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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Imagem intravital longitudinal através de janelas de silicone claras

Published: January 5, 2022 doi: 10.3791/62757
Automatic Translation
*1,2,3, *1,4,5, 1, 1,6, 7,8, 9, 1, 1, 1, 8, 1
1Cold Spring Harbor Laboratory, 2Cold Spring Harbor Laboratory School of Biological Sciences, 3Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 4Medical Scientist Training Program, School of Medicine, Stony Brook University, 5Graduate Program in Pharmacology, Stony Brook University, 6Graduate Program in Genetics, Stony Brook University, 7Graduate Program in Biomedical Engineering, Stony Brook University, 8Department of Biomedical Engineering, Stony Brook University, 9Department of Pathology, University of Michigan
* These authors contributed equally

Summary

Uma abordagem é aqui apresentada para imagens intravitais de longo prazo usando janelas de silicone opticamente claras que podem ser coladas diretamente ao tecido/órgão de interesse e à pele. Essas janelas são mais baratas e mais versáteis do que outras atualmente utilizadas no campo, e a inserção cirúrgica causa inflamação e angústia limitadas aos animais.

Abstract

A microscopia intravital (IVM) permite a visualização do movimento celular, divisão e morte na resolução unicelular. O IVM através de janelas de imagem cirurgicamente inseridas é particularmente poderoso porque permite a observação longitudinal do mesmo tecido durante dias a semanas. Janelas de imagem típicas compreendem uma mancha de vidro em uma estrutura metálica biocompatível suturada na pele do rato. Essas janelas podem interferir com a livre circulação dos camundongos, provocar uma forte resposta inflamatória e falhar devido a vidros quebrados ou suturas rasgadas, qualquer uma das quais pode exigir eutanásia. Para resolver essas questões, janelas para imagem de órgão abdominal de longo prazo e gland mamária foram desenvolvidas a partir de uma película fina de polidimtilsiloxano (PDMS), um polímero de silicone opticamente claro anteriormente usado para janelas de imagem craniana. Essas janelas podem ser coladas diretamente nos tecidos, reduzindo o tempo necessário para a inserção. O PDMS é flexível, contribuindo para sua durabilidade em camundongos ao longo do tempo — até 35 dias foram testados. A imagem longitudinal é a imagem da mesma região tecidual durante sessões separadas. Uma rede de aço inoxidável foi incorporada dentro das janelas para localização da mesma região, permitindo a visualização de processos dinâmicos (como a involução da glândula mamária) nos mesmos locais, com dias de diferença. Esta janela de silicone também permitiu o monitoramento de células cancerígenas únicas disseminadas que se desenvolvem em micro-metástases ao longo do tempo. As janelas de silicone utilizadas neste estudo são mais simples de inserir do que janelas de vidro emolduradas em metal e causam inflamação limitada dos tecidos imaged. Além disso, as grades incorporadas permitem o rastreamento direto da mesma região tecidual em sessões de imagem repetidas.

Introduction

A microscopia intravital (IVM), a imagem de tecidos em animais anestesiados, oferece insights sobre a dinâmica dos eventos fisiológicos e patológicos na resolução celular em tecidos intactos. As aplicações dessa técnica variam bastante, mas o IVM tem sido fundamental no campo da biologia do câncer para ajudar a elucidar como as células cancerígenas invadem tecidos e metástases, interagem com o microambiente circundante e respondem a medicamentos 1,2,3. Além disso, o IVM tem sido fundamental para avançar na compreensão dos mecanismos complexos que regem as respostas imunológicas, fornecendo insights complementares às abordagens de perfil ex vivo (por exemplo, citometria de fluxo). Por exemplo, experimentos de imagem intravital revelaram detalhes sobre funções imunológicas no que se referem à migração celular e contato celular e ofereceram uma plataforma para quantificar a dinâmica espacial em resposta a lesões ou infecções 4,5,6,7. Muitos desses processos também podem ser estudados através de coloração histológica, mas apenas o IVM permite o rastreamento de mudanças dinâmicas. De fato, enquanto uma seção histológica oferece um instantâneo do tecido em um dado momento, a imagem intravital pode rastrear eventos intercelulares e subcelulares dentro do mesmo tecido ao longo do tempo. Em particular, o progresso na rotulagem de fluorescência e o desenvolvimento de repórteres moleculares permitiram que eventos moleculares se correlacionam com comportamentos celulares, como proliferação, morte, motilidade e interação com outras células ou a matriz extracelular. A maioria das técnicas de IVM são baseadas na microscopia de fluorescência, que devido à dispersão de luz, torna a imagem mais profunda desafiadora. O tecido de interesse, portanto, muitas vezes precisa ser exposto cirurgicamente com um procedimento muitas vezes invasivo e terminal. Assim, dependendo do local do órgão, o tecido pode ser imagedo continuamente por um período variando de poucos a 40 h8. Alternativamente, a inserção cirúrgica de uma janela permanente de imagem permite a imagem do mesmo tecido sequencialmente durante um período de dias até semanas 7,9.

O desenvolvimento de novas janelas de imagem tem sido destacado como uma necessidade tecnológica para melhorar ainda mais as abordagens de imagem intravital10. A janela de imagem intravital prototípica é um anel de metal contendo uma mancha de vidro presa à pele com suturas11. Interferências com a livre circulação, o acúmulo de exsudato e danos à tampa de vidro são problemas comuns vistos com o uso dessas janelas. Além disso, a janela prototípica requer produção especializada, e o procedimento cirúrgico pode exigir treinamento extensivo. Para resolver essas questões, o polidimtilsiloxano (PDMS), um polímero de silicone, que já foi usado em janelas cranianas para imagens de longo prazo no cérebro12, foi adaptado para uso em imagens de órgãos abdominais e glândulas mamárias. Aqui, é apresentado um método detalhado para a geração de janelas de silicone baseadas em PDMS, incluindo como lançar a janela em torno de uma grade de aço inoxidável para fornecer marcos para imagens repetidas das mesmas regiões teciduais. Além disso, é descrito um procedimento cirúrgico simples e sem pontos para inserir a janela sobre órgãos abdominais ou a glândula mamária. Esta nova abordagem supera alguns dos problemas mais comuns com janelas de imagem usadas atualmente e aumenta a acessibilidade de imagens intravitais longitudinais.

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Protocol

Todos os procedimentos descritos foram realizados de acordo com as Diretrizes Cirúrgicas do Laboratório de Cold Spring Harbor e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais no Laboratório de Cold Spring Harbor.

1. Fundição da janela de silicone

  1. Prepare o polímero de silicone (PDMS) misturando o elastômero base e o agente de cura em uma proporção de 10:1 (v/v).
  2. Lance uma janela depositando uma pequena quantidade de PDMS em uma superfície estéril e lisa e ajuste a relação volume-área para a espessura desejada.
    NOTA: O uso de 200 mg de solução de polímero para um círculo de 22 mm de diâmetro na tampa de uma tampa de 24 poços resulta em um bom comprometimento entre robustez da janela e clareza óptica.
  3. Opcional: Para fornecer marcos para imagens repetidas das mesmas regiões teciduais, pressione levemente uma grade de aço inoxidável no silicone depois que o PDMS estiver na superfície de fundição desejada.
  4. Para remover bolhas de ar, coloque a superfície revestida em um desiccador de vácuo por 45 minutos para desgas o polímero.
  5. Cure as janelas de silicone em um forno a 80 °C por 45 min.
  6. Marque o polímero nas bordas do molde e retire delicadamente as janelas curadas da superfície usada para fundir com fórceps.
  7. Antes da cirurgia, esterilize as janelas autoclaving.

2. Preparando o mouse para a inserção da janela de silicone

  1. Anestesiar o mouse em uma câmara de indução usando isoflurane de 4% (v/v). Mova o rato para uma almofada de aquecimento sobre a mesa cirúrgica, coloque o rato na máscara de nariz da anestesia e reduza a concentração de isoflurane para 2% para manutenção durante toda a cirurgia.
  2. Verifique a profundidade da anestesia beliscando os dedos dos membros traseiros. Não prossiga até que o mouse esteja inativo e não mostre a resposta reflexo do dedo do dedo do dedo.
  3. Aplique lubrificante oftálmico nos olhos para evitar que sequem e evitem traumas.
  4. Administrar analgesia preventiva (buprenorfina 0,05 mg/kg) subcutânea.
  5. Raspe o local cirúrgico e remova completamente o cabelo com um creme de depilação.
  6. Aplique solução povidone-iodo (10% v/v) e etanol (70% v/v) consecutivamente 3x para prevenir a infecção no local cirúrgico.

3. Inserir uma janela ventral para imagem no fígado; adaptável para outros órgãos abdominais (Figura 1)

  1. Coloque o mouse na posição supina.
  2. Faça uma incisão de 10 mm a partir do processo xifoide usando tesouras e fórceps estéreis.
  3. Remova uma seção de 1-1,5 cm2 da pele ao longo da linha média.
  4. Use um segundo par de tesouras estéreis e fórceps para remover uma seção do peritônio ligeiramente menor que a seção da pele.
  5. Opcional: Para visualizar uma porção maior do fígado, use cotonetes de algodão estéreis umedeados com soro fisiológico estéril para empurrar o fígado para baixo do diafragma revelando o ligamento falciforme ligando o fígado ao diafragma. Corte o ligamento tomando cuidado para não cortar a veia cava inferior.
  6. Retire o adesivo cirúrgico com uma seringa de 31 G, aplique uma pequena quantidade dele na superfície do fígado ao redor das bordas da área a ser imageda. Este adesivo cria uma vedação circular, deixando a área central intacta para imagens.
    ATENÇÃO: Limite o adesivo a pequenas gotículas formando um padrão circular ao redor da área de imagem. O tecido imediatamente em contato com o adesivo não pode ser imageado. Não é necessário secar o tecido antes de aplicar o adesivo.
    NOTA: Qualquer adesivo à base de cianoacrila pode ser usado com sucesso para este procedimento. O adesivo cirúrgico garante a esterilidade. Para procedimentos terminais, super colas de todos os fins produzem bons resultados.
  7. Posicione a janela usando fórceps e segure-a firmemente contra o fígado até que o adesivo seque (~2 min).
  8. Dobre as bordas da janela sob o peritônio.
  9. Com uma seringa, deposite uma pequena quantidade de adesivo cirúrgico nas bordas da janela que agora estão sob o peritônio. Empurre para baixo no peritônio com fórceps para fixá-lo na janela.
  10. Da mesma forma, deposite uma pequena quantidade de adesivo cirúrgico no peritônio antes de empurrar para baixo na pele com fórceps para fixá-lo ao peritônio.
    NOTA: Se realizada corretamente, uma área circular de tecido hepático deve agora ser visível através da janela.
  11. Aplique cola nas bordas da janela para criar uma borda que ajude a evitar que a pele cresça de volta sobre a janela.
    ATENÇÃO: Se o procedimento for realizado utilizando técnicas cirúrgicas estéreis e a janela é esterilizada antes da inserção, a vedação da ferida com adesivo cirúrgico é suficiente para evitar infecções. No entanto, a não observância de técnicas assépticas adequadas durante a inserção cirúrgica ou fechamento imperfeito pode levar a infecção aberta ou subclínica e secagem do tecido.

4. Inserir uma janela lateral para imagem no fígado; compatível com a injeção simultânea de células cancerígenas na veia portal (Figura 2)

  1. Coloque o mouse na posição de decúbito lateral esquerdo
  2. Faça uma incisão de 10 mm no flanco direito 3 mm abaixo do arco costal usando tesouras estéreis e fórceps.
  3. Remova uma seção de 1 cm2 da pele.
  4. Use um segundo par de tesouras estéreis e fórceps para remover uma seção do peritônio ligeiramente menor que a seção da pele.
  5. Retire o adesivo cirúrgico com uma seringa de 31 G, aplique uma pequena quantidade dele na superfície do fígado ao redor das bordas da área a ser imageda.
    ATENÇÃO: Limite o adesivo a pequenas gotículas formando um padrão circular ao redor da área de imagem. O tecido imediatamente em contato com o adesivo não pode ser imageado.
    NOTA: Qualquer adesivo à base de cianoacrila pode ser usado com sucesso para este procedimento. O adesivo cirúrgico garante a esterilidade. Para procedimentos terminais, super colas de todos os fins produzem bons resultados.
  6. Posicione a janela usando fórceps e segure-a firmemente contra o fígado até que o adesivo seque (~2 min).
  7. Dobre as bordas da janela sob o peritônio.
  8. Com uma seringa, deposite uma pequena quantidade de adesivo cirúrgico nas bordas da janela que agora estão sob o peritônio. Empurre para baixo no peritônio com fórceps para fixá-lo na janela.
  9. Da mesma forma, deposite uma pequena quantidade de adesivo cirúrgico no peritônio antes de empurrar para baixo na pele com fórceps para fixá-lo ao peritônio.
    NOTA: Se realizada corretamente, uma área circular de tecido hepático deve agora ser visível através da janela.
  10. Aplique cola nas bordas da janela para criar uma borda que ajude a evitar que a pele cresça de volta sobre a janela.
  11. Se for necessária uma injeção venosa de portal:
    1. Coloque o mouse na posição supina.
    2. Faça uma incisão de 10 mm começando pelo processo xiphoide na pele.
    3. Usando um segundo par de tesouras estéreis e fórceps, faça uma incisão de 10 mm no peritônio.
    4. Mergulhe dois cotonetes de algodão em soro fisiológico estéril.
    5. Use os cotonetes de algodão para puxar suavemente o intestino para a gaze estéril umedecida com soro fisiológico estéril, tomando cuidado para não torcer ou perturbar a orientação.
    6. Continue deslocando o intestino da cavidade abdominal até que a veia portal seja visível no lado direito do abdômen.
    7. Insira uma agulha de 31-33 G de 5 a 7 mm caudal até o ponto de entrada da veia portal no fígado, certificando-se de prosseguir dentro do vaso sanguíneo e não através dele.
    8. Injete lentamente as células cancerígenas (resuspended em 100 μL de PBS estéril).
      NOTA: Para este experimento, a linha de células cancerígenas pancreáticas de amurina (por exemplo, KPC-BL/6-1199) pode ser cultivada em mídia DMEM completa e 1 x 105 células injetadas em 100 μL de PBS estéril.
    9. Para evitar sangramento, logo após a retirada da agulha, aplique pressão suave no local da injeção com um pequeno pedaço de esponja cirúrgica por 1-2 min.
    10. Depois que a pressão for liberada, monitore o local por 1-2 min para garantir hemostasia.
    11. Usando cotonetes umedecidos, devolva o intestino para a cavidade abdominal seguindo a orientação fisiológica do órgão.
    12. Usando fórceps estéreis, insira a janela imediatamente sob o peritônio, no lado esquerdo da cavidade abdominal do camundongo.
    13. Sutura com suturas de seda 4-0 e grampo a incisão midline com clipes de aço inoxidável de 7 mm.
    14. Mova o mouse para a posição de decúbito lateral esquerdo
    15. Faça uma incisão de 10 mm no flanco direito 3 mm sob o arco costal através da pele usando tesouras estéreis e fórceps.
    16. Remova uma seção de 1 cm2 da pele ao redor da incisão.
    17. Use um segundo par de tesouras estéreis e fórceps para remover uma seção do peritônio ligeiramente menor que a seção da pele.
    18. Puxe a janela para o lugar sobre o fígado antes de colá-lo no lugar, como descrito sob os passos 4.8-4.10.

5. Inserir a janela para imagem no pâncreas (Figura 3)

  1. Coloque o mouse na posição de decúbito lateral direito.
  2. Faça uma incisão de 10 mm no flanco esquerdo 3 mm abaixo do arco costal usando tesouras estéreis e fórceps.
  3. Remova uma seção de 1 cm2 da pele ao redor da incisão.
  4. Use um segundo par de tesouras estéreis e fórceps para remover uma seção do peritônio ligeiramente menor que a seção da pele.
  5. Usando cotonetes de algodão estéreis encharcados com soro fisiológico estéril, puxe suavemente o baço para visualizar o pâncreas. Prossiga para reposicionar o pâncreas com os cotonetes umedecidos de algodão para tornar mais área de superfície visível através da incisão.
    NOTA: Neste ponto, as células cancerígenas do pâncreas podem ser injetadas ortotopicamente no pâncreas se fizer parte do projeto experimental.
  6. Retire o adesivo cirúrgico com uma seringa de 31 G, aplique uma pequena quantidade dele na superfície do pâncreas ao redor das bordas da área a ser imageda.
    ATENÇÃO: Limite o adesivo a pequenas gotículas formando um padrão circular ao redor da área de imagem. O tecido imediatamente em contato com o adesivo não pode ser imageado.
  7. Posicione a janela usando fórceps e segure-a firmemente contra o pâncreas até que o adesivo seque (~2 min).
  8. Dobre as bordas da janela sob o peritônio.
  9. Com uma seringa, deposite uma pequena quantidade de adesivo cirúrgico nas bordas da janela que agora estão sob o peritônio. Empurre para baixo no peritônio com fórceps para fixá-lo na janela.
  10. Da mesma forma, deposite uma pequena quantidade de adesivo cirúrgico no peritônio antes de empurrar para baixo na pele com fórceps para fixá-lo ao peritônio.
    NOTA: Se realizada corretamente, uma área circular de tecido do pâncreas deve agora ser visível através da janela.
  11. Aplique cola nas bordas da janela para criar uma borda que ajude a evitar que a pele cresça de volta sobre a janela.

6. Inserir a janela para imagem na glândula mamária (Figura 4)

  1. Coloque o mouse na posição supina.
  2. Faça uma incisão medial de 10 mm para um dos mamilos inguinais usando tesouras e fórceps estéreis.
  3. Remova uma seção de 0,5 cm2 da pele acima da glândula mamária.
  4. Use um segundo par de tesouras estéreis para separar cuidadosamente a glândula mamária da pele, espalhando a tesoura entre as duas superfícies para interromper a adesão.
    NOTA: Para facilitar a imagem da área da glândula mamária inguinal, tenha cuidado para dissecar uma porção de pele acima da glândula mamária, mas superior à perna traseira, para que a janela não limite a mobilidade do mouse.
  5. Retire o adesivo cirúrgico com uma seringa de 31 G, aplique uma pequena quantidade dela na superfície da glândula mamária ao redor das bordas da área a ser imageda.
    ATENÇÃO: Limite o adesivo a pequenas gotículas formando um padrão circular ao redor da área de imagem. O tecido imediatamente em contato com o adesivo não pode ser imageado.
  6. Posicione a janela usando fórceps e segure-a firmemente contra a glândula mamária até que o adesivo seque (~2 min).
    NOTA: Uma área circular de tecido da glândula mamária deve agora ser visível através da janela se realizada corretamente.
  7. Dobre as bordas da janela sob a pele.
  8. Com uma seringa, deposite uma pequena quantidade de adesivo cirúrgico nas bordas da janela que agora estão sob a pele. Empurre para baixo na pele com fórceps para prender a pele à janela.
  9. Aplique cola nas bordas da janela para criar uma borda que ajude a evitar que a pele cresça de volta sobre a janela.

7. Recuperação pós-cirúrgica

  1. Coloque o mouse em uma gaiola de recuperação limpa com amplo material de aninhamento, garantindo que parte da gaiola esteja descansando sobre uma almofada de aquecimento.
  2. Monitore o mouse continuamente até que ele esteja consciente e móvel.
  3. Se necessário, forneça uma dose adicional de analgésico 12 h após a dose preventiva.
    NOTA: Analgesia adicional é geralmente desnecessária, mas consulte um veterinário se o rato mostra sinais de angústia (como costas curvadas, pele despenteada ou interesse perdido em alimentos). Monitore o camundongo diariamente durante os primeiros 3 dias após a cirurgia para sinais de infecção ou outros efeitos adversos. Menos de 2% dos camundongos necessitam de atenção veterinária ou eutanásia, normalmente devido ao descolamento parcial da janela. É importante notar que para camundongos machos com janelas de imagem hepática ventral, lutar entre camundongos pode resultar em desprendimento das janelas. Isso é evitado por abrigar os ratos separadamente.

8. Imagem através da janela

  1. Anestesiar o mouse em uma câmara de indução usando isoflurane de 4% (v/v).
  2. Aplique lubrificante oftálmico nos olhos para evitar que sequem e evitem traumas.
  3. Mova o rato da câmara de indução para o estágio do microscópio. Coloque o rato na máscara do nariz da anestesia e reduza a concentração de isoflurane para aproximadamente 1-1,5% para anestesia de manutenção durante todo o procedimento de imagem.
  4. Coloque um sensor de almofada de pressão abaixo do mouse para monitorar a taxa de respiração e fixar o mouse ao palco usando fita cirúrgica macia.
  5. Insira um termômetro retal para monitorar a temperatura corporal durante toda a sessão de imagem.
  6. Ligue a almofada aquecida, monitorando o mouse de perto para garantir que a temperatura corporal não exceda os 37 °C.
  7. Utilize o software para monitorar a taxa de respiração do mouse. A taxa ideal é ~1 respiração/segundo. Ajuste a anestesia conforme necessário.
  8. Antes de cada sessão de imagem, limpe a janela de qualquer meio de imersão de lente residual e detritos, limpando-a suavemente com um cotonete mergulhado em 70% de etanol (v/v).
  9. Ao utilizar uma lente de imersão em água, aplique gel de ultrassom na janela, evitando bolhas.
    NOTA: A água destilada também pode ser usada, mas pode exigir reaplicação durante a imagem.
  10. Para encontrar a profundidade ideal para imagens, primeiro, localize a grade e coloque-a em foco.
  11. Determine a profundidade aproximada da imagem do tecido, definindo a parte inferior da grade para 0. Essas informações são necessárias para localizar o plano z correspondente em sessões de imagem subsequentes.
  12. Para identificar o mesmo local em várias sessões de imagem, utilize os quadrados na grade como ponto de referência. Durante a imagem, observe a orientação da grade e localização dentro da grade de cada campo de visão visualizada (por exemplo,2ª fileira do topo,4º quadrado da esquerda).
  13. Durante sucessivas sessões de imagem, use a grade para navegar de volta para áreas específicas da grade - e, portanto, campos de imagem.
  14. Após cada sessão de imagem, remova qualquer meio de imersão de lente residual e detritos limpando suavemente a janela com um cotonete mergulhado em 70% de etanol (v/v).

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Representative Results

Imagens intravitais através de janelas de imagem podem ser usadas para observar, rastrear e quantificar uma ampla gama de eventos celulares e moleculares em resolução unicelular durante um período de horas a semanas. As características ideais para uma janela de imagem incluem: a) impacto limitado no bem-estar do camundongo e na fisiologia do tecido; b) durabilidade; c) simplicidade da inserção; e d) marcos claros para imagens repetidas da mesma região. O resultado é uma janela de silicone versátil e inerte que é facilmente produzida e inserida e que pode ser equipada com uma grade para localizar o mesmo campo de visão ao longo do período de várias sessões de imagem.

A janela é feita de PDMS, que é um material barato, flexível e claro. As janelas podem ser lançadas com suprimentos amplamente disponíveis para compra para a maioria dos laboratórios. Para estes efeitos, os moldes circulares (22 mm de diâmetro) que já estão gravados na tampa de 24 placas bem disponíveis comercialmente funcionam bem. Variando a quantidade de polímero utilizado por unidade, é possível ajustar a espessura da janela. Para documentar o efeito da espessura da janela na resolução de imagens, foi realizada uma análise da função de propagação de ponto (PSF) de microesferas fluorescentes de 40 nm para comparar a imagem através de janelas PDMS de espessuras variadas a deslizamentos de vidro normalmente usados para janelas de imagem intravital (0,17 mm de espessura). Para replicar a configuração utilizada para imagens intravitais, a imagem PSF foi realizada utilizando o mesmo microscópio de dois fótons e lente de imersão de água com gel de ultrassom aplicado como meio de imersão.

A largura total na Metade Máxima (FWHM) da intensidade do sinal calculada através do ajuste do PSF nos planos laterais foi comparável à do vidro para janelas PDMS lançadas com 100 mg de PDMS (Figura 5A,B). A resolução lateral em relação às tampas de vidro foi reduzida para janelas fundidas com 150-250 mg de PDMS (Figura 5A,B). No plano de imagem do eixo Z, as janelas PDMS fundidas com 100-200 mg de polímero tiveram um desempenho melhor do que as tampas de vidro (Figura 5C). A claridade óptica foi perdida em janelas fundidas com 300 mg de PDMS, tornando as medidas não confiáveis (Figuras 5A-C). A razão X/Y dos valores FWHM não difere significativamente entre vidro e PDMS de qualquer espessura, embora a razão para janelas lançadas com 200-250 mg de polímero notavelmente desviado de 1 usando gel de ultrassom como meio de imersão (Figura 5D). No entanto, ao usar a água como meio de imersão para o fundição da janela com 200 mgs, o desvio da simetria foi muito menos pronunciado. Nesta espessura, os desvios devido a aberrações no polímero são, portanto, provavelmente menores. Os valores de intensidade de fluorescência máxima também foram coletados para cada microesfera e mostraram que o vidro e o PDMS tiveram desempenho comparativa, embora o sinal mais alto tenha sido registrado através do vidro (Figura 5I). A espessura ideal da janela PDMS dependerá de aplicações específicas e sistemas de imagem. Para a maioria dos efeitos, 200 mg de solução de polímero para uma janela circular de 22 mm de diâmetro é um compromisso ideal entre robustez da janela e clareza óptica. De fato, janelas fundidas com menos de 200 mgs foram mais opticamente claras, com valores FWHM semelhantes ao vidro, mas ocasionalmente rasgadas durante a implantação cirúrgica, enquanto não foram observados casos de dano à janela usando 200 mgs (em >100 ratos).

Para medir essa diferença nas propriedades do material, as janelas PDMS (200 mgs e 150 mgs) foram carregadas em uma máquina de teste de material servohydúlico sob um perfil de controle de carga de 1N/s até a falha do material (Figura 5J). Os valores de força e deslocamento foram medidos em uma frequência de 100 Hz. Os dados de deslocamento de força foram então convertidos em tensão de estresse usando as equações:

σ = F / A (1)

Ɛ = ΔL / L0 (2)

Onde σ é estresse (Pa), F é força (N), A é a área transversal da janela, Ɛ é tensão, ΔL é o deslocamento, e L0 é a espessura da janela. A dureza do material foi determinada pelo cálculo da área de soma sob a curva de tensão de estresse. A dureza de um material refere-se à sua capacidade de deformar plasticamente e absorver energia no processo antes da fratura – uma propriedade chave para janelas implantadas13. De acordo com observações durante experimentos de imagem, janelas lançadas com 200 mg de PDMS têm resistência significativamente maior do que janelas lançadas com 150 mgs (Figura 5K) e, portanto, menos propensas a quebrar.

Em seguida, o Módulo de Young (E) das janelas PDMS preferidas lançadas com 200 mgs foi determinado e comparado ao de tampas de vidro padrão, extraindo a região linear da curva de tensão e determinando a inclinação usando a lei de Hooke:

σ = EƐ (3)

O módulo de young das janelas de vidro foi significativamente maior que o PDMS, o que era esperado porque o vidro é muito mais rígido em força material do que pdms (Figura 5L). Assim, embora o vidro seja um material mais forte baseado no módulo de seu maior Young, a maior dureza das janelas PDMS de 200 mg suporta que elas possam ser aplicadas por períodos mais longos sem risco de quebra e necessidade de um segundo procedimento cirúrgico ou eutanásia.

Uma grande vantagem das janelas de silicone é a versatilidade. É importante ressaltar que o procedimento para inserir cirurgicamente a janela pode ser facilmente adaptado a diferentes locais anatômicos. As adaptações à cirurgia são facilitadas pelo fato de que as janelas podem ser facilmente redimensionadas com tesouras cirúrgicas e que as janelas são coladas à superfície do tecido/órgão de interesse e à pele, eliminando completamente a exigência de suturas. A inserção bem sucedida das janelas desta forma foi alcançada para o fígado, pâncreas e glândula mamária (Figuras 6A-C). Em particular, dois protocolos diferentes foram desenvolvidos para implantar janelas ventral ou lateral para imagens hepáticas. A Figura 1 mostra os passos para inserir uma janela ventral. Este procedimento pode ser adaptado para outros órgãos abdominais e produzirá a maior área de superfície imagem. No entanto, a menos que uma grande (>1 cm2) área inflamável seja necessária, a inserção de uma janela lateral no flanco direito do mouse (Figura 2) é a preferida para diminuir artefatos de movimento, por exemplo, devido à respiração e peristalse. Além disso, o procedimento cirúrgico para inserção da janela de imagem lateral é compatível com uma injeção simultânea de células cancerígenas na veia portal para modelar experimentalmente o desenvolvimento da metástase hepática. Assim, os camundongos podem passar por um único procedimento em vez de dois separados quando a injeção de veia portal e a inserção da janela de imagem abdominal são necessárias no mesmo animal. Um procedimento análogo é usado para implantar uma janela sobre o pâncreas no flanco esquerdo do mouse (Figura 3). A janela também pode ser inserida sobre tecidos subcutâneos, ou seja, glândulas mamárias normais, bem como tumores mamários já estabelecidos espontâneos ou ortotopicamente transplantados (Figura 4). Alternativamente, as células cancerígenas podem ser injetadas na glândula mamária através da janela para acompanhar longitudinalmente o desenvolvimento de um tumor primário, pois as agulhas podem perfurar o filme PDMS sem comprometer a integridade da janela.

Devido ao seu baixo peso e flexibilidade, as janelas de silicone não interferem na mobilidade do mouse (Filme 1). Assim, as janelas de silicone superam os principais obstáculos associados às janelas de vidro, como fragilidade, sutura complexa e impacto na mobilidade animal. Em vez disso, a principal limitação associada às janelas de silicone é o recrescimento do epitélio sob a janela. No entanto, quando uma quantidade apropriada de pele é removida e a ferida é totalmente selada com cola, a re-epitelialização é limitada, e a imagem pode continuar por longos períodos de tempo (até 35 dias foram testados, Figura 6D). Após inserir a janela, o mouse pode ser imageado longitudinalmente por aproximadamente um mês ou até que o adesivo cirúrgico falhe ou re-epitelialização ocorra. Sessões diárias curtas de imagem (~60 min) ou menos frequentes, mas sessões de imagem mais longas são favorecidas para evitar efeitos adversos induzidos por anestesia. Animais portadores de janelas podem ser visualizados em qualquer plataforma de imagem intravital, através de microscopia confocal de fótons ou multifotons, usando procedimentos padrão (ver, por exemplo,14). Antes e depois de cada sessão de imagem, é aconselhável limpar a janela da sujeira e detritos, limpando-a com um cotonete mergulhado em 70% de etanol (v/v).

Para rastrear o mesmo local ao longo do tempo, grades de aço inoxidável podem ser incorporadas dentro da janela. A Figura 7A mostra as especificações das grades personalizadas e gravadas a laser usadas aqui. Redes comerciais para microscopia eletrônica de transmissão também são adequadas para esta aplicação. A grade é incorporada dentro da janela durante o procedimento de fundição e é claramente visível sobre a área de imagem tanto a olho nu (Figura 7B) quanto através dos oculares do microscópio (Figura 7C). Como a janela está colada à superfície do órgão, a posição dos campos de imagem em relação à rede é estável. Durante a imagem, observe a orientação da grade e localização dentro da grade de cada campo de visão que é visualizado (por exemplo,2ª fileira a partir do topo,4º quadrado da esquerda). Em seguida, use a grade para navegar de volta para áreas específicas da grade - e, portanto, campos de imagem - durante sucessivas sessões de imagem.

A grade também é útil para alinhar o campo de imagem durante uma sessão de imagem quando o tecido lentamente deriva devido, por exemplo, respiração ou peristalse. A maioria das janelas de imagem com uma borda rígida pode ser amarrada a um suporte durante a imagem, adicionando estabilidade à área de imagem. Uma vez que as janelas flexíveis não podem ser diretamente estabilizadas, a fita cirúrgica é usada para estabilizar a seção do corpo contendo a janela, e a área de imagem é realinada ao centro da grade correspondente quadrada ou marcos de tecido previamente identificados (por exemplo, marcos vasculares) em intervalos definidos (tipicamente a cada 30 minutos). A correção posterior para a mudança microscópica do campo de visão é realizada digitalmente na fase pós-aquisição através de código que realinda os quadros com base em padrões de tecido detectados (código suplementar 1-2).

Para validar que a janela não causa qualquer reação adversa sistêmica aberta, o peso dos animais submetidos à implantação de janelas e controles não tratados com correspondência etária foi monitorado. Após uma perda inicial de peso associada à cirurgia, a maioria dos camundongos com janelas inseridas continua a ganhar peso ao longo do tempo, indicando que a inserção da janela é bem tolerada (Figuras 8A-C). Para janelas de fígado e glândula mamária, o peso normal é recuperado dentro de 5 dias da cirurgia. A recuperação pós-operatória é mais lenta após a implantação da janela sobre o pâncreas, com os ratos retornando ao peso pré-operatório dentro de 14 dias. Esta observação é consistente com os efeitos esperados associados à manipulação do pâncreas no momento da cirurgia. Note que mesmo nos casos em que a perda de peso não atinge o limiar para o ponto final humano, os camundongos que não recuperam o peso corporal pré-operatório (<5% de todos os camundongos, exemplificados pelo mouse indicado por * na Figura 8B) são tipicamente censurados a partir de experimentos de imagem. Além disso, a contagem de glóbulos brancos, determinada em vários pontos de tempo após a inserção da janela, não foram alteradas em quase nenhum camundongo portador de janela em comparação com os controles e não mudaram consideravelmente ao longo do tempo (Figura 8D), sugerindo que a janela não causou grande inflamação sistêmica.

Em seguida, para avaliar o grau de resposta do tecido local à janela e à cola, os camundongos foram eutanizados aos 3, 14 e 28 (janelas da glândula mamária) ou 35 dias (janelas de fígado e pâncreas) após a inserção cirúrgica da janela para análise histológica. A avaliação das seções hepáticas manchadas de hematoxilina e eosina (H&E) mostrou formação superficial (20-80 μm), mínima a leve de granulação capsular sob as janelas para a maioria dos camundongos (2 em cada 3 camundongos avaliados no dia 3, e 2 de 3 avaliados no dia 14). Estas lesões foram focais (1-3 mm de comprimento), correspondendo aproximadamente à largura da camada de cola (Figura 8E). Após 35 dias, a maioria dos camundongos (4 de 6 avaliados em dois experimentos separados) não apresentava tecido granular, enquanto alguns (2 de 6) apresentavam esclerose capsular focal moderada e desmoplasia (a uma profundidade de 25-250 μm). Curiosamente, não foram observadas lesões significativas na superfície do pâncreas diretamente sob a janela em qualquer ponto de tempo na coorte de nove camundongos (Figura 8G). No entanto, alguns camundongos apresentaram áreas de atrofia na pancreata e inflamação na gordura abdominal (esteatite), consistente com danos induzidos por manipulação. Para a glândula mamária, no dia 3 após a implantação da janela, 3 de 3 camundongos tinham tecido de granulação que lembra uma incisão curativa visível ao longo da superfície da glândula ou uma reação inflamatória no tecido adiposo; no dia 14, 3 dos 3 camundongos avaliados tinham tecido de granulação. Estas lesões foram novamente focais e de 1 a 3 mm de comprimento (Figura 8I). Camundongos com janelas de glândula mamária eutanizadas 28 dias após a cirurgia não apresentaram anormalidades histológicas óbvias.

Esta análise sugere que a janela não compromete a arquitetura fisiológica geral dos órgãos testados (fígado, pâncreas, glândula mamária). O tecido reativo encontrado na superfície do fígado e na glândula mamária foi provavelmente uma reação à cola e limitado ao tecido imediatamente em contato com o adesivo. O tecido normal pode ser facilmente encontrado adjacente (< 100 μm) ao tecido reativo em regiões não expostas à cola (Figura 8E,I), e a inflamação tecidual, portanto, não interfere na imagem de regiões de tecido saudável. Além disso, a reação tecidual é provavelmente reversível, pois a maioria dos camundongos (8 em cada 9 camundongos, em todos os locais de tecido) não mostrou lesões significativas nos pontos de tempo tardios (28 ou 35 dias), embora a confirmação direta de que a reação tecidual se resolva seria difícil de alcançar sem medições longitudinais em camundongos individuais.

Também foi realizada coloração imunohistoquímica multiplexada para CD45, CD68 e mieloperoxidase (MPO) para caracterizar a infiltração de leucócitos, monócitos/macrófagos e neutrófilos, respectivamente. Um aumento na infiltração de células imunes associada ao tecido de granulação e esteatite foi observado na glândula mamária e no fígado, mas não no pâncreas (Figura 8F,H,J).  Note-se que essas alterações provavelmente foram transitórias, pois o infiltrado de células imunes era comparável ao dos controles não tratados na última vez (28 dias para janelas de glândula mamária e 35 dias para janelas de fígado e pâncreas).

O fígado foi escolhido como local para caracterizar ainda mais se a inserção da janela e a imagem causaram infiltração imune local significativa usando imagens. Para isso, foram utilizados camundongos c-fms-EGFP (MacGreen), nos quais foram utilizadas células mieloides (principalmente macrófagos) com uma proteína fluorescente verde. As janelas hepáticas foram implantadas em três camundongos c-fms-EGFP e as visualizaram nos dias 1, 3 e 5 após a cirurgia usando a grade para localizar o mesmo campo de visão. O número de macrófagos presentes na área de imagem não mudou consideravelmente ao longo do tempo após a inserção da janela (Figura 8K).

Em seguida, a janela foi testada funcionalmente por meio de imagens de um conjunto diversificado de processos biológicos no nível celular (ou seja, movimento, proliferação, contato celular) e nível de tecido (ou seja, crescimento tumoral no pâncreas, infiltração imunológica durante a involução da glândula mamária e metástase hepática). O pâncreas não é um local de fácil acesso para imagens. Para demonstrar como a janela pode ser utilizada para capturar a dinâmica celular do câncer neste órgão, janelas foram inseridas sobre o pâncreas de seis camundongos C57BL/6J ao mesmo tempo que a injeção ortotópica de células KPC-BL/6-1199, uma linha de células cancerígenas pancreáticas derivadas de um KPC comumente usado (KrasLSL- G12D/+;p 53LSL-R172H; Pdx1-Cre) modelo de camundongo geneticamente modificado de câncer pancreático. Para serem visualizadas por microscopia confocal, as células KPC-BL/6-1199 foram projetadas para expressar GFP aprimorado indutível doxiciclina (células iGFP-1199). Seis dias após a injeção, os camundongos foram colocados em uma dieta doxiciclina para desencadear a expressão de proteína fluorescente verde (GFP) nas células cancerígenas do pâncreas. A Figura 9 mostra imagens representativas de um rato ortotopicamente injetado com células iGFP-1199 nos dias 11 e 14 após injeção e inserção da janela. O filme 2 mostra a borda do tumor iGFP-1199 em um trecho de uma sessão de imagem de 2 h no dia 11 após a inserção da janela, ilustrando a capacidade de capturar dinâmicas de projeção de membrana celular no pâncreas usando as janelas de silicone.

A janela de silicone também pode ser usada para capturar a infiltração dinâmica de células imunes ao longo do tempo. Para ilustrar isso, as janelas da glândula mamária foram instituídas em actb-ECFP lactante (Tg(CAG-ECFP)CK6Nagy); Camundongos LysM-eGFP (Lyz2tm1.1Graf) imediatamente após o desmamar. Nestes camundongos, todas as células, mas a maioria das células epiteliais, expressam proteína fluorescente de ciano (CFP) impulsionada pelo promotor de beta actina, e as células mieloides - principalmente neutrófilos, mas também macrófagos - são rotuladas pelo eGFP impulsionado pelo promotor lysozyme M. Os camundongos foram retratados nos dias 2 e 4 após a inserção da janela, durante o processo de involução da glândula mamária, quando o tecido mamário da glândula começa a retornar ao seu estado pré-gravidez. Duas macros para ImageJ foram desenvolvidas para reduzir artefatos de movimento e melhorar a visualização, uma alinha os planos Z em um vídeo intravital 4dimensional (Código Suplementar 1) e a outra reduz a oscilação devido à respiração ou outros artefatos de movimento (código suplementar 2). Figura 10 e Filme 3A-C mostram infiltração de neutrófilos dentro do tecido da glândula mamária remodelante no mesmo local nos dias 2 e 4, ilustrando como a janela poderia ser usada para monitorar e rastrear a infiltração e o movimento das células imunes em dias diferentes. Um experimento análogo foi realizado em um camundongo c-fms-EGFP, com células mielóides (principalmente macrófagos) expressando GFP impulsionado pelo promotor c-fms (Filme 4).

Por fim, a área de superfície relativamente grande desta janela personalizável permite a observação de eventos raros, como a formação de metástase hepática após a inoculação intravenosa. Para demonstrar esse fenômeno, janelas hepáticas foram inseridas em camundongos C57BL/6J no momento da injeção de veia portal com células cancerígenas do pâncreas KPC-BL/6-1199 expressando constitutivamente a proteína de fusão nuclear histone2B-CFP (H2B-CFP). Com o tempo, o crescimento de células únicas e pequenos aglomerados de 2-3 células à medida que se desenvolveram em micrometastases (células >100) foi monitorado. A Figura 10 mostra imagens representativas tiradas nos dias 1, 3, 7 e 9 após a injeção e inserção da janela e demonstra a progressão de células únicas para micrometastases.

Todas as imagens e filmes foram coletados usando um microscópio multifotônio. Projeções de intensidade máxima e alinhamentos de filmes ao longo dos eixos Z e X ao longo do tempo foram gerados usando o software ImageJ. Imagens e filmes alinhados foram então compilados usando o software Imaris.

Figure 1
Figura 1: Inserção cirúrgica de uma janela de imagem abdominal ventral sobre o fígado. (A) O desenho mostra a localização anatômica das estruturas relevantes para a cirurgia. A caixa branca traceja o campo cirúrgico visto nas imagens. (B) Uma incisão é feita começando 3 mm abaixo do processo xifoide e continuando para baixo para que uma seção de 1-1,5 cm2 da pele seja removida ao longo da linha média. (C) Uma seção ligeiramente menor do peritônio é dissecada. (D) O ligamento falciforme (ponta de flecha branca) é cortado, empurrando o fígado para baixo. Nota: cotonetes umedecidos com soro fisiológico estéril são usados para manipular suavemente órgãos internos. (E) Utilizando uma seringa, uma pequena quantidade de adesivo cirúrgico é aplicada em gotículas ao redor da área de interesse na superfície do fígado. (F) A janela é posicionada e firmemente posicionada contra o fígado até que o adesivo tenha secado (2 min). (G) As bordas da janela são dobradas sob o peritônio e a pele. (H) Para fixar a janela ao peritônio, o adesivo é aplicado na superfície da janela correspondente à área sombreada, antes de empurrar o peritônio para baixo e colá-lo no lugar. A pele é igualmente colada no peritônio. Uma borda de cola é finalmente depositada ao longo da linha vermelha para evitar o crescimento do epitélio sobre a janela. (I) Mesma imagem de (H) sem as marcas mostrando o mouse pronto para recuperação pós-cirúrgica. Área delineada com linhas tracejadas é ampliada em (J, K). (J) Marcas das gotículas do adesivo são visíveis na superfície do fígado (cabeças de flecha) (K) Mesma foto que em J mostrando o fígado visível através da janela delineada por uma linha branca tracejada. As gotículas de adesivo na superfície hepática são delineadas em vermelho. A área a ser imagem é delineada em branco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Inserção cirúrgica de uma janela sobre o lobo direito do fígado. (A) O desenho mostra a localização anatômica das estruturas relevantes para a cirurgia. A caixa tracejada preta descreve o campo cirúrgico visto nas imagens. (B) O rato é colocado na posição de decúbito lateral esquerdo, uma incisão é feita a partir de 3 mm abaixo da caixa torácica, e uma seção de aproximadamente 1 cm2 da pele é removida. (C) Uma seção ligeiramente menor do peritônio é dissecada. (D) O fígado é gentilmente puxado para baixo abaixo da caixa torácica usando um cotonete umedecido. (E) Utilizando uma seringa, uma pequena quantidade de adesivo cirúrgico é aplicada em gotículas (cabeça de seta branca) na superfície do fígado. (F) A janela é posicionada e firmemente posicionada contra o fígado até que o adesivo tenha secado (2 min). (G) As bordas da janela são dobradas sob o peritônio e a pele. (H) Para fixar a janela ao peritônio, o adesivo é aplicado na superfície da janela, correspondente à área sombreada, antes de empurrar o peritônio para baixo e colá-lo no lugar. A pele é igualmente colada no peritônio. Uma borda de cola também é depositada ao longo da linha vermelha para evitar o crescimento do epitélio sobre a janela. (I) Em alta ampliação, o fígado (delineado por uma linha branca tracejada) é visível através da janela. A área de imagem é marcada pela grade embutida na janela (cabeça de seta branca). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Inserção cirúrgica de uma janela sobre o pâncreas. (A) O desenho mostra a localização anatômica das estruturas relevantes para a cirurgia. A caixa tracejada preta descreve o campo cirúrgico visto nas imagens. (B) O mouse é colocado na posição de decúbito lateral direito. O baço é visível através da pele raspada (linha tracejada) (C) Uma incisão é feita a partir de 3 mm abaixo da caixa torácica, e uma seção de aproximadamente 1 cm2 da pele é removida. (D) Uma seção ligeiramente menor do peritônio é dissecada. (E) O pâncreas (cabeça de seta branca) é posicionado suavemente com um cotonete umedecido na localização da janela. (F) Utilizando uma seringa, uma pequena quantidade de adesivo cirúrgico é aplicada no baço, bem como no pâncreas (longe da região a ser imageda). (G) A janela é posicionada e firmemente mantida contra o pâncreas até que o adesivo seque (2 min). As bordas da janela são dobradas sob o peritônio e a pele. (H) Para fixar a janela ao peritônio, o adesivo é aplicado na superfície da janela correspondente à área sombreada, antes de empurrar o peritônio para baixo e colá-lo no lugar. A pele é igualmente colada no peritônio. Uma borda de cola também é depositada ao longo da linha vermelha para evitar o crescimento do epitélio sobre a janela. (I) Na alta ampliação, o pâncreas (delineado por uma linha branca) é visível através da janela. A área de imagem é marcada pela grade embutida na janela (cabeça de seta branca). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Inserção cirúrgica de uma janela sobre a glândula mamária inguinal. (A) O desenho mostra a localização anatômica das estruturas relevantes para a cirurgia. A caixa tracejada preta descreve o campo cirúrgico visto nas imagens. Note que a cirurgia pode ser realizada no dia 4ou 5 das glândulas mamárias. (B) O camundongo é colocado em posição supina em um campo cirúrgico estéril. O5º mamilo direito (cabeça de flecha) é usado como um marco para realizar a incisão. (C) Uma incisão é feita, a glândula mamária é separada da pele sobrelada, e uma seção de aproximadamente 1 cm2 da pele é removida. (D) Utilizando uma seringa, uma pequena quantidade de adesivo cirúrgico é aplicada em gotículas ao redor da área de interesse na superfície da glândula mamária. (E) A janela é posicionada e mantida firmemente até que o adesivo tenha secado (2 min). (F) As bordas da janela são dobradas sob a pele usando fórceps. (G) Para fixar a janela à pele, o adesivo é aplicado na superfície da janela correspondente à área sombreada, antes de empurrar a pele para baixo sobre ela e colá-la no lugar. Uma borda de cola também é depositada ao longo da linha vermelha para evitar o crescimento do epitélio sobre a janela.  (H) Um exemplo de uma janela implantada sobre um pequeno tumor na glândula mamáriadireita 4 é fornecido. Área delineada com linhas tracejadas são mostradas em maior ampliação em (I). (I) As gotículas de adesivo na superfície da glândula mamária são delineadas em vermelho. A área a ser imagem é delineada em preto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: As janelas de imagem de silicone têm propriedades ópticas e materiais favoráveis. (A-C) Para medir a função de propagação de pontos e comparar as propriedades de imagem das janelas PDMS com as de tampas de vidro, microesferas fluorescentes verde-amarelas de 40 nm foram imagens através de janelas PDMS de espessura variada ou tampas de vidro (espessura n 1,5)16. As imagens foram coletadas utilizando gel de ultrassom como meio de imersão para corresponder às condições da imagem intravital. Os lotes mostram a largura total calculada na Metade Máxima (FWHM) no (Um) eixo X, (B) eixo Y, e (C) Eixo Z (média ± SD; n = 3/grupo, adquirido usando duas ou mais janelas separadas; ANOVA unidirecional comparando todas as janelas PDMS com vidro com o teste de múltiplas comparações de Dunnett; apenas diferenças significativas são indicadas). (D) A razão entre os valores calculados de FWHM no eixo X e Y (A-B) é mostrado como uma medida da simetria das imagens de origem pontual ao longo dos eixos X e Y e, portanto, de aberrações ópticas. (E-G) Microesferas foram imagens através de três janelas separadas fundidas com 200 mg de PDMS (semelhante às janelas usadas para imagens intravitais para Figura 9, Figura 10, Figura 11 e Filme 2, Filme 3, Filme 4) ou três tampas de vidro (nº 1,5 de espessura) para medir a função de propagação de ponto. Em contraste com os exemplos de imagem intravital, foram coletadas imagens para esses cálculos utilizando água como meio de imersão. As parcelas mostram o FWHM calculado no (E) eixo X, (F) eixo Y e (G) Eixo Z (± médio SD; n = 3/grupo utilizando três janelas separadas; Teste de Mann-Whitney, não foram detectadas diferenças significativas). (H) O enredo mostra a razão entre os valores calculados de FWHM no eixo X e Y (E-F). (Eu) As parcelas mostram o pico de intensidade fluorescente por microesfera (média ± SD; n = 3/grupo; Teste de Mann-Whitney, não foram detectadas diferenças significativas). Todas as imagens foram coletadas em um comprimento de onda de 960 nm e uma potência laser de 3%. Foi coletada uma pilha z de 100 μm para cada microesfera, com um tamanho de passo de 0,6 μm. O quadro de imagem foi fixado em 69 μm x 69 μm com uma resolução de 1022 pixels x 1022 pixels. A análise foi realizada com fiji - plugin MetroloJ. (J) Para testar as propriedades do material, as janelas PDMS foram mantidas em tensão e presas entre duas arruelas em forma de anel usando super cola para garantir uma resposta elástica durante os testes mecânicos. O mesmo procedimento foi utilizado para deslizamentos de vidro de micro capa sem a tensão devido à rigidez do vidro. Uma ponta de carregamento constituída por um hemisfério (6 mm de diâmetro) com uma extrusão de cilindro (diâmetro de 4 mm, 20 mm de comprimento) foi impressa em 3D usando um filamento de ácido policático. As janelas foram carregadas em uma máquina de teste de material servohydúlico sob um perfil de controle de carga de 1 N/s até a falha do material. Os valores de força e deslocamento foram medidos em uma frequência de 100 Hz. A imagem mostra o teste da janela configurado com a ponta de carregamento sendo aplicada no centro da janela. (K) O enredo mostra a dureza do material determinado pelo cálculo da área de soma sob a curva de tensão de estresse usando a função Trapz em MATLAB (média ± SEM; n = 3/grupo usando três janelas PDMS separadas para cada espessura e tampas de vidro; ANOVA unidirecional com o teste de múltiplas comparações de Tukey). (L) O enredo mostra o Módulo do Jovem determinado a partir da porção linear da curva de tensão (média ± SEM; n = 3/grupo usando três janelas PDMS separadas e tampas de vidro; teste t com correção de Welch). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: A janela de silicone demonstra alta tolerabilidade e longevidade. (A) Uma imagem representativa de um rato C57BL/6J masculino de 7 semanas de idade com uma janela de imagem abdominal ventral sem uma grade 11 dias após a cirurgia da janela. (B) Uma imagem representativa de um rato C57BL/6J masculino de 7 semanas com uma janela de imagem pancreática contendo uma grade 14 dias após a cirurgia da janela. (C) Uma imagem representativa de um rato C57BL/6J c-fms-EGFP de 12 semanas de idade com uma janela de imagem da glândula mamária contendo uma grade >7 dias após a cirurgia da janela. (D) Janela de imagem hepática em um rato c-fms-EGFP masculino de 7 semanas de idade fotografada (linha superior) e fotografada (linha inferior) no dia 0 (imediatamente após a cirurgia) e 35 dias após a cirurgia. Remover a quantidade adequada de pele e selar a ferida com cola evita que a pele re-epitelize e empurre a janela para cima e para fora, permitindo que o órgão seja imageado a longo prazo. Barras de escala = 30 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Grades dentro das janelas permitem o rastreamento do mesmo campo de visão. (A) Especificações detalhadas para a produção personalizada de janelas de aço inoxidável cortadas a laser. (B) Uma grade embutida na janela de imagem pode ser vista sobre o fígado, com a borda da cola ao redor da janela claramente visível. (C) Ver a janela através dos oculares do microscópio de dois fótons. Vasos sanguíneos (vermelho) e sinal verde do fígado podem ser vistos ao fundo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: Resposta sistêmica e local à inserção da janela. (A-C) O peso foi monitorado para camundongos fêmeas C57BL/6J de 7 semanas de idade por um período de 28 dias após a inserção da janela no fígado (Um), o pâncreas (B) ou a glândula mamária (C). A variação percentual de peso corporal em comparação com os camundongos não tratados é mostrada. (*) indica um rato que não recuperou o peso corporal normal e, portanto, teria sido censurado a partir de um experimento de imagem. Os mesmos mouses de controle são mostrados em todos os três painéis para uma comparação mais fácil com cada tipo de janela. (D) A contagem de glóbulos brancos (WBC) é monitorada nos dias 3, 14 e 28 (janela da glândula mamária) ou 35 (janela de fígado ou pâncreas) após a cirurgia. A faixa normal para a contagem de WBC no mouse é indicada por linhas tracejadas. (E,G,Eu) A hematoxilina e a eosina de seções de tecido de controles não tratados (esquerda) e um rato C57BL/6J de 7 semanas de idade 14 dias após a inserção de uma janela de imagem (direita) sobre o (E) fígado, (G) pâncreas, ou (Eu) glândula mamária. (E,Eu) Lesões superficiais e de granulação focal são visíveis em locais discretos ao longo da superfície (seta) de fígado e glândula mamária, sugerindo uma reação à cola. O tecido normal indicado por * é visível nas regiões adjacentes às lesões de granulação. Três controles e três camundongos com janelas de fígado foram avaliados em cada ponto de tempo (dias 3, 14 e 35 após a cirurgia), exceto que 6 camundongos com janelas de fígado foram avaliados no dia 35 após a cirurgia. Dois em 3 camundongos apresentaram tecido de granulação nos dias 3 e 14. 1 em cada 3 camundongos exibiu tecido de granulação no dia 35.  Três controles e três camundongos com janelas de glândula mamária foram avaliados em cada ponto de tempo (dias 3, 14 e 28 após a cirurgia). Três em cada 3 camundongos tiveram tecido de granulação ou reações inflamatórias no tecido adiposo da glândula mamária nos dias 3 e 14. Zero de 3 camundongos apresentaram lesões de granulação ou reações inflamatórias no dia 28. (G) Não são visíveis lesões significativas no pâncreas. Três controles e três camundongos com janelas de pâncreas foram avaliados em cada ponto de tempo (dias 3, 14 e 35 após a cirurgia). Camundongos com janelas pancreáticas não tinham tecido de granulação em nenhum momento. Barra de escala = 500 μm (F,H,J) A coloração imunohistoquímica multiplex foi realizada em seções teciduais de controles não tratados e camundongos C57BL/6J de 7 semanas de idade 14 dias após a inserção de uma janela de imagem sobre o (F) fígado, (H) pâncreas ou (J) glândula mamária. Anticorpos contra CD45, CD68 e mieloperoxidase (MPO) foram utilizados para rotular leucócitos, monócitos/macrófagos e neutrófilos, respectivamente. As manchas cd45 e CD68 foram realizadas na mesma seção, enquanto a coloração do MPO foi realizada em uma seção serial do mesmo tecido. O anticorpo anti-CD45 foi detectado com um anticorpo secundário conjugado pelo HRP e imageado primeiro, depois o cromogen e o anticorpo secundário foram despojados e slides foram incubados com um anticorpo secundário reconhecendo anti-CD68. A quantificação foi realizada com o software Fiji por meio de limiar de cor; parâmetros foram ajustados entre anticorpos e tecidos. As parcelas mostram a quantificação como contagem de células por campo de visão (FOV) (média ± SEM; n = 3/grupo; ANOVA unidirecional com o teste de múltiplas comparações de Tukey; apenas diferenças significativas são indicadas). (K) C57BL/6J masculino c-fms-EGFP camundongos de 8 a 11 semanas de idade tiveram uma janela de imagem de silicone inserida sobre o lobo direito do fígado. A lectina fluorescente (100 μL) foi injetada intravenosa imediatamente antes de cada sessão de imagem. As imagens são de um único rato, no mesmo lócus de grade nos dias 1, 3 e 5 após a cirurgia, a aproximadamente 200 μm abaixo da grade. Barra de escala = 30 μm. Imagem usando um comprimento de onda de excitação de 960 nm, potência laser 10%. Os vasos sanguíneos aparecem em vermelho. Macrófagos aparecem em verde (setas brancas). Representante de três ratos com imagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9: Os tumores podem ser visualizados em vários pontos de tempo ao longo de semanas após a inserção da janela. Imagens representativas de um rato C57BL/6J de 7 semanas de idade, injetado com 1,5 x 104 células cancerígenas do pâncreas de 7 semanas no momento da inserção da janela pancreática, e imagens nos dias 11 e 14 após a inserção da janela. Barras de escala = 30 μm. Imagem usando um comprimento de onda de excitação de 960 nm, potência laser 10%. Representante de 6 ratos com imagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 10
Figura 10: Alterações dinâmicas na infiltração de células imunes durante a involução normal da glândula mamária. Usando a grade metálica embutida na janela de imagem, o mesmo local pode ser imagen durante a remodelação normal do tecido, como durante a involução da glândula mamária. Para avaliar melhor a funcionalidade das janelas de silicone no monitoramento de mudanças dinâmicas como infiltração de células imunes, uma fêmea de 12 semanas C57BL/6J x BALB/c ACTB-ECFP; O rato LysM-eGFP com uma janela de imagem inserida sobre a glândula mamária abdominal foi imageado nos dias 2 e 4 após a involução da glândula mamária. Neutrófilos aparecem em verde (setas brancas). A atividade de elastróifa neutrófila foi visualizada injetando uma sonda fluorescente elastase de neutrófilo 4 horas antes de iniciar a imagem, e aparece em vermelho (ou amarelo quando colocalizado com neutrófilos). As células epiteliais aparecem em azul. Instantâneos são uma projeção de intensidade máxima de cinco imagens ao longo do eixo Z (100-150 mm de profundidade). As imagens são de Filmes 3A e 3B, e nas imagens da linha inferior, apenas o sinal CFP é mostrado e as imagens são marcadas com uma linha tracejada vermelha para visualizar os mesmos locais dentro do tecido nos dois pontos de tempo diferentes. Barras de escala = 30 μm. Imagem usando comprimentos de onda de excitação de 960 nm e 1080 nm, potência laser a 10% e 15% respectivamente. Representante de quatro ratos com imagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 11
Figura 11: A formação de metástase do câncer pode ser acompanhada ao longo do tempo. Um rato macho C57BL/6J de 10 semanas injetado com 1 x 105 KPC-BL/6-1199 células cancerígenas pancreáticas expressando proteína fluorescente conjugada histone H2B (H2B-CFP) através da veia portal no momento da inserção da janela. A imagem hepática foi realizada através de uma janela lateral 24h (Dia 1) após a injeção e em três pontos de tempo posteriores (até 9 dias), conforme indicado. Uma única célula cancerígena visível nos dias 1 e 3 após a injeção são indicadas com setas brancas. O segundo sinal harmônico das fibras de colágeno também foi visualizado no canal ciano (setas amarelas). As imagens são do mesmo mouse em cada ponto de tempo diferente. Imagens de plano Z única tiradas entre 300 μm e 350 μm de profundidade. Barras de escala = 30 μm. Imagem usando um comprimento de onda de excitação de 880 nm. Potência laser a 8%.. Representante de três ratos com imagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Filme 1: Janelas imaginde silicone são bem toleradas em ratos. O filme mostra um rato C57BL/6J de 9 semanas 14 dias após a inserção da janela. O rato não apresenta nenhum dos comportamentos padrão associados à dor (por exemplo, mau preparo, olhos fechados ou letargia). Representante de seis camundongos registrados, e consistente com mais de 100 camundongos observados após implantação bem sucedida da janela. Clique aqui para baixar este vídeo.

Filme 2: Imagens subcelulares de células cancerígenas do pâncreas implantadas ortotopticamente. as células iGFP-1199 foram injetadas ortotopicamente no pâncreas de um rato C57BL/6J masculino de 7 semanas de idade e imagens no dia 11 após injeção de células cancerosas e inserção de janelas. O filme é uma projeção de intensidade máxima de seis imagens ao longo do eixo Z e extraído de um período de imagem de 2 h. Carimbo de hora (h:min:s:ms). Representante de seis ratos com imagens. Clique aqui para baixar este vídeo.

Filme 3: Alterações na infiltração de células imunes no ACTB-ECFP; Camundongos LysM-eGFP durante a involução. C57BL/6J feminino x BALB/c ACTB-ECFP; Camundongos LysM-eGFP expressando GFP em células mielóides (principalmente em granulócitos, mas também em macrófagos), e ECFP em todas as células (mas mais altas em células epiteliais) foram criados com 8 semanas de idade. Após a parturiização, os filhotes foram normalizados para seis filhotes por rato. No dia 10, após a parturiização, os filhotes foram desmamados e janelas de imagem da glândula mamária abdominal foram inseridas. Células mieloides aparecem em verde; a atividade de elastase de neutrófilo, rotulada usando a sonda Neutrophil Elastase 680 FAST injetada 4 h antes do início da imagem, aparece em vermelho (aparecerá amarela quando colocalizada com neutrófilos); e células epiteliais aparecem em azul. Os filmes são uma projeção de intensidade máxima de cinco imagens ao longo do eixo Z (100-150 μm de profundidade). (A) Imagem no 2º dia de involução da glândula mamária. Barra de escala = 20 μm. Imagem usando comprimentos de onda de excitação de 960 nm e 1080 nm, potência laser a 10% e 15% respectivamente. (B) Imagem no 4º dia de involução da glândula mamária. Barra de escala = 20 μm. Filme é da mesma região de camundongos e tecidos que o Filme 3A. (C) Ampliação superior de uma região de interesse do Filme 3B, mostrando dois neutrófilos interagindo entre si e as células epiteliais da glândula mamária. A formação de saliências transitórias de membrana pode ser observada na borda principal durante a migração de neutrófilos. Carimbo de hora (h:min:s:ms). Representante de quatro ratos com imagens. Clique aqui para baixar Movie 3A. Clique aqui para baixar Movie 3B. Clique aqui para baixar o Filme 3C.     

Filme 4: Alterações na infiltração de células imunes em camundongos c-fms-EGFP durante a involução. Os camundongos C57BL/6J c-fms-EGFP femininos, com macrófagos rotulados por GFP, foram criados com 8 semanas de idade. Após a parturição, as ninhadas foram ajustadas para seis filhotes por rato. No dia 10, após a parturiização, os filhotes foram desmamados e janelas de imagem da glândula mamária abdominal foram inseridas. O filme, adquirido no dia 1 da involução (um dia após a inserção da janela), destaca o proeminente infiltrado no macrófago durante a involução. Macrófagos aparecem em verde, fibras de colágeno (segunda geração harmônica) aparecem em azul, e vasos sanguíneos aparecem em vermelho (Lectin-DyLight 594). Barra de escala = 20 μm. As imagens são projeções de intensidade máxima de cinco imagens ao longo do eixo Z (100-150 um em profundidade). Imagem usando comprimentos de onda de excitação de 960 nm e 800 nm, potência laser a 10% e 15% respectivamente. Carimbo de hora (h:min:s:ms). Representante de três ratos com imagens. Clique aqui para baixar este vídeo.

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Discussion

As janelas de imagem intravital são ferramentas importantes para visualizar diretamente processos fisiológicos e patológicos na resolução celular à medida que se desdobram ao longo do tempo. O novo procedimento descrito para fundir e inserir janelas flexíveis de imagem de silicone em camundongos supera alguns dos problemas mais comuns com janelas de imagem usadas atualmente (exsudate, quebra e interferência com a mobilidade normal), proporciona segurança adicional para o rato e aumenta a acessibilidade desta técnica.

As janelas de imagem mais utilizadas compreendem uma estrutura metálica segurando uma mancha de vidro. Um grande obstáculo para o uso dessas janelas prototípicas é que a fixação do anel metálico envolve procedimentos de costura laboriosos, necessitando de pessoal com treinamento cirúrgico avançado. Além disso, a fabricação dos quadros é cara e requer equipamentos especializados. As janelas PDMS superam ambas as questões. O procedimento para inserir as janelas PDMS elimina a costura, diminuindo significativamente a barreira para aprender a técnica. Os materiais para produzir as janelas também são baratos e podem ser facilmente comprados. Além disso, tanto a forma da janela quanto o procedimento cirúrgico podem ser adaptados para imagem de diferentes órgãos, incluindo a glândula mamária, fígado, pâncreas, baço e intestino.

Considerando que as janelas de imagem intravital atuais permitem imagens longitudinais por tipicamente alguns dias, vários problemas comuns limitam o uso dessas janelas por longos períodos de tempo. O peso e o tamanho das janelas de vidro podem interferir com a livre circulação dos ratos, e exsudato pode se acumular contra a janela. Os camundongos também podem danificar a tampa de vidro, resultando em feridas e infecções. Em contrapartida, o procedimento descrito aqui mantém o mesmo nível de acessibilidade ao tecido, minimizando a angústia para os animais. PDMS é um polímero sintético seguro, biostável e amplamente utilizado para aplicações biomédicas em humanos, como dispositivos de entrega de drogas, cirurgia de reconstrução facial e implantes mamários. Além de aumentar a tolerância dos animais à janela, o uso de um material biologicamente inerte, em oposição ao vidro, é particularmente importante para estudos que envolvem o sistema imunológico, onde a inflamação local seria um efeito confuso. Além disso, uma grande melhoria é a eliminação de pontos, pois os ratos vão morder e puxar para eles, o que pode fazer com que as janelas de imagem de vidro emolduradas em metal caiam. Este problema foi parcialmente abordado por uma nova geração de janelas que foram projetadas para que os pontos sejam escondidos em um sulco9. No entanto, esta última estratégia requer sutura de corda de bolsa, que é um procedimento complicado, propenso a erros que muitas vezes faz com que os pontos sejam puxados muito apertados, resultando em necrose do tecido e dor. Portanto, a capacidade de colar a janela no lugar constitui uma grande vantagem da abordagem da janela de silicone. Além disso, a janela é feita de um material flexível e durável com peso insignificante, o que diminui seu impacto no movimento do animal, como avaliado anteriormente em uma comparação de janelas que usavam silicone em vez de metal para segurar uma tampa de vidro17. Ao eliminar completamente o deslizamento de tampa de vidro, a janela de silicone elimina os problemas com as armações metálicas e vidro. Além disso, a flexibilidade da janela permite que ela seja inserida com facilidade e diminui a força de estresse causada pela colagem de uma superfície rígida aos órgãos, diminuindo assim o risco de danos permanentes ao tecido que está sendo observado. Além disso, como a janela é muito mais fácil de inserir e segurar no lugar, o procedimento geral leva menos tempo, limitando os possíveis efeitos colaterais devido à anestesia prolongada. Para a inserção sobre o fígado, a diferença no tempo de procedimento é particularmente substancial, de 45 min para janelas emolduradas em metal para 15 min para as janelas de silicone. De fato, enquanto a inserção da estrutura metálica sobre o fígado requer dissecção do processo xifoide (a cartilagem no final do esterno), que também é potencialmente dolorosa e causa inflamação sustentada, essa dissecção é desnecessária para a inserção da janela de silicone. Por fim, a janela de imagem apresentada neste trabalho oferece vantagens adicionais em relação a possíveis aplicações. Por exemplo, ao contrário das janelas de vidro, as janelas de silicone fornecem fácil acesso ao tecido, de modo que células cancerígenas, corantes fluorescentes ou drogas podem ser injetadas diretamente pela janela.

Outra janela de imagem de silicone baseada em PDMS adequada para inserção em uma variedade de locais anatômicos, incluindo a glândula mamária, foi recentemente descrita18. Essa janela é moldada para gerar uma forma e uma borda especializada que permite a implantação rápida da janela sem a necessidade de pontos ou cola. Em contraste, a janela de silicone aqui apresentada não requer nenhum molde especial e, importante, pode ser cortada para moldar durante o procedimento cirúrgico para se adaptar à localização anatômica e ao camundongo individual. Embora o protocolo aqui descrito exija o uso de cola, este requisito adicional permite a imagem de órgãos abdominais, incluindo o fígado e o baço. Além disso, a janela de silicone descrita aqui permite a incorporação de uma grade de aço inoxidável dentro da janela, que fornece pontos de referência. Esses marcos permitem o rastreamento do mesmo local exato ao longo do tempo e facilitam a repetição de imagens do mesmo local ao longo de várias sessões (imagem longitudinal) para estudar processos que levam dias a semanas, como o desenvolvimento de lesões metastáticas.

Em resumo, uma janela de imagem de silicone foi desenvolvida para uso em IVM longitudinal da glândula mamária ou órgãos abdominais. A janela é opticamente clara, altamente durável e barata. A simplicidade do procedimento de inserção da janela reduz as habilidades técnicas necessárias para implementar abordagens de imagem intravital baseadas em janelas. A adaptabilidade da janela a diversos sítios teciduais permite a implementação de IVM em uma vasta gama de estudos biológicos.

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Disclosures

M.E. é membro do conselho consultivo de pesquisa da brensocatib para a Insmed, Inc.; membro do conselho consultivo científico da Vividion Therapeutics, Inc.; um consultor da Protalix, Inc.; e detém ações da Agios Pharmaceuticals, Inc. D.A.T. é co-fundadora da Mestag Therapeutics, e está no conselho consultivo científico e detém ações da Mestag Therapeutics, Leap Therapeutics, Surface Oncology e Cygnal Therapeutics. Os outros autores não declaram interesses concorrentes.

Acknowledgments

Agradecemos a Rob Eifert por sua ajuda na concepção e otimização das grades de aço inoxidável cortadas a laser. Este trabalho foi apoiado pelo Centro de Câncer da CSHL (P30-CA045508) e fundos para m.E. dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) (1R01CA2374135 e 5P01CA013106-49); CSHL e Northwell Health; a Fundação Família Thompson; Nade através da América; e uma bolsa da Fundação Simons para a CSHL. O M.S. foi apoiado pelo National Institute of General Medical Sciences Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) e pelo National Cancer Institute of the NIH sob o prêmio número 1F30CA253993-01. L.M. é apoiado por uma Bolsa de Pós-Doutorado da Fundação James S. McDonnell. J.M.A. é o beneficiário de uma Bolsa de Pós-Doutorado do Instituto de Pesquisa do Câncer/Irvington (Prêmio CRI #3435). O D.A.T. é apoiado pelo Laboratório Dedicado da Fundação Lustgarten para Pesquisa de Câncer Pancreático e pela Thompson Family Foundation. Desenhos animados foram criados com Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape 3M 70200770819
Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2 Ethicon  N267H
ACTB-ECFP mice Jackson Laboratory 22974
AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole) Vector Laboratories  SK-4200
Alcohol swabs BD  326895
Anesthesia system Molecular Imaging Products Co.
Acqknowledge software and sensors  BIOPAC ACK100W, ACK100M, TSD110
Betadine spray  LORIS 109-08
c-fms-EGFP (MacGreen) mice Jackson Laboratory 18549
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 664
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) Invitrogen 14-0451-82
CD68 Antibody Abcam ab125212
Curity gauze sponges  Covidien
Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP)  Abcam ab6885
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)  Abcam ab97064
Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP)  Abcam ab102182
Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear Electron Microscopy Sciences 24236-10 Two-part, 10:1 mixing ratio
Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness  Electron Microscopy Sciences 72296-08
Ender-3 Pro 3D printer Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD
Far Infrared Heated blanket Kent Scientific RT-0520
Fc Receptor Blocker Innovex Biosciences NB309
Fiji imaging processing package https://imagej.net/software/fiji/
FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515) Invitrogen F8795
Gating system: BIOPAC Systems Inc. The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems.
Acqknowledge software  ACK100W, ACK100M
Diff. Amp. Module, C Series  DA100C
Dual Gating Sys small animal DTU200 
MP160 for Windows - Analysis system MP160WSW 
MouseOx Plus 120V  MOX-120V;015000 
Pressure Pad  TSD110 
Gelfoam Pfizer 9031508 Absorbable gelatin sponge
Hardened fine scissors Fine Science Tools 14090-11 Two pairs; stainless steel, sharp-sharp
tips, straight tip, 26 mm
cutting edge, 11 cm length
Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody R&D Systems AF3667
Hot bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45 Turn on approximately 30 min
before use; sterilize tools at >200
°C for 30 s
Imaris  Bitplane www.bitplane.com
Immersion medium Immersol W 2010 Zeiss 444969-0000-000 
Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc BD 324912
Isoflurane (Fluriso) VetOne 502017
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594 Vector Laboratories  DL-1177-1
LysM-eGFP mice www.mmrrc.org 012039-MU
Micro dissecting forceps Roboz RS-5135 Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length
Micro dissecting forceps Roboz RS-5153 1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip
width, 4" length
MTS MiniBionix II 808 MTS Systems Servohydraulic material testing machine
Neutrophil Elastase 680 FAST probe PerkinElmer NEV11169
Nitrogen General Welding Supply Corp.
Oxygen General Welding Supply Corp.
Polylactic acid filament Hatchbox 1.75 mm diameter
ProLong Diamond Antifade Mountant Invitrogen P36970
Puralube ophthalmic ointment Dechra  NDC17033-211-38
Reflex 7 wound clips Roboz Surgical RS-9255
Stainless steel grid Fotofab One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square.  
Surface Treated SterileTissue Culture Plates Fisher Scientific FB012929 Lid used as curing surface for imaging windows
TriM Scope Multiphoton Microscope  LaVision BioTec Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes:
T560LP
T665LPXXR
T495lxpr
Vetbond 3M 70200742529
VWR micro cover glass VWR 48404-453

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References

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Pesquisa sobre câncer edição 179
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Maiorino, L., Shevik, M., Adrover,… More

Maiorino, L., Shevik, M., Adrover, J. M., Han, X., Georgas, E., Wilkinson, J. E., Seidner, H., Foerschner, L., Tuveson, D. A., Qin, Y. X., Egeblad, M. Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows. J. Vis. Exp. (179), e62757, doi:10.3791/62757 (2022).

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