mm caudaal in op het punt van binnenkomst van de poortader in de lever, zorg ervoor dat u in het bloedvat gaat en niet er doorheen.
    8. Injecteer de kankercellen langzaam (geresuspendeerd in 100 μL steriel PBS).
       OPMERKING: Voor dit experiment kan de cellijn van amurine alvleesklierkanker (bijv. KPC-BL/6-1199) worden gekweekt in volledige DMEM-media en 1 x 10⁵ cellen geïnjecteerd in 100 μL steriel PBS.
    9. Om bloedingen te voorkomen, oefent u onmiddellijk na het terugtrekken van de naald gedurende 1-2 minuten zachte druk uit op de injectieplaats met een klein stukje chirurgische spons.
    10. Nadat de druk is vrijgegeven, controleert u de site gedurende 1-2 minuten om hemostase te garanderen.
    11. Met behulp van bevochtigde wattenstaafjes, breng de darm terug in de buikholte volgens de fysiologische oriëntatie van het orgaan.
    12. Plaats met behulp van een steriele tang het venster direct onder het peritoneum, aan de linkerkant van de buikholte van de muis.
    13. Hecht met 4-0 zijden hechtingen en niet de middellijnincisie met 7 mm roestvrijstalen wondclips.
    14. Beweeg de muis naar de linker zijwaartse decubituspositie
    15. Maak een incisie van 10 mm op de rechterflank 3 mm onder de ribbenboog door de huid met behulp van een steriele schaar en tang.
    16. Verwijder een 1 cm² deel van de huid rond de incisie.
    17. Gebruik een tweede steriele schaar en tang om een deel van het peritoneum te verwijderen dat iets kleiner is dan het deel van de huid.
    18. Trek het venster op zijn plaats over de lever voordat u het op zijn plaats lijmt, zoals beschreven in de stappen 4.8-4.10.

5. Het venster voor beeldvorming in de alvleesklier invoegen (figuur 3)

1. Plaats de muis op de rechter laterale decubituspositie.
2. Maak een incisie van 10 mm op de linkerflank 3 mm onder de ribbenboog met behulp van een steriele schaar en tang.
3. Verwijder een 1 cm² deel van de huid rond de incisie.
4. Gebruik een tweede steriele schaar en tang om een deel van het peritoneum te verwijderen dat iets kleiner is dan het deel van de huid.
5. Gebruik steriele wattenstaafjes gedrenkt in steriele zoutoplossing en trek voorzichtig aan de milt om de alvleesklier te visualiseren. Ga verder met het herpositioneren van de alvleesklier met de bevochtigde wattenstaafjes om meer oppervlak zichtbaar te maken door de incisie.
   OPMERKING: Op dit punt kunnen alvleesklierkankercellen orthotopisch in de alvleesklier worden geïnjecteerd als het deel uitmaakt van het experimentele ontwerp.
6. Trek chirurgische lijm op met een spuit van 31 G, breng een kleine hoeveelheid ervan aan op het oppervlak van de alvleesklier rond de randen van het in beeld te brengen gebied.
   LET OP: Beperk de lijm tot kleine druppeltjes die een cirkelvormig patroon vormen rond het beeldvormingsgebied. Weefsel dat onmiddellijk in contact komt met de lijm kan niet worden afgebeeld.
7. Plaats het raam met een tang en houd het stevig tegen de alvleesklier totdat de lijm is opgedroogd (~ 2 min).
8. Vouw de randen van het raam onder het buikvlies.
9. Deponeer met een spuit een kleine hoeveelheid chirurgische lijm op de randen van het venster die zich nu onder het peritoneum bevinden. Druk met een tang op het peritoneum om het aan het raam vast te zetten.
10. Zet op dezelfde manier een kleine hoeveelheid chirurgische lijm op het peritoneum voordat u met een tang op de huid drukt om deze aan het peritoneum vast te zetten.
    OPMERKING: Indien correct uitgevoerd, moet een cirkelvormig gebied van pancreasweefsel nu zichtbaar zijn door het venster.
11. Breng lijm aan rond de randen van het venster om een rand te creëren die helpt voorkomen dat de huid teruggroeit over het raam.

6. Het venster voor beeldvorming in de borstklier inbrengen (figuur 4)

1. Plaats de muis op de rugligging.
2. Maak een 10 mm incisie mediaal naar een van de inguinale tepels met behulp van een steriele schaar en tang.
3. Verwijder een 0,5 cm² deel van de huid boven de borstklier.
4. Gebruik een tweede steriele schaar om de borstklier zorgvuldig van de huid te scheiden door de schaar tussen de twee oppervlakken te spreiden om de hechting te verstoren.
   OPMERKING: Om het beeld van het inguinale borstkliergebied te vergemakkelijken, moet u voorzichtig zijn met het ontleden van een deel van de huid boven de borstklier, maar superieur aan het achterbeen, zodat het venster de mobiliteit van de muis niet beperkt.
5. Trek chirurgische lijm op met een spuit van 31 G, breng een kleine hoeveelheid ervan aan op het oppervlak van de borstklier rond de randen van het in beeld te brengen gebied.
   LET OP: Beperk de lijm tot kleine druppeltjes die een cirkelvormig patroon vormen rond het beeldvormingsgebied. Weefsel dat onmiddellijk in contact komt met de lijm kan niet worden afgebeeld.
6. Plaats het raam met een tang en houd het stevig tegen de borstklier totdat de lijm is opgedroogd (~ 2 min).
   OPMERKING: Een cirkelvormig gebied van borstklierweefsel moet nu zichtbaar zijn door het venster als het correct wordt uitgevoerd.
7. Vouw de randen van het venster onder de huid.
8. Deponeer met een spuit een kleine hoeveelheid chirurgische lijm op de randen van het venster die zich nu onder de huid bevinden. Druk met een tang op de huid om de huid aan het raam vast te zetten.
9. Breng lijm aan rond de randen van het venster om een rand te creëren die helpt voorkomen dat de huid teruggroeit over het raam.

7. Postoperatief herstel

1. Plaats de muis in een schone herstelkooi met voldoende nestmateriaal en zorg ervoor dat een deel van de kooi op een verwarmingskussen rust.
2. Houd de muis continu in de gaten totdat deze bewust en mobiel is.
3. Geef indien nodig een extra dosis pijnstillend middel 12 uur na de preventieve dosis.
   OPMERKING: Extra analgesie is over het algemeen niet nodig, maar raadpleeg een dierenarts als de muis tekenen van nood vertoont (zoals gebogen rug, onverzorgde vacht of verloren interesse in voedsel). Controleer de muis dagelijks gedurende de eerste 3 dagen na de operatie op tekenen van infectie of andere bijwerkingen. Minder dan 2% van de muizen heeft veterinaire aandacht of euthanasie nodig, meestal als gevolg van gedeeltelijke loslating van het raam. Het is belangrijk op te merken dat voor mannelijke muizen met ventrale leverbeeldvormingsvensters, vechten tussen muizen kan resulteren in loslating van ramen. Dit wordt voorkomen door de muizen apart te huisvesten.

8. Beeldvorming door het raam

1. Verdoof de muis in een inductiekamer met 4% (v/v) isofluraan.
2. Breng oogheelkundig glijmiddel aan op de ogen om te voorkomen dat ze uitdrogen en trauma voorkomen.
3. Beweeg de muis van de inductiekamer naar de microscoopfase. Plaats de muis in het anesthesieneusmasker en verlaag de isofluraanconcentratie tot ongeveer 1-1,5% voor onderhoudsanesthesie tijdens de beeldvormingsprocedure.
4. Plaats een drukkussensensor onder de muis om de ademsnelheid te controleren en bevestig de muis aan het podium met behulp van zachte chirurgische tape.
5. Plaats een rectale thermometer om de lichaamstemperatuur tijdens de beeldvormingssessie te controleren.
6. Schakel de verwarmde pad in en houd de muis nauwlettend in de gaten om ervoor te zorgen dat de lichaamstemperatuur niet hoger is dan 37 °C.
7. Gebruik software om de ademsnelheid van de muis te controleren. De optimale snelheid is ~ 1 ademhaling / seconde. Pas de anesthesie indien nodig aan.
8. Reinig het raam vóór elke beeldsessie van elk achtergebleven onderdompelingsmedium en vuil van de lens door het voorzichtig af te vegen met een wattenstaafje gedompeld in 70% ethanol (v / v).
9. Wanneer u een onderdompelingslens in water gebruikt, breng dan ultrasone gel aan op het raam en vermijd bubbels.
   OPMERKING: Gedestilleerd water kan ook worden gebruikt, maar moet mogelijk opnieuw worden aangebracht tijdens het afbeelden.
10. Om de optimale diepte voor beeldvorming te vinden, zoekt u eerst het raster en plaatst u het in focus.
11. Bepaal de geschatte weefselbeeldvormingsdiepte door de onderkant van het raster op 0 in te stellen. Deze informatie is nodig om het overeenkomstige z-vlak in volgende beeldvormingssessies te lokaliseren.
12. Als u dezelfde locatie wilt identificeren tijdens meerdere beeldbewerkingssessies, gebruikt u de vierkanten op het raster als referentiepunt. Let tijdens het fotograferen op de oriëntatie van het raster en de locatie binnen het raster van elk beeldveld (bijvoorbeeld de^2e rij bovenaan, het^4e vierkant vanaf de linkerkant).
13. Gebruik tijdens opeenvolgende beeldvormingssessies het raster om terug te navigeren naar specifieke rastergebieden - en dus beeldvormende velden.
14. Verwijder na elke beeldsessie het resterende onderdompelingsmedium en vuil van de lens door het raam voorzichtig af te vegen met een wattenstaafje gedompeld in 70% ethanol (v / v).

Representative Results

Intravitale beeldvorming door middel van beeldvormingsvensters kan worden gebruikt om een breed scala aan cellulaire en moleculaire gebeurtenissen met eencellige resolutie over een periode van uren tot weken te observeren, te volgen en te kwantificeren. Ideale kenmerken voor een beeldvormingsvenster zijn: a) beperkte impact op het welzijn van de muis en de fysiologie van het weefsel; b) duurzaamheid; c) eenvoud van inbrengen; en d) duidelijke oriëntatiepunten voor herhaalde beeldvorming van hetzelfde gebied. Het resultaat is een veelzijdig, inert siliconenvenster dat gemakkelijk kan worden geproduceerd en ingevoegd en dat kan worden uitgerust met een raster om hetzelfde gezichtsveld te lokaliseren over de duur van verschillende beeldvormingssessies.

Het venster is gemaakt van PDMS, wat een goedkoop, flexibel en helder materiaal is. Ramen kunnen worden gegoten met benodigdheden die op grote schaal beschikbaar zijn voor aankoop voor de meeste laboratoria. Voor deze doeleinden werken de cirkelvormige mallen (22 mm diameter) die al op het deksel van de in de handel verkrijgbare 24 putplaten zijn geëtst, goed. Door de hoeveelheid gebruikte polymeer per oppervlakte-eenheid te variëren, is het mogelijk om de dikte van het venster aan te passen. Om het effect van de dikte van het venster op de beeldvormingsresolutie te documenteren, werd een point spread function (PSF) analyse van 40 nm fluorescerende microsferen uitgevoerd om de beeldvorming door PDMS-vensters van verschillende diktes te vergelijken met glazen coverslips die typisch worden gebruikt voor intravitale beeldvormingsvensters (0,17 mm dik). Om de opstelling te repliceren die wordt gebruikt voor intravitale beeldvorming, werd de PSF-beeldvorming uitgevoerd met dezelfde twee-fotonenmicroscoop en wateronderdompelingslens met ultrasone gel aangebracht als een onderdompelingsmedium.

De volledige breedte bij half maximum (FWHM) van de signaalintensiteit berekend via de pasvorm van de PSF in de laterale vlakken was vergelijkbaar met die van glas voor PDMS-ramen gegoten met 100 mg PDMS (figuur 5A, B). De zijdelingse resolutie in vergelijking met glazen afdekplaten werd verlaagd voor ramen gegoten met 150-250 mg PDMS (figuur 5A,B). In het beeldvlak met de z-as presteerden PDMS-vensters gegoten met 100-200 mg polymeer beter dan glazen afdekplaten (figuur 5C). Optische helderheid ging verloren in gegoten ramen met 300 mg PDMS, waardoor de metingen onbetrouwbaar werden (figuren 5A-C). De X/Y-verhouding van de FWHM-waarden verschilde niet significant tussen glas en PDMS van enige dikte, hoewel de verhouding voor ramen gegoten met 200-250 mg polymeer met name afweek van 1 met behulp van ultrasone gel als onderdompelingsmedium (figuur 5D). Bij gebruik van water als dompelmedium voor het raamgietmiddel met 200 mg was de afwijking van de symmetrie echter veel minder uitgesproken. Bij deze dikte zijn afwijkingen als gevolg van afwijkingen in het polymeer daarom waarschijnlijk gering. Piekfluorescentie-intensiteitswaarden werden ook verzameld voor elke microsfeer en toonden aan dat glas en PDMS vergelijkbaar presteerden, hoewel het hoogste signaal door glas werd geregistreerd (figuur 5I). De optimale dikte van het PDMS-venster is afhankelijk van specifieke toepassingen en beeldvormingssystemen. Voor de meeste doeleinden is 200 mg polymeeroplossing voor een cirkelvormig venster met een diameter van 22 mm een optimaal compromis tussen raamsterkte en optische helderheid. Inderdaad, ramen gegoten met minder dan 200 mg waren optisch helderder, met FWHM-waarden vergelijkbaar met glas, maar af en toe scheurden tijdens chirurgische implantatie, terwijl er geen gevallen van raamschade werden waargenomen met 200 mg (in >100 muizen).

Om dit verschil in materiaaleigenschappen te meten, werden PDMS-vensters (200 mg en 150 mg) in een servohydraulische materiaaltestmachine geladen onder een belastingsregelingsprofiel van 1N/s tot materiaalstoring (figuur 5J). Kracht- en verplaatsingswaarden werden gemeten met een frequentie van 100 Hz. De krachtverplaatsingsgegevens werden vervolgens omgezet in spanningsbelasting met behulp van de vergelijkingen:

σ = F / A (1)

Ɛ = ΔL / L₀ (2)

Waar σ spanning is (Pa), F kracht (N), A de dwarsdoorsnede van het venster is, Ɛ spanning is, ΔL de verplaatsing is en L₀ de dikte van het venster. De taaiheid van het materiaal werd bepaald door het sommatiegebied onder de spannings-rekcurve te berekenen. De taaiheid van een materiaal verwijst naar het vermogen om plastisch te vervormen en energie te absorberen in het proces vóór breuk - een belangrijke eigenschap voor geïmplanteerde ramen¹³. In overeenstemming met waarnemingen tijdens beeldvormingsexperimenten hebben ramen gegoten met 200 mg PDMS een significant grotere taaiheid dan ramen gegoten met 150 mg (figuur 5K) en zijn daarom minder vatbaar voor breken.

Vervolgens werd Young's Modulus (E) van de voorkeur PDMS-vensters gegoten met 200 mg bepaald en vergeleken met die van standaard glazen afdekkingsplaten door het lineaire gebied van de spannings-rekcurve te extraheren en de helling te bepalen met behulp van de wet van Hooke:

σ = EƐ (3)

Young's modulus van de glazen ramen was aanzienlijk groter dan PDMS, wat werd verwacht omdat glas veel stijver is in materiaalsterkte dan PDMS (figuur 5L). Dus, hoewel glas een sterker materiaal is op basis van de grotere Young's modulus, ondersteunt de grotere taaiheid van de 200 mg PDMS-vensters dat ze gedurende langere perioden kunnen worden toegepast zonder risico op breken en een tweede chirurgische ingreep of euthanasie noodzakelijk maken.

Een groot voordeel van de siliconen ramen is veelzijdigheid. Belangrijk is dat de procedure om het venster operatief in te brengen eenvoudig kan worden aangepast aan verschillende anatomische locaties. Aanpassingen aan de operatie worden vergemakkelijkt door het feit dat de ramen gemakkelijk kunnen worden aangepast met een chirurgische schaar en dat ramen op het oppervlak van het weefsel / orgaan van belang en op de huid worden gelijmd, waardoor de noodzaak voor hechtingen volledig wordt geëlimineerd. Succesvolle inbrenging van vensters op deze manier is bereikt voor de lever, pancreas en borstklier (figuren 6A-C). In het bijzonder werden twee verschillende protocollen ontwikkeld om ventrale of laterale vensters te implanteren voor beeldvorming van de lever. Figuur 1 toont de stappen om een ventraal venster in te voegen. Deze procedure kan worden aangepast voor andere buikorganen en levert het grootste beeldbare oppervlak op. Tenzij echter een groot (>1 cm²) beeldbaar gebied vereist is, heeft het invoegen van een lateraal venster in de rechterflank van de muis (figuur 2) de voorkeur om bewegingsartefacten te verminderen, bijvoorbeeld vanwege ademhaling en peristaltiek. Bovendien is de chirurgische procedure voor het inbrengen van het laterale beeldvormingsvenster compatibel met een gelijktijdige injectie van kankercellen in de poortader om de ontwikkeling van levermetastasen experimenteel te modelleren. Muizen kunnen dus een enkele procedure ondergaan in plaats van twee afzonderlijke wanneer poortaderinjectie en abdominale beeldvormingsvensterinbreng nodig zijn bij hetzelfde dier. Een analoge procedure wordt gebruikt om een venster over de alvleesklier op de linkerflank van de muis te implanteren (figuur 3). Het venster kan ook worden ingebracht over onderhuidse weefsels, d.w.z. normale borstklieren, evenals reeds vastgestelde spontane of orthotopisch getransplanteerde borsttumoren (figuur 4). Als alternatief kunnen kankercellen via het venster in de borstklier worden geïnjecteerd om de ontwikkeling van een primaire tumor in de lengterichting te volgen, omdat naalden de PDMS-film kunnen doorboren zonder de integriteit van het venster in gevaar te brengen.

Vanwege hun lage gewicht en flexibiliteit interfereren siliconenvensters niet met de mobiliteit van de muis (film 1). Siliconenramen overwinnen dus belangrijke obstakels die verband houden met glazen ramen, zoals kwetsbaarheid, complexe hechting en impact op de mobiliteit van dieren. In plaats daarvan is de belangrijkste beperking geassocieerd met siliconenvensters de hergroei van het epitheel onder het raam. Wanneer echter een geschikte hoeveelheid huid wordt verwijderd en de wond volledig is afgesloten met lijm, is herepitheelisatie beperkt en kan de beeldvorming gedurende langere tijd doorgaan (tot 35 dagen zijn getest, figuur 6D). Na het inbrengen van het venster kan de muis gedurende ongeveer een maand in de lengterichting worden afgebeeld of totdat de chirurgische lijm faalt of herepitheelvorming optreedt. Korte dagelijkse beeldvormingssessies (~ 60 min) of minder frequente maar langere beeldvormingssessies hebben de voorkeur om door anesthesie veroorzaakte bijwerkingen te voorkomen. Raamdragende dieren kunnen worden afgebeeld op elk intravitaal beeldvormingsplatform, via zowel single-photon als multiphoton confocale microscopie, met behulp van standaardprocedures (zie bijv. ¹⁴). Voor en na elke beeldvormingssessie is het raadzaam om het raam te reinigen van vuil en vuil door het af te vegen met een wattenstaafje gedompeld in 70% ethanol (v / v).

Om dezelfde locatie in de loop van de tijd te volgen, kunnen roestvrijstalen roosters in het venster worden ingebed. Figuur 7A toont de specificaties voor de op maat gemaakte, laser-geëtste rasters die hier worden gebruikt. Commerciële netten voor transmissie-elektronenmicroscopie zijn ook geschikt voor deze toepassing. Het raster wordt tijdens de gietprocedure in het venster ingebed en is duidelijk zichtbaar over het beeldvormingsgebied, zowel met het blote oog (figuur 7B) als door de oculairen van de microscoop (figuur 7C). Omdat het venster aan het oppervlak van het orgaan is gelijmd, is de positie van beeldvormende velden ten opzichte van het raster stabiel. Noteer tijdens het fotograferen de oriëntatie van het raster en de locatie binnen het raster van elk gezichtsveld dat wordt afgebeeld (bijvoorbeeld^{de 2e} rij vanaf de bovenkant, het^4e vierkant vanaf de linkerkant). Gebruik vervolgens het raster om terug te navigeren naar specifieke rastergebieden - en dus beeldvormende velden - tijdens opeenvolgende beeldvormingssessies.

Het raster is ook nuttig om het beeldvormingsveld uit te lijnen tijdens een beeldvormingssessie wanneer het weefsel langzaam afdrijft als gevolg van bijvoorbeeld ademhaling of peristaltiek. De meeste beeldvensters met een stijve rand kunnen tijdens het fotograferen aan een houder worden vastgemaakt, waardoor stabiliteit aan het beeldvormingsgebied wordt toegevoegd. Omdat de flexibele vensters niet direct kunnen worden gestabiliseerd, wordt chirurgische tape gebruikt om het lichaamsgedeelte met het venster te stabiliseren en wordt het beeldvormingsgebied opnieuw uitgelijnd met het midden van het overeenkomstige rastervierkant of eerder geïdentificeerde weefseloriëntatiepunten (bijv. Vasculaire oriëntatiepunten) met gedefinieerde intervallen (meestal elke 30 minuten). Verdere driftcorrectie voor microscopische verschuiving van het gezichtsveld wordt digitaal uitgevoerd in de post-acquisitiefase door middel van code die de frames opnieuw uitlijnt op basis van gedetecteerde weefselpatronen (aanvullende code 1-2).

Om te valideren dat het venster geen openlijke systemische bijwerking veroorzaakt, werd het gewicht van dieren die raamimplantatie en onbehandelde leeftijdsgematchte controles hadden ondergaan, gecontroleerd. Na een initieel gewichtsverlies geassocieerd met een operatie, blijven de meeste muizen met ingebrachte vensters in de loop van de tijd aankomen, wat aangeeft dat het inbrengen van vensters goed wordt verdragen (figuren 8A-C). Voor lever- en borstkliervensters wordt het normale gewicht binnen 5 dagen na de operatie herwonnen. Postoperatief herstel is langzamer na implantatie van het venster over de pancreas, waarbij muizen binnen 14 dagen terugkeren naar pre-operatief gewicht. Deze observatie komt overeen met de verwachte effecten geassocieerd met manipulatie van de pancreas op het moment van de operatie. Merk op dat zelfs in gevallen waarin gewichtsverlies de drempel voor een humaan eindpunt niet bereikt, muizen die geen pre-operatief lichaamsgewicht terugkrijgen (<5% van alle muizen, geïllustreerd door de muis aangegeven door * in figuur 8B) meestal worden gecensureerd uit beeldvormingsexperimenten. Bovendien waren de aantallen witte bloedcellen, bepaald op verschillende tijdstippen na het inbrengen van het venster, niet veranderd in bijna alle raamdragende muizen in vergelijking met controles en veranderden ze niet significant in de loop van de tijd (figuur 8D), wat suggereert dat het venster geen grote systemische ontsteking veroorzaakte.

Vervolgens, om de mate van lokale weefselrespons op het venster en de lijm te evalueren, werden muizen geëuthanaseerd op 3, 14 en 28 (borstkliervensters) of 35 dagen (lever- en pancreasvensters) na chirurgische inbrenging van het venster voor histologische analyse. Evaluatie van hematoxyline en eosine (H & E) gekleurde leversecties toonde oppervlakkige (20-80 μm), minimale tot milde capsulaire granulatieweefselvorming onder de ramen voor de meeste muizen (2 van de 3 muizen geëvalueerd op dag 3 en 2 van de 3 geëvalueerd op dag 14). Deze laesies waren brandpunts (1-3 mm lang), wat ongeveer overeenkomt met de breedte van de lijmlaag (figuur 8E). Na 35 dagen vertoonden de meeste muizen (4 van de 6 geëvalueerd in twee afzonderlijke experimenten) geen korrelig weefsel, terwijl een paar (2 van de 6) matige focale capsulaire sclerose en desmoplasie hadden (op een diepte van 25-250 μm). Interessant is dat er op geen enkel moment significante laesies werden waargenomen op het oppervlak van de pancreas direct onder het venster in het cohort van negen muizen (figuur 8G). Sommige muizen vertoonden echter gebieden van atrofie in de pancreata en ontsteking in het buikvet (steatitis), consistent met door manipulatie veroorzaakte schade. Voor de borstklier hadden 3 van de 3 muizen op dag 3 na vensterimplantatie granulatieweefsel dat deed denken aan een helende incisie zichtbaar langs het oppervlak van de klier of een ontstekingsreactie in het vetweefsel; op dag 14 hadden 3 van de 3 geëvalueerde muizen granulatieweefsel. Deze laesies waren opnieuw brandpunt en 1-3 mm lang (figuur 8I). Muizen met melkkliervensters die 28 dagen na de operatie werden geëuthanaseerd, vertoonden geen duidelijke histologische afwijkingen.

Deze analyse suggereert dat het venster de algehele fysiologische architectuur van de geteste organen (lever, pancreas, borstklier) niet in gevaar brengt. Het reactieve weefsel op het oppervlak van de lever en de borstklier was waarschijnlijk een reactie op de lijm en beperkt tot weefsel dat onmiddellijk in contact kwam met de lijm. Normaal weefsel kan gemakkelijk worden gevonden naast (< 100 μm) aan het reactieve weefsel in gebieden die niet zijn blootgesteld aan lijm (figuur 8E, I), en de weefselontsteking interfereert daarom niet met de beeldvorming van gezonde weefselgebieden. Bovendien is de weefselreactie waarschijnlijk omkeerbaar omdat de meeste muizen (8 van de 9 muizen, op alle weefsellocaties) geen significante laesies vertoonden op de late tijdstippen (28 of 35 dagen), hoewel directe bevestiging dat de weefselreactie oplost moeilijk te bereiken zou zijn zonder longitudinale metingen bij individuele muizen.

Multiplexed immunohistochemische kleuring voor CD45, CD68 en myeloperoxidase (MPO) werd ook uitgevoerd om de infiltratie van respectievelijk leukocyten, monocyten / macrofagen en neutrofielen te karakteriseren. Een toename van immuuncelinfiltratie geassocieerd met granulatieweefsel en steatitis werd waargenomen in de borstklier en de lever, maar niet in de pancreas (figuur 8F,H,J).  Van belang is dat deze veranderingen waarschijnlijk van voorbijgaande aard waren, omdat het infiltraat van de immuuncel vergelijkbaar was met dat van de onbehandelde controles op de laatste tijdstippen (28 dagen voor melkkliervensters en 35 dagen voor lever- en pancreasvensters).

De lever werd gekozen als de locatie om verder te karakteriseren of vensterinbrenging en beeldvorming significante lokale immuuninfiltratie veroorzaakten met behulp van beeldvorming. Hiervoor werden c-fms-EGFP (MacGreen) muizen¹⁵ gebruikt, waarbij myeloïde cellen (meestal macrofagen) zijn gelabeld met een groen fluorescerend eiwit. Levervensters werden geïmplanteerd in drie c-fms-EGFP-muizen en brachten ze in beeld op dag 1, 3 en 5 na de operatie met behulp van het raster om hetzelfde gezichtsveld te lokaliseren. Het aantal macrofagen dat in het beeldvormingsgebied aanwezig was, veranderde niet significant in de loop van de tijd na het inbrengen van het venster (figuur 8K).

Vervolgens werd het venster functioneel getest door een gevarieerde reeks biologische processen op cellulair niveau (d.w.z. beweging, proliferatie, cel-celcontact) en weefselniveau (d.w.z. tumorgroei in de pancreas, immuuninfiltratie tijdens borstklierinvolutie en levermetastasen) in beeld te brengen. De alvleesklier is geen gemakkelijk toegankelijke locatie voor beeldvorming. Om aan te tonen hoe het venster kan worden gebruikt om de dynamiek van kankercellen in dit orgaan vast te leggen, werden vensters ingevoegd over de pancreas van zes C57BL / 6J-muizen op hetzelfde moment als orthotopische injectie van KPC-BL / 6-1199-cellen, een alvleesklierkankercellijn afgeleid van een veelgebruikte KPC (Kras^{LSL- G12D / +} ;p 53^LSL-R172H; Pdx1-Cre) genetisch gemanipuleerd muismodel van alvleesklierkanker. Om te worden gevisualiseerd door confocale microscopie, werden KPC-BL / 6-1199-cellen ontworpen om doxycycline-induceerbare verbeterde GFP (iGFP-1199-cellen) tot expressie te brengen. Zes dagen na injectie werden de muizen op een doxycyclinedieet gezet om expressie van groen fluorescerend eiwit (GFP) in de alvleesklierkankercellen te activeren. Figuur 9 toont representatieve beelden van een muis die orthotopisch is geïnjecteerd met iGFP-1199-cellen op dag 11 en 14 na injectie en het inbrengen van het venster. Film 2 toont de iGFP-1199 tumorrand in een fragment van een 2-uur durende beeldvormingssessie op dag 11 na het inbrengen van het venster, wat het vermogen illustreert om de dynamiek van celmembraanprojectie in de pancreas vast te leggen met behulp van de siliconenvensters.

Het siliconenvenster kan ook worden gebruikt om dynamische immuuncelinfiltratie in de loop van de tijd vast te leggen. Om dit te illustreren werden melkkliervensters geïnstert in zogende ACTB-ECFP (Tg(CAG-ECFP)CK6Nagy); LysM-eGFP (Lyz2tm1.1Graf) muizen direct na het spenen. In deze muizen drukken alle cellen, maar de meeste epitheelcellen, cyaan fluorescerend eiwit (CFP) tot expressie, aangedreven door de bèta-actinepromotor, en myeloïde cellen - voornamelijk neutrofielen, maar ook macrofagen - worden gelabeld door eGFP aangedreven door de lysozym M-promotor. De muizen werden afgebeeld op dag 2 en 4 na het inbrengen van het venster, tijdens het proces van borstklierinvolutie, wanneer het borstklierweefsel begint terug te keren naar de toestand van vóór de zwangerschap. Twee macro's voor ImageJ zijn ontwikkeld om bewegingsartefacten te verminderen en visualisatie te verbeteren, één lijnt de Z-vlakken uit in een 4-dimensionale intravitale video (aanvullende code 1) en de andere vermindert de wiebeligheid als gevolg van ademhaling of andere bewegingsartefacten (aanvullende code 2). Figuur 10 en film 3A-C tonen neutrofiele infiltratie in het remodellererende borstklierweefsel op dezelfde locatie op dag 2 en 4, en illustreren hoe het venster kan worden gebruikt om de infiltratie en beweging van immuuncellen gedurende verschillende dagen te volgen en te volgen. Een analoog experiment werd uitgevoerd in een c-fms-EGFP-muis, met myeloïde cellen (voornamelijk macrofagen) die GFP tot expressie brengen, aangedreven door de c-fms-promotor (Film 4).

Ten slotte maakt het relatief grote oppervlak van dit aanpasbare venster observatie van zeldzame gebeurtenissen mogelijk, zoals de vorming van levermetastasen na intraveneuze inenting. Om dit fenomeen aan te tonen, werden levervensters ingebracht in C57BL / 6J-muizen ten tijde van poortaderinjectie met KPC-BL / 6-1199 pancreaskankercellen die constitutief het kernfusie-eiwit histone2B-CFP (H2B-CFP) tot expressie brachten. Na verloop van tijd werd de uitgroei van afzonderlijke cellen en kleine clusters van 2-3 cellen gevolgd terwijl ze zich ontwikkelden tot micrometastasen (>100 cellen). Figuur 10 toont representatieve beelden genomen op dag 1, 3, 7 en 9 na injectie en vensterinbrenging en toont de progressie van enkele cellen naar micrometastasen.

Alle beelden en films werden verzameld met behulp van een multifotonenmicroscoop. Maximale intensiteitsprojecties en filmuitlijningen langs de Z- en X-as in de loop van de tijd werden gegenereerd met behulp van ImageJ-software. Uitgelijnde afbeeldingen en films werden vervolgens gecompileerd met behulp van Imaris-software.

Figuur 1: Chirurgische inbrenging van een ventrale abdominale beeldvormingsvenster over de lever. (A) De cartoon toont de anatomische locatie van structuren die relevant zijn voor de operatie. Het witte vak met stippel schetst het chirurgische veld dat op de foto's wordt bekeken. (B) Er wordt een incisie gemaakt die begint 3 mm onder het xiphoid-proces en naar beneden wordt voortgezet, zodat een 1-1,5 cm^2-gedeelte van de huid langs de middellijn wordt verwijderd. (C) Een iets kleiner deel van het peritoneum wordt ontleed. (D) Het falciforme ligament (witte pijlpunt) wordt doorgesneden, waardoor de lever naar beneden wordt geduwd. Opmerking: wattenstaafjes bevochtigd met steriele zoutoplossing worden gebruikt om inwendige organen voorzichtig te manipuleren. (E) Met behulp van een spuit wordt een kleine hoeveelheid chirurgische lijm aangebracht in druppels rond het interessegebied op het oppervlak van de lever. (F) Het venster wordt geplaatst en stevig tegen de lever gehouden totdat de lijm is opgedroogd (2 min). (G) De randen van het raam zijn gevouwen onder het buikvlies en de huid. (H) Om het venster aan het peritoneum te bevestigen, wordt lijm aangebracht op het oppervlak van het venster dat overeenkomt met het gearceerde gebied, voordat het peritoneum erop wordt geduwd en op zijn plaats wordt gelijmd. De huid wordt op dezelfde manier op het peritoneum gelijmd. Een rand van lijm wordt uiteindelijk langs de rode lijn afgezet om groei van het epitheel over het raam te voorkomen. (I) Dezelfde afbeelding als in (H) zonder de markeringen die de muis klaar laten zien voor postoperatief herstel. Gebied omlijnd met stippellijnen wordt vergroot in (J, K). (J) Markeringen van de druppels lijm zijn zichtbaar op het oppervlak van de lever (pijlpunten) (K) Dezelfde foto als in J waarop de lever zichtbaar is door het venster dat wordt omlijnd door een witte stippellijn. De druppeltjes lijm op het leveroppervlak zijn rood omlijnd. Het gebied dat moet worden afgebeeld, is wit omlijnd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Chirurgische inbrenging van een venster over de rechterkwab van de lever. (A) De cartoon toont de anatomische locatie van structuren die relevant zijn voor de operatie. De zwarte stippelvormige doos schetst het chirurgische veld dat op de foto's te zien is. (B) De muis wordt in de linker laterale decubituspositie geplaatst, er wordt een incisie gemaakt die begint 3 mm onder de ribbenkast en een gedeelte van ongeveer 1 cm² van de huid wordt verwijderd. (C) Een iets kleiner deel van het peritoneum wordt ontleed. (D) De lever wordt voorzichtig onder de ribbenkast naar beneden getrokken met behulp van een bevochtigd wattenstaafje. (E) Met behulp van een spuit wordt een kleine hoeveelheid chirurgische lijm aangebracht in druppels (witte pijlpunt) op het oppervlak van de lever. (F) Het venster wordt geplaatst en stevig tegen de lever gehouden totdat de lijm is opgedroogd (2 min). (G) De randen van het raam zijn gevouwen onder het buikvlies en de huid. (H) Om het raam aan het peritoneum te bevestigen, wordt lijm aangebracht op het oppervlak van het venster, overeenkomend met het gearceerde gebied, voordat het peritoneum erop wordt geduwd en op zijn plaats wordt gelijmd. De huid wordt op dezelfde manier op het peritoneum gelijmd. Een rand van lijm wordt ook afgezet langs de rode lijn om groei van het epitheel over het raam te voorkomen. (I) Bij hoge vergroting is de lever (omlijnd door een witte stippellijn) zichtbaar door het raam. Het beeldgebied wordt gemarkeerd door het raster dat in het venster is ingebed (witte pijlpunt). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Chirurgische inbrenging van een venster over de alvleesklier. (A) De cartoon toont de anatomische locatie van structuren die relevant zijn voor de operatie. De zwarte stippelvormige doos schetst het chirurgische veld dat op de foto's te zien is. (B) De muis wordt in de rechter laterale decubituspositie geplaatst. De milt is zichtbaar door de geschoren huid (stippellijn) (C) Er wordt een incisie gemaakt vanaf 3 mm onder de ribbenkast en een huidgedeelte van ongeveer 1 cm² wordt verwijderd. (D) Een iets kleiner deel van het peritoneum wordt ontleed. (E) De alvleesklier (witte pijlpunt) wordt voorzichtig geplaatst met een bevochtigd wattenstaafje op de plaats van het raam. (F) Met behulp van een spuit wordt een kleine hoeveelheid chirurgische lijm aangebracht op de milt, evenals op de alvleesklier (weg van het in beeld te brengen gebied). (G) Het venster wordt geplaatst en stevig tegen de alvleesklier gehouden totdat de lijm is opgedroogd (2 min). De randen van het raam zijn gevouwen onder het buikvlies en de huid. (H) Om het venster aan het peritoneum te bevestigen, wordt lijm aangebracht op het oppervlak van het venster dat overeenkomt met het gearceerde gebied, voordat het peritoneum erop wordt geduwd en op zijn plaats wordt gelijmd. De huid wordt op dezelfde manier op het peritoneum gelijmd. Een rand van lijm wordt ook afgezet langs de rode lijn om groei van het epitheel over het raam te voorkomen. (I) Bij hoge vergroting is de alvleesklier (omlijnd door een witte stippellijn) zichtbaar door het raam. Het beeldgebied wordt gemarkeerd door het raster dat in het venster is ingebed (witte pijlpunt). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Chirurgische inbrenging van een venster over de liesklier. (A) De cartoon toont de anatomische locatie van structuren die relevant zijn voor de operatie. De zwarte stippelvormige doos schetst het chirurgische veld dat op de foto's te zien is. Merk op dat de operatie kan worden uitgevoerd op de^4e of de^5e borstklieren. (B) De muis wordt in rugligging op een steriel chirurgisch veld geplaatst. De^5e rechter tepel (pijlpunt) wordt gebruikt als oriëntatiepunt om de incisie uit te voeren. (C) Er wordt een incisie gemaakt, de borstklier wordt gescheiden van de bovenliggende huid en een gedeelte van ongeveer 1 cm² van de huid wordt verwijderd. (D) Met behulp van een spuit wordt een kleine hoeveelheid chirurgische lijm aangebracht in druppels rond het interessegebied op het oppervlak van de borstklier. (E) Het venster wordt geplaatst en stevig vastgehouden totdat de lijm is opgedroogd (2 min). (F) De randen van het raam worden met een tang onder de huid gevouwen. (G) Om het venster aan de huid te bevestigen, wordt lijm aangebracht op het oppervlak van het venster dat overeenkomt met het gearceerde gebied, voordat de huid erop wordt geduwd en op zijn plaats wordt gelijmd. Een rand van lijm wordt ook afgezet langs de rode lijn om groei van het epitheel over het raam te voorkomen.  (H) Een voorbeeld van een venster geïmplanteerd over een kleine tumor in de^4e rechter borstklier wordt gegeven. Gebied omlijnd met stippellijnen wordt weergegeven in hogere vergroting in (I). (I) De druppels lijm op het oppervlak van de melkklier zijn rood omlijnd. Het in beeld te brengen gebied is zwart omlijnd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Siliconenbeeldvormingsvensters hebben gunstige optische en materiaaleigenschappen. (A-C) Om de puntspreidingsfunctie te meten en de beeldeigenschappen van de PDMS-vensters te vergelijken met die van glazen afdekplaten, werden 40 nm geelgroene fluorescerende microsferen in beeld gebracht door PDMS-vensters van verschillende dikte of glazen afdekkingsplaten (# 1,5 dikte)¹⁶. Beelden werden verzameld met behulp van ultrasone gel als onderdompelingsmedium om te voldoen aan de omstandigheden van intravitale beeldvorming. Percelen tonen de berekende volledige breedte bij half maximum (FWHM) in de (Een) X-as (B) Y-as, en (C) Z-as (gemiddelde ± SD; n = 3/groep, verkregen met behulp van twee of meer afzonderlijke vensters; eenrichtings-ANOVA vergelijkt alle PDMS-vensters met glas met dunnett's meervoudige vergelijkingstest; alleen significante verschillen worden aangegeven). (D) De verhouding tussen de berekende FWHM-waarden op de X- en Y-as (A-B) wordt weergegeven als een maat voor de symmetrie van de puntbronbeelden langs de X- en Y-as, en dus voor optische aberraties. (E-G) Microsferen werden in beeld gebracht door drie afzonderlijke vensters gegoten met 200 mg PDMS (vergelijkbaar met de vensters die worden gebruikt voor intravitale beeldvorming voor Figuur 9, Figuur 10, Figuur 11 en Film 2, Film 3, Film 4) of drie glazen coverslip (# 1,5 dikte) om de puntspreidingsfunctie te meten. In tegenstelling tot de intravitale beeldvormingsvoorbeelden werden beelden voor deze berekeningen verzameld met behulp van water als onderdompelingsmedium. Plots tonen de berekende FWHM in de (E) X-as (F) Y-as en (G) Z-as (gemiddelde ± SD; n = 3/groep met behulp van drie afzonderlijke vensters; Mann-Whitney test, werden geen significante verschillen gedetecteerd). (H) Grafiek toont de verhouding tussen berekende FWHM-waarden in de X- en Y-as (E-F). (Ik) Plots tonen de piek fluorescentie-intensiteit per microsfeer (gemiddelde ± SD; n = 3/groep; Mann-Whitney test, werden geen significante verschillen gedetecteerd). Alle beelden werden verzameld bij een golflengte van 960 nm en een laservermogen van 3%. Voor elke microsfeer werd een z-stack van 100 μm verzameld, met een stapgrootte van 0,6 μm. Beeldframe werd ingesteld op 69 μm x 69 μm met een resolutie van 1022 pixels x 1022 pixels. Analyse werd uitgevoerd met Fiji - MetroloJ plugin. (J) Om de materiaaleigenschappen te testen, werden PDMS-ramen in spanning gehouden en met superlijm tussen twee ringvormige ringen bevestigd om een elastische respons tijdens mechanische tests te garanderen. Dezelfde procedure werd gebruikt voor micro-afdekglasslips zonder de spanning vanwege de stijfheid van het glas. Een laadpunt bestaande uit een halfrond (6 mm diameter) met een cilinderextrusie (4 mm diameter, 20 mm lengte) werd 3D geprint met behulp van een polymelkzuurfilament. De ramen werden in een servohydraulische materiaaltestmachine geladen onder een lastcontroleprofiel van 1 N/s tot materiaalstoring. Kracht- en verplaatsingswaarden werden gemeten met een frequentie van 100 Hz. De afbeelding toont de venstertest die is ingesteld met de laadtip die in het midden van het venster wordt toegepast. (K) De grafiek toont de taaiheid van het materiaal dat wordt bepaald door het somoppervlak onder de spanningsrekcurve te berekenen met behulp van de Trapz-functie in MATLAB (gemiddelde ± SEM; n = 3/groep met behulp van drie afzonderlijke PDMS-vensters voor elke dikte en glazen afdekkingsplaten; eenrichtings-ANOVA met de meervoudige vergelijkingstest van Tukey). (L) Plot toont de Young's Modulus bepaald uit het lineaire deel van de spanning-rekcurve (gemiddelde ± SEM; n = 3/groep met behulp van drie afzonderlijke PDMS-vensters en glazen coverslips; t-test met Welch's correctie). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Het siliconenvenster vertoont een hoge verdraagbaarheid en levensduur. (A) Een representatief beeld van een mannelijke, 7 weken oude C57BL / 6J-muis met een ventrale abdominale beeldvormingsvenster zonder raster 11 dagen na raamoperatie. (B) Een representatief beeld van een mannelijke 7 weken oude C57BL/6J muis met een pancreasbeeldvormingsvenster met een raster 14 dagen na de raamoperatie. (C) Een representatief beeld van een vrouwelijke 12 weken oude C57BL/6J c-fms-EGFP muis met een borstklier beeldvormingsvenster met een raster >7 dagen na de raamoperatie. (D) Leverbeeldvormingsvenster bij een mannelijke 7 weken oude c-fms-EGFP-muis gefotografeerd (bovenste rij) en afgebeeld (onderste rij) op dag 0 (onmiddellijk na de operatie) en 35 dagen na de operatie. Het verwijderen van de juiste hoeveelheid huid en het afdichten van de wond met lijm voorkomt dat de huid opnieuw epitheliseert en het raam omhoog en naar buiten duwt, waardoor het orgaan op lange termijn in beeld kan worden gebracht. Schaalbalken = 30 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Rasters in de vensters maken het mogelijk om hetzelfde gezichtsveld te volgen. (A) Gedetailleerde specificaties voor de aangepaste productie van lasergesneden roestvrijstalen ramen. (B) Een raster ingebed in het beeldvormingsvenster is te zien over de lever, met de rand van lijm rond het venster duidelijk zichtbaar. (C) Zicht op het raam door de oculairen van de twee fotonenmicroscoop. Bloedvaten (rood) en groen signaal van de lever zijn op de achtergrond te zien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Systemische en lokale reactie op het invoegen van vensters. (A-C) Het gewicht werd gecontroleerd voor 7 weken oude C57BL/6J vrouwelijke muizen gedurende een periode van 28 dagen na het inbrengen van het venster in de lever (Een), de alvleesklier (B) of de borstklier (C). Procentuele verandering van lichaamsgewicht in vergelijking met onbehandelde leeftijdsgematchte muizen wordt getoond. (*) duidt op een muis die niet terugkwam op normaal lichaamsgewicht en daarom gecensureerd zou zijn uit een beeldvormingsexperiment. Dezelfde controlemuizen worden in alle drie de panelen weergegeven voor een eenvoudigere vergelijking met elk type venster. (D) Het aantal witte bloedcellen (WBC) wordt gecontroleerd op dag 3, 14 en 28 (borstkliervenster) of 35 (lever- of pancreasvenster) na de operatie. Het normale bereik voor WBC-telling in de muis wordt aangegeven door stippellijnen. (E,G,IkHematoxyline- en eosinekleuring van weefselsecties van onbehandelde controles (links) en een 7 weken oude C57BL/6J-muis 14 dagen na het inbrengen van een beeldvormingsvenster (rechts) over de (E) lever , (G) alvleesklier, of (Ik) borstklier. (E,IkOppervlakkige en focale granulatielaesies zijn zichtbaar op discrete plaatsen langs het oppervlak (pijl) van lever en borstklier, wat een reactie op de lijm suggereert. Normaal weefsel aangegeven met * is zichtbaar in de regio's grenzend aan de granulatielaesies. Drie controles en drie muizen met levervensters werden op elk tijdstip geëvalueerd (dag 3, 14 en 35 na de operatie), behalve dat 6 muizen met levervensters werden geëvalueerd op dag 35 na de operatie. Twee van de 3 muizen vertoonden granulatieweefsel op dag 3 en 14. 1 op de 3 muizen vertoonde granulatieweefsel op dag 35.  Drie controles en drie muizen met melkkliervensters werden op elk tijdstip geëvalueerd (dag 3, 14 en 28 na de operatie). Drie van de 3 muizen hadden granulatieweefsel of ontstekingsreacties in het vetweefsel van de borstklier op dag 3 en 14. Nul van de 3 muizen vertoonde granulatielaesies of ontstekingsreacties op dag 28. (G) Er zijn geen significante laesies zichtbaar in de alvleesklier. Drie controles en drie muizen met pancreasvensters werden op elk tijdstip geëvalueerd (dag 3, 14 en 35 na de operatie). Muizen met pancreasvensters hadden op geen enkel moment granulatieweefsel. Schaalbalk = 500 μm (F,H,JMultiplex immunohistochemische kleuring werd uitgevoerd op weefselsecties van onbehandelde controles en 7 weken oude C57BL/6J-muizen 14 dagen na het inbrengen van een beeldvormingsvenster over de (F) lever , (H) alvleesklier of (J) borstklier. Antilichamen tegen CD45, CD68 en myeloperoxidase (MPO) werden gebruikt om respectievelijk leukocyten, monocyten/macrofagen en neutrofielen te labelen. CD45- en CD68-kleuring werden uitgevoerd op dezelfde sectie, terwijl MPO-kleuring werd uitgevoerd op een seriële sectie van hetzelfde weefsel. Het anti-CD45-antilichaam werd gedetecteerd met een HRP-geconjugeerd secundair antilichaam en eerst in beeld gebracht, vervolgens werden het chromogeen en het secundaire antilichaam gestript en werden dia's geïncubeerd met een secundair antilichaam dat anti-CD68 herkent. Kwantificering werd uitgevoerd met Fiji-software door kleurdrempeling; parameters werden aangepast over antilichamen en weefsels. Plots tonen de kwantificering als celtellingen per gezichtsveld (FOV) (gemiddelde ± SEM; n = 3/groep; eenrichtings-ANOVA met Tukey's meervoudige vergelijkingstest; alleen significante verschillen zijn aangegeven). (K) Mannelijk C57BL/6J c-fms-EGFP muizen van 8-11 weken oud hadden een siliconenbeeldvormingsvenster ingebracht over de rechterkwab van de lever. Fluorescerend gelabeld lectine (100 μL) werd onmiddellijk voor elke beeldvormingssessie intraveneus geïnjecteerd. Beelden zijn van een enkele muis, op dezelfde rasterlocatie op dag 1, 3 en 5 na de operatie, op ongeveer 200 μm onder het raster. Schaalbalk = 30 μm. Afgebeeld met een excitatiegolflengte van 960 nm, laservermogen 10%. Bloedvaten verschijnen in rood. Macrofagen verschijnen in groen (witte pijlen). Vertegenwoordiger van drie afgebeelde muizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9: Tumoren kunnen op meerdere tijdstippen worden gevisualiseerd gedurende weken na het inbrengen van het venster. Representatieve beelden van een mannelijke 7 weken oude C57BL/6J muis orthotopisch geïnjecteerd met 1,5 x 10⁴ iGFP-1199 pancreaskankercellen op het moment van het inbrengen van het pancreasvenster, en afgebeeld op dag 11 en 14 na het inbrengen van het venster. Schaalbalken = 30 μm. Afgebeeld met een excitatiegolflengte van 960 nm, laservermogen 10%. Vertegenwoordiger van 6 afgebeelde muizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 10: Dynamische veranderingen in immuuncelinfiltratie tijdens normale borstklierinvolutie. Met behulp van het metalen raster dat in het beeldvormingsvenster is ingebed, kan dezelfde locatie worden afgebeeld tijdens normale weefselremodellering, zoals tijdens involutie van de borstklier. Om de functionaliteit van de siliconenvensters verder te evalueren bij het monitoren van dynamische veranderingen zoals immuuncelinfiltratie, een 12 weken oude vrouwelijke C57BL / 6J x BALB / c ACTB-ECFP; De LysM-eGFP-muis met een beeldvormingsvenster dat over de abdominale borstklier werd ingebracht, werd afgebeeld op dag 2 en 4 na involutie van de borstklier. Neutrofielen verschijnen in groen (witte pijlen). Neutrofiele elastase-activiteit werd gevisualiseerd door een Neutrofiel elastase fluorescerende sonde 4 uur voor aanvang van de beeldvorming te injecteren en verschijnt in rood (of geel wanneer gecolokaliseerd met neutrofielen). De epitheelcellen verschijnen in blauw. Snapshots zijn een maximale intensiteitsprojectie van vijf beelden langs de Z-as (100-150 mm diep). Afbeeldingen zijn afkomstig van films 3A en 3B, en op de onderste rijbeelden wordt alleen het CFP-signaal weergegeven en worden afbeeldingen gemarkeerd met een rode stippellijn om dezelfde locaties in weefsel op de twee verschillende tijdstippen te visualiseren. Schaalbalken = 30 μm. Afgebeeld met behulp van 960 nm en 1080 nm excitatiegolflengten, laservermogen bij respectievelijk 10% en 15%. Vertegenwoordiger van vier afgebeelde muizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 11: De vorming van kankermetastase kan in de loop van de tijd worden gevolgd. Een mannelijke C57BL/6J 10 weken oude muis geïnjecteerd met 1 x 10⁵ KPC-BL/6-1199 pancreaskankercellen die nucleaire gelokaliseerde histon H2B geconjugeerd cyaan fluorescerend eiwit (H2B-CFP) tot expressie brengen door de poortader op het moment van vensterinbrenging. Leverbeeldvorming werd uitgevoerd via een lateraal venster 24 uur (dag 1) na injectie en op drie latere tijdstippen (tot 9 dagen), zoals aangegeven. Een enkele kankercel die zichtbaar is op dag 1 en 3 na injectie is aangegeven met witte pijlen. Het tweede harmonische signaal van collageenvezels werd ook gevisualiseerd in het cyaankanaal (gele pijlen). Afbeeldingen zijn afkomstig van dezelfde muis op elk ander tijdstip. Single z-plane beelden genomen tussen 300 μm en 350 μm diep. Schaalbalken = 30 μm. Afgebeeld met een excitatiegolflengte van 880 nm. Laservermogen van 8%. Vertegenwoordiger van drie afgebeelde muizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Film 1: Silicone imaging ramen worden goed verdragen bij muizen. Film toont een mannelijke 9 weken oude C57BL / 6J muis 14 dagen na het invoegen van het venster. Muis vertoont geen van de standaardgedragingen die gepaard gaan met pijn (bijv. Slechte verzorging, gesloten ogen of lethargie). Representatief voor zes geregistreerde muizen, en consistent met meer dan 100 muizen waargenomen na succesvolle raamimplantatie. Klik hier om deze video te downloaden.

Film 2: Subcellulaire beeldvorming van orthotopisch geïmplanteerde alvleesklierkankercellen. iGFP-1199 cellen werden orthotopisch geïnjecteerd in de alvleesklier van een mannelijke 7 weken oude C57BL/6J muis en afgebeeld op dag 11 na injectie van kankercellen en window insertie. De film is een maximale intensiteitsprojectie van zes beelden langs de Z-as en geëxtraheerd uit een beeldperiode van 2 uur. Tijdstempel (h:min:s:ms). Vertegenwoordiger van zes afgebeelde muizen. Klik hier om deze video te downloaden.

Film 3: Veranderingen in immuuncelinfiltratie in ACTB-ECFP; LysM-eGFP muizen tijdens involutie. Vrouw C57BL/6J x BALB/c ACTB-ECFP; LysM-eGFP-muizen die GFP tot expressie brachten in myeloïde cellen (voornamelijk in granulocyten maar ook in macrofagen) en ECFP in alle cellen (maar het hoogst in epitheelcellen) werden gefokt op de leeftijd van 8 weken. Na de bevalling werden de pups genormaliseerd tot zes pups per muis. Op dag 10 na de bevalling werden de pups gespeend en werden de beeldvormingsvensters van de buikmaxima ingebracht. Myeloïde cellen verschijnen in het groen; neutrofiele elastase-activiteit, gelabeld met behulp van de Neutrofiele Elastase 680 FAST-sonde die 4 uur voor het begin van de beeldvorming werd geïnjecteerd, verschijnt in rood (zal geel lijken wanneer gecolokaliseerd met neutrofielen); en epitheelcellen verschijnen in blauw. Films zijn een maximale intensiteitsprojectie van vijf beelden langs de Z-as (100-150 μm diep). (A) Beeldvorming op dag 2 van de involutie van de borstklier. Schaalbalk = 20 μm. Afgebeeld met behulp van 960 nm en 1080 nm excitatiegolflengten, laservermogen bij respectievelijk 10% en 15%. (B) Beeldvorming op dag 4 van de involutie van de borstklier. Schaalbalk = 20 μm. Film komt uit hetzelfde muizen- en weefselgebied als Movie 3A. (C) Hogere vergroting van een interessegebied uit Movie 3B, met twee neutrofielen die met elkaar interageren en de epitheelcellen van de borstklier. De vorming van voorbijgaande membraanuitsteeksels kan aan de voorkant worden waargenomen tijdens neutrofiele migratie. Tijdstempel (h:min:s:ms). Vertegenwoordiger van vier afgebeelde muizen. Klik hier om Movie 3A te downloaden. Klik hier om Movie 3B te downloaden. Klik hier om Movie 3C te downloaden.     

Film 4: Veranderingen in immuuncelinfiltratie in c-fms-EGFP muizen tijdens involutie. Vrouwelijke C57BL/6J c-fms-EGFP muizen, met GFP-gelabelde macrofagen, werden gefokt op de leeftijd van 8 weken. Na de bevalling werden de nesten aangepast tot zes pups per muis. Op dag 10 na de bevalling werden de pups gespeend en werden de beeldvormingsvensters van de buikmaxima ingebracht. De film, verkregen op involutiedag 1 (een dag na het invoegen van het venster), belicht het prominente macrofaaginfiltraat tijdens involutie. Macrofagen verschijnen in groen, collageenvezels (tweede harmonische generatie) verschijnen in blauw en bloedvaten verschijnen in rood (Lectin-DyLight 594). Schaalbalk = 20 μm. Beelden zijn maximale intensiteitsprojecties van vijf afbeeldingen langs de Z-as (100-150 um in diepte). Afgebeeld met behulp van 960 nm en 800 nm excitatiegolflengten, laservermogen op respectievelijk 10% en 15%. Tijdstempel (h:min:s:ms). Vertegenwoordiger van drie afgebeelde muizen. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende code 1. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende code 2. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Intravitale beeldvormingsvensters zijn belangrijke hulpmiddelen voor het direct visualiseren van fysiologische en pathologische processen met cellulaire resolutie terwijl ze zich in de loop van de tijd ontvouwen. De nieuwe procedure die wordt beschreven voor het gieten en invoegen van flexibele, siliconenbeeldvormingsvensters bij muizen overwint enkele van de meest voorkomende problemen met momenteel gebruikte afbeeldingsvensters (exsudaat, breken en interferentie met normale mobiliteit), biedt extra veiligheid voor de muis en verhoogt de toegankelijkheid van deze techniek.

De meest gebruikte beeldvensters bestaan uit een metalen frame met een glazen afdekplaat. Een groot obstakel voor het gebruik van deze prototypische ramen is dat het beveiligen van de metalen ring moeizame stikprocedures met zich meebrengt, waardoor personeel met geavanceerde chirurgische training nodig is. Bovendien is de productie van de frames kostbaar en vereist gespecialiseerde apparatuur. De PDMS-vensters verhelpen beide problemen. De procedure om de PDMS-vensters in te voegen elimineert stiksels, waardoor de barrière voor het leren van de techniek aanzienlijk wordt verlaagd. De materialen om de ramen te produceren zijn ook goedkoop en kunnen gemakkelijk worden gekocht. Bovendien kunnen zowel de vorm van het venster als de chirurgische ingreep worden aangepast voor het afbeelden van verschillende organen, waaronder de borstklier, lever, pancreas, milt en darm.

Terwijl de huidige intravitale beeldvormingsvensters longitudinale beeldvorming meestal een paar dagen mogelijk maken, beperken verschillende veelvoorkomende problemen het gebruik van deze vensters gedurende langere tijd. Het gewicht en de grootte van glazen ramen kunnen de vrije beweging van de muizen verstoren en exsudaat kan zich ophopen tegen het raam. Muizen kunnen ook de glazen afdekking beschadigen, wat resulteert in wonden en infecties. Daarentegen handhaaft de hier beschreven procedure hetzelfde niveau van toegankelijkheid tot het weefsel terwijl de nood voor de dieren wordt geminimaliseerd. PDMS is een veilig, biostabiel, synthetisch polymeer dat veel wordt gebruikt voor biomedische toepassingen bij mensen, zoals apparaten voor medicijnafgifte, gezichtsreconstructiechirurgie en borstimplantaten. Naast het verhogen van de tolerantie van de dieren voor het venster, is het gebruik van een biologisch inert materiaal, in tegenstelling tot glas, vooral belangrijk voor studies waarbij het immuunsysteem betrokken is, waar lokale ontsteking een verstorend effect zou hebben. Bovendien is een belangrijke verbetering de eliminatie van hechtingen, omdat muizen eraan bijten en eraan trekken, waardoor de met metaal omlijste glazen beeldvensters eruit kunnen vallen. Dit probleem werd gedeeltelijk verholpen door een nieuwere generatie ramen die zo zijn ontworpen dat de steken zijn verborgen in een groef⁹. Deze laatste strategie vereist echter het hechten van portemonneesnaren, wat een gecompliceerde, foutgevoelige procedure is die er vaak voor zorgt dat hechtingen te strak worden getrokken, wat resulteert in necrose van het weefsel en pijn. Daarom vormt de mogelijkheid om het raam op zijn plaats te lijmen een groot voordeel van de siliconen raambenadering. Bovendien is het raam gemaakt van een flexibel, duurzaam materiaal met een verwaarloosbaar gewicht, wat de impact op de beweging van het dier vermindert, zoals eerder beoordeeld in een vergelijking van ramen die siliconen in plaats van metaal gebruikten om een glazen afdekkingslip¹⁷ vast te houden. Door de glazen afdekkingslip volledig te elimineren, elimineert het siliconen venster de problemen met zowel de metalen frames als het glas. Bovendien maakt de flexibiliteit van het venster het mogelijk om het gemakkelijk in te brengen en vermindert het de stresskracht die wordt veroorzaakt door het lijmen van een stijf oppervlak op de organen, waardoor het risico op permanente schade aan het weefsel dat wordt waargenomen, wordt verminderd. Bovendien, omdat het venster veel gemakkelijker in te brengen en op zijn plaats te houden is, duurt de algehele procedure minder tijd, waardoor de mogelijke bijwerkingen als gevolg van langdurige anesthesie worden beperkt. Voor het inbrengen over de lever is het verschil in proceduretijd bijzonder aanzienlijk, van 45 minuten voor ramen met een metalen frame tot 15 minuten voor de siliconen ramen. In feite, terwijl het inbrengen van het metalen frame over de lever dissectie van het xiphoid-proces vereist (het kraakbeen aan het einde van het borstbeen), dat ook potentieel pijnlijk is en aanhoudende ontsteking veroorzaakt, is deze dissectie niet nodig voor het inbrengen van het siliconenvenster. Ten slotte biedt het beeldvormingsvenster dat in dit werk wordt gepresenteerd extra voordelen met betrekking tot mogelijke toepassingen. In tegenstelling tot glazen ramen bieden siliconenvensters bijvoorbeeld gemakkelijke toegang tot het weefsel, zodat kankercellen, fluorescerende kleurstoffen of medicijnen rechtstreeks door het raam kunnen worden geïnjecteerd.

Een ander op PDMS gebaseerd siliconenbeeldvormingsvenster dat geschikt is voor inbrenging op verschillende anatomische locaties, waaronder de borstklier, werd onlangs beschreven¹⁸. Dat venster is gegoten om een vorm en gespecialiseerde rand te genereren die een snelle implantatie van het raam mogelijk maakt zonder dat er steken of lijm nodig zijn. Daarentegen vereist het siliconenvenster dat hier wordt gepresenteerd geen speciale mal en kan het belangrijk zijn dat het tijdens de chirurgische procedure in vorm kan worden gesneden om zich aan te passen aan de anatomische locatie en individuele muis. Hoewel het hierin beschreven protocol het gebruik van lijm vereist, maakt deze aanvullende vereiste beeldvorming van buikorganen mogelijk, inclusief de lever en milt. Bovendien maakt het hier beschreven siliconenvenster het mogelijk om een roestvrijstalen rooster in het venster in te bedden, wat referentiepunten biedt. Deze oriëntatiepunten maken het mogelijk om dezelfde exacte locatie in de loop van de tijd te traceren en vergemakkelijken herhaalde beeldvorming van dezelfde site gedurende meerdere sessies (longitudinale beeldvorming) om processen te bestuderen die dagen tot weken duren, zoals de ontwikkeling van gemetastaseerde laesies.

Samenvattend werd een siliconen beeldvormingsvenster ontwikkeld voor gebruik in longitudinale IVM van de borstklier of buikorganen. Het raam is optisch helder, zeer duurzaam en goedkoop. De eenvoud van de window insertion procedure vermindert de technische vaardigheden die nodig zijn voor het implementeren van window-based intravitaal imaging benaderingen. Het aanpassingsvermogen van het venster aan diverse weefsellocaties maakt de implementatie van IVM in een breed scala aan biologische studies mogelijk.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape	3M	70200770819
Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2	Ethicon	N267H
ACTB-ECFP mice	Jackson Laboratory	22974
AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole)	Vector Laboratories	SK-4200
Alcohol swabs	BD	326895
Anesthesia system	Molecular Imaging Products Co.
Acqknowledge software and sensors	BIOPAC	ACK100W, ACK100M, TSD110
Betadine spray	LORIS	109-08
c-fms-EGFP (MacGreen) mice	Jackson Laboratory	18549
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	664
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)	Invitrogen	14-0451-82
CD68 Antibody	Abcam	ab125212
Curity gauze sponges	Covidien
Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP)	Abcam	ab6885
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)	Abcam	ab97064
Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP)	Abcam	ab102182
Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear	Electron Microscopy Sciences	24236-10	Two-part, 10:1 mixing ratio
Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness	Electron Microscopy Sciences	72296-08
Ender-3 Pro 3D printer	Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD
Far Infrared Heated blanket	Kent Scientific	RT-0520
Fc Receptor Blocker	Innovex Biosciences	NB309
Fiji imaging processing package			https://imagej.net/software/fiji/
FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515)	Invitrogen	F8795
Gating system:	BIOPAC Systems Inc.		The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems.
Acqknowledge software		ACK100W, ACK100M
Diff. Amp. Module, C Series		DA100C
Dual Gating Sys small animal		DTU200
MP160 for Windows - Analysis system		MP160WSW
MouseOx Plus 120V		MOX-120V;015000
Pressure Pad		TSD110
Gelfoam	Pfizer	9031508	Absorbable gelatin sponge
Hardened fine scissors	Fine Science Tools	14090-11	Two pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length
Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody	R&D Systems	AF3667
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 s
Imaris	Bitplane	www.bitplane.com
Immersion medium Immersol W 2010	Zeiss	444969-0000-000
Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc	BD	324912
Isoflurane (Fluriso)	VetOne	502017
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594	Vector Laboratories	DL-1177-1
LysM-eGFP mice	www.mmrrc.org	012039-MU
Micro dissecting forceps	Roboz	RS-5135	Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length
Micro dissecting forceps	Roboz	RS-5153	1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length
MTS MiniBionix II 808	MTS Systems		Servohydraulic material testing machine
Neutrophil Elastase 680 FAST probe	PerkinElmer	NEV11169
Nitrogen	General Welding Supply Corp.
Oxygen	General Welding Supply Corp.
Polylactic acid filament	Hatchbox		1.75 mm diameter
ProLong Diamond Antifade Mountant	Invitrogen	P36970
Puralube ophthalmic ointment	Dechra	NDC17033-211-38
Reflex 7 wound clips	Roboz Surgical	RS-9255
Stainless steel grid	Fotofab		One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square.
Surface Treated SterileTissue Culture Plates	Fisher Scientific	FB012929	Lid used as curing surface for imaging windows
TriM Scope Multiphoton Microscope	LaVision BioTec		Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: T560LP T665LPXXR T495lxpr
Vetbond	3M	70200742529
VWR micro cover glass	VWR	48404-453