Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

הדמיה תוך-ורידית אורכית דרך חלונות סיליקון שקופים

Published: January 5, 2022 doi: 10.3791/62757
Automatic Translation
*1,2,3, *1,4,5, 1, 1,6, 7,8, 9, 1, 1, 1, 8, 1
1Cold Spring Harbor Laboratory, 2Cold Spring Harbor Laboratory School of Biological Sciences, 3Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 4Medical Scientist Training Program, School of Medicine, Stony Brook University, 5Graduate Program in Pharmacology, Stony Brook University, 6Graduate Program in Genetics, Stony Brook University, 7Graduate Program in Biomedical Engineering, Stony Brook University, 8Department of Biomedical Engineering, Stony Brook University, 9Department of Pathology, University of Michigan
* These authors contributed equally

Summary

כאן מוצגת גישה להדמיה תוך-ורידית ארוכת טווח באמצעות חלונות סיליקון שקופים אופטית, הניתנים להדבקה ישירות לרקמה/איבר המעניין ולעור. חלונות אלה זולים ורב-תכליתיים יותר מאחרים הנהוגים כיום בשטח, וההחדרה הכירורגית גורמת לדלקת מוגבלת ולמצוקה לבעלי החיים.

Abstract

מיקרוסקופיה תוך-ורידית (IVM) מאפשרת הדמיה של תנועת תאים, חלוקה ומוות ברזולוציה של תא בודד. IVM דרך חלונות הדמיה שהוכנסו בניתוח הוא חזק במיוחד מכיוון שהוא מאפשר תצפית אורכית של אותה רקמה במשך ימים עד שבועות. חלונות הדמיה טיפוסיים כוללים כיסוי זכוכית במסגרת מתכת תואמת ביולוגית הנתפרת לעור העכבר. חלונות אלה יכולים להפריע לתנועה החופשית של העכברים, לעורר תגובה דלקתית חזקה, ולהיכשל עקב זכוכית שבורה או תפרים קרועים, שכל אחד מהם עשוי להצריך המתת חסד. כדי להתמודד עם בעיות אלה, פותחו חלונות להדמיה ארוכת טווח של איברי בטן ובלוטות החלב מסרט דק של פולידימתילסילוקסן (PDMS), פולימר סיליקון צלול אופטית ששימש בעבר להדמיית חלונות הדמיה גולגולתיים. חלונות אלה יכולים להיות מודבקים ישירות לרקמות, ובכך להפחית את הזמן הדרוש להחדרה. PDMS הוא גמיש, ותורם לעמידותו בעכברים לאורך זמן – עד 35 יום נבדקו. הדמיה אורכית היא הדמיה של אותו אזור רקמה במהלך מפגשים נפרדים. רשת נירוסטה הוטמעה בתוך החלונות כדי למקם את אותו אזור, מה שאפשר הדמיה של תהליכים דינמיים (כמו אינבולוציה של בלוטת החלב) באותם מקומות, בהפרש של ימים ספורים זה מזה. חלון סיליקון זה איפשר גם ניטור של תאים סרטניים בעלי תפוצה יחידה המתפתחים למיקרו-גרורות לאורך זמן. חלונות הסיליקון ששימשו במחקר זה פשוטים יותר להחדרה מאשר חלונות זכוכית ממוסגרים במתכת וגורמים לדלקת מוגבלת של הרקמות המצולמות. יתר על כן, רשתות משובצות מאפשרות מעקב פשוט אחר אותו אזור רקמה במפגשי הדמיה חוזרים ונשנים.

Introduction

מיקרוסקופיה תוך-ורידית (IVM), הדמיה של רקמות בבעלי חיים מורדמים, מציעה תובנות על הדינמיקה של אירועים פיזיולוגיים ופתולוגיים ברזולוציה תאית ברקמות שלמות. היישומים של טכניקה זו משתנים מאוד, אך IVM סייע בתחום הביולוגיה של הסרטן כדי לעזור להבהיר כיצד תאים סרטניים פולשים לרקמות וגרורות, מתקשרים עם המיקרו-סביבה שמסביב ומגיבים לתרופות 1,2,3. בנוסף, IVM היה המפתח לקידום ההבנה של המנגנונים המורכבים השולטים בתגובות החיסוניות על ידי מתן תובנות המשלימות לגישות פרופיל ex vivo (למשל, ציטומטריה של זרימה). לדוגמה, ניסויי הדמיה תוך-ורידיים חשפו פרטים על תפקודי מערכת החיסון בכל הקשור לנדידת תאים ולמגע בין תאים, והציעו פלטפורמה לכמות הדינמיקה המרחבית-טמפורלית בתגובה לפציעה או לזיהום 4,5,6,7. רבים מהתהליכים הללו יכולים להיחקר גם באמצעות כתמים היסטולוגיים, אך רק IVM מאפשר מעקב אחר שינויים דינמיים. למעשה, בעוד שמקטע היסטולוגי מציע תמונת מצב של הרקמה בזמן נתון, הדמיה תוך-תאית יכולה לעקוב אחר אירועים בין-תאיים ותת-תאיים בתוך אותה רקמה לאורך זמן. בפרט, ההתקדמות בתיוג הפלואורסצנטי והתפתחותם של כתבים מולקולריים אפשרו לאירועים מולקולריים להיות מתואמים עם התנהגויות תאיות, כגון התפשטות, מוות, תנועתיות ואינטראקציה עם תאים אחרים או עם המטריצה החוץ-תאית. רוב טכניקות IVM מבוססות על מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, אשר בשל פיזור אור, מה שהופך את ההדמיה של רקמות עמוקות יותר למאתגרת. הרקמה המעניינת, אם כן, צריכה לעתים קרובות להיחשף בניתוח בהליך פולשני וסופי לעתים קרובות. לכן, בהתאם לאתר האיבר, ניתן לדמות את הרקמה ברציפות במשך תקופה שנעה בין כמה ל -40 שעות8. לחלופין, החדרה כירורגית של חלון הדמיה קבוע מאפשרת הדמיה של אותה רקמה ברצף על פני תקופה של ימים עד שבועות 7,9.

הפיתוח של חלונות הדמיה חדשים הודגש כצורך טכנולוגי לשיפור נוסף של גישות ההדמיה התוך-ויראלית10. חלון ההדמיה התוך-עינית הוא טבעת מתכת המכילה כיסוי זכוכית המחובר לעור עם תפרים11. הפרעה לתנועה חופשית, הצטברות של הפרשה ונזק לכיסוי הזכוכית הם בעיות נפוצות שנראו בשימוש בחלונות כאלה. יתר על כן, החלון האבטיפוסי דורש ייצור מיוחד, וההליך הכירורגי יכול לדרוש הכשרה נרחבת. כדי לטפל בבעיות אלה, פולידימתילסילוקסן (PDMS), פולימר סיליקון, ששימש בעבר בחלונות גולגולת להדמיה ארוכת טווח במוח12, הותאם לשימוש בהדמיית איברי בטן ובלוטת החלב. כאן מוצגת שיטה מפורטת ליצירת חלונות סיליקון מבוססי PDMS, כולל כיצד להטיל את החלון סביב רשת נירוסטה כדי לספק ציוני דרך להדמיה חוזרת של אותם אזורי רקמה. יתר על כן, מתואר הליך כירורגי פשוט ונטול תפרים להחדרת החלון מעל איברי הבטן או בלוטת החלב. גישה חדשה זו מתגברת על כמה מהבעיות הנפוצות ביותר עם חלונות הדמיה הנמצאים בשימוש כיום ומגבירה את הנגישות של הדמיה תוך-ורידית אורכית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים שתוארו בוצעו בהתאם להנחיות הכירורגיות של מעבדת קולד ספרינג הארבור ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדת קולד ספרינג הארבור.

1. יציקת חלון הסיליקון

  1. הכן את פולימר הסיליקון (PDMS) על ידי ערבוב האלסטומר הבסיסי וחומר הריפוי ביחס של 10:1 (v/v).
  2. יציקו חלון על ידי הפקדת כמות קטנה של PDMS על משטח סטרילי וחלק והתאימו את יחס הנפח לאזור לעובי הרצוי.
    הערה: שימוש בתמיסת פולימר של 200 מ"ג עבור עיגול בקוטר 22 מ"מ על מכסה של מכסה של 24 לוחות היטב מביא לפשרה טובה בין עמידות החלון לבהירות אופטית.
  3. אופציונלי: כדי לספק ציוני דרך להדמיה חוזרת ונשנית של אותם אזורי רקמה, לחץ קלות על רשת נירוסטה לתוך הסיליקון לאחר שה- PDMS נמצא על משטח היציקה הרצוי.
  4. כדי להסיר בועות אוויר, מניחים את המשטח המצופה במייבש ואקום למשך 45 דקות כדי לנטרל את הפולימר.
  5. יש לרפא את חלונות הסיליקון בתנור בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
  6. נקבו את הפולימר בשולי התבנית וקלפו בעדינות את החלונות הנרפאים מהמשטח המשמש ליציקה עם מלקחיים.
  7. לפני הניתוח, לעקר את החלונות על ידי autoclaving.

2. הכנת העכבר להכנסת חלון הסיליקון

  1. הרדמה את העכבר בתא אינדוקציה באמצעות 4% (v/v) איזופלורן. העבירו את העכבר למשטח חימום על שולחן הניתוח, הניחו את העכבר במסכת האף להרדמה והורידו את ריכוז האיזופלורן ל-2% לצורך תחזוקה לאורך כל הניתוח.
  2. בדוק את עומק ההרדמה על ידי צביטה של בהונות הגפיים האחוריות. אין להמשיך עד שהעכבר אינו פעיל ואינו מראה תגובת רפלקס צביטה בבוהן.
  3. יש למרוח על העיניים חומר סיכה אופתלמי כדי למנוע מהן להתייבש ולמנוע טראומה.
  4. נהלו משכך כאבים מונע (בופרנורפין 0.05 מ"ג/ק"ג) תת עורית.
  5. לגלח את אתר הניתוח ולהסיר לחלוטין את השיער עם קרם להסרת שיער.
  6. יש למרוח תמיסת פובידון-יוד (10% v/v) ואתנול (70% v/v) ברצף פי 3 כדי למנוע את ההדבקה באתר הניתוח.

3. החדרת חלון גחון להדמיה בכבד; ניתן להתאמה לאיברי בטן אחרים (איור 1)

  1. מקם את העכבר במצב שכיבה.
  2. בצע חתך 10 מ"מ החל 3 מ"מ למטה מתהליך xiphoid באמצעות מספריים ומלקחיים סטריליים.
  3. יש להסיר מקטע של 1-1.5 ס"מ2 של העור לאורך קו האמצע.
  4. השתמש בזוג שני של מספריים ומלקחיים סטריליים כדי להסיר קטע של הצפק מעט קטן יותר מחלק העור.
  5. אופציונלי: כדי לדמיין חלק גדול יותר מהכבד, השתמשו במטושי כותנה סטריליים לחים במי מלח סטריליים כדי לדחוף את הכבד כלפי מטה מהסרעפת החושפת את הרצועה הפלציפורמית המחברת את הכבד לסרעפת. נתקו את הרצועה תוך הקפדה שלא לחתוך את הווריד הנבוב התחתון.
  6. למשוך דבק כירורגי עם מזרק 31 G, להחיל כמות קטנה ממנו על פני השטח של הכבד סביב הקצוות של האזור כדי להיות תמונה. דבק זה יוצר אטימה עגולה, ומשאיר את אזור המרכז שלם להדמיה.
    אזהרה: הגבילו את הדבק לטיפות קטנות היוצרות תבנית מעגלית סביב אזור ההדמיה. לא ניתן לדמיין רקמה במגע מיידי עם הדבק. אין צורך לייבש את הרקמה לפני החלת הדבק.
    הערה: ניתן להשתמש בהצלחה בכל הדבקים המבוססים על ציאנואקרילט עבור הליך זה. דבק כירורגי מבטיח סטריליות. עבור הליכים סופניים, דבקי-על לכל מטרה מניבים תוצאות טובות.
  7. מקמו את החלון באמצעות מלקחיים והחזיקו אותו בחוזקה כנגד הכבד עד שהדבק התייבש (כ-2 דקות).
  8. קפלו את קצות החלון מתחת לצפק.
  9. עם מזרק, להפקיד כמות קטנה של דבק כירורגי בשולי החלון שנמצאים כעת מתחת לצפק. דחפו כלפי מטה את הצפק עם מלקחיים כדי להדק אותו לחלון.
  10. באופן דומה, הפקידו כמות קטנה של דבק כירורגי על הצפק לפני שהם דוחפים כלפי מטה את העור עם מלקחיים כדי להצמיד אותו לצפק.
    הערה: אם מבוצע כראוי, אזור מעגלי של רקמת הכבד צריך להיראות כעת דרך החלון.
  11. יש למרוח דבק סביב קצוות החלון כדי ליצור חישוק שיעזור למנוע מהעור לצמוח בחזרה מעל החלון.
    אזהרה: אם ההליך מתבצע בטכניקות כירורגיות סטריליות והחלון מעוקר לפני ההחדרה, די באיטום הפצע באמצעות דבק כירורגי כדי למנוע זיהומים. עם זאת, אי ביצוע טכניקות אספטיות נכונות במהלך החדרה כירורגית או סגירה לא מושלמת עלול להוביל לזיהום גלוי או תת-קליני ולהתייבשות מהרקמה.

4. החדרת חלון רוחבי להדמיה בכבד; התואם את ההזרקה המקבילה של תאים סרטניים בווריד הפורטל (איור 2)

  1. מקם את העכבר על מיקום הדקוביטוס הצדדי השמאלי
  2. בצע חתך 10 מ"מ באגף הימני 3 מ"מ מתחת לקשת הקוסטלית באמצעות מספריים ומלקחיים סטריליים.
  3. יש להסיר קטע עור בגודל 1 ס"מו-2 .
  4. השתמש בזוג שני של מספריים ומלקחיים סטריליים כדי להסיר קטע של הצפק מעט קטן יותר מחלק העור.
  5. למשוך דבק כירורגי עם מזרק 31 G, להחיל כמות קטנה ממנו על פני השטח של הכבד סביב הקצוות של האזור כדי להיות תמונה.
    אזהרה: הגבילו את הדבק לטיפות קטנות היוצרות תבנית מעגלית סביב אזור ההדמיה. לא ניתן לדמיין רקמה במגע מיידי עם הדבק.
    הערה: ניתן להשתמש בהצלחה בכל הדבקים המבוססים על ציאנואקרילט עבור הליך זה. דבק כירורגי מבטיח סטריליות. עבור הליכים סופניים, דבקי-על לכל מטרה מניבים תוצאות טובות.
  6. מקמו את החלון באמצעות מלקחיים והחזיקו אותו בחוזקה כנגד הכבד עד שהדבק התייבש (כ-2 דקות).
  7. קפלו את קצות החלון מתחת לצפק.
  8. עם מזרק, להפקיד כמות קטנה של דבק כירורגי בשולי החלון שנמצאים כעת מתחת לצפק. דחפו כלפי מטה את הצפק עם מלקחיים כדי להדק אותו לחלון.
  9. באופן דומה, הפקידו כמות קטנה של דבק כירורגי על הצפק לפני שהם דוחפים כלפי מטה את העור עם מלקחיים כדי להצמיד אותו לצפק.
    הערה: אם מבוצע כראוי, אזור מעגלי של רקמת הכבד צריך להיראות כעת דרך החלון.
  10. יש למרוח דבק סביב קצוות החלון כדי ליצור חישוק שיעזור למנוע מהעור לצמוח בחזרה מעל החלון.
  11. אם נדרשת הזרקת וריד פורטל:
    1. מקם את העכבר במצב שכיבה.
    2. בצע חתך של 10 מ"מ החל מתהליך ה- xiphoid בעור.
    3. באמצעות זוג שני של מספריים ומלקחיים סטריליים, לבצע חתך 10 מ"מ בצפק.
    4. טובלים שני צמר גפן מלוחים במי מלח סטריליים.
    5. השתמשו במטושים מכותנה כדי למשוך בעדינות את המעי על גזה סטרילית הרטובה במי מלח סטריליים, תוך הקפדה שלא לסובב או לשבש את הכיוון בדרך אחרת.
    6. יש להמשיך לעקור את המעי מחלל הבטן עד לווריד הפורטלי להיראות בצד ימין של הבטן.
    7. מכניסים מחט 31–33 גרם בקוטר 5–7 מ"מ עד לנקודת הכניסה של וריד הפורטל לתוך הכבד, תוך הקפדה להמשיך בתוך כלי הדם ולא דרכו.
    8. לאט לאט להזריק את התאים הסרטניים (resuspended ב 100 μL של PBS סטרילי).
      הערה: עבור ניסוי זה ניתן לתרבית את קו תאי סרטן הלבלב של אמורין (לדוגמה, KPC-BL/6-1199) בתרבית במדיית DMEM מלאה וב-1 x 10 105 תאים מוזרקים ב-100 μL של PBS סטרילי.
    9. כדי למנוע דימום, מיד לאחר משיכת המחט, להפעיל לחץ עדין על אתר ההזרקה עם חתיכה קטנה של ספוג כירורגי במשך 1-2 דקות.
    10. לאחר שחרור הלחץ, יש לעקוב אחר האתר במשך 1-2 דקות כדי לוודא שהמוסטזיס.
    11. באמצעות צמר גפן לח, להחזיר את המעי לתוך חלל הבטן בעקבות הכיוון הפיזיולוגי של האיבר.
    12. באמצעות מלקחיים סטריליים, להכניס את החלון מיד מתחת לצפק, בצד שמאל של חלל הבטן של העכבר.
    13. תפר עם תפרים משי 4-0 ומהדק את החתך בקו האמצע עם קליפסים לפצעים מפלדת אל-חלד 7 מ"מ.
    14. הזזת העכבר למצב דקוביטוס לרוחב שמאלה
    15. בצע חתך 10 מ"מ באגף הימני 3 מ"מ מתחת לקשת הקוסטלית דרך העור באמצעות מספריים ומלקחיים סטריליים.
    16. יש להסיר מקטע של 1 ס"מ2 של העור סביב החתך.
    17. השתמש בזוג שני של מספריים ומלקחיים סטריליים כדי להסיר קטע של הצפק מעט קטן יותר מחלק העור.
    18. משוך את החלון למקומו מעל הכבד לפני הדבקתו במקומו, כמתואר בשלבים 4.8-4.10.

5. החדרת החלון להדמיה בלבלב (איור 3)

  1. מקם את העכבר על מיקום הדקוביטוס הצדדי הימני.
  2. בצע חתך 10 מ"מ באגף השמאלי 3 מ"מ מתחת לקשת הקוסטלית באמצעות מספריים ומלקחיים סטריליים.
  3. יש להסיר מקטע של 1 ס"מ2 של העור סביב החתך.
  4. השתמש בזוג שני של מספריים ומלקחיים סטריליים כדי להסיר קטע של הצפק מעט קטן יותר מחלק העור.
  5. באמצעות צמר גפן סטרילי ספוג במי מלח סטריליים, משכו בעדינות את הטחול כדי לדמיין את הלבלב. המשך למקם מחדש את הלבלב עם מטושים מכותנה לחה כדי להפוך שטח פנים גדול יותר לנראה דרך החתך.
    הערה: בשלב זה, תאים סרטניים בלבלב יכולים להיות מוזרקים באופן אורתוטופי לתוך הלבלב אם זה חלק מהתכנון הניסויי.
  6. למשוך דבק כירורגי עם מזרק 31 G, להחיל כמות קטנה ממנו על פני השטח של הלבלב סביב הקצוות של האזור כדי להיות תמונה.
    אזהרה: הגבילו את הדבק לטיפות קטנות היוצרות תבנית מעגלית סביב אזור ההדמיה. לא ניתן לדמיין רקמה במגע מיידי עם הדבק.
  7. מקמו את החלון באמצעות מלקחיים והחזיקו אותו בחוזקה כנגד הלבלב עד שהדבק התייבש (כ-2 דקות).
  8. קפלו את קצות החלון מתחת לצפק.
  9. עם מזרק, להפקיד כמות קטנה של דבק כירורגי בשולי החלון שנמצאים כעת מתחת לצפק. דחפו כלפי מטה את הצפק עם מלקחיים כדי להדק אותו לחלון.
  10. באופן דומה, הפקידו כמות קטנה של דבק כירורגי על הצפק לפני שהם דוחפים כלפי מטה את העור עם מלקחיים כדי להצמיד אותו לצפק.
    הערה: אם מבוצע כראוי, אזור מעגלי של רקמת הלבלב צריך להיות גלוי כעת דרך החלון.
  11. יש למרוח דבק סביב קצוות החלון כדי ליצור חישוק שיעזור למנוע מהעור לצמוח בחזרה מעל החלון.

6. החדרת החלון להדמיה בבלוטת החלב (איור 4)

  1. מקם את העכבר על מצב השכיבה.
  2. הכינו חתך 10 מ"מ מדיאלי לאחת הפטמות המפשעתיות באמצעות מספריים ומלקחיים סטריליים.
  3. יש להסיר קטע עור בגודל 0.5 ס"מ2 מעל בלוטת החלב.
  4. השתמשו בזוג שני של מספריים סטריליים כדי להפריד בזהירות את בלוטת החלב מהעור על ידי פיזור המספריים בין שני המשטחים כדי לשבש את ההדבקה.
    הערה: כדי להקל על הדמיה של אזור בלוטת החלב המפשעה, הקפידו לנתח חלק מהעור מעל בלוטת החלב אך עדיף על הרגל האחורית, כך שהחלון אינו מגביל את ניידות העכבר.
  5. למשוך דבק כירורגי עם מזרק 31 G, להחיל כמות קטנה ממנו על פני השטח של בלוטת החלב סביב הקצוות של האזור כדי להיות תמונה.
    אזהרה: הגבילו את הדבק לטיפות קטנות היוצרות תבנית מעגלית סביב אזור ההדמיה. לא ניתן לדמיין רקמה במגע מיידי עם הדבק.
  6. מקמו את החלון באמצעות מלקחיים והחזיקו אותו בחוזקה כנגד בלוטת החלב עד שהדבק התייבש (כ-2 דקות).
    הערה: אזור מעגלי של רקמת בלוטת החלב צריך להיות גלוי כעת דרך החלון אם הוא מבוצע כראוי.
  7. מקפלים את שולי החלון מתחת לעור.
  8. עם מזרק, להפקיד כמות קטנה של דבק כירורגי בשולי החלון שנמצאים כעת מתחת לעור. לדחוף למטה על העור עם מלקחיים כדי להצמיד את העור לחלון.
  9. יש למרוח דבק סביב קצוות החלון כדי ליצור חישוק שיעזור למנוע מהעור לצמוח בחזרה מעל החלון.

7. התאוששות לאחר הניתוח

  1. מניחים את העכבר בכלוב התאוששות נקי עם חומר קינון בשפע, ומבטיחים שחלק מהכלוב מונח על משטח חימום.
  2. נטר את העכבר באופן רציף עד שהוא מודע ונייד.
  3. במידת הצורך, לספק מנה נוספת של משכך כאבים 12 שעות לאחר המינון מראש.
    הערה: משככי כאבים נוספים הם בדרך כלל מיותרים, אך התייעצו עם וטרינר אם העכבר מראה סימני מצוקה (כגון גב חבוק, פרווה לא מטופחת או אובדן עניין במזון). עקוב אחר העכבר מדי יום במשך 3 הימים הראשונים לאחר הניתוח עבור סימנים של זיהום או תופעות לוואי אחרות. פחות מ-2% מהעכברים זקוקים לטיפול וטרינרי או להמתת חסד, בדרך כלל עקב ניתוק חלקי של החלון. חשוב לציין כי עבור עכברים זכרים עם חלונות הדמיה של כבד גחוני, לחימה בין עכברים עלולה לגרום לניתוק חלונות. זה נמנע על ידי דיור העכברים בנפרד.

8. הדמיה דרך החלון

  1. הרדמה את העכבר בתא אינדוקציה באמצעות 4% (v/v) איזופלורן.
  2. יש למרוח על העיניים חומר סיכה אופתלמי כדי למנוע מהן להתייבש ולמנוע טראומה.
  3. העבר את העכבר מתא האינדוקציה לשלב המיקרוסקופ. מניחים את העכבר במסכת האף להרדמה, ומורידים את ריכוז האיזופלורן לכ-1-1.5% לצורך הרדמה בתחזוקה לאורך כל הליך ההדמיה.
  4. הניחו חיישן כרית לחץ מתחת לעכבר כדי לנטר את קצב הנשימה ולקבע את העכבר לבמה באמצעות סרט ניתוח רך.
  5. הכנס מדחום רקטלי כדי לעקוב אחר טמפרטורת הגוף לאורך כל סשן ההדמיה.
  6. הפעל את המשטח המחומם, תוך ניטור הדוק של העכבר כדי להבטיח שטמפרטורת הגוף לא תעלה על 37 °C (76 °F).
  7. השתמש בתוכנה כדי לנטר את קצב הנשימה של העכבר. הקצב האופטימלי הוא ~ נשימה אחת לשנייה. התאימו את ההרדמה לפי הצורך.
  8. לפני כל סשן הדמיה, נקו את החלון מכל מדיום טבילה ופסולת של עדשה שיורית על ידי ניגוב עדין שלו עם צמר גפן טבול ב-70% אתנול (v/v).
  9. בעת שימוש בעדשת טבילה במים, יש למרוח ג'ל אולטרסאונד על החלון, תוך הימנעות מבועות.
    הערה: ניתן להשתמש גם במים מזוקקים, אך הם עשויים לדרוש יישום מחדש במהלך ההדמיה.
  10. כדי למצוא את העומק האופטימלי להדמיה, ראשית, אתרו את הרשת והניחו אותה בפוקוס.
  11. קבע את עומק הדמיית הרקמה המשוער על-ידי הגדרת החלק התחתון של הרשת ל- 0. מידע זה נחוץ כדי לאתר את מישור z המתאים במפגשי ההדמיה הבאים.
  12. כדי לזהות את אותו מיקום במשך מספר הפעלות הדמיה, השתמש בריבועים שעל הרשת כנקודת ייחוס. במהלך ההדמיה, שים לב לכיוון הרשת ולמיקום בתוך הרשת של כל שדה ראייה שצולם (לדוגמה, שורה 2 מלמעלה, ריבוע 4 משמאל).
  13. במהלך הפעלות הדמיה עוקבות, השתמש ברשת כדי לנווט בחזרה לאזורי רשת ספציפיים - וכך לשדות הדמיה.
  14. לאחר כל סשן הדמיה, יש להסיר את כל מדיום הטבילה והפסולת של העדשה השיורית על ידי ניגוב עדין של החלון באמצעות ספוגית צמר גפן טבולה ב-70% אתנול (v/v).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניתן להשתמש בהדמיה תוך-ורידית דרך חלונות הדמיה כדי לצפות, לעקוב ולכמת מגוון רחב של אירועים תאיים ומולקולריים ברזולוציה של תא יחיד במשך תקופה של שעות עד שבועות. תכונות אידיאליות לחלון הדמיה כוללות: א) השפעה מוגבלת על רווחתו של העכבר ועל הפיזיולוגיה של הרקמה; ב) עמידות; ג) פשטות ההכנסה; ו-ד) ציוני דרך ברורים להדמיה חוזרת ונשנית של אותו אזור. התוצאה היא חלון סיליקון רב-תכליתי, אינרטי, המיוצר ומוכנס בקלות וניתן לצייד אותו ברשת כדי לאתר את אותו שדה ראייה לאורך מספר מפגשי הדמיה.

החלון עשוי PDMS, שהוא חומר זול, גמיש וברור. ניתן להטיל את Windows עם חומרים מתכלים הזמינים לרכישה באופן נרחב עבור רוב המעבדות. למטרות אלה, התבניות העגולות (קוטר 22 מ"מ) שכבר חרוטות על המכסה של 24 לוחות באר הזמינים מסחרית פועלות היטב. על ידי שינוי כמות הפולימר המשמשת ליחידת שטח, ניתן להתאים את עובי החלון. כדי לתעד את השפעת עובי החלון על רזולוציית ההדמיה, נערך ניתוח פונקציית התפשטות נקודתית (PSF) של מיקרו-ספירות פלואורסצנטיות של 40 ננומטר כדי להשוות את ההדמיה דרך חלונות PDMS בעוביים משתנים לכיסויי זכוכית המשמשים בדרך כלל לחלונות הדמיה תוך-ורידיים (בעובי 0.17 מ"מ). כדי לשכפל את המערך המשמש להדמיה תוך-ורידית, הדמיית ה-PSF בוצעה באמצעות אותו מיקרוסקופ דו-פוטוני ועדשת טבילת מים עם ג'ל אולטרסאונד שהוחל כמדיום טבילה.

הרוחב המלא בחצי מקסימום (FWHM) של עוצמת האות שחושב באמצעות התאמת ה-PSF במישורים הצדדיים היה דומה לזה של זכוכית עבור חלונות PDMS יצוקים עם 100 מ"ג של PDMS (איור 5A,B). הרזולוציה הצידית בהשוואה לכיסויי זכוכית הופחתה עבור חלונות יצוקים עם 150-250 מ"ג של PDMS (איור 5A,B). במישור התמונה של ציר z, חלונות PDMS יצוקים עם 100-200 מ"ג של פולימר הציגו ביצועים טובים יותר מאשר כיסויי זכוכית (איור 5C). הבהירות האופטית אבדה בחלונות יצוקים עם 300 מ"ג של PDMS, מה שהופך את המדידות לבלתי אמינות (איורים 5A–C). יחס ה-X/Y של ערכי ה-FWHM לא היה שונה באופן משמעותי בין זכוכית ל-PDMS בעובי כלשהו, אם כי היחס בין חלונות יצוקים עם 200-250 מ"ג של פולימר סטה באופן בולט מ-1 באמצעות ג'ל אולטרסאונד כמדיום הטבילה (איור 5D). עם זאת, כאשר משתמשים במים כמדיום טבילה ליציקת החלון עם 200 מ"ג, הסטייה מהסימטריה הייתה הרבה פחות בולטת. בעובי זה, סטיות עקב סטיות בפולימר הן ככל הנראה מינוריות. ערכי שיא של עוצמת הפלואורסצנציה נאספו גם עבור כל מיקרוספרה והראו כי ביצועי הזכוכית וה-PDMS היו דומים, אם כי האות הגבוה ביותר נרשם באמצעות זכוכית (איור 5I). העובי האופטימלי של חלון PDMS יהיה תלוי ביישומים ובמערכות הדמיה ספציפיות. עבור רוב המטרות, תמיסת פולימר של 200 מ"ג לחלון מעגלי בקוטר 22 מ"מ היא פשרה אופטימלית בין עמידות החלון לבהירות אופטית. ואכן, חלונות יצוקים עם פחות מ-200 מ"ג היו ברורים יותר מבחינה אופטית, עם ערכי FWHM הדומים לזכוכית, אך לעיתים נקרעו במהלך השתלה כירורגית, בעוד שלא נצפו מקרים של נזק לחלונות באמצעות 200 מ"ג (>100 עכברים).

כדי למדוד את ההבדלים האלה בתכונות החומר, חלונות PDMS (200 מ"ג ו-150 מ"ג) הועמסו לתוך מכונת בדיקת חומרים סרוודהידראוליים תחת פרופיל בקרת עומס של 1N/s עד לכשל בחומר (איור 5J). ערכי כוח ותזוזה נמדדו בתדר של 100 הרץ. לאחר מכן הומרו נתוני תזוזת הכוח למתח באמצעות המשוואות:

σ = F / A (1)

Ɛ = ΔL / L0 (2)

כאשר σ הוא מתח (Pa), F הוא כוח (N), A הוא אזור החתך של החלון, Ɛ הוא מתח, ΔL הוא התזוזה, ו-L0 הוא עובי החלון. קשיחות החומר נקבעה על ידי חישוב שטח הסיכום תחת עקומת המתח-מאמץ. הקשיחות של חומר מתייחסת ליכולתו לעוות פלסטית ולספוג אנרגיה בתהליך שלפני השבר – מאפיין מפתח עבור חלונות מושתלים13. בהסכמה עם תצפיות במהלך ניסויי הדמיה, חלונות יצוקים עם 200 מ"ג של PDMS הם בעלי קשיחות גבוהה יותר באופן משמעותי מאשר חלונות יצוקים עם 150 מ"ג (איור 5K) ולכן הם נוטים פחות להישבר.

לאחר מכן, מודולוס יאנג (E) של חלונות PDMS המועדפים יצוקים עם 200 מ"ג נקבע והושווה לזה של כיסויי זכוכית סטנדרטיים על ידי חילוץ האזור הליניארי של עקומת מתח-מאמץ וקביעת השיפוע באמצעות חוק הוק:

σ = EƐ (3)

מודולוס חלונות הזכוכית של יאנג היה גדול משמעותית מ-PDMS, מה שהיה צפוי מכיוון שהזכוכית נוקשה הרבה יותר בחוזק החומר מאשר PDMS (איור 5L). לפיכך, למרות שזכוכית היא חומר חזק יותר המבוסס על מודולוס יאנג רבתי שלה, הקשיחות הגדולה יותר של חלונות PDMS בגודל 200 מ"ג תומכת בכך שניתן ליישם אותם לתקופות ארוכות יותר ללא סיכון של שבירה ומחייבים הליך כירורגי שני או המתת חסד.

יתרון מרכזי של חלונות הסיליקון הוא רב-תכליתיות. חשוב לציין כי ניתן להתאים בקלות את ההליך להחדרת החלון בניתוח למיקומים אנטומיים שונים. ההסתגלות לניתוח מתאפשרת על ידי העובדה שניתן לשנות את גודל החלונות בקלות עם מספריים כירורגיים וכי החלונות מודבקים לפני השטח של הרקמה / איבר העניין ולעור, ומבטלים לחלוטין את הדרישה לתפרים. החדרה מוצלחת של חלונות בדרך זו הושגה עבור הכבד, הלבלב ובלוטת החלב (איורים 6A–C). בפרט, פותחו שני פרוטוקולים שונים להשתלת חלונות גחוניים או רוחביים להדמיית כבד. איור 1 מציג את השלבים להוספת חלון גחון. הליך זה יכול להיות מותאם לאיברי בטן אחרים ויניב את שטח הפנים הגדול ביותר שניתן להצטלם. עם זאת, אלא אם כן נדרש אזור גדול (>1 ס"מ2) הניתן להדמיה, החדרת חלון רוחבי באגף הימני של העכבר (איור 2) עדיפה על מנת להקטין את תוצרי התנועה, למשל, עקב נשימה ופריטלטיקה. בנוסף, ההליך הכירורגי להחדרת חלון ההדמיה הצדדי תואם להזרקה בו זמנית של תאים סרטניים בווריד הפורטל כדי למדל באופן ניסיוני את התפתחות גרורות הכבד. לפיכך, עכברים יכולים לעבור הליך יחיד במקום שניים נפרדים כאשר יש צורך בהזרקת וריד הפורטל והחדרת חלון הדמיית בטן באותה חיה. הליך מקביל משמש להשתלת חלון מעל הלבלב באגף השמאלי של העכבר (איור 3). ניתן גם להחדיר את החלון מעל רקמות תת עוריות, כלומר בלוטות החלב הרגילות, כמו גם על גידולי חלב ספונטניים או אורתוטופיים שכבר הוקמו (איור 4). לחלופין, ניתן להזריק תאים סרטניים בבלוטת החלב דרך החלון כדי לעקוב באופן אורכי אחר התפתחות הגידול הראשוני, שכן מחטים יכולות לנקב את סרט ה- PDMS מבלי להתפשר על שלמות החלון.

בשל משקלם הנמוך וגמישותם, חלונות סיליקון אינם מפריעים לניידות העכבר (סרט 1). לפיכך, חלונות סיליקון להתגבר על מכשולים גדולים הקשורים לחלונות זכוכית, כגון שבריריות, תפירה מורכבת והשפעה על ניידות בעלי חיים. במקום זאת, המגבלה העיקרית הקשורה לחלונות סיליקון היא צמיחה מחדש של האפיתל מתחת לחלון. עם זאת, כאשר מסירים כמות מתאימה של עור והפצע אטום לחלוטין בדבק, אפיתליאליזציה מחדש מוגבלת, וההדמיה יכולה להימשך לאורך פרקי זמן ממושכים (עד 35 יום נבדקו, איור 6D). לאחר החדרת החלון, ניתן לצלם את העכבר באופן אורכי במשך כחודש או עד שהדבק הניתוחי נכשל או מתרחש אפיתליזציה מחדש. מפגשי הדמיה יומיים קצרים (כ-60 דקות) או מפגשי הדמיה תכופים פחות אך ארוכים יותר מועדפים כדי למנוע תופעות לוואי הנגרמות על ידי הרדמה. ניתן לדמות בעלי חיים נושאי חלונות על כל פלטפורמת הדמיה תוך-ורידית, הן באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של פוטון יחיד והן באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית רב-פוטונית, תוך שימוש בהליכים סטנדרטיים (ראו למשל, 14). לפני ואחרי כל סשן הדמיה, מומלץ לנקות את החלון מפני זוהמה ופסולת על ידי ניגובו עם צמר גפן טבול ב-70% אתנול (v/v).

על מנת לעקוב אחר אותו מיקום לאורך זמן, ניתן להטמיע רשתות נירוסטה בתוך החלון. איור 7A מציג את המפרטים של הרשתות החרוטות בלייזר בהתאמה אישית המשמשות כאן. רשתות מסחריות למיקרוסקופ אלקטרונים הולכה מתאימות גם הן ליישום זה. הרשת מוטבעת בתוך החלון במהלך הליך היציקה והיא נראית בבירור מעל אזור ההדמיה הן לעין בלתי (איור 7B) והן דרך עיני המיקרוסקופ (איור 7C). מכיוון שהחלון מודבק לפני השטח של האיבר, מיקום שדות ההדמיה ביחס לרשת יציב. במהלך ההדמיה, שים לב לכיוון הרשת ולמיקום בתוך הרשת של כל שדה ראייה המצולם (לדוגמה, שורה 2מלמעלה, ריבוע 4 משמאל). לאחר מכן, השתמש ברשת כדי לנווט בחזרה לאזורי רשת ספציפיים - וכך לשדות הדמיה - במהלך הפעלות הדמיה עוקבות.

הרשת שימושית גם כדי ליישר את שדה ההדמיה במהלך סשן הדמיה כאשר הרקמה נסחפת באיטיות עקב, למשל, נשימה או פריסטלזה. רוב חלונות ההדמיה עם שפה קשיחה יכולים להיות קשורים למחזיק במהלך ההדמיה, מה שמוסיף יציבות לאזור ההדמיה. מכיוון שלא ניתן לייצב את החלונות הגמישים באופן ישיר, נעשה שימוש בנייר דבק כירורגי לייצוב חלק הגוף המכיל את החלון, ואזור ההדמיה מיושר מחדש למרכז ריבוע הרשת המתאים או לציוני דרך של רקמות שזוהו בעבר (למשל, ציוני דרך של כלי דם) במרווחי זמן מוגדרים (בדרך כלל כל 30 דקות). תיקון סחף נוסף להסטה מיקרוסקופית של שדה הראייה מתבצע באופן דיגיטלי בשלב שלאחר הרכישה באמצעות קוד המיישר מחדש את המסגרות בהתבסס על תבניות רקמה שזוהו (קוד משלים 1-2).

כדי לאמת שהחלון אינו גורם לתגובת לוואי מערכתית גלויה, נוטר משקלם של בעלי החיים שעברו השתלת חלונות ובקרות לא מטופלות תואמות גיל. לאחר ירידה ראשונית במשקל הקשורה לניתוח, רוב העכברים עם חלונות מוכנסים ממשיכים לעלות במשקל לאורך זמן, מה שמצביע על כך שהכנסת חלונות נסבלת היטב (איורים 8A–C). עבור חלונות בלוטות הכבד והיונקים, המשקל התקין חוזר תוך 5 ימים מהניתוח. ההתאוששות לאחר הניתוח איטית יותר לאחר השתלת החלון מעל הלבלב, כאשר העכברים חוזרים למשקל טרום ניתוחי תוך 14 יום. תצפית זו עולה בקנה אחד עם ההשפעות הצפויות הקשורות למניפולציה של הלבלב בזמן הניתוח. שימו לב שגם במקרים שבהם ירידה במשקל אינה מגיעה לסף של נקודת קצה הומאנית, עכברים שאינם מחזירים לעצמם את משקל הגוף לפני הניתוח (<5% מכלל העכברים, כפי שמדגים העכבר המצוין על ידי * באיור 8B) מצונזרים בדרך כלל מניסויי הדמיה. בנוסף, ספירת תאי הדם הלבנים, שנקבעה בנקודות זמן שונות לאחר החדרת החלון, לא שונתה כמעט בעכברים נושאי חלונות בהשוואה לבקרים ולא השתנתה במידה ניכרת עם הזמן (איור 8D), מה שמרמז על כך שהחלון לא גרם לדלקת מערכתית משמעותית.

לאחר מכן, כדי להעריך את מידת תגובת הרקמה המקומית לחלון ולדבק, עכברים הומתו ב-3, 14 ו-28 (חלונות בלוטות החלב) או 35 יום (חלונות הכבד והלבלב) לאחר החדרה כירורגית של החלון לצורך ניתוח היסטולוגי. הערכה של מקטעי כבד מוכתמים של המטוקסילין ואוזין (H&E) הראתה שטחיים (20-80 מיקרומטר), היווצרות רקמת גרגיר קפסולרית מינימלית עד קלה מתחת לחלונות עבור רוב העכברים (2 מתוך 3 עכברים הוערכו ביום 3, ו-2 מתוך 3 הוערכו ביום ה-14). נגעים אלה היו מוקדיים (באורך של 1–3 מ"מ), והתאימו בערך לרוחב שכבת הדבק (איור 8E). לאחר 35 יום, רוב העכברים (4 מתוך 6 שהוערכו בשני ניסויים נפרדים) לא הציגו רקמה גרעינית, בעוד שכמה (2 מתוך 6) סבלו מטרשת קפסולרית מוקדית מתונה ודסמופלזיה (בעומק של 25-250 מיקרומטר). באופן מעניין, לא נצפו נגעים משמעותיים על פני השטח של הלבלב ישירות מתחת לחלון בכל נקודת זמן בקבוצה של תשעה עכברים (איור 8G). עם זאת, חלק מהעכברים הראו אזורים של ניוון בלבלב ודלקת בשומן הבטן (סטאטיטיס), העולים בקנה אחד עם נזק שנגרם כתוצאה ממניפולציה. עבור בלוטת החלב, ביום 3 לאחר השתלת החלון, 3 מתוך 3 עכברים היו רקמת גרנולציה המזכירה חתך ריפוי הנראה לאורך פני השטח של הבלוטה או תגובה דלקתית ברקמת השומן; ביום ה-14, ל-3 מתוך 3 עכברים שנבדקו הייתה רקמת גרנולציה. נגעים אלה היו שוב מוקדיים ואורכם 1–3 מ"מ (איור 8I). עכברים עם חלונות בלוטות החלב הומתו 28 ימים לאחר הניתוח לא הראו הפרעות היסטולוגיות ברורות.

ניתוח זה מצביע על כך שהחלון אינו פוגע בארכיטקטורה הפיזיולוגית הכוללת של האיברים שנבדקו (כבד, לבלב, בלוטת החלב). הרקמה הריאקטיבית שנמצאה על פני הכבד ובלוטת החלב הייתה ככל הנראה תגובה לדבק והוגבלה לרקמות מיד במגע עם הדבק. ניתן למצוא בקלות רקמה תקינה צמודה (< 100 מיקרומטר) לרקמה הריאקטיבית באזורים שאינם חשופים לדבק (איור 8E,I), ולכן דלקת הרקמות אינה מפריעה להדמיה של אזורי רקמה בריאים. יתר על כן, תגובת הרקמה היא ככל הנראה הפיכה מכיוון שרוב העכברים (8 מתוך 9 עכברים, בכל מיקומי הרקמה) לא הראו נגעים משמעותיים בנקודות הזמן המאוחרות (28 או 35 יום), אם כי אישור ישיר לכך שתגובת הרקמה נפתרת יהיה קשה להשגה ללא מדידות אורכיות בעכברים בודדים.

צביעה אימונוהיסטוכימית מרובבת עבור CD45, CD68 ומיאלופרוקסידאז (MPO) בוצעה גם כדי לאפיין את חדירתם של לויקוציטים, מונוציטים/מקרופאגים ונייטרופילים, בהתאמה. עלייה בהסתננות של תאי מערכת החיסון הקשורה לרקמת גרנולציה וסטאטיטיס נצפתה בבלוטת החלב ובכבד, אך לא בלבלב (איור 8F,H,J).  יש לציין כי שינויים אלה היו ככל הנראה חולפים שכן חדירת תאי החיסון הייתה דומה לזו של הבקרות שלא טופלו בנקודות הזמן האחרונות (28 ימים לחלונות בלוטות החלב ו-35 יום לחלונות הכבד והלבלב).

הכבד נבחר כאתר כדי לאפיין עוד יותר אם החדרת חלונות והדמיה גרמו לחדירה חיסונית מקומית משמעותית באמצעות הדמיה. לשם כך נעשה שימוש בעכברי c-fms-EGFP (MacGreen)15, שבהם נעשה שימוש בתאים מיאלואידיים (בעיקר מקרופאגים) המסומנים בחלבון פלואורסצנטי ירוק. חלונות כבד הושתלו בשלושה עכברי c-fms-EGFP וצילמו אותם בימים 1, 3 ו-5 לאחר ניתוח באמצעות הרשת כדי לאתר את אותו שדה ראייה. מספר המקרופאגים הנמצאים באזור ההדמיה לא השתנה במידה ניכרת עם הזמן לאחר החדרת החלון (איור 8K).

לאחר מכן, החלון נבדק באופן פונקציונלי על ידי הדמיה של קבוצה מגוונת של תהליכים ביולוגיים ברמה התאית (כלומר, תנועה, התפשטות, מגע בין תאים) ורמת רקמה (כלומר, צמיחת גידולים בלבלב, חדירה חיסונית במהלך אינבולוציה של בלוטת החלב, וגרורות בכבד). הלבלב אינו מיקום נגיש להדמיה. כדי להדגים כיצד ניתן להשתמש בחלון כדי ללכוד את הדינמיקה של התאים הסרטניים באיבר זה, הוכנסו חלונות מעל הלבלב של שישה עכברי C57BL/6J במקביל להזרקה אורתוטופית של תאי KPC-BL/6-1199, קו תאי סרטן לבלב שמקורו ב-KPC נפוץ (KrasLSL- G12D/+;p 53LSL-R172H; Pdx1-Cre) מודל עכבר מהונדס גנטית של סרטן הלבלב. על מנת שניתן יהיה לדמיין אותם על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית, תאי KPC-BL/6-1199 הונדסו לבטא GFP משופר (תאי iGFP-1199) הניתנים להשראה של דוקסיציקלין. שישה ימים לאחר ההזרקה, העכברים הוכנסו לדיאטת דוקסיציקלין כדי לעורר ביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) בתאי סרטן הלבלב. איור 9 מציג תמונות מייצגות מעכבר שהוזרק לו באופן אורתוטופי תאי iGFP-1199 בימים 11 ו-14 לאחר הזרקה והחדרת חלון. סרט 2 מציג את קצה הגידול iGFP-1199 בקטע של סשן הדמיה של שעתיים ביום ה-11 לאחר החדרת החלון, הממחיש את היכולת ללכוד דינמיקה של הקרנת קרום התא בלבלב באמצעות חלונות הסיליקון.

ניתן להשתמש בחלון הסיליקון גם כדי ללכוד חדירה דינמית של תאי מערכת החיסון לאורך זמן. כדי להמחיש זאת, חלונות בלוטות החלב הוכנסו לתוך ACTB-ECFP מניק (Tg(CAG-ECFP)CK6Nagy); עכברי LysM-eGFP (Lyz2tm1.1Graf) מיד לאחר הגמילה. בעכברים אלה, כל התאים, אך רוב תאי האפיתל, החלבון הפלואורסצנטי הציאן האקספרסיבי (CFP) המונע על ידי מקדם הבטא אקטין, ותאים מיאלואידים - בעיקר נויטרופילים, אך גם מקרופאגים - מסומנים על ידי eGFP המונע על ידי מקדם הליזוזים M. העכברים צולמו בימים 2 ו -4 לאחר החדרת החלון, במהלך תהליך של החדרת בלוטת החלב, כאשר רקמת בלוטת החלב מתחילה לחזור למצבה לפני ההריון. שני פקודות מאקרו עבור ImageJ פותחו כדי להפחית את תוצרי התנועה ולשפר את ההדמיה, האחד מיישר את מישורי Z בסרטון תוך-ורידי 4-ממדי (קוד משלים 1) והשני מפחית את ההתנדנדות עקב נשימה או תוצרי תנועה אחרים (קוד משלים 2). איור 10 וסרט 3A–C מראים חדירת נויטרופילים לתוך רקמת בלוטת החלב המשפצת באותו מיקום בימים 2 ו-4, מה שממחיש כיצד ניתן להשתמש בחלון כדי לנטר ולעקוב אחר חדירה ותנועה של תאי מערכת החיסון במשך ימים שונים. ניסוי מקביל נערך בעכבר c-fms-EGFP, כאשר תאים מיאלואידיים (בעיקר מקרופאגים) מבטאים GFP המונעים על ידי מקדם c-fms (סרט 4).

לבסוף, שטח הפנים הגדול יחסית של חלון זה הניתן להתאמה אישית מאפשר תצפית על אירועים נדירים, כגון היווצרות גרורות בכבד לאחר חיסון תוך ורידי. כדי להדגים תופעה זו, הוכנסו חלונות כבד בעכברי C57BL/6J בזמן הזרקת ורידים פורטליים עם תאי סרטן לבלב KPC-BL/6-1199 המבטאים באופן מכונן את חלבון ההיתוך הגרעיני histone2B-CFP (H2B-CFP). עם הזמן, התפשטותם של תאים בודדים ואשכולות קטנים של 2-3 תאים כשהתפתחו למיקרו-מטסטזות (>100 תאים) הייתה מנוטרת. איור 10 מציג תמונות מייצגות שצולמו בימים 1, 3, 7 ו-9 לאחר הזרקה והחדרת חלונות, ומדגים את ההתקדמות מתאים בודדים למיקרו-מטסטזות.

כל התמונות והסרטים נאספו באמצעות מיקרוסקופ מולטי-פוטון. הקרנות בעוצמה מרבית ויישור סרטים לאורך צירי Z ו-X לאורך זמן נוצרו באמצעות תוכנת ImageJ. תמונות וסרטים מיושרים נאספו לאחר מכן באמצעות תוכנת אימריס.

Figure 1
איור 1: החדרה כירורגית של חלון הדמיית בטן גחונית מעל הכבד. התיבה המקווקו הלבנה מתארת את השדה הכירורגי הנצפה בתמונות. (B) מתבצע חתך המתחיל ב-3 מ"מ מתחת לתהליך ה-xiphoid וממשיך למטה כך שמקטע עור בגודל 1–1.5 ס"מ2 מוסר לאורך קו האמצע. (C) קטע מעט קטן יותר של הצפק מנותח. (D) הרצועה הבזית (ראש החץ הלבן) נקטעת, ודוחפת את הכבד כלפי מטה. הערה: צמר גפן מטושים לחים עם מלח סטרילי משמשים למניפולציה עדינה של איברים פנימיים. (E) באמצעות מזרק, כמות קטנה של דבק כירורגי מוחלת בטיפות סביב אזור העניין על פני השטח של הכבד. (F) החלון ממוקם ומוחזק בחוזקה כנגד הכבד עד שהדבק מתייבש (2 דקות). (G) קצות החלון מקופלים מתחת לצפק ולעור. (H) כדי לאבטח את החלון לצפק, מוחל דבק על פני החלון המתאים לאזור המוצל, לפני שדוחפים עליו את הצפק ומדביקים אותו למקומו. העור מודבק באופן דומה על הצפק. שפת דבק מופקדת לבסוף לאורך הקו האדום כדי למנוע צמיחה של האפיתל מעל החלון. (I) אותה תמונה כמו ב-(H) ללא הסימונים המראים את העכבר מוכן להחלמה לאחר הניתוח. השטח המתואר בקווים מקווקווים מוגדל ב- (J, K). (J) סימנים מטיפות הדבק נראים על פני השטח של הכבד (ראשי חץ) (K) אותה תמונה כמו ב-J המציגה את הכבד הנראה דרך החלון המתואר על ידי קו מקווקו לבן. טיפות הדבק על פני השטח של הכבד מתוארות באדום. האזור שיש להצטלם מתואר באופן מוגדר בלבן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: החדרה כירורגית של חלון מעל האונה הימנית של הכבד. (א) הקריקטורה מציגה את מיקומם האנטומי של המבנים הרלוונטיים לניתוח. התיבה המקווקו השחורה מתארת את השדה הכירורגי הנצפה בתמונות. (B) העכבר ממוקם בתנוחת דקוביטוס הצידית השמאלית, מתבצע חתך החל מ-3 מ"מ מתחת לכלוב הצלעות, ומוסר קטע עור של כ-1 ס"מ2 . (C) קטע מעט קטן יותר של הצפק מנותח. (D) הכבד נמשך בעדינות למטה מתחת לכלוב הצלעות באמצעות צמר גפן לח. (E) באמצעות מזרק, כמות קטנה של דבק כירורגי מוחלת בטיפות (ראש חץ לבן) על פני השטח של הכבד. (F) החלון ממוקם ומוחזק בחוזקה כנגד הכבד עד שהדבק מתייבש (2 דקות). (G) קצות החלון מקופלים מתחת לצפק ולעור. (H) כדי לאבטח את החלון לצפק, דבק מוחל על פני השטח של החלון, המתאים לאזור המוצל, לפני שדוחפים עליו את הצפק ומדביקים אותו למקומו. העור מודבק באופן דומה על הצפק. גם שפת דבק מופקדת לאורך הקו האדום כדי למנוע צמיחה של האפיתל מעל החלון. (I) בהגדלה גבוהה, הכבד (המתואר על ידי קו מקווקו לבן) נראה דרך החלון. אזור ההדמיה מסומן על-ידי הרשת המוטבעת בחלון (ראש החץ הלבן). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: החדרה כירורגית של חלון מעל הלבלב. (א) הקריקטורה מציגה את מיקומם האנטומי של המבנים הרלוונטיים לניתוח. התיבה המקווקו השחורה מתארת את השדה הכירורגי הנצפה בתמונות. (B) העכבר ממוקם במיקום הדקוביטוס הצדדי הימני. הטחול נראה דרך העור המגולח (קו מקווקו) (C) חתך נעשה החל מ -3 מ"מ מתחת לכלוב הצלעות, וכ 1 ס"מ2 קטע של העור מוסר. (D) קטע מעט קטן יותר של הצפק מנותח. (E) הלבלב (ראש החץ הלבן) ממוקם בעדינות עם צמר גפן לח במיקום החלון. (F) באמצעות מזרק, כמות קטנה של דבק כירורגי מוחלת על הטחול, כמו גם על הלבלב (הרחק מהאזור כדי להצטלם). (ז) החלון ממוקם ומוחזק בחוזקה כנגד הלבלב עד שהדבק מתייבש (2 דקות). קצוות החלון מקופלים מתחת לצפק ולעור. (H) כדי לאבטח את החלון לצפק, מוחל דבק על פני החלון המתאים לאזור המוצל, לפני שדוחפים עליו את הצפק ומדביקים אותו למקומו. העור מודבק באופן דומה על הצפק. גם שפת דבק מופקדת לאורך הקו האדום כדי למנוע צמיחה של האפיתל מעל החלון. (I) בהגדלה גבוהה, הלבלב (המתואר על ידי קו מקווקו לבן) נראה דרך החלון. אזור ההדמיה מסומן על-ידי הרשת המוטבעת בחלון (ראש החץ הלבן). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: החדרה כירורגית של חלון מעל בלוטת היונק המפשעה. (א) הקריקטורה מציגה את מיקומם האנטומי של המבנים הרלוונטיים לניתוח. התיבה המקווקו השחורה מתארת את השדה הכירורגי הנצפה בתמונות. שים לב כי הניתוח יכול להתבצע עלבלוטות החלב 4 או 5. (B) העכבר ממוקם בתנוחת שכיבה על שדה כירורגי סטרילי. הפטמההימנית החמישית (ראש החץ) משמשת כנקודת ציון לביצוע החתך. (C) נעשה חתך, בלוטת החלב מופרדת מהעור שמעליו, ומוסר קטע עור של כ-1 ס"מ2. (D) באמצעות מזרק, כמות קטנה של דבק כירורגי מוחלת בטיפות סביב אזור העניין על פני החלב. (E) החלון ממוקם ומוחזק בחוזקה עד שהדבק מתייבש (2 דקות). (F) קצות החלון מקופלים מתחת לעור באמצעות מלקחיים. (ז) כדי להדק את החלון לעור, מורחים את הדבק על פני החלון המתאים לאזור המוצל, לפני שדוחפים עליו את העור כלפי מטה ומדביקים אותו למקומו. גם שפת דבק מופקדת לאורך הקו האדום כדי למנוע צמיחה של האפיתל מעל החלון.  (H) דוגמה לחלון המושתל מעל גידול קטןבבלוטת החלב הימנית ה-4 מסופקת. שטח המתואר עם קווים מקווקווים מוצג בהגדלה גבוהה יותר ב- (I). (I) טיפות הדבק על פני החלב מתוארות באדום. האזור שיש להצטלם מתואר באופן שחור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: לחלונות הדמיה מסיליקון יש תכונות אופטיות וחומריות חיוביות. (א–ג) כדי למדוד את פונקציית התפשטות הנקודות ולהשוות את תכונות ההדמיה של חלונות PDMS לאלה של כיסויי זכוכית, 40 ננומטר מיקרוספרות פלואורסצנטיות צהובות-ירוקות צולמו דרך חלונות PDMS בעובי משתנה או בכיסויי זכוכית (עובי #1.5)16. התמונות נאספו באמצעות ג'ל אולטרסאונד כמדיום טבילה כדי להתאים לתנאי ההדמיה התוך-ורידית. החלקות מציגות את הרוחב המלא המחושב בחצי מרבי (FWHM) ב- (A) ציר X, (B) ציר Y, ו- (C) ציר Z (ממוצע ± SD; n = 3/קבוצה, נרכש באמצעות שני חלונות נפרדים או יותר; ANOVA חד כיווני המשווה את כל חלונות PDMS לזכוכית עם מבחן ההשוואות המרובות של דאנט; רק הבדלים משמעותיים מסומנים). (D) היחס בין ערכי FWHM מחושבים בציר X ו- Y (א–ב) מוצג כמדד לסימטריה של תמונות המקור הנקודתיות לאורך צירי X ו-Y, ולכן של סטיות אופטיות. (ה–ג) מיקרוספרות צולמו דרך שלושה חלונות נפרדים יצוקים עם 200 מ"ג של PDMS (בדומה לחלונות ששימשו להדמיה תוך-ורידית עבור תרשים 9, איור 10, תרשים 11 ו סרט 2, סרט 3, סרט 4) או שלושה כיסויי זכוכית (עובי #1.5) למדידת פונקציית התפשטות הנקודה. בניגוד לדוגמאות ההדמיה התוך-ורידית, תמונות לחישובים אלה נאספו תוך שימוש במים כמדיום טבילה. העלילות מציגות את ה- FWHM המחושב ב- (E) ציר X, (F) ציר Y ו- (G) ציר Z (ממוצע ± SD; n = 3/קבוצה באמצעות שלושה חלונות נפרדים; מבחן מאן-וויטני, לא זוהו הבדלים משמעותיים). (H) תרשים מציג את היחס בין ערכי FWHM מחושבים בציר X ו- Y (ה–פ). (אני) חלקות מראות את שיא העוצמה הפלואורסצנטית לכל מיקרוספרה (ממוצע ± SD; n = 3/קבוצה; מבחן מאן-וויטני, לא זוהו הבדלים משמעותיים). כל התמונות נאספו באורך גל של 960 ננומטר ובהספק לייזר של 3%. מחסנית z של 100 μm נאספה עבור כל מיקרוספרה, עם גודל צעד של 0.6 מיקרומטר. מסגרת התמונה הוגדרה על 69 μm x 69 μm עם רזולוציה של 1022 פיקסלים x 1022 פיקסלים. הניתוח בוצע עם פיג'י - תוסף MetroloJ. (J) כדי לבחון את תכונות החומר, חלונות PDMS הוחזקו במתח ואובטחו בין שני מכונות כביסה בצורת טבעת באמצעות דבק-על כדי להבטיח תגובה אלסטית במהלך בדיקות מכניות. אותו הליך שימש להחלקות זכוכית מיקרו כיסוי ללא המתח בשל קשיחות הזכוכית. קצה העמסה המורכב מהמיספרה (קוטר 6 מ"מ) עם שחול גליל (קוטר 4 מ"מ, אורך 20 מ"מ) הודפס בתלת-ממד באמצעות נימה של חומצה פולילקטית. החלונות הועמסו לתוך מכונת בדיקת חומרים סרווהידראוליים תחת פרופיל בקרת עומס של 1 N/s עד לכשל בחומר. ערכי כוח ותזוזה נמדדו בתדר של 100 הרץ. התמונה מציגה את בדיקת החלון המוגדרת עם קצה הטעינה המוחל במרכז החלון. (K) העלילה מציגה את קשיחות החומר שנקבעה על ידי חישוב שטח הסיכום תחת עקומת מתח-מתח באמצעות פונקציית Trapz ב- MATLAB (ממוצע ± SEM; n = 3/קבוצה באמצעות שלושה חלונות PDMS נפרדים עבור כל עובי וכיסויי זכוכית; ANOVA חד-כיווני עם מבחן ההשוואות המרובות של Tukey). (L) העלילה מציגה את מודולוס יאנג שנקבע מהחלק הליניארי של עקומת המתח-מתח (ממוצע ± SEM; n = 3/קבוצה באמצעות שלושה חלונות PDMS נפרדים וכיסויי זכוכית; מבחן t עם התיקון של וולש). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: חלון הסיליקון מדגים סבילות גבוהה ואריכות ימים. (A) תמונה מייצגת של עכבר C57BL/6J זכר בן 7 שבועות עם חלון הדמיית בטן גחוני ללא רשת 11 יום לאחר ניתוח החלון. (B) תמונה מייצגת של עכבר C57BL/6J זכר בן 7 שבועות עם חלון הדמיה בלבלב המכיל רשת 14 יום לאחר ניתוח חלון. (C) תמונה מייצגת של עכבר C57BL/6J c-fms-EGFP בן 12 שבועות עם חלון הדמיה של בלוטת החלב המכיל רשת >7 ימים לאחר ניתוח החלון. (D) חלון הדמיית כבד בעכבר c-fms-EGFP בן 7 שבועות שצולם (שורה עליונה) וצולם (שורה תחתונה) ביום 0 (מיד לאחר הניתוח) ו-35 יום לאחר הניתוח. הסרת כמות העור המתאימה ואיטום הפצע בדבק מונעים מהעור לבצע אפיתל מחדש ולדחוף את החלון למעלה והחוצה, מה שמאפשר לדמות את האיבר לטווח ארוך. סרגלי קנה מידה = 30 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: הרשתות בתוך החלונות מאפשרות מעקב אחר אותו שדה ראייה. (A) מפרטים מפורטים לייצור מותאם אישית של חלונות נירוסטה חתוכים בלייזר. (B) ניתן לראות רשת המוטבעת בתוך חלון ההדמיה מעל הכבד, כאשר שפת הדבק סביב החלון נראית בבירור. (C) מבט על החלון דרך עיניהם של שני מיקרוסקופי הפוטונים. כלי דם (אדום) ואות ירוק מהכבד ניתן לראות ברקע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 8
תרשים 8: תגובה מערכתית ומקומית להכנסת חלונות. (א–ג) המשקל היה במעקב אחר נקבות C57BL/6J בנות 7 שבועות במשך תקופה של 28 ימים לאחר החדרת חלון בכבד (A), הלבלב (B) או בלוטת החלב (C). אחוז השינוי במשקל הגוף בהשוואה לעכברים שאינם מטופלים תואמי גיל מוצגים. (*) מציין עכבר שלא חזר למשקל גוף תקין ולכן היה מצונזר מניסוי הדמיה. אותם עכברי בקרה מוצגים בכל שלושת הלוחות להשוואה קלה יותר לכל סוג של חלון. (D) ספירת תאי דם לבנים (WBC) מנוטרת בימים 3, 14 ו-28 (חלון בלוטת החלב) או 35 (חלון הכבד או הלבלב) לאחר הניתוח. הטווח הנורמלי עבור ספירת WBC בעכבר מסומן על ידי קווים מקווקווים. (E,G,אני) צביעת המטוקסילין ואוזין של חתכי רקמות מבקרות לא מטופלות (משמאל) ועכבר C57BL/6J בן 7 שבועות 14 יום לאחר החדרת חלון הדמיה (מימין) מעל (E) כבד, (G) לבלב, או (אני) בלוטת החלב. (E,אני) נגעי גרגירים שטחיים ומוקדיים נראים במקומות בדידים לאורך פני השטח (חץ) של הכבד ובלוטת החלב, מה שמרמז על תגובה לדבק. רקמה תקינה המצוינת על ידי * נראית באזורים הסמוכים לנגעי הגרנולציה. בכל נקודת זמן הוערכו שלושה עכברים עם חלונות כבד (ימים 3, 14 ו-35 לאחר הניתוח), פרט לכך ש-6 עכברים עם חלונות כבד הוערכו ביום ה-35 לאחר הניתוח. שניים מתוך 3 עכברים הציגו רקמת גרגיר בימים 3 ו-14. 1 מתוך 3 עכברים הציג רקמת גרנולציה ביום ה-35.  שלושה בקרים ושלושה עכברים עם חלונות בלוטות החלב הוערכו בכל נקודת זמן (ימים 3, 14 ו-28 לאחר הניתוח). לשלושה מתוך 3 עכברים הייתה רקמת גרנולציה או תגובות דלקתיות ברקמת השומן של בלוטת החלב בימים 3 ו-14. אפס מתוך 3 עכברים הפגינו נגעי גרנולציה או תגובות דלקתיות ביום 28. (G) לא נראים נגעים משמעותיים בלבלב. שלושה פקדים ושלושה עכברים עם חלונות לבלב הוערכו בכל נקודת זמן (ימים 3, 14 ו-35 לאחר הניתוח). לעכברים עם חלונות לבלב לא הייתה רקמת גרגירים בשום נקודת זמן. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר (F,H,J) צביעה אימונוהיסטוכימית מולטיפלקס בוצעה על חלקי רקמות מתוך בקרות לא מטופלות ועכברי C57BL/6J בני 7 שבועות 14 יום לאחר החדרת חלון הדמיה מעל (F) כבד, (H) לבלב או (J) בלוטת החלב. נוגדנים נגד CD45, CD68 ומיאלופרוקסידאז (MPO) שימשו לסימון לויקוציטים, מונוציטים/מקרופאגים ונויטרופילים בהתאמה. צביעת CD45 ו-CD68 בוצעו באותו קטע ואילו צביעת MPO בוצעה על קטע טורי של אותה רקמה. הנוגדן נגד CD45 זוהה עם נוגדן משני מצומד HRP והצטלם תחילה, לאחר מכן הכרומוגן והנוגדן המשני הופשטו והשקופיות הודגמו עם נוגדן משני שזיהה אנטי-CD68. הכימות בוצע באמצעות תוכנת פיג'י על ידי סף צבע; הפרמטרים הותאמו על פני נוגדנים ורקמות. החלקות מציגות את הכימות כספירת תאים לכל שדה ראייה (FOV) (ממוצע ± SEM; n = 3/group; ANOVA חד-כיווני עם מבחן ההשוואות המרובות של Tukey; רק הבדלים משמעותיים מסומנים). (K) זכר C57BL/6J c-fms-EGFP לעכברים בני 8-11 שבועות הוכנס חלון הדמיה מסיליקון מעל האונה הימנית של הכבד. לקטין בעל תווית פלואורסצנטית (100 μL) הוזרק תוך ורידי מיד לפני כל פעולת הדמיה. התמונות הן מעכבר יחיד, באותו מוקד רשת בימים 1, 3 ו-5 לאחר הניתוח, במהירות של כ-200 מיקרומטר מתחת לרשת. סרגל קנה מידה = 30 מיקרומטר. התמונה צולמה באמצעות אורך גל עירור של 960 ננומטר, הספק לייזר 10%. כלי הדם מופיעים באדום. מקרופאגים מופיעים בירוק (חצים לבנים). נציג של שלושה עכברים מדומים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 9
איור 9: ניתן לדמיין גידולים בנקודות זמן מרובות במשך שבועות לאחר החדרת החלון. תמונות מייצגות מעכבר C57BL/6J זכר אחד בן 7 שבועות שהוזרק לו באופן אורתוטופי 1.5 x 104 תאי סרטן לבלב iGFP-1199 בזמן החדרת חלון הלבלב, והצטלם בימים 11 ו -14 לאחר החדרת החלון. סרגלי קנה מידה = 30 מיקרומטר. התמונה צולמה באמצעות אורך גל עירור של 960 ננומטר, הספק לייזר 10%. נציג של 6 עכברים שצולמו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 10
איור 10: שינויים דינמיים בהסתננות של תאי מערכת החיסון במהלך אינבולציה תקינה של בלוטת החלב. באמצעות רשת המתכת המוטמעת בחלון ההדמיה, ניתן לדמות את אותו מיקום במהלך שיפוץ רקמות רגיל, כגון במהלך החדרת בלוטת החלב. כדי להעריך עוד יותר את הפונקציונליות של חלונות הסיליקון בניטור שינויים דינמיים כמו חדירת תאי מערכת החיסון, נקבה בת 12 שבועות C57BL/6J x BALB/c ACTB-ECFP; עכבר LysM-eGFP עם חלון הדמיה שהוכנס מעל בלוטת החלב הבטנית צולם בימים 2 ו -4 לאחר התפשטות בלוטת החלב. נויטרופילים מופיעים בירוק (חצים לבנים). פעילות אלסטאז נויטרופילית הודגמה על ידי הזרקת גשושית פלואורסצנטית נויטרופילית אלסטאז 4 שעות לפני תחילת ההדמיה, ומופיעה באדום (או בצהוב כאשר קולוקל עם נויטרופילים). תאי האפיתל מופיעים בכחול. תצלומי בזק הם הקרנה בעוצמה מרבית של חמש תמונות לאורך ציר Z (עומק של 100–150 מ"מ). התמונות הן מסרטים 3A ו- 3B, ובתמונות השורה התחתונה, מוצג רק אות CFP והתמונות מסומנות בקו מקווקו אדום כדי להמחיש את אותם מיקומים בתוך רקמה בשתי נקודות הזמן השונות. סרגלי קנה מידה = 30 מיקרומטר. התמונה צולמה באמצעות אורכי גל של עירור של 960 ננומטר ו-1080 ננומטר, הספק לייזר ב-10% ו-15% בהתאמה. נציג של ארבעה עכברים מדומים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 11
איור 11: ניתן לעקוב אחר היווצרות גרורות סרטניות לאורך זמן. זכר C57BL/6J עכבר בן 10 שבועות שהוזרק לו 1 x 105 KPC-BL/6-1199 תאי סרטן לבלב המבטאים חלבון פלואורסצנטי ציאן מצומד (H2B-CFP) מצומד גרעיני מקומי (H2B-CFP) דרך וריד הפורטל בזמן החדרת החלון. הדמיית כבד בוצעה דרך חלון רוחבי 24 שעות (יום 1) לאחר ההזרקה ובשלוש נקודות זמן מאוחרות יותר (עד 9 ימים), כפי שצוין. תא סרטני יחיד הנראה בימים 1 ו-3 לאחר ההזרקה מסומנים בחצים לבנים. אות הרמוני שני מסיבי קולגן הודגם גם הוא בתעלת הציאן (חצים צהובים). התמונות הן מאותו עכבר בכל נקודת זמן שונה. תמונות במישור z יחיד שצולמו בין 300 מיקרומטר לעומק של 350 מיקרומטר ל-350 מיקרומטר. סרגלי קנה מידה = 30 מיקרומטר. התמונה צולמה באמצעות אורך גל עירור של 880 ננומטר. הספק לייזר ב-8%. נציג של שלושה עכברים מדומים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

סרט 1: חלונות סיליקון דמיונייםg נסבלים היטב בעכברים. הסרט מציג עכבר C57BL/6J זכר בן 9 שבועות 14 יום לאחר החדרת החלון. עכבר אינו מפגין אף אחת מההתנהגויות הסטנדרטיות הקשורות לכאב (למשל, טיפוח לקוי, עיניים עצומות או עייפות). מייצג שישה עכברים שתועדו, ועקבי עם יותר מ-100 עכברים שנצפו לאחר השתלה מוצלחת בחלון. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

סרט 2: הדמיה תת-תאית של תאי סרטן הלבלב המושתלים באופן אורתוטופי. תאי iGFP-1199 הוזרקו באופן אורתוטופי לתוך הלבלב של עכבר C57BL/6J זכר בן 7 שבועות והצטלמו ביום ה-11 לאחר הזרקת תאים סרטניים והחדרת חלונות. הסרט הוא הקרנה בעוצמה מקסימלית של שש תמונות לאורך ציר Z וחולצה מתקופת הדמיה של שעתיים. חותמת זמן (h:min:s:ms). נציג של שישה עכברים שצולמו. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

סרט 3: שינויים בחדירת תאי מערכת החיסון ב-ACTB-ECFP; עכברי LysM-eGFP במהלך ההתמרמרות. נקבה C57BL / 6J x BALB / c ACTB-ECFP; עכברי LysM-eGFP המבטאים GFP בתאי מיאלואידים (בעיקר בגרנולציטים אך גם במקרופאגים), ו-ECFP בכל התאים (אך הגבוהים ביותר בתאי אפיתל) גודלו בגיל 8 שבועות. לאחר פרידה, הגורים נורמלו לשישה גורים לכל עכבר. ביום ה-10 לאחר ההמלטה, הגורים נגמלו והוכנסו חלונות הדמיה של בלוטת החלב הבטנית. תאים מיאלואידים מופיעים בירוק; פעילות אלסטאז נויטרופילים, המסומנת באמצעות הגשושית הנויטרופילית אלסטאז 680 FAST שהוזרקה 4 שעות לפני תחילת ההדמיה, מופיעה באדום (תיראה צהובה כאשר תסומן עם נויטרופילים); ותאי אפיתל מופיעים בכחול. סרטים הם הקרנה בעוצמה מרבית של חמש תמונות לאורך ציר Z (עומק של 100-150 מיקרומטר). (A) הדמיה ביום 2 של התפשטות בלוטת החלב. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. התמונה צולמה באמצעות אורכי גל של עירור של 960 ננומטר ו-1080 ננומטר, הספק לייזר ב-10% ו-15% בהתאמה. (B) הדמיה ביום 4 של החדרת בלוטת החלב. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. הסרט הוא מאותו אזור עכבר ורקמות כמו סרט 3A. (C) הגדלה גבוהה יותר של אזור עניין מסרט 3B, המציג שני נויטרופילים המקיימים אינטראקציה זה עם זה ותאי האפיתל של בלוטת החלב. ניתן לראות את היווצרותן של בליטות ממברנה חולפות בקצה המוביל במהלך נדידת נויטרופילים. חותמת זמן (h:min:s:ms). נציג של ארבעה עכברים מדומים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את סרט 3A. אנא לחץ כאן כדי להוריד את סרט 3B. אנא לחץ כאן כדי להוריד את סרט 3C.     

סרט 4: שינויים בחדירת תאי מערכת החיסון בעכברי c-fms-EGFP במהלך ההסתערות. נקבות עכברי C57BL/6J c-fms-EGFP, עם מקרופאגים המסומנים ב-GFP, גודלו בגיל 8 שבועות. לאחר ההמלטה הותאמו לשישה גורים לכל עכבר. ביום ה-10 לאחר ההמלטה, הגורים נגמלו והוכנסו חלונות הדמיה של בלוטת החלב הבטנית. הסרט, שנרכש ביום הראשון (יום אחד לאחר החדרת החלון), מדגיש את ההסתננות הבולטת של המקרופאג' במהלך ההתמרמרות. מקרופאגים מופיעים בירוק, סיבי קולגן (דור הרמוני שני) מופיעים בכחול, וכלי דם מופיעים באדום (Lectin-DyLight 594). סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. תמונות הן הקרנות בעוצמה מרבית של חמש תמונות לאורך ציר Z (עומק של 100-150 אום). התמונה צולמה באמצעות אורכי גל עירור של 960 ננומטר ו-800 ננומטר, הספק לייזר ב-10% ו-15% בהתאמה. חותמת זמן (h:min:s:ms). נציג של שלושה עכברים מדומים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

קוד משלים 1. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קוד משלים 2. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

חלונות הדמיה תוך-ורידיים הם כלים חשובים להדמיה ישירה של תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים ברזולוציה תאית כשהם מתפתחים לאורך זמן. ההליך החדשני המתואר ליציקה והכנסת חלונות הדמיה גמישים מסיליקון בעכברים מתגבר על כמה מהבעיות הנפוצות ביותר עם חלונות הדמיה הנמצאים בשימוש כיום (הפרשה, שבירה והפרעה לניידות רגילה), מספק בטיחות נוספת לעכבר ומגביר את הנגישות של טכניקה זו.

חלונות ההדמיה הנפוצים ביותר כוללים מסגרת מתכת המחזיקה כיסוי זכוכית. מכשול מרכזי לשימוש בחלונות אב-טיפוס אלה הוא שאבטחת טבעת המתכת כרוכה בהליכי תפירה מייגעים, המחייבים אנשי צוות בעלי הכשרה כירורגית מתקדמת. בנוסף, ייצור המסגרות הוא יקר ודורש ציוד מיוחד. חלונות PDMS מתגברים על שתי הבעיות הללו. ההליך להכנסת חלונות PDMS מבטל את התפירה, מה שמוריד משמעותית את המחסום ללימוד הטכניקה. החומרים לייצור החלונות הם גם זולים וניתן לרכוש אותם בקלות. בנוסף, הן את צורת החלון והן את ההליך הכירורגי ניתן להתאים להדמיה של איברים שונים, כולל בלוטת החלב, הכבד, הלבלב, הטחול והמעי.

בעוד שחלונות ההדמיה התוך-ורידיים הנוכחיים מאפשרים הדמיה אורכית למשך מספר ימים בדרך כלל, מספר בעיות נפוצות מגבילות את השימוש בחלונות אלה לפרקי זמן ממושכים. המשקל והגודל של חלונות הזכוכית יכולים להפריע לתנועה החופשית של העכברים, והפרשה יכולה להצטבר כנגד החלון. עכברים יכולים גם לפגוע בכיסוי הזכוכית, וכתוצאה מכך פצעים וזיהומים. לעומת זאת, ההליך המתואר כאן שומר על אותה רמת נגישות לרקמה תוך מזעור המצוקה של בעלי החיים. PDMS הוא פולימר סינתטי בטוח, הניתן לביוגרפית, הנמצא בשימוש נרחב עבור יישומים ביו-רפואיים בבני אדם, כגון התקנים להעברת תרופות, ניתוחים לשחזור פנים ושתלי חזה. מעבר להגברת הסבילות של בעלי החיים לחלון, השימוש בחומר אינרטי מבחינה ביולוגית, בניגוד לזכוכית, חשוב במיוחד למחקרים המערבים את מערכת החיסון, שבהם דלקת מקומית תהיה השפעה מבלבלת. בנוסף, שיפור משמעותי הוא חיסול התפרים, שכן עכברים נושכים ומושכים בהם, מה שעלול לגרום לחלונות ההדמיה מזכוכית הממוסגרת במתכת ליפול. בעיה זו טופלה באופן חלקי על ידי דור חדש יותר של חלונות שתוכננו כך שהתפרים מוסתרים בחריץ9. עם זאת, אסטרטגיה אחרונה זו דורשת תפירת חוטי ארנק, שהיא הליך מסובך, מועד לטעויות, שלעתים קרובות גורם לתפרים להימשך חזק מדי, וכתוצאה מכך נמק של הרקמה וכאב. לכן, היכולת להדביק את החלון במקום מהווה יתרון גדול של גישת חלון הסיליקון. יתר על כן, החלון עשוי מחומר גמיש ועמיד בעל משקל זניח, מה שמקטין את השפעתו על תנועת החיה, כפי שהוערך בעבר בהשוואה בין חלונות שהשתמשו בסיליקון במקום במתכת כדי להחזיק כיסוי זכוכית17. על ידי ביטול מוחלט של מכסה הזכוכית, חלון הסיליקון מבטל את הבעיות הן עם מסגרות המתכת והן עם הזכוכית. יתר על כן, הגמישות של החלון מאפשרת להחדיר אותו בקלות ומפחיתה את כוח הלחץ הנגרם על ידי הדבקת משטח קשיח לאיברים, ובכך מפחיתה את הסיכון לנזק בלתי הפיך לרקמה הנצפית. בנוסף, מכיוון שהחלון הרבה יותר קל להכניס ולהחזיק במקום, ההליך הכולל לוקח פחות זמן, ומגביל את תופעות הלוואי האפשריות עקב הרדמה ממושכת. עבור החדרה מעל הכבד, ההבדל בזמן ההליך הוא משמעותי במיוחד, מ 45 דקות עבור חלונות ממוסגרים מתכת ל 15 דקות עבור חלונות הסיליקון. למעשה, בעוד שהכנסת מסגרת המתכת מעל הכבד דורשת כריתה של התהליך ה-xiphoid (הסחוס בקצה עצם החזה), שגם הוא עלול להכאיב ולגרום לדלקת מתמשכת, דיסקציה זו מיותרת להחדרת חלון הסיליקון. לבסוף, חלון ההדמיה המוצג בעבודה זו מספק יתרונות נוספים ביחס ליישומים אפשריים. לדוגמה, בניגוד לחלונות זכוכית, חלונות סיליקון מספקים גישה נוחה לרקמה, כך שניתן להזריק ישירות דרך החלון תאים סרטניים, צבעים פלואורסצנטיים או תרופות.

חלון הדמיית סיליקון נוסף המבוסס על PDMS המתאים להחדרה במגוון מקומות אנטומיים, כולל בלוטת החלב, תואר לאחרונה18. חלון זה מעוצב כדי ליצור צורה וקצה מיוחד המאפשר השתלה מהירה של החלון ללא צורך בתפרים או דבק. לעומת זאת, חלון הסיליקון המוצג כאן אינו דורש עובש מיוחד וחשוב מכך, ניתן לחתוך אותו לצורה במהלך ההליך הכירורגי כדי להתאים את עצמו למיקום האנטומי ולעכבר הבודד. למרות שהפרוטוקול המתואר כאן מחייב שימוש בדבק, דרישה נוספת זו מאפשרת הדמיה של איברי הבטן, כולל הכבד והטחול. יתר על כן, חלון הסיליקון המתואר כאן מאפשר הטבעה של רשת נירוסטה בתוך החלון, המספקת ציוני דרך התייחסות. ציוני דרך אלה מאפשרים מעקב אחר אותו מיקום בדיוק לאורך זמן ומאפשרים הדמיה חוזרת ונשנית של אותו אתר במשך מספר מפגשים (הדמיה אורכית) כדי לחקור תהליכים הנמשכים ימים עד שבועות כגון התפתחות של נגעים גרורתיים.

לסיכום, פותח חלון הדמיה מסיליקון לשימוש ב- IVM אורכי של בלוטת החלב או איברי הבטן. החלון ברור אופטית, עמיד מאוד וזול. הפשטות של הליך החדרת החלון מפחיתה את הכישורים הטכניים הנדרשים ליישום גישות הדמיה תוך-ורידיות מבוססות חלונות. יכולת ההסתגלות של החלון לאתרי רקמות מגוונים מאפשרת יישום של IVM במגוון עצום של מחקרים ביולוגיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

M.E. הוא חבר במועצה המייעצת למחקר עבור brensocatib עבור Insmed, Inc.; חבר במועצה המדעית המייעצת של Vividion Therapeutics, Inc.; יועץ עבור Protalix, Inc.; ומחזיקה במניות באגיוס פרמצבטיקה בע"מ. D.A.T. היא מייסדת שותפה של Mestag Therapeutics, והיא חברה במועצה המדעית המייעצת ומחזיקה במניות ב- Mestag Therapeutics, Leap Therapeutics, Surface Oncology ו- Cygnal Therapeutics. המחברים האחרים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים לרוב אייפרט על עזרתו בתכנון ואופטימיזציה של רשתות הנירוסטה שנחתכו בלייזר. עבודה זו נתמכה על ידי מרכז הסרטן CSHL (P30-CA045508) וכספים עבור M.E. מהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH) (1R01CA2374135 ו- 5P01CA013106-49); CSHL ונורת'וול בריאות; קרן משפחת תומפסון; לשחות ברחבי אמריקה; ומענק מקרן סימונס ל-CSHL. M.S. נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים תוכנית הכשרה למדעים רפואיים (T32-GM008444) והמכון הלאומי לסרטן של NIH תחת פרס מספר 1F30CA253993-01. L.M. נתמך על ידי מלגת פוסט-דוקטורט של קרן ג'יימס ס. מקדונל. J.M.A. הוא חתן מלגת מכון לחקר הסרטן/מלגת אירווינגטון פוסט-דוקטורט (פרס CRI #3435). D.A.T. נתמך על ידי המעבדה הייעודית של קרן לוסטגרטן לחקר סרטן הלבלב וקרן משפחת תומפסון. קריקטורות נוצרו עם Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape 3M 70200770819
Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2 Ethicon  N267H
ACTB-ECFP mice Jackson Laboratory 22974
AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole) Vector Laboratories  SK-4200
Alcohol swabs BD  326895
Anesthesia system Molecular Imaging Products Co.
Acqknowledge software and sensors  BIOPAC ACK100W, ACK100M, TSD110
Betadine spray  LORIS 109-08
c-fms-EGFP (MacGreen) mice Jackson Laboratory 18549
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 664
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) Invitrogen 14-0451-82
CD68 Antibody Abcam ab125212
Curity gauze sponges  Covidien
Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP)  Abcam ab6885
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)  Abcam ab97064
Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP)  Abcam ab102182
Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear Electron Microscopy Sciences 24236-10 Two-part, 10:1 mixing ratio
Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness  Electron Microscopy Sciences 72296-08
Ender-3 Pro 3D printer Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD
Far Infrared Heated blanket Kent Scientific RT-0520
Fc Receptor Blocker Innovex Biosciences NB309
Fiji imaging processing package https://imagej.net/software/fiji/
FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515) Invitrogen F8795
Gating system: BIOPAC Systems Inc. The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems.
Acqknowledge software  ACK100W, ACK100M
Diff. Amp. Module, C Series  DA100C
Dual Gating Sys small animal DTU200 
MP160 for Windows - Analysis system MP160WSW 
MouseOx Plus 120V  MOX-120V;015000 
Pressure Pad  TSD110 
Gelfoam Pfizer 9031508 Absorbable gelatin sponge
Hardened fine scissors Fine Science Tools 14090-11 Two pairs; stainless steel, sharp-sharp
tips, straight tip, 26 mm
cutting edge, 11 cm length
Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody R&D Systems AF3667
Hot bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45 Turn on approximately 30 min
before use; sterilize tools at >200
°C for 30 s
Imaris  Bitplane www.bitplane.com
Immersion medium Immersol W 2010 Zeiss 444969-0000-000 
Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc BD 324912
Isoflurane (Fluriso) VetOne 502017
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594 Vector Laboratories  DL-1177-1
LysM-eGFP mice www.mmrrc.org 012039-MU
Micro dissecting forceps Roboz RS-5135 Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length
Micro dissecting forceps Roboz RS-5153 1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip
width, 4" length
MTS MiniBionix II 808 MTS Systems Servohydraulic material testing machine
Neutrophil Elastase 680 FAST probe PerkinElmer NEV11169
Nitrogen General Welding Supply Corp.
Oxygen General Welding Supply Corp.
Polylactic acid filament Hatchbox 1.75 mm diameter
ProLong Diamond Antifade Mountant Invitrogen P36970
Puralube ophthalmic ointment Dechra  NDC17033-211-38
Reflex 7 wound clips Roboz Surgical RS-9255
Stainless steel grid Fotofab One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square.  
Surface Treated SterileTissue Culture Plates Fisher Scientific FB012929 Lid used as curing surface for imaging windows
TriM Scope Multiphoton Microscope  LaVision BioTec Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes:
T560LP
T665LPXXR
T495lxpr
Vetbond 3M 70200742529
VWR micro cover glass VWR 48404-453

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dondossola, E., et al. Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone. Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).
  2. Haeger, A., et al. Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche. Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184 (2020).
  3. Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
  4. Eickhoff, S., et al. Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions. Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).
  5. Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
  6. Sammicheli, S., et al. Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses. Science Immunology. 1 (4), (2016).
  7. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  8. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).
  9. Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
  10. Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. Recording the wild lives of immune cells. Science Immunology. 3 (27), (2018).
  11. Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), 29917 (2014).
  12. Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818 (2016).
  13. Anderson, T. L. Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , CRC Press, Taylor & Francis Group. Florida. (2005).
  14. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088 (2013).
  15. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  16. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  17. Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. Intravital. 5 (1), 1125562 (2016).
  18. Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).

Tags

חקר הסרטן גיליון 179
הדמיה תוך-ורידית אורכית דרך חלונות סיליקון שקופים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maiorino, L., Shevik, M., Adrover,… More

Maiorino, L., Shevik, M., Adrover, J. M., Han, X., Georgas, E., Wilkinson, J. E., Seidner, H., Foerschner, L., Tuveson, D. A., Qin, Y. X., Egeblad, M. Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows. J. Vis. Exp. (179), e62757, doi:10.3791/62757 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter