Summary
En tilnærming er her presentert for langsiktig intravital avbildning ved hjelp av optisk klare, silikonvinduer som kan limes direkte til vev / organ av interesse og huden. Disse vinduene er billigere og mer allsidige enn andre som for tiden brukes i feltet, og kirurgisk innsetting forårsaker begrenset betennelse og nød for dyrene.
Abstract
Intravital mikroskopi (IVM) muliggjør visualisering av cellebevegelse, divisjon og død ved encellet oppløsning. IVM gjennom kirurgisk innsatte bildevinduer er spesielt kraftig fordi det tillater langsgående observasjon av samme vev over dager til uker. Typiske bildevinduer består av en glassdekslelip i en biokompatibel metallramme som sutureres til musens hud. Disse vinduene kan forstyrre musenes frie bevegelse, fremkalle en sterk inflammatorisk respons, og mislykkes på grunn av knust glass eller revet suturer, hvorav noen kan nødvendiggjøre eutanasi. For å løse disse problemene ble vinduer for langsiktig abdominal organ og brystkjertelavbildning utviklet fra en tynn film av polydimetylsiloksan (PDMS), en optisk klar silikonpolymer som tidligere ble brukt til kranialavbildningsvinduer. Disse vinduene kan limes direkte til vevet, noe som reduserer tiden som trengs for innsetting. PDMS er fleksibel, noe som bidrar til holdbarheten hos mus over tid – opptil 35 dager er testet. Langsgående avbildning er avbildning av samme vevsområde under separate økter. Et rutenett i rustfritt stål ble innebygd i vinduene for å lokalisere samme region, slik at visualisering av dynamiske prosesser (som brystkjertelinvolusjon) på samme steder, dager fra hverandre. Dette silikonvinduet tillot også overvåking av enkeltforminderte kreftceller som utviklet seg til mikrometastaser over tid. Silikonvinduene som brukes i denne studien er enklere å sette inn enn metallrammede glassvinduer og forårsaker begrenset betennelse i det avbildede vevet. Videre tillater innebygde rutenett enkel sporing av samme vevsregion i gjentatte bildebehandlingsøkter.
Introduction
Intravital mikroskopi (IVM), avbildning av vev hos bedøvede dyr, gir innsikt i dynamikken i fysiologiske og patologiske hendelser ved cellulær oppløsning i intakt vev. Anvendelsene av denne teknikken varierer mye, men IVM har vært medvirkende i kreftbiologifeltet for å bidra til å belyse hvordan kreftceller invaderer vev og metastasererer, samhandler med det omkringliggende mikromiljøet og reagerer på legemidler 1,2,3. I tillegg har IVM vært nøkkelen til å fremme forståelsen av de komplekse mekanismene som styrer immunresponsen ved å gi innsikt komplementær til ex vivo profileringsmetoder (f.eks. strømningscytometri). For eksempel har intravitale bildebehandlingsforsøk avslørt detaljer om immunfunksjoner når de gjelder cellemigrasjon og cellecellekontakt og har tilbudt en plattform for å kvantisere romlig dynamikk som svar på skade eller infeksjon 4,5,6,7. Mange av disse prosessene kan også studeres gjennom histologisk farging, men bare IVM tillater sporing av dynamiske endringer. Faktisk, mens en histologisk seksjon tilbyr et øyeblikksbilde av vevet på et gitt tidspunkt, kan intravital avbildning spore intercellulære og subcellulære hendelser i samme vev over tid. Spesielt har fremgang i fluorescensmerking og utvikling av molekylære reportere gjort det mulig å korrelere molekylære hendelser med cellulær atferd, for eksempel spredning, død, motilitet og interaksjon med andre celler eller den ekstracellulære matrisen. De fleste IVM-teknikker er basert på fluorescensmikroskopi, som på grunn av lysspredning gjør avbildning av dypere vev utfordrende. Interessevevet må derfor ofte eksponeres kirurgisk med en ofte invasiv og terminal prosedyre. Således, avhengig av organstedet, kan vevet avbildes kontinuerlig i en periode som varierer fra noen få til 40 h8. Alternativt tillater kirurgisk innsetting av et permanent bildevindu bildet av det samme vevet sekvensielt over en periode på dager til uke 7,9.
Utviklingen av nye bildevinduer har blitt fremhevet som et teknologisk behov for å forbedre intravital bildebehandling ytterligere tilnærminger10. Det prototypiske intravitale bildevinduet er en metallring som inneholder en glassdeksler festet til huden med suturer11. Interferens med fri bevegelse, opphopning av ekssudat og skade på glassdekslene er vanlige problemer sett ved bruk av slike vinduer. Videre krever det prototypiske vinduet spesialisert produksjon, og den kirurgiske prosedyren kan kreve omfattende opplæring. For å løse disse problemene ble polydimetylsiloksan (PDMS), en silikonpolymer, som tidligere har blitt brukt i kranialvinduer for langvarig avbildning i hjernen12, tilpasset for bruk i mageorgan og brystkjertelavbildning. Her presenteres en detaljert metode for å generere PDMS-baserte silikonvinduer, inkludert hvordan du kaster vinduet rundt et rutenett i rustfritt stål for å gi landemerker for gjentatt bildebehandling av de samme vevsområdene. Videre er en enkel, stingfri kirurgisk prosedyre for å sette inn vinduet over bukorganer eller brystkjertelen beskrevet. Denne nye tilnærmingen overvinner noen av de vanligste problemene med bildevinduer som brukes for øyeblikket, og øker tilgjengeligheten til langsgående intravital avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som er beskrevet ble utført i samsvar med Cold Spring Harbor Laboratory Surgical Guidelines og hadde blitt godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Cold Spring Harbor Laboratory.
1. Støping av silikonvinduet
- Forbered silikonpolymeren (PDMS) ved å blande baseelastomeren og herdemiddelet i et forhold på 10:1 (v/v).
- Kast et vindu ved å deponere en liten mengde PDMS på en steril, jevn overflate og juster volum-til-område-forholdet til ønsket tykkelse.
MERK: Bruk av 200 mg polymeroppløsning for en sirkel med diameter på 22 mm på lokket på et 24-brønnslokk resulterer i et godt kompromiss mellom vindusturdiness og optisk klarhet. - Valgfritt: For å gi landemerker for gjentatt avbildning av de samme vevsområdene, trykk lett et rutenett i rustfritt stål inn i silikonet etter at PDMS er på ønsket støpeflate.
- For å fjerne luftbobler, plasser den belagte overflaten i en vakuumdesiccator i 45 min for å degas polymeren.
- Herd silikonvinduene i en ovn ved 80 °C i 45 minutter.
- Skår polymeren på kantene av formen og skrell forsiktig de herdede vinduene fra overflaten som brukes til støping med tang.
- Før operasjonen steriliserer du vinduene ved autoklavering.
2. Forbereder musen for innsetting av silikonvinduet
- Bedøv musen i et induksjonskammer ved hjelp av 4% (v / v) isofluran. Flytt musen til en oppvarmingspute på det kirurgiske bordet, plasser musen i anestesi nesemasken, og senk isoflurankonsentrasjonen til 2% for vedlikehold gjennom hele operasjonen.
- Kontroller dybden av anestesi ved å klemme tærne på bakre lemmer. Ikke fortsett før musen er inaktiv og ikke viser tå klype refleksrespons.
- Påfør oftalmisk smøremiddel på øynene for å forhindre at de tørker og forhindrer traumer.
- Administrer pre-emptive analgesi (buprenorfin 0,05 mg/kg) subkutant.
- Barber det kirurgiske stedet og fjern håret helt med en hårfjerningskrem.
- Påfør povidon-jodoppløsning (10% v / v) og etanol (70% v / v) fortløpende 3x for å forhindre infeksjon på operasjonsstedet.
3. Sette inn et ventralvindu for avbildning i leveren; tilpasningsdyktig for andre bukorganer (figur 1)
- Plasser musen i liggende stilling.
- Lag et snitt på 10 mm som starter 3 mm ned fra xiphoid-prosessen ved hjelp av steril saks og tang.
- Fjern en 1-1,5 cm2 del av huden langs midtlinjen.
- Bruk et annet par steril saks og tang for å fjerne en del av bukhinnen litt mindre enn huddelen.
- Valgfritt: For å visualisere en større del av leveren, bruk sterile bomullspinne fuktet med steril saltvann for å skyve leveren ned fra membranen som avslører falciform ligamentet som forbinder leveren med membranen. Sever ligamentet pass på ikke å kutte den dårligere vena cava.
- Trekk ut kirurgisk lim med en 31 G sprøyte, påfør en liten mengde av den på overflaten av leveren rundt kantene på området som skal avbildes. Dette limet skaper en sirkulær forsegling, slik at midtområdet er intakt for avbildning.
FORSIKTIG: Begrens limet til små dråper som danner et sirkulært mønster rundt bildeområdet. Vev umiddelbart i kontakt med limet kan ikke avbildes. Det er ikke nødvendig å tørke vevet før du påfører limet.
MERK: Eventuelle cyanoacrylatbaserte lim kan brukes med hell for denne prosedyren. Kirurgisk lim sikrer sterilitet. For terminalprosedyrer gir all-purpose superlim gode resultater. - Plasser vinduet med tang og hold det godt mot leveren til limet har tørket (~2 min).
- Brett kantene på vinduet under bukhinnen.
- Med en sprøyte, avsett en liten mengde kirurgisk lim på kantene av vinduet som nå er under bukhinnen. Trykk ned på bukhinnen med tang for å feste den til vinduet.
- På samme måte, deponer en liten mengde kirurgisk lim på bukhinnen før du skyver ned på huden med tang for å sikre den til bukhinnen.
MERK: Hvis det utføres riktig, skal et sirkulært område av levervev nå være synlig gjennom vinduet. - Påfør lim rundt kantene på vinduet for å lage en kant som vil bidra til å forhindre at huden vokser tilbake over vinduet.
FORSIKTIG: Hvis prosedyren utføres ved hjelp av sterile kirurgiske teknikker og vinduet steriliseres før innsetting, er det tilstrekkelig å forsegle såret med kirurgisk lim for å unngå infeksjoner. Unnlatelse av å følge riktige aseptiske teknikker under kirurgisk innsetting eller ufullkommen lukking kan imidlertid føre til overt eller subklinisk infeksjon og tørking ut av vevet.
4. Sette inn et sidevindu for avbildning i leveren; kompatibel med samtidig injeksjon av kreftceller i portalvenen (figur 2)
- Plasser musen på venstre side-decubitus-posisjon
- Lag et snitt på 10 mm på høyre flanke 3 mm under kostbuen ved hjelp av steril saks og tang.
- Fjern en 1 cm2 del av huden.
- Bruk et annet par steril saks og tang for å fjerne en del av bukhinnen litt mindre enn huddelen.
- Trekk ut kirurgisk lim med en 31 G sprøyte, påfør en liten mengde av den på overflaten av leveren rundt kantene på området som skal avbildes.
FORSIKTIG: Begrens limet til små dråper som danner et sirkulært mønster rundt bildeområdet. Vev umiddelbart i kontakt med limet kan ikke avbildes.
MERK: Eventuelle cyanoacrylatbaserte lim kan brukes med hell for denne prosedyren. Kirurgisk lim sikrer sterilitet. For terminalprosedyrer gir all-purpose superlim gode resultater. - Plasser vinduet med tang og hold det godt mot leveren til limet har tørket (~2 min).
- Brett kantene på vinduet under bukhinnen.
- Med en sprøyte, avsett en liten mengde kirurgisk lim på kantene av vinduet som nå er under bukhinnen. Trykk ned på bukhinnen med tang for å feste den til vinduet.
- På samme måte, deponer en liten mengde kirurgisk lim på bukhinnen før du skyver ned på huden med tang for å sikre den til bukhinnen.
MERK: Hvis det utføres riktig, skal et sirkulært område av levervev nå være synlig gjennom vinduet. - Påfør lim rundt kantene på vinduet for å lage en kant som vil bidra til å forhindre at huden vokser tilbake over vinduet.
- Hvis en portal vene injeksjon er nødvendig:
- Plasser musen i liggende stilling.
- Lag et 10 mm snitt som starter ned fra xiphoid-prosessen i huden.
- Bruk et annet par steril saks og tang, lag et 10 mm snitt i bukhinnen.
- Dypp to bomullspinne i steril saltvann.
- Bruk bomullspinnene til forsiktig å trekke tarmen på steril gasbind fuktet med steril saltvann, pass på at du ikke vrir eller på annen måte forstyrrer orienteringen.
- Fortsett å fortrenge tarmen fra bukhulen til portalvenen er synlig på høyre side av magen.
- Sett inn en 31-33 G nål 5-7 mm kaudal til inngangspunktet for portalvenen i leveren, sørg for å fortsette i blodkaret og ikke gjennom det.
- Injiser kreftcellene langsomt (resuspendert i 100 μL steril PBS).
MERK: For dette eksperimentet kan amurin kreftcellelinje i bukspyttkjertelen (f.eks. KPC-BL/6-1199) dyrkes i komplette DMEM-medier og 1 x 105 celler injisert i 100 μL steril PBS. - For å unngå blødning, umiddelbart etter at nålen er trukket ut, legg forsiktig trykk på injeksjonsstedet med et lite stykke kirurgisk svamp i 1-2 min.
- Etter at trykket er sluppet, overvåk stedet i 1-2 min for å sikre hemostase.
- Bruk fuktede bomullspinne, returner tarmen inn i bukhulen etter organets fysiologiske orientering.
- Bruk sterile tang, sett inn vinduet umiddelbart under bukhinnen, på venstre side av bukhulen på musen.
- Sutur med 4-0 silke suturer og stift midtlinjen snitt med 7 mm rustfritt stål sårklemmer.
- Flytt musen til venstre lateral decubitus posisjon
- Lag et snitt på 10 mm på høyre flanke 3 mm under kostbuen gjennom huden ved hjelp av steril saks og tang.
- Fjern en 1 cm2 del av huden rundt snittet.
- Bruk et annet par steril saks og tang for å fjerne en del av bukhinnen litt mindre enn huddelen.
- Trekk vinduet på plass over leveren før du limer det på plass, som beskrevet under trinn 4.8-4.10.
5. Sette inn vinduet for avbildning i bukspyttkjertelen (figur 3)
- Plasser musen på høyre lateral decubitus posisjon.
- Lag et snitt på 10 mm på venstre flanke 3 mm under kostnadsbuen ved hjelp av steril saks og tang.
- Fjern en 1 cm2 del av huden rundt snittet.
- Bruk et annet par steril saks og tang for å fjerne en del av bukhinnen litt mindre enn huddelen.
- Bruk sterile bomullspinne gjennomvåt med steril saltvann, trekk forsiktig på milten for å visualisere bukspyttkjertelen. Fortsett å omplassere bukspyttkjertelen med de fuktede bomullspinnene for å gjøre mer overflateareal synlig gjennom snittet.
MERK: På dette tidspunktet kan kreftceller i bukspyttkjertelen injiseres ortopisk i bukspyttkjertelen hvis det er en del av eksperimentell design. - Trekk ut kirurgisk lim med en 31 G sprøyte, påfør en liten mengde av den på overflaten av bukspyttkjertelen rundt kantene på området som skal avbildes.
FORSIKTIG: Begrens limet til små dråper som danner et sirkulært mønster rundt bildeområdet. Vev umiddelbart i kontakt med limet kan ikke avbildes. - Plasser vinduet med tang og hold det godt mot bukspyttkjertelen til limet har tørket (~2 min).
- Brett kantene på vinduet under bukhinnen.
- Med en sprøyte, avsett en liten mengde kirurgisk lim på kantene av vinduet som nå er under bukhinnen. Trykk ned på bukhinnen med tang for å feste den til vinduet.
- På samme måte, deponer en liten mengde kirurgisk lim på bukhinnen før du skyver ned på huden med tang for å sikre den til bukhinnen.
MERK: Hvis det utføres riktig, skal et sirkulært område av bukspyttkjertelvev nå være synlig gjennom vinduet. - Påfør lim rundt kantene på vinduet for å lage en kant som vil bidra til å forhindre at huden vokser tilbake over vinduet.
6. Sette inn vinduet for avbildning i brystkjertelen (figur 4)
- Plasser musen på liggende stilling.
- Lag en 10 mm snittmedial til en av de inguinale brystvortene ved hjelp av steril saks og tang.
- Fjern en 0,5 cm2 del av huden over brystkjertelen.
- Bruk et annet par steril saks for å forsiktig skille brystkjertelen fra huden ved å spre saksen mellom de to overflatene for å forstyrre overholdelsen.
MERK: For å lette avbildningen av det inguinale brystkjertelområdet, må du være forsiktig med å dissekere en del av huden over brystkjertelen, men overlegen bakbenet, slik at vinduet ikke begrenser musens mobilitet. - Trekk ut kirurgisk lim med en 31 G sprøyte, påfør en liten mengde av den på overflaten av brystkjertelen rundt kantene på området som skal avbildes.
FORSIKTIG: Begrens limet til små dråper som danner et sirkulært mønster rundt bildeområdet. Vev umiddelbart i kontakt med limet kan ikke avbildes. - Plasser vinduet med tang og hold det godt mot brystkjertelen til limet har tørket (~2 min).
MERK: Et sirkulært område av brystkjertelvev skal nå være synlig gjennom vinduet hvis det utføres riktig. - Brett kantene på vinduet under huden.
- Med en sprøyte, deponer en liten mengde kirurgisk lim på kantene av vinduet som nå er under huden. Trykk ned på huden med tang for å feste huden til vinduet.
- Påfør lim rundt kantene på vinduet for å lage en kant som vil bidra til å forhindre at huden vokser tilbake over vinduet.
7. Post-kirurgisk utvinning
- Plasser musen i et rent gjenopprettingsbur med rikelig hekkemateriale, og sørg for at en del av buret hviler på en varmepute.
- Overvåk musen kontinuerlig til den er bevisst og mobil.
- Gi om nødvendig en ekstra dose smertestillende 12 timer etter forkjøpsdosen.
MERK: Ekstra smertestillende er generelt unødvendig, men kontakt en veterinær hvis musen viser tegn på nød (for eksempel hunched tilbake, unkempt pels eller tapt interesse for mat). Overvåk musen daglig de første 3 dagene etter operasjonen for tegn på infeksjon eller andre bivirkninger. Mindre enn 2% av musene krever veterinær oppmerksomhet eller eutanasi, vanligvis på grunn av delvis løsrivelse av vinduet. Det er viktig å merke seg at for mannlige mus med ventral leveravbildningsvinduer kan kamp mellom mus føre til løsrivelse av vinduer. Dette unngås ved å huse musene separat.
8. Bildebehandling gjennom vinduet
- Bedøv musen i et induksjonskammer ved hjelp av 4% (v / v) isofluran.
- Påfør oftalmisk smøremiddel på øynene for å forhindre at de tørker og forhindrer traumer.
- Flytt musen fra induksjonskammeret til mikroskopstadiet. Plasser musen i anestesi nesemasken, og senk isoflurankonsentrasjonen til ca. 1-1,5% for vedlikeholdsbedøvelse gjennom bildeprosedyren.
- Plasser en trykkputesensor under musen for å overvåke pustehastigheten og feste musen til scenen ved hjelp av mykt kirurgisk tape.
- Sett inn et rektaltermometer for å overvåke kroppstemperaturen gjennom bildebehandlingsøkten.
- Slå på den oppvarmede puten, og følg musen nøye for å sikre at kroppstemperaturen ikke overstiger 37 °C.
- Bruk programvare for å overvåke musens pustehastighet. Den optimale hastigheten er ~ 1 pust / sekund. Juster anestesi etter behov.
- Før hver bildeøkt rengjør du vinduet fra ethvert gjenværende objektivinnlevelsesmedium og rusk ved å tørke det forsiktig med en bomullspinne dyppet i 70% etanol (v / v).
- Når du bruker en vann nedsenkningslinse, bruk ultralydgel på vinduet, unngå bobler.
MERK: Destillert vann kan også brukes, men kan kreve påføring under avbildning. - For å finne den optimale dybden for avbildning, finn først rutenettet og plasser det i fokus.
- Bestem den omtrentlige vevsavbildningsdybden ved å sette bunnen av rutenettet til 0. Denne informasjonen er nødvendig for å finne det tilsvarende z-planet i etterfølgende bildebehandlingsøkter.
- Hvis du vil identifisere samme sted over flere bildebehandlingsøkter, bruker du firkantene i rutenettet som et referansepunkt. Under bildet noterer du retningen på rutenettet og plasseringen i rutenettet for hvert synsfelt som er avbildet (for eksempel 2. rad fra toppen, 4. firkant fra venstre).
- Under påfølgende bildebehandlingsøkter bruker du rutenettet til å navigere tilbake til bestemte rutenettområder – og dermed bildefelt.
- Etter hver bildeøkt fjerner du eventuelle gjenværende linseinnlevelsesmedium og rusk ved å tørke av vinduet forsiktig med en bomullspinne dyppet i 70% etanol (v / v).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intravital avbildning gjennom bildevinduer kan brukes til å observere, spore og kvantifisere et bredt spekter av cellulære og molekylære hendelser ved encellet oppløsning over en periode på timer til uker. Ideelle funksjoner for et bildevindu inkluderer: a) begrenset innvirkning på musens velvære og vevets fysiologi; b) holdbarhet; c) enkelhet ved innsetting; og d) klare landemerker for gjentatt avbildning av samme region. Resultatet er et allsidig, inert silikonvindu som enkelt produseres og settes inn, og som kan utstyres med et rutenett for å finne det samme synsfeltet i løpet av flere bildeøkter.
Vinduet er laget av PDMS, som er et billig, fleksibelt og klart materiale. Windows kan brukes med forsyninger som er allment tilgjengelige for kjøp for de fleste laboratorier. Til disse formål fungerer de sirkulære formene (22 mm diameter) som allerede er etset på lokket på kommersielt tilgjengelige 24 brønnplater godt. Ved å variere mengden polymer som brukes per enhetsområde, er det mulig å justere tykkelsen på vinduet. For å dokumentere effekten av tykkelsen på vinduet på bildeoppløsning, ble det utført en punktspredningsfunksjon (PSF) analyse av 40 nm fluorescerende mikrosfærer for å sammenligne bildet gjennom PDMS-vinduer med varierende tykkelser til glassdeksler som vanligvis brukes til intravitale bildevinduer (0,17 mm tykke). For å gjenskape oppsettet som brukes til intravital avbildning, ble PSF-avbildningen utført ved hjelp av samme to-fotonmikroskop og vanninnlevelseslinse med ultralydgel påført som et nedsenkingsmedium.
Full bredde ved halv maksimum (FWHM) av signalintensiteten beregnet via PSFs passform i sideplanene var sammenlignbar med glasset for PDMS-vinduer med 100 mg PDMS (figur 5A, B). Sideoppløsningen sammenlignet med glassdeksler ble redusert for vinduer med 150–250 mg PDMS (figur 5A,B). I z-aksen bildeplan, PDMS vinduer støpt med 100-200 mg polymer utført bedre enn glass coverlips (Figur 5C). Optisk klarhet gikk tapt i vinduer med 300 mg PDMS, noe som gjorde målingene upålitelige (figur 5A–C). X/Y-forholdet mellom FWHM-verdiene var ikke signifikant forskjellig mellom glass og PDMS av noen tykkelse, selv om forholdet mellom vinduer støpt med 200-250 mg polymer spesielt avviket fra 1 ved hjelp av ultralydgel som nedsenkningsmedium (figur 5D). Men når du bruker vann som nedsenkingsmedium for vinduet støpt med 200 mg, var avviket fra symmetri mye mindre uttalt. Ved denne tykkelsen er avvik på grunn av avvik i polymeren derfor sannsynligvis mindre. Topp fluorescensintensitetsverdier ble også samlet inn for hver mikrosfære og viste at glass og PDMS utførte sammenlignbart, selv om det høyeste signalet ble registrert gjennom glass (figur 5I). Den optimale tykkelsen på PDMS-vinduet vil avhenge av bestemte applikasjoner og bildesystemer. For de fleste formål er 200 mg polymeroppløsning for et sirkulært vindu med 22 mm diameter et optimalt kompromiss mellom vindusturdiness og optisk klarhet. Faktisk var vinduer støpt med mindre enn 200 mg mer optisk klare, med FWHM-verdier som ligner på glass, men av og til rev under kirurgisk implantasjon, mens ingen tilfeller av vindusskade ble observert ved hjelp av 200 mg (i >100 mus).
For å måle denne forskjellen i materialegenskaper ble PDMS-vinduer (200 mg og 150 mg) lastet inn i en servohydraulic materialtestmaskin under en lastkontrollprofil på 1N/s til materialsvikt (figur 5J). Kraft- og forskyvningsverdier ble målt med en frekvens på 100 Hz. Kraftforskyvningsdataene ble deretter konvertert til stressbelastning ved hjelp av ligningene:
σ = F / A (1)
Ɛ = ΔL / L0 (2)
Hvor σ er stress (Pa), F er kraft (N), A er vinduets tverrsnittsområde, Ɛ er belastning, ΔL er forskyvningen, og L0 er tykkelsen på vinduet. Materialets seighet ble bestemt ved å beregne summeringsområdet under spenningsbelastningskurven. Seigheten til et materiale refererer til dets evne til å deformere plastisk og absorbere energi i prosessen før brudd - en nøkkelegenskap for implanterte vinduer13. I samsvar med observasjoner under bildebehandlingseksperimenter har vinduer med 200 mg PDMS betydelig større seighet enn vinduer støpt med 150 mg (figur 5K) og er derfor mindre utsatt for brudd.
Deretter ble Youngs Modulus (E) av de foretrukne PDMS-vinduene støpt med 200 mg bestemt og sammenlignet med standard glassdeksler ved å trekke ut den lineære regionen av stressstammekurven og bestemme skråningen ved hjelp av Hookes lov:
σ = EƐ (3)
Youngs modul av glassvinduene var betydelig større enn PDMS, noe som var forventet fordi glass er mye stivere i materialstyrke enn PDMS (figur 5L). Således, selv om glass er et sterkere materiale basert på sin større Youngs modulus, støtter den større seigheten til 200 mg PDMS-vinduene at de kan brukes i lengre perioder uten risiko for å bryte og nødvendiggjøre en annen kirurgisk prosedyre eller eutanasi.
En stor fordel med silikonvinduene er allsidighet. Det er viktig at prosedyren for kirurgisk innsetting av vinduet enkelt kan skreddersys til forskjellige anatomiske steder. Tilpasninger til operasjonen forenkles av det faktum at vinduene lett kan endres med kirurgisk saks og at vinduer limes til overflaten av vev / organ av interesse og til huden, og eliminerer helt kravet til suturer. Vellykket innsetting av vinduer på denne måten er oppnådd for leveren, bukspyttkjertelen og brystkjertelen (figur 6A-C). Spesielt ble to forskjellige protokoller utviklet for å implantere enten ventrale eller laterale vinduer for leveravbildning. Figur 1 viser trinnene for å sette inn et ventralvindu. Denne prosedyren kan tilpasses andre bukorganer og vil gi det største bildebare overflatearealet. Men med mindre et stort (>1 cm2) bildeområde er nødvendig, foretrekkes det å sette inn et sidevindu i høyre flanke av musen (figur 2) for å redusere bevegelsesartefakter, for eksempel på grunn av åndedrett og peristaltikk. I tillegg er den kirurgiske prosedyren for å sette inn sideavbildningsvinduet kompatibel med en samtidig injeksjon av kreftceller i portalvenen for å eksperimentelt modellere utviklingen av levermetastase. Dermed kan mus gjennomgå en enkelt prosedyre i stedet for to separate når portalveneinjeksjon og abdominal bildevinduinnsetting er nødvendig i samme dyr. En analog prosedyre brukes til å implantere et vindu over bukspyttkjertelen på venstre flanke av musen (figur 3). Vinduet kan også settes inn over subkutant vev, det vil si normale brystkjertler, samt allerede etablerte spontane eller ortopisk transplanterte brystsvulster (figur 4). Alternativt kan kreftceller injiseres i brystkjertelen gjennom vinduet for å langsgående følge utviklingen av en primærsvulst, da nåler kan punktere PDMS-filmen uten å gå på kompromiss med vinduets integritet.
På grunn av lav vekt og fleksibilitet forstyrrer silikonvinduer ikke musens mobilitet (film 1). Dermed overvinner silikonvinduer store hindringer forbundet med glassvinduer, for eksempel skjørhet, kompleks suturing og innvirkning på dyremobilitet. I stedet er hovedbegrensningen forbundet med silikonvinduer gjenveksten av epitelet under vinduet. Men når en passende mengde hud fjernes og såret er helt forseglet med lim, er re-epitelialisering begrenset, og avbildning kan fortsette over lengre perioder (opptil 35 dager er testet, figur 6D). Etter å ha satt inn vinduet, kan musen avbildes langsgående i omtrent en måned eller til det kirurgiske limet svikter eller re-epithelialisering oppstår. Korte daglige bildebehandlingsøkter (~60 min) eller mindre hyppige, men lengre bildebehandlingsøkter er foretrukket for å unngå anestesiinduserte bivirkninger. Vindusbærende dyr kan avbildes på en hvilken som helst intravital bildeplattform, både via enkeltfoton eller multifoton konfokal mikroskopi, ved hjelp av standardprosedyrer (se for eksempel 14). Før og etter hver bildeøkt anbefales det å rengjøre vinduet fra smuss og rusk ved å tørke det med en bomullspinne dyppet i 70% etanol (v / v).
For å spore samme sted over tid, kan rustfrie stålgitter bygges inn i vinduet. Figur 7A viser spesifikasjonene for de skreddersydde, laseretset rutenettene som brukes her inne. Kommersielle nett for transmisjonselektronmikroskopi er også egnet for denne applikasjonen. Gitteret er innebygd i vinduet under støpeprosedyren og er tydelig synlig over bildeområdet både for det blotte øye (figur 7B) og gjennom mikroskopets okular (figur 7C). Fordi vinduet er limt til overflaten av orgelet, er plasseringen av bildefelt i forhold til rutenettet stabil. Legg merke til retningen på rutenettet og plasseringen i rutenettet for hvert synsfelt som er avbildet (for eksempel 2. rad fra toppen, 4. firkant fra venstre). Deretter bruker du rutenettet til å navigere tilbake til bestemte rutenettområder – og dermed bildefelt – under påfølgende bildebehandlingsøkter.
Rutenettet er også nyttig for å justere bildefeltet under en bildebehandlingsøkt når vevet sakte går på grunn av for eksempel åndedrett eller peristaltikk. De fleste bildevinduer med en stiv kant kan festes til en holder under bildebehandling, noe som gir stabilitet til bildeområdet. Siden de fleksible vinduene ikke kan stabiliseres direkte, brukes kirurgisk tape til å stabilisere kroppsdelen som inneholder vinduet, og bildeområdet justeres på nytt til midten av den tilsvarende rutenettplassen eller tidligere identifiserte vevslandemerker (f.eks. vaskulære landemerker) ved definerte intervaller (vanligvis hvert 30. minutt). Ytterligere driftkorrigering for mikroskopisk flytting av synsfeltet utføres digitalt i etteranskaffelsesfasen gjennom kode som justerer rammene på nytt basert på oppdagede vevsmønstre (Tilleggskode 1-2).
For å bekrefte at vinduet ikke forårsaker noen overt systemisk bivirkning, ble vekten av dyr som hadde gjennomgått vindusimplantasjon og ubehandlede alderstilpassede kontroller overvåket. Etter et første vekttap forbundet med kirurgi, fortsetter de fleste mus med innsatte vinduer å gå opp i vekt over tid, noe som indikerer at vindusinnsetting er godt tolerert (figur 8A-C). For lever- og brystkjertelvinduer gjenvinnes normal vekt innen 5 dager fra operasjonen. Postoperativ utvinning er langsommere etter implantasjon av vinduet over bukspyttkjertelen, med mus tilbake til preoperativ vekt innen 14 dager. Denne observasjonen er i samsvar med de forventede effektene forbundet med manipulering av bukspyttkjertelen på operasjonstidspunktet. Merk at selv i tilfeller der vekttap ikke når terskelen for humant endepunkt, blir mus som ikke gjenvinner preoperativ kroppsvekt (<5% av alle mus, eksemplifisert av musen indikert av * i figur 8B) vanligvis sensurert fra bildeforsøk. I tillegg ble hvite blodlegemer, bestemt på ulike tidspunkter etter vindusinnsetting, ikke endret i nesten alle vindusbærende mus sammenlignet med kontroller og endret seg ikke betydelig over tid (figur 8D), noe som tyder på at vinduet ikke forårsaket stor systemisk betennelse.
Deretter, for å evaluere graden av lokal vevsrespons på vinduet og limet, ble mus euthanized ved 3, 14 og 28 (brystkjertelvinduer) eller 35 dager (lever- og bukspyttkjertelvinduer) etter kirurgisk innsetting av vinduet for histologisk analyse. Evaluering av hematoksylin og eosin (H&E) fargede leverseksjoner viste overfladisk (20-80 μm), minimal til mild kapsulær granuleringsvevsdannelse under vinduene for de fleste mus (2 av 3 mus evaluert på dag 3, og 2 av 3 evaluert på dag 14). Disse lesjonene var brennvidde (1–3 mm lange), tilsvarende omtrent bredden på limlaget (figur 8E). Etter 35 dager presenterte de fleste mus (4 av 6 evaluert i to separate eksperimenter) ikke granulært vev, mens noen få (2 av 6) hadde moderat fokal kapsulær sklerose og desmoplasi (på en dybde på 25-250 μm). Interessant ble det ikke observert noen signifikante lesjoner på overflaten av bukspyttkjertelen direkte under vinduet når som helst i kohorten av ni mus (figur 8G). Noen mus viste imidlertid områder av atrofi i bukspyttkjertelen og betennelse i bukfett (steatitt), i samsvar med manipulasjonsindusert skade. For brystkjertelen, på dag 3 etter vindusimplantasjon, hadde 3 av 3 mus enten granuleringsvev som minner om et helbredende snitt som er synlig langs overflaten av kjertelen eller en inflammatorisk reaksjon i fettvevet; på dag 14 hadde 3 av 3 mus evaluert granuleringsvev. Disse lesjonene var igjen brennvidde og 1–3 mm lange (figur 8I). Mus med brystkjertelvinduer euthanized 28 dager etter operasjonen viste ingen åpenbare histologiske abnormiteter.
Denne analysen antyder at vinduet ikke kompromitterer den generelle fysiologiske arkitekturen til organene som er testet (lever, bukspyttkjertel, brystkjertel). Det reaktive vevet som ble funnet på overflaten av leveren og brystkjertelen var sannsynligvis en reaksjon på limet og begrenset til vev umiddelbart i kontakt med limet. Normalt vev kan lett bli funnet ved siden av (< 100 μm) til det reaktive vevet i regioner som ikke er utsatt for lim (figur 8E, I), og vevsbetennelsen forstyrrer derfor ikke avbildningen av sunne vevsregioner. Videre er vevsreaksjonen sannsynligvis reversibel ettersom de fleste mus (8 av 9 mus, på tvers av alle vevssteder) ikke viste noen signifikante lesjoner på sentidspunkter (28 eller 35 dager), selv om direkte bekreftelse på at vevsreaksjonen løser seg ville være vanskelig å oppnå uten langsgående målinger hos individuelle mus.
Multiplekset immunhiistokjemisk farging for henholdsvis CD45, CD68 og myeloperoksidase (MPO) ble utført for å karakterisere infiltrasjonen av leukocytter, monocytter/makrofager og nøytrofiler. En økning i immuncelleinfiltrasjon assosiert med granuleringsvev og steatitt ble sett i brystkjertelen og leveren, men ikke i bukspyttkjertelen (Figur 8F, H, J). Vær oppmerksom på at disse endringene sannsynligvis var forbigående da immuncelleinfiltralet var sammenlignbart med de ubehandlede kontrollene på siste tidspunkt (28 dager for brystkjertelvinduer og 35 dager for lever- og bukspyttkjertelvinduer).
Leveren ble valgt som stedet for å ytterligere karakterisere om vindusinnsetting og avbildning forårsaket betydelig lokal immuninfiltrasjon ved hjelp av avbildning. For å gjøre dette ble c-fms-EGFP (MacGreen) mus15, der myeloide celler (for det meste makrofager) er merket med et grønt fluorescerende protein, brukt. Levervinduer ble implantert i tre c-fms-EGFP-mus og avbildet dem på dag 1, 3 og 5 etter operasjonen ved hjelp av rutenettet for å finne det samme synsfeltet. Antall makrofager som finnes i bildeområdet, ble ikke betydelig endret over tid etter vindusinnsetting (figur 8K).
Deretter ble vinduet funksjonstestet ved å avbilde et mangfoldig sett med biologiske prosesser på cellenivå (dvs. bevegelse, spredning, cellecellekontakt) og vevsnivå (dvs. tumorvekst i bukspyttkjertelen, immuninfiltrasjon under brystkjertelinvolusjon og levermetastase). Bukspyttkjertelen er ikke et lett tilgjengelig sted for avbildning. For å demonstrere hvordan vinduet kan brukes til å fange kreftcelledynamikk i dette organet, ble vinduer satt inn over bukspyttkjertelen til seks C57BL/6J-mus samtidig som ortotopisk injeksjon av KPC-BL/6-1199-celler, en kreftcellelinje i bukspyttkjertelen avledet fra en ofte brukt KPC (KrasLSL- G12D/+;p 53LSL-R17; Pdx1-Cre) genetisk konstruert musemodell av kreft i bukspyttkjertelen. For å bli visualisert ved konfokal mikroskopi ble KPC-BL/6-1199 celler konstruert for å uttrykke doxycyklin-induserbare forbedrede GFP (iGFP-1199 celler). Seks dager etter injeksjon ble musene satt på et doxycyklin diett for å utløse uttrykk for grønt fluorescerende protein (GFP) i bukspyttkjertelen kreftceller. Figur 9 viser representative bilder fra en mus som er ortopisk injisert med iGFP-1199-celler på dag 11 og 14 etter injeksjon og vindusinnsetting. Film 2 viser iGFP-1199 tumorkanten i et utdrag av en 2-timers bildeøkt på dag 11 etter vindusinnsetting, noe som illustrerer evnen til å fange dynamikken i cellemembranprojeksjon i bukspyttkjertelen ved hjelp av silikonvinduene.
Silikonvinduet kan også brukes til å fange dynamisk immuncelleinfiltrasjon over tid. For å illustrere dette ble brystkjertelvinduer instertert i lakterende ACTB-ECFP (Tg(CAG-ECFP)CK6Nagy); LysM-eGFP (Lyz2tm1.1Graf) mus umiddelbart etter avvenning. I disse musene er alle celler, men mest epitelceller, ekspress cyan fluorescerende protein (CFP) drevet av beta actin-promotoren, og myeloide celler - først og fremst nøytrofiler, men også makrofager - merket av eGFP drevet av lysozyme M-promotoren. Musene ble avbildet på dag 2 og 4 etter vindusinnsetting, under prosessen med brystkjertelinvolusjon, når brystkjertelvev begynner å gå tilbake til sin pre-graviditet tilstand. To makroer for ImageJ ble utviklet for å redusere bevegelsesartefakter og forbedre visualiseringen, den ene justerer Z-flyene i en 4-dimensjonal intravital video (Tilleggskode 1) og den andre reduserer wobbliness på grunn av pust eller andre bevegelsesartefakter (Tilleggskode 2). Figur 10 og Film 3A-C viser nøytrofiltrasjon i ombyggingen av brystkjertelvevet på samme sted på dag 2 og 4, noe som illustrerer hvordan vinduet kan brukes til å overvåke og spore immuncelleinfiltrasjon og bevegelse over forskjellige dager. Et analogt eksperiment ble utført i en c-fms-EGFP-mus, med myeloide celler (hovedsakelig makrofager) som uttrykte GFP drevet av c-fms-promotoren (Film 4).
Til slutt tillater det relativt store overflatearealet i dette tilpassbare vinduet observasjon av sjeldne hendelser, for eksempel dannelsen av levermetastase etter intravenøs inokulasjon. For å demonstrere dette fenomenet ble levervinduer satt inn i C57BL/6J-mus på tidspunktet for portalveneinjeksjon med KPC-BL/6-1199 kreftceller i bukspyttkjertelen som utgjør en konstant uttrykk for det kjernefysiske fusjonsproteinet histone2B-CFP (H2B-CFP). Over tid ble utveksten av enkeltceller og små klynger på 2-3 celler da de utviklet seg til mikrometastaser (>100 celler) overvåket. Figur 10 viser representative bilder tatt på dag 1, 3, 7 og 9 etter innsetting av injeksjon og vindu, og viser fremdriften fra enkeltceller til mikrometastaser.
Alle bilder og filmer ble samlet inn ved hjelp av et multifotonmikroskop. Maksimal intensitet projeksjoner og film justeringer langs Z og X akser over tid ble generert ved hjelp av ImageJ programvare. Justerte bilder og filmer ble deretter kompilert ved hjelp av Imaris programvare.
Figur 1: Kirurgisk innsetting av et ventralt abdominal bildevindu over leveren. (A) Tegneserien viser den anatomiske plasseringen av strukturer som er relevante for operasjonen. Den hvite stiplede boksen skisserer det kirurgiske feltet som vises på bildene. (B) Det gjøres et snitt som starter 3 mm under xiphoidprosessen og fortsetter ned slik at en 1-1,5 cm2 del av huden fjernes langs midtlinjen. (C) En litt mindre del av bukhinnen dissekeres. (D) Falciform ligamentet (hvit pilspiss) er kuttet, skyver leveren ned. Merk: Bomullspinne fuktet med steril saltvann brukes til å manipulere indre organer forsiktig. (E) Ved hjelp av en sprøyte påføres en liten mengde kirurgisk lim i dråper rundt interesseområdet på overflaten av leveren. (F) Vinduet er plassert og holdt fast mot leveren til limet har tørket (2 min). (G) Kantene på vinduet brettes under bukhinnen og huden. (H) For å feste vinduet til bukhinnen, påføres lim på overflaten av vinduet som tilsvarer det skyggelagte området, før du skyver bukhinnen ned på den og limer den på plass. Huden limes på samme måte på bukhinnen. En kant av lim blir til slutt avsatt langs den røde linjen for å forhindre vekst av epitelet over vinduet. (I) Samme bilde som i (H) uten markeringer som viser musen klar for post-kirurgisk utvinning. Området som er omrisset med stiplede linjer, forstørres i (J, K). (J) Merker fra limdråpene er synlige på overflaten av leveren (pilhodene) (K) Samme bilde som i J som viser leveren synlig gjennom vinduet skissert av en hvit stiplet linje. Limdråpene på leveroverflaten er skissert i rødt. Området som skal avbildes, er omrisset av hvitt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Kirurgisk innsetting av et vindu over høyre lobe i leveren. (A) Tegneserien viser den anatomiske plasseringen av strukturer som er relevante for operasjonen. Den svarte stiplede boksen skisserer det kirurgiske feltet som vises på bildene. (B) Musen er plassert i venstre lateral decubitus posisjon, et snitt er gjort starter 3 mm under ribben buret, og en ca 1 cm2 del av huden er fjernet. (C) En litt mindre del av bukhinnen dissekeres. (D) Leveren trekkes forsiktig ned under ribbeburet ved hjelp av en fuktet bomullspinne. (E) Ved hjelp av en sprøyte påføres en liten mengde kirurgisk lim i dråper (hvitt pilhode) på overflaten av leveren. (F) Vinduet er plassert og holdt fast mot leveren til limet har tørket (2 min). (G) Kantene på vinduet brettes under bukhinnen og huden. (H) For å feste vinduet til bukhinnen, påføres lim på overflaten av vinduet, som tilsvarer det skyggelagte området, før du skyver bukhinnen ned på den og limer den på plass. Huden limes på samme måte på bukhinnen. En kant av lim er også avsatt langs den røde linjen for å forhindre vekst av epitelet over vinduet. (I) Ved høy forstørrelse er leveren (skissert av en hvit stiplet linje) synlig gjennom vinduet. Bildeområdet er merket med rutenettet som er innebygd i vinduet (hvitt pilhode). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kirurgisk innsetting av et vindu over bukspyttkjertelen. (A) Tegneserien viser den anatomiske plasseringen av strukturer som er relevante for operasjonen. Den svarte stiplede boksen skisserer det kirurgiske feltet som vises på bildene. (B) Musen er plassert i høyre lateral decubitus posisjon. Milten er synlig gjennom den barberte huden (stiplet linje) (C) Det gjøres et snitt som starter 3 mm under ribbeburet, og en ca. 1 cm2 del av huden fjernes. (D) En litt mindre del av bukhinnen dissekeres. (E) Bukspyttkjertelen (hvitt pilhode) er forsiktig plassert med en fuktet bomullspinne i vinduets plassering. (F) Ved hjelp av en sprøyte påføres en liten mengde kirurgisk lim på milten, samt bukspyttkjertelen (vekk fra regionen som skal avbildes). (G) Vinduet er plassert og holdt fast mot bukspyttkjertelen til limet har tørket (2 min). Kantene på vinduet er brettet under bukhinnen og huden. (H) For å feste vinduet til bukhinnen, påføres lim på overflaten av vinduet som tilsvarer det skyggelagte området, før du skyver bukhinnen ned på den og limer den på plass. Huden limes på samme måte på bukhinnen. En kant av lim er også avsatt langs den røde linjen for å forhindre vekst av epitelet over vinduet. (I) Ved høy forstørrelse er bukspyttkjertelen (omrisset av en hvit stiplet linje) synlig gjennom vinduet. Bildeområdet er merket med rutenettet som er innebygd i vinduet (hvitt pilhode). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Kirurgisk innsetting av et vindu over inngangspattekjertelen. (A) Tegneserien viser den anatomiske plasseringen av strukturer som er relevante for operasjonen. Den svarte stiplede boksen skisserer det kirurgiske feltet som vises på bildene. Legg merke til at operasjonen kan utføres enten på4th eller 5th brystkjertler. (B) Musen er plassert i en liggende stilling på et sterilt kirurgisk felt. Denfemte høyre brystvorten (pilhodet) brukes som et landemerke for å utføre snittet. (C) Et snitt er laget, brystkjertelen er skilt fra den overlykkende huden, og en ca. 1 cm2 del av huden fjernes. (D) Ved hjelp av en sprøyte påføres en liten mengde kirurgisk lim i dråper rundt interesseområdet på overflaten av brystkjertelen. (E) Vinduet er plassert og holdt fast til limet har tørket (2 min). (F) Kantene på vinduet brettes under huden ved hjelp av tang. (G) For å feste vinduet til huden, påføres lim på overflaten av vinduet som tilsvarer det skyggelagte området, før du skyver huden ned på den og limer den på plass. En kant av lim er også avsatt langs den røde linjen for å forhindre vekst av epitelet over vinduet. (H) Et eksempel på et vindu implantert over en liten svulst i denfjerde høyre brystkjertelen er gitt. Område som er omrisset med stiplede linjer, vises med høyere forstørrelse i (I). (I) Limdråpene på brystkjerteloverflaten er skissert i rødt. Området som skal avbildes, er omrisset av svart. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Silikonavbildningsvinduer har gunstige optiske egenskaper og materialegenskaper. (A–C) For å måle punktspredningsfunksjonen og sammenligne bildeegenskapene til PDMS-vinduene med glassdeksler, ble 40 nm gulgrønne fluorescerende mikrosfærer avbildet gjennom PDMS-vinduer med varierende tykkelse eller glassdeksler (#1,5 tykkelse)16. Bilder ble samlet inn ved hjelp av ultralydgel som nedsenkingsmedium for å matche forholdene for intravital avbildning. Plott viser beregnet full bredde ved halv maksimum (FWHM) i (En) X-akse, (B) Y-akse og (C) Z-akse (gjennomsnittlig ± SD; n = 3/gruppe, anskaffet ved hjelp av to eller flere separate vinduer; enveis ANOVA som sammenligner alle PDMS-vinduer med glass med Dunnetts multiparasjonstest; bare signifikante forskjeller er angitt). (D) Forholdet mellom beregnede FWHM-verdier i X- og Y-aksen (A–B) vises som et mål på symmetrien til punktkildebildene langs X- og Y-aksene, og derfor av optiske avvik. (E–G) Mikrosfærer ble avbildet gjennom tre separate vinduer med 200 mg PDMS (tilsvarende vinduene som brukes i for intravital avbildning for Figur 9, Figur 10, Figur 11 og Film 2, Film 3, Film 4) eller tre glassdeksler (#1,5 tykkelse) for å måle punktspredningsfunksjonen. I motsetning til de intravitale bildeeksemplene ble bilder for disse beregningene samlet opp ved hjelp av vann som nedsenkingsmedium. Plott viser beregnet FWHM i (E) X-akse, (F) Y-akse og (G) Z-akse (gjennomsnitt ± SD; n = 3/gruppe ved hjelp av tre separate vinduer; Mann-Whitney test, ingen signifikante forskjeller ble oppdaget). (H) Plottet viser forholdet mellom beregnede FWHM-verdier i X- og Y-aksen (E–F). (Jeg) Plott viser topp fluorescerende intensitet per mikrosfære (gjennomsnittlig ± SD; n = 3/gruppe; Mann-Whitney test, ingen signifikante forskjeller ble oppdaget). Alle bilder ble samlet inn ved en bølgelengde på 960 nm og en lasereffekt på 3%. En 100 μm z-stabel ble samlet inn for hver mikrosfære, med en trinnstørrelse på 0,6 μm. Bilderammen ble satt til 69 μm x 69 μm med en oppløsning på 1022 piksler x 1022 piksler. Analyse ble utført med Fiji - MetroloJ plugin. (J) For å teste materialegenskaper ble PDMS-vinduer holdt i spenning og festet mellom to ringformede skiver ved hjelp av superlim for å sikre en elastisk respons under mekanisk testing. Den samme prosedyren ble brukt til mikrodekselglassslipper uten spenning på grunn av glassets stivhet. En lastespiss bestående av en halvkule (6 mm diameter) med en sylinderekstrudering (4 mm diameter, 20 mm lengde) ble 3D trykt ved hjelp av en polylaktisk syrefilament. Vinduene ble lastet inn i en servohydraulic materialtestingsmaskin under en lastkontrollprofil på 1 N / s til materialfeil. Kraft- og forskyvningsverdier ble målt med en frekvens på 100 Hz. Bildet viser vindustestingen som er satt opp med lastetipset som brukes midt i vinduet. (K) Plottet viser seigheten til materialet som bestemmes ved å beregne summeringsområdet under spenningsbelastningskurven ved hjelp av Trapz-funksjonen i MATLAB (gjennomsnittlig ± SEM; n = 3/gruppe ved hjelp av tre separate PDMS-vinduer for hver tykkelse og glassdeksler; enveis ANOVA med Tukeys multisammenligningstest). (L) Plottet viser Young's Modulus bestemt fra den lineære delen av spenningsspenningskurven (gjennomsnittlig ± SEM; n = 3/gruppe ved hjelp av tre separate PDMS-vinduer og glassdeksler; t-test med Welchs korreksjon). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Silikonvinduet viser høy tolerabilitet og lang levetid. (A) Et representativt bilde av en mannlig, 7 uker gammel C57BL/6J-mus med et ventralt abdominal bildevindu uten rutenett 11 dager etter vinduskirurgi. (B) Et representativt bilde av en mannlig 7-ukers gammel C57BL/6J-mus med et bildevindu i bukspyttkjertelen som inneholder et rutenett 14 dager etter vinduskirurgi. (C) Et representativt bilde av en kvinnelig 12-ukers gammel C57BL/6J c-fms-EGFP-mus med et bildevindu i brystkjertelen som inneholder et rutenett >7 dager etter vinduskirurgi. (D) Lever bildevindu i en mannlig 7 uker gammel c-fms-EGFP mus fotografert (øverste rad) og avbildet (nederste rad) på dag 0 (umiddelbart etter operasjonen) og 35 dager etter operasjonen. Fjerning av riktig mengde hud og tetting av såret med lim forhindrer at huden epiteliserer og skyver vinduet opp og ut, slik at orgelet kan avbildes på lang sikt. Skalastenger = 30 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Rutenett i vinduene tillater sporing av samme synsfelt. (A) Detaljerte spesifikasjoner for tilpasset produksjon av laserkuttede rustfrie stålvinduer. (B) Et rutenett innebygd i bildevinduet kan ses over leveren, med kanten av lim rundt vinduet tydelig synlig. (C) Visning av vinduet gjennom okularet til de to fotonmikroskopet. Blodkar (rød) og grønt signal fra leveren kan ses i bakgrunnen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Systemisk og lokal respons på vindusinnsetting. (A–C) Vekten ble overvåket for 7 uker gamle C57BL/6J kvinnelige mus i en periode på 28 dager etter vindusinnsetting i leveren (En), bukspyttkjertelen (B) eller brystkjertelen (C). Prosent kroppsvektsendring sammenlignet med ubehandlede alderstilpassede mus vises. (*) indikerer en mus som ikke gjenvunnet normal kroppsvekt og ville derfor ha blitt sensurert fra et bildeeksperiment. De samme kontrollmusene vises i alle tre panelene for enklere sammenligning med hver vindustype. (D) Antall hvite blodlegemer (WBC) overvåket på dag 3, 14 og 28 (brystkjertelvindu) eller 35 (lever- eller bukspyttkjertelvindu) etter operasjonen. Det normale området for WBC-telling i musen indikeres av stiplede linjer. (E,G,Jeg) Hematoksylin og eosinfarging av vevsseksjoner fra ubehandlede kontroller (venstre) og en 7 uker gammel C57BL/6J-mus 14 dager etter innsetting av et bildevindu (til høyre) over (E) leveren, (G) bukspyttkjertel, eller (Jeg) brystkjertelen. (E,Jeg) Overfladiske og fokale granuleringsskader er synlige på diskrete steder langs overflaten (pilen) av leveren og brystkjertelen, noe som tyder på en reaksjon på limet. Normalt vev indikert med * er synlig i områdene ved siden av granulatlesjonene. Tre kontroller og tre mus med levervinduer ble evaluert på hvert tidspunkt (dag 3, 14 og 35 etter operasjonen), bortsett fra at 6 mus med levervinduer ble evaluert på dag 35 etter operasjonen. To av 3 mus viste granulasjonsvev på dag 3 og 14. 1 av 3 mus viste granulasjonsvev på dag 35. Tre kontroller og tre mus med brystkjertelvinduer ble evaluert ved hvert tidspunkt (dag 3, 14 og 28 etter operasjonen). Tre av 3 mus hadde granuleringsvev eller inflammatoriske reaksjoner i brystkjertelens fettvev på dag 3 og 14. Null av 3 mus viste granuleringsskader eller inflammatoriske reaksjoner på dag 28. (G) Ingen signifikante lesjoner er synlige i bukspyttkjertelen. Tre kontroller og tre mus med bukspyttkjertelvinduer ble evaluert på hvert tidspunkt (dag 3, 14 og 35 etter operasjonen). Mus med bukspyttkjertelvinduer hadde ikke granuleringsvev på noe tidspunkt. Skalastang = 500 μm (F,H,J) Multipleks immunhiistokjemisk farging ble utført på vevsseksjoner fra ubehandlede kontroller og 7 uker gamle C57BL/6J-mus 14 dager etter innsetting av et bildevindu over (F) leveren, (H) bukspyttkjertelen eller (J) brystkjertelen. Antistoffer mot CD45, CD68 og myeloperoxidase (MPO) ble brukt til å merke henholdsvis leukocytter, monocytter/makrofager og nøytrofiler. CD45- og CD68-farging ble utført på samme seksjon mens MPO-farging ble utført på en seriell del av samme vev. Anti-CD45-antistoffet ble påvist med et HRP-konjugert sekundært antistoff og avbildet først, deretter ble kromogenet og det sekundære antistoffet strippet og lysbilder inkubert med et sekundært antistoff som gjenkjenner anti-CD68. Kvantifisering ble utført med Fiji-programvare ved fargeterskel; parametrene ble justert på tvers av antistoffer og vev. Plott viser kvantifiseringen som celleantall per synsfelt (FOV) (gjennomsnittlig ± SEM; n = 3/gruppe; enveis ANOVA med Tukeys multisammenligningstest; bare signifikante forskjeller er angitt). (K) Mann C57BL/6J c-fms-EGFP mus 8-11 ukers alder hadde et silikonavbildningsvindu satt inn over høyre lobe i leveren. Fluorescerende merket lectin (100 μL) ble injisert intravenøst umiddelbart før hver bildeøkt. Bilder er fra en enkelt mus, på samme rutenett locus på dag 1, 3 og 5 etter operasjonen, på ca 200 μm under rutenettet. Skalastang = 30 μm. Avbildet med en eksitasjonsbølgelengde på 960 nm, lasereffekt 10%. Blodårene vises i rødt. Makrofager vises i grønt (hvite piler). Representant for tre avbildet mus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Svulster kan visualiseres på flere tidspunkter over uker etter vindusinnsetting. Representative bilder fra en mannlig 7-ukers gammel C57BL/6J mus ortopisk injisert med 1,5 x 104 iGFP-1199 kreftceller i bukspyttkjertelen på tidspunktet for innsetting av bukspyttkjertelen, og avbildet på dag 11 og 14 etter vindusinnsetting. Skalastenger = 30 μm. Avbildet med en eksitasjonsbølgelengde på 960 nm, lasereffekt 10%. Representant for 6 avbildet mus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: Dynamiske endringer i immuncelleinfiltrasjon under normal brystkjertelinvolusjon. Ved hjelp av metallgitteret som er innebygd i bildevinduet, kan samme sted avbildes under normal vevsoppussing, for eksempel under brystkjertelinnvolusjon. For ytterligere å evaluere funksjonaliteten til silikonvinduene i overvåking av dynamiske endringer som immuncelleinfiltrasjon, en 12 uker gammel kvinnelig C57BL / 6J x BALB / c ACTB-ECFP; LysM-eGFP mus med et bildevindu satt inn over bukpattedyrkjertelen ble avbildet på dag 2 og 4 etter brystkjertelinvolusjon. Nøytrofiler vises i grønt (hvite piler). Nøytrofil elastaseaktivitet ble visualisert ved å injisere en Neutrophil Elastase fluorescerende sonde 4 timer før du begynner å forestille deg, og vises i rødt (eller gult når det er colokalisert med nøytrofiler). Epitelcellene vises i blått. Øyeblikksbilder er en maksimal intensitetsprojeksjon på fem bilder langs Z-aksen (100–150 mm i dybden). Bilder er fra Film 3A og 3B, og på bilder på nedre rad vises bare CFP-signalet, og bilder er merket med en rød stiplet linje for å visualisere de samme stedene i vev på de to forskjellige tidspunktene. Skalastenger = 30 μm. Avbildet med 960 nm og 1080 nm eksitasjonsbølgelengder, laserkraft på henholdsvis 10% og 15%. Representant for fire avbildet mus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 11: Dannelsen av kreftmetastase kan spores over tid. En mannlig C57BL/6J 10 uker gammel mus injisert med 1 x 105 KPC-BL/6-1199 kreftceller i bukspyttkjertelen som uttrykker kjernefysisk lokalisert histone H2B konjugert cyan fluorescerende protein (H2B-CFP) gjennom portalvenen på tidspunktet for vindusinnsetting. Leveravbildning ble utført gjennom et lateralt vindu 24 timer (dag 1) etter injeksjon og på tre senere tidspunkter (opptil 9 dager), som angitt. En enkelt kreftcelle synlig på dag 1 og 3 etter injeksjon er indikert med hvite piler. Andre harmoniske signal fra kollagenfibre ble også visualisert i cyankanalen (gule piler). Bilder er fra samme mus på hvert enkelt tidspunkt. Enkelt z-plane bilder tatt mellom 300 μm og 350 μm i dybden. Skalastenger = 30 μm. Avbildet med en eksitasjonsbølgelengde på 880 nm. Lasereffekt på 8%. Representant for tre avbildet mus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Film 1: Silikon imaging vinduer tolereres godt hos mus. Filmen viser en mannlig 9-ukers gammel C57BL/6J-mus 14 dager etter vindusinnsetting. Musen viser ikke noen av standard atferd forbundet med smerte (f.eks. dårlig grooming, lukkede øyne eller sløvhet). Representant for seks registrerte mus, og i samsvar med over 100 mus observert etter vellykket vindusimplantasjon. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Film 2: Subcellulær avbildning av ortopisk implanterte kreftceller i bukspyttkjertelen. iGFP-1199-celler ble injisert ortopisk i bukspyttkjertelen til en mannlig 7-ukers gammel C57BL/6J-mus og avbildet på dag 11 etter injeksjon av kreftceller og vindusinnsetting. Filmen er en maksimal intensitetsprojeksjon av seks bilder langs Z-aksen og trukket ut fra en 2-timers bildeperiode. Tidsangivelse (t:min:s:ms). Representant for seks avbildet mus. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Film 3: Endringer i immuncelleinfiltrasjon i ACTB-ECFP; LysM-eGFP mus under involusjon. Kvinne C57BL/6J x BALB/c ACTB-ECFP; LysM-eGFP-mus som uttrykker GFP i myeloide celler (hovedsakelig i granulocytter, men også i makrofager), og ECFP i alle celler (men høyest i epitelceller) ble oppdrettet ved 8 ukers alder. Etter fødselen ble valper normalisert til seks valper per mus. På dag 10 etter fødselen ble valpene avventet og abdominal brystkjertelavbildningsvinduer ble satt inn. Myeloidceller vises i grønt; nøytrofil elastaseaktivitet, merket med Neutrophil Elastase 680 FAST-sonden injisert 4 timer før starten av avbildningen, vises i rødt (vil virke gul når den er colokalisert med nøytrofiler); og epitelceller vises i blått. Filmer er en maksimal intensitetsprojeksjon av fem bilder langs Z-aksen (100–150 μm i dybden). (A) Avbildning på dag 2 av brystkjertelen involusjon. Skalastang = 20 μm. Avbildet med 960 nm og 1080 nm eksitasjonsbølgelengder, laserkraft på henholdsvis 10% og 15%. (B) Avbildning på dag 4 av brystkjertelen involusjon. Skalastang = 20 μm. Filmen er fra samme mus- og vevsregion som Movie 3A. (C) Høyere forstørrelse av en interesseregion fra Movie 3B, som viser to nøytrofiler som samhandler med hverandre og epitelcellene i brystkjertelen. Dannelsen av forbigående membranutstikk kan observeres i forkant under nøytrofil migrasjon. Tidsangivelse (t:min:s:ms). Representant for fire avbildet mus. Klikk her for å laste ned Movie 3A. Klikk her for å laste ned Movie 3B. Klikk her for å laste ned Movie 3C.
Film 4: Endringer i immuncelleinfiltrasjon hos c-fms-EGFP-mus under involusjon. Kvinnelige C57BL/6J c-fms-EGFP-mus, med GFP-merkede makrofager, ble oppdrettet ved 8 ukers alder. Etter fødselen ble kull justert til seks valper per mus. På dag 10 etter fødselen ble valpene avventet og abdominal brystkjertelavbildningsvinduer ble satt inn. Filmen, som er anskaffet på involusjonsdag 1 (en dag etter innsetting av vinduet), fremhever den fremtredende makrofagen infiltrerer under involusjon. Makrofager vises i grønne kollagenfibre (andre harmoniske generasjon) vises i blått, og blodårene vises i rødt (Lectin-DyLight 594). Skalastang = 20 μm. Bilder er maksimale intensitetsprojeksjoner på fem bilder langs Z-aksen (100–150 um i dybden). Avbildet med 960 nm og 800 nm eksitasjonsbølgelengder, lasereffekt på henholdsvis 10% og 15%. Tidsangivelse (t:min:s:ms). Representant for tre avbildet mus. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Utfyllende kode 1. Klikk her for å laste ned denne filen.
Utfyllende kode 2. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intravitale bildevinduer er viktige verktøy for direkte visualisering av fysiologiske og patologiske prosesser ved cellulær oppløsning når de utfolder seg over tid. Den nye prosedyren som er beskrevet for støping og innsetting av fleksible silikonavbildningsvinduer hos mus, overvinner noen av de vanligste problemene med brukte bildevinduer (ekssudat, brudd og interferens med normal mobilitet), gir ekstra sikkerhet for musen og øker tilgjengeligheten til denne teknikken.
De mest brukte bildevinduene består av en metallramme som holder en glassdekslerlip. Et stort hinder for bruken av disse prototypiske vinduene er at sikring av metallringen innebærer arbeidskrevende sømprosedyrer, noe som nødvendiggjør personell med avansert kirurgisk opplæring. I tillegg er produksjon av rammene kostbart og krever spesialisert utstyr. PDMS-vinduene overvinner begge disse problemene. Prosedyren for å sette inn PDMS-vinduene eliminerer søm, noe som reduserer barrieren betydelig for å lære teknikken. Materialene for å produsere vinduene er også billige og kan enkelt kjøpes. I tillegg kan både formen på vinduet og den kirurgiske prosedyren tilpasses for avbildning av forskjellige organer, inkludert brystkjertelen, leveren, bukspyttkjertelen, milten og tarmen.
Mens nåværende intravitale bildevinduer tillater langsgående avbildning i vanligvis noen dager, begrenser flere vanlige problemer bruken av disse vinduene i lengre perioder. Vekten og størrelsen på glassvinduer kan forstyrre musenes frie bevegelse, og ekssudat kan samle seg mot vinduet. Mus kan også skade glassdekslene, noe som resulterer i sår og infeksjoner. I motsetning til dette opprettholder prosedyren som er beskrevet her, samme tilgjengelighetsnivå for vevet samtidig som nøden for dyrene minimeres. PDMS er en sikker, biostable, syntetisk polymer som er mye brukt til biomedisinske applikasjoner hos mennesker, for eksempel legemiddelleveringsenheter, ansiktsrekonstruksjonskirurgi og brystimplantater. Utover å øke dyrenes toleranse i vinduet, er bruk av et biologisk inert materiale, i motsetning til glass, spesielt viktig for studier som involverer immunforsvaret, hvor lokal betennelse ville være en forvirrende effekt. I tillegg er en stor forbedring eliminering av masker, da mus vil bite og trekke på dem, noe som kan føre til at metallrammede glassavbildningsvinduer faller ut. Dette problemet ble delvis løst av en nyere generasjon vinduer som ble designet slik at maskene er skjult i et spor9. Imidlertid krever denne sistnevnte strategien veskestreng suturing, som er en komplisert, feilutsatt prosedyre som ofte fører til at masker trekkes for stramt, noe som resulterer i nekrose i vevet og smerten. Derfor utgjør evnen til å lime vinduet på plass en stor fordel med silikonvinduets tilnærming. Videre er vinduet laget av et fleksibelt, slitesterkt materiale med ubetydelig vekt, noe som reduserer virkningen på dyrets bevegelse, som tidligere vurdert i en sammenligning av vinduer som brukte silikon i stedet for metall for å holde en glassdekslelip17. Ved å eliminere glassdekslene helt, eliminerer silikonvinduet problemene med både metallrammene og glasset. Videre gjør vinduets fleksibilitet det mulig å sette det inn med letthet og reduserer stresskraften forårsaket av liming av en stiv overflate til organene, og reduserer dermed risikoen for permanent skade på vevet som observeres. I tillegg, fordi vinduet er mye lettere å sette inn og holde på plass, tar den generelle prosedyren mindre tid, og begrenser mulige bivirkninger på grunn av langvarig anestesi. For innsetting over leveren er forskjellen i prosedyretid spesielt betydelig, fra 45 min for metallrammede vinduer til 15 min for silikonvinduene. Faktisk, mens det å sette inn metallrammen over leveren krever disseksjon av xiphoid-prosessen (brusk på slutten av brystbenet), noe som også er potensielt smertefullt og forårsaker vedvarende betennelse, er denne disseksjonen unødvendig for å sette inn silikonvinduet. Til slutt gir bildevinduet som presenteres i dette arbeidet ytterligere fordeler med hensyn til mulige applikasjoner. For eksempel, i motsetning til glassvinduer, gir silikonvinduer enkel tilgang til vevet, slik at kreftceller, fluorescerende fargestoffer eller legemidler kan injiseres direkte gjennom vinduet.
Et annet PDMS-basert silikonavbildningsvindu egnet for innsetting på en rekke anatomiske steder, inkludert brystkjertelen, ble nylig beskrevet18. Det vinduet er støpt for å generere en form og spesialisert kant som muliggjør rask implantasjon av vinduet uten behov for masker eller lim. I motsetning krever silikonvinduet som presenteres her ikke noen spesiell mugg, og viktigst, kan kuttes for å forme under kirurgisk prosedyre for å tilpasse seg anatomisk plassering og individuell mus. Selv om protokollen beskrevet heri nødvendiggjør bruk av lim, tillater dette ekstra kravet avbildning av bukorganer, inkludert lever og milt. Videre tillater silikonvinduet som er beskrevet her, å legge inn et rutenett i rustfritt stål i vinduet, som gir referanselandemerker. Disse landemerkene muliggjør sporing av samme nøyaktige plassering over tid og letter gjentatt avbildning av samme sted over flere økter (langsgående avbildning) for å studere prosesser som tar dager til uker, for eksempel utvikling av metastatiske lesjoner.
Oppsummert ble et silikonavbildningsvindu utviklet for bruk i langsgående IVM i brystkjertelen eller bukorganene. Vinduet er optisk klart, svært holdbart og billig. Enkelheten i innsettingsprosedyren for vinduet reduserer de tekniske ferdighetene som kreves for å implementere vindusbaserte intravitale avbildningsmetoder. Vinduets tilpasningsevne til forskjellige vevssteder gjør det mulig å gjennomføre IVM i et stort utvalg av biologiske studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
M.E. er medlem av forskningsrådet for brensocatib for Insmed, Inc.; medlem av det vitenskapelige rådgivende styret for Vividion Therapeutics, Inc.; en konsulent for Protalix, Inc.; og har aksjer i Agios Pharmaceuticals, Inc. D.A.T. er medgrunnlegger av Mestag Therapeutics, og sitter i det vitenskapelige rådgivende styret og har aksjer i Mestag Therapeutics, Leap Therapeutics, Surface Oncology og Cygnal Therapeutics. De andre forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker Rob Eifert for hans hjelp til å designe og optimalisere de laserskårne rutenettene i rustfritt stål. Dette arbeidet ble støttet av CSHL Cancer Center (P30-CA045508) og midler til M.E. fra National Institutes of Health (NIH) (1R01CA2374135 og 5P01CA013106-49); CSHL og Northwell Helse; Thompson Family Foundation; Svøm over Hele Amerika; og et stipend fra Simons Foundation til CSHL. M.S. ble støttet av National Institute of General Medical Sciences Medical Scientist Training Programme Training Award (T32-GM008444) og National Cancer Institute of the NIH under tildeling nummer 1F30CA253993-01. L.M. støttes av et James S. McDonnell Foundation Postdoctoral Fellowship. J.M.A. er mottaker av et Cancer Research Institute/Irvington Postdoctoral Fellowship (CRI Award #3435). D.A.T. støttes av Lustgarten Foundation Dedicated Laboratory for Pancreatic Cancer Research og Thompson Family Foundation. Tegneserier ble laget med Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape | 3M | 70200770819 | |
| Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2 | Ethicon | N267H | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 22974 | |
| AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole) | Vector Laboratories | SK-4200 | |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Anesthesia system | Molecular Imaging Products Co. | ||
| Acqknowledge software and sensors | BIOPAC | ACK100W, ACK100M, TSD110 | |
| Betadine spray | LORIS | 109-08 | |
| c-fms-EGFP (MacGreen) mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) | Invitrogen | 14-0451-82 | |
| CD68 Antibody | Abcam | ab125212 | |
| Curity gauze sponges | Covidien | ||
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6885 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab97064 | |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab102182 | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Two-part, 10:1 mixing ratio |
| Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness | Electron Microscopy Sciences | 72296-08 | |
| Ender-3 Pro 3D printer | Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD | ||
| Far Infrared Heated blanket | Kent Scientific | RT-0520 | |
| Fc Receptor Blocker | Innovex Biosciences | NB309 | |
| Fiji imaging processing package | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515) | Invitrogen | F8795 | |
| Gating system: | BIOPAC Systems Inc. | The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems. | |
| Acqknowledge software | ACK100W, ACK100M | ||
| Diff. Amp. Module, C Series | DA100C | ||
| Dual Gating Sys small animal | DTU200 | ||
| MP160 for Windows - Analysis system | MP160WSW | ||
| MouseOx Plus 120V | MOX-120V;015000 | ||
| Pressure Pad | TSD110 | ||
| Gelfoam | Pfizer | 9031508 | Absorbable gelatin sponge |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Two pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length |
| Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody | R&D Systems | AF3667 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 s |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc | BD | 324912 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | 502017 | |
| Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594 | Vector Laboratories | DL-1177-1 | |
| LysM-eGFP mice | www.mmrrc.org | 012039-MU | |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 | Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5153 | 1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length |
| MTS MiniBionix II 808 | MTS Systems | Servohydraulic material testing machine | |
| Neutrophil Elastase 680 FAST probe | PerkinElmer | NEV11169 | |
| Nitrogen | General Welding Supply Corp. | ||
| Oxygen | General Welding Supply Corp. | ||
| Polylactic acid filament | Hatchbox | 1.75 mm diameter | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36970 | |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra | NDC17033-211-38 | |
| Reflex 7 wound clips | Roboz Surgical | RS-9255 | |
| Stainless steel grid | Fotofab | One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square. | |
| Surface Treated SterileTissue Culture Plates | Fisher Scientific | FB012929 | Lid used as curing surface for imaging windows |
| TriM Scope Multiphoton Microscope | LaVision BioTec | Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: T560LP T665LPXXR T495lxpr |
|
| Vetbond | 3M | 70200742529 | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48404-453 |
References
- Dondossola, E., et al. Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone. Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).
- Haeger, A., et al. Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche. Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184 (2020).
- Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
- Eickhoff, S., et al. Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions. Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).
- Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
- Sammicheli, S., et al. Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses. Science Immunology. 1 (4), (2016).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
- Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. Recording the wild lives of immune cells. Science Immunology. 3 (27), (2018).
- Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), 29917 (2014).
- Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818 (2016).
- Anderson, T. L. Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , CRC Press, Taylor & Francis Group. Florida. (2005).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088 (2013).
- Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
- Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
- Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. Intravital. 5 (1), 1125562 (2016).
- Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
