Summary

Продольная прижизненная визуализация через прозрачные силиконовые окна

Published: January 05, 2022
doi:

Summary

Здесь представлен подход для долгосрочной прижизненной визуализации с использованием оптически чистых силиконовых окон, которые могут быть приклеены непосредственно к интересующей ткани / органу и коже. Эти окна дешевле и универсальнее, чем другие, используемые в настоящее время в полевых условиях, а хирургическое введение вызывает ограниченное воспаление и дистресс у животных.

Abstract

Прижизненная микроскопия (IVM) позволяет визуализировать движение, деление и гибель клеток при разрешении одной клетки. IVM через хирургически вставленные окна визуализации особенно мощный, потому что он позволяет продольное наблюдение за одной и той же тканью в течение нескольких дней до недель. Типичные окна для визуализации состоят из стеклянной крышки в биосовместимой металлической раме, пришитой к коже мыши. Эти окна могут мешать свободному движению мышей, вызывать сильную воспалительную реакцию и выходить из строя из-за разбитого стекла или разорванных швов, любой из которых может потребовать эвтаназии. Для решения этих проблем были разработаны окна для долгосрочной визуализации органов брюшной полости и молочных желез из тонкой пленки полидиметилсилоксана (PDMS), оптически прозрачного силиконового полимера, ранее использовавшегося для краниальных окон визуализации. Эти окна можно приклеивать непосредственно к тканям, сокращая время, необходимое для вставки. PDMS является гибким, что способствует его долговечности на мышах с течением времени — было протестировано до 35 дней. Продольная визуализация – это визуализация одной и той же области ткани во время отдельных сеансов. Сетка из нержавеющей стали была встроена в окна, чтобы локализовать одну и ту же область, что позволило визуализировать динамические процессы (например, инволюцию молочной железы) в одних и тех же местах, с интервалом в несколько дней. Это силиконовое окно также позволило контролировать одиночные диссеминированные раковые клетки, развивающиеся в микрометастазы с течением времени. Силиконовые окна, используемые в этом исследовании, проще вставить, чем стеклянные окна с металлическим каркасом, и вызывают ограниченное воспаление изображенных тканей. Кроме того, встроенные сетки позволяют легко отслеживать одну и ту же область ткани в повторных сеансах визуализации.

Introduction

Прижизненная микроскопия (IVM), визуализация тканей у анестезируемых животных, дает представление о динамике физиологических и патологических событий при клеточном разрешении в интактных тканях. Применение этого метода широко варьируется, но IVM сыграл важную роль в области биологии рака, чтобы помочь выяснить, как раковые клетки вторгаются в ткани и метастазируют, взаимодействуют с окружающей микросредой и реагируют на лекарства 1,2,3. Кроме того, IVM был ключом к углублению понимания сложных механизмов, регулирующих иммунные реакции, предоставляя понимание, дополняющее подходы профилирования ex vivo (например, проточная цитометрия). Например, эксперименты с прижизненной визуализацией выявили подробности об иммунных функциях, поскольку они связаны с миграцией клеток и контактом между клетками, и предложили платформу для количественной оценки пространственно-временной динамики в ответ на травму или инфекцию 4,5,6,7. Многие из этих процессов также могут быть изучены с помощью гистологического окрашивания, но только IVM позволяет отслеживать динамические изменения. Фактически, в то время как гистологический срез предлагает снимок ткани в данный момент времени, прижизненная визуализация может отслеживать межклеточные и субклеточные события в одной и той же ткани с течением времени. В частности, прогресс в флуоресцентной маркировке и разработка молекулярных репортеров позволили соотнести молекулярные события с клеточным поведением, таким как пролиферация, смерть, подвижность и взаимодействие с другими клетками или внеклеточным матриксом. Большинство методов IVM основаны на флуоресцентной микроскопии, которая из-за рассеяния света затрудняет визуализацию более глубоких тканей. Поэтому ткань, представляющая интерес, часто нуждается в хирургическом воздействии с помощью часто инвазивной и терминальной процедуры. Таким образом, в зависимости от участка органа, ткань может быть изображена непрерывно в течение периода, варьирующегося от нескольких до 40 ч8. В качестве альтернативы, хирургическое введение окна постоянной визуализации позволяет последовательно визуализировать одну и ту же ткань в течение периода от нескольких дней до недель 7,9.

Разработка новых окон визуализации была подчеркнута как технологическая необходимость дальнейшего совершенствования подходов к прижизненной визуализации10. Прототипное окно прижизненной визуализации представляет собой металлическое кольцо, содержащее стеклянную крышку, закрепленную на коже швами11. Вмешательство в свободное движение, накопление экссудата и повреждение стеклянной крышки являются общими проблемами, наблюдаемыми при использовании таких окон. Кроме того, прототип окна требует специализированного производства, а хирургическая процедура может потребовать обширной подготовки. Для решения этих проблем полидиметилсилоксан (PDMS), силиконовый полимер, который ранее использовался в черепных окнах для долгосрочной визуализации в мозге12, был адаптирован для использования в визуализации органов брюшной полости и молочных желез. Здесь представлен подробный метод создания силиконовых окон на основе PDMS, в том числе о том, как отлить окно вокруг сетки из нержавеющей стали, чтобы обеспечить ориентиры для повторного изображения одних и тех же областей ткани. Кроме того, описана простая, без швов хирургическая процедура введения окна над органами брюшной полости или молочной железой. Этот новый подход преодолевает некоторые из наиболее распространенных проблем с используемыми в настоящее время окнами визуализации и повышает доступность продольной прижизненной визуализации.

Protocol

Все описанные процедуры были выполнены в соответствии с Лабораторным хирургическим руководством Колд-Спринг-Харбор и были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в лаборатории Колд-Спринг-Харбор. 1. Литье силиконового окна </strong…

Representative Results

Прижизненная визуализация через окна визуализации может использоваться для наблюдения, отслеживания и количественной оценки широкого спектра клеточных и молекулярных событий с одноклеточным разрешением в течение периода от часов до недель. К идеальным особенностям окна визуализац?…

Discussion

Окна прижизненной визуализации являются важными инструментами для непосредственной визуализации физиологических и патологических процессов с клеточным разрешением, поскольку они разворачиваются с течением времени. Новая процедура, описанная для литья и вставки гибких силиконовых …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Роба Эйферта за его помощь в разработке и оптимизации решеток из нержавеющей стали лазерной резки. Эта работа была поддержана Онкологическим центром CSHL (P30-CA045508) и средствами для M.E. от Национальных институтов здравоохранения (NIH) (1R01CA2374135 и 5P01CA013106-49); CSHL и Northwell Health; Фонд семьи Томпсон; Плавайте по Всей Америке; и грант Фонда Саймонса CSHL. M.S. был поддержан Национальным институтом общих медицинских наук Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) и Национальным институтом рака NIH под номером 1F30CA253993-01. L.M. поддерживается постдокторской стипендией Фонда Джеймса С. Макдоннелла. J.M.A. является получателем стипендии Института исследований рака / Ирвингтонской постдокторской стипендии (CRI Award #3435). D.A.T. поддерживается Специализированной лабораторией по исследованию рака поджелудочной железы Фонда Люстгартена и Фондом семьи Томпсон. Мультфильмы создавались с Biorender.com.

Materials

3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape 3M 70200770819
Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2 Ethicon  N267H
ACTB-ECFP mice Jackson Laboratory 22974
AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole) Vector Laboratories  SK-4200
Alcohol swabs BD  326895
Anesthesia system Molecular Imaging Products Co.
Acqknowledge software and sensors  BIOPAC ACK100W, ACK100M, TSD110
Betadine spray  LORIS 109-08
c-fms-EGFP (MacGreen) mice Jackson Laboratory 18549
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 664
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) Invitrogen 14-0451-82
CD68 Antibody Abcam ab125212
Curity gauze sponges  Covidien
Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP)  Abcam ab6885
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)  Abcam ab97064
Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP)  Abcam ab102182
Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear Electron Microscopy Sciences 24236-10 Two-part, 10:1 mixing ratio
Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness  Electron Microscopy Sciences 72296-08
Ender-3 Pro 3D printer Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD
Far Infrared Heated blanket Kent Scientific RT-0520
Fc Receptor Blocker Innovex Biosciences NB309
Fiji imaging processing package https://imagej.net/software/fiji/
FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515) Invitrogen F8795
Gating system: BIOPAC Systems Inc. The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems.
Acqknowledge software  ACK100W, ACK100M
Diff. Amp. Module, C Series  DA100C
Dual Gating Sys small animal DTU200 
MP160 for Windows – Analysis system MP160WSW 
MouseOx Plus 120V  MOX-120V;015000 
Pressure Pad  TSD110 
Gelfoam Pfizer 9031508 Absorbable gelatin sponge
Hardened fine scissors Fine Science Tools 14090-11 Two pairs; stainless steel, sharp-sharp
tips, straight tip, 26 mm
cutting edge, 11 cm length
Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody R&D Systems AF3667
Hot bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45 Turn on approximately 30 min
before use; sterilize tools at >200
°C for 30 s
Imaris  Bitplane www.bitplane.com
Immersion medium Immersol W 2010 Zeiss 444969-0000-000 
Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc BD 324912
Isoflurane (Fluriso) VetOne 502017
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594 Vector Laboratories  DL-1177-1
LysM-eGFP mice www.mmrrc.org 012039-MU
Micro dissecting forceps Roboz RS-5135 Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length
Micro dissecting forceps Roboz RS-5153 1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip
width, 4" length
MTS MiniBionix II 808 MTS Systems Servohydraulic material testing machine
Neutrophil Elastase 680 FAST probe PerkinElmer NEV11169
Nitrogen General Welding Supply Corp.
Oxygen General Welding Supply Corp.
Polylactic acid filament Hatchbox 1.75 mm diameter
ProLong Diamond Antifade Mountant Invitrogen P36970
Puralube ophthalmic ointment Dechra  NDC17033-211-38
Reflex 7 wound clips Roboz Surgical RS-9255
Stainless steel grid Fotofab One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square.  
Surface Treated SterileTissue Culture Plates Fisher Scientific FB012929 Lid used as curing surface for imaging windows
TriM Scope Multiphoton Microscope  LaVision BioTec Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes:
T560LP
T665LPXXR
T495lxpr
Vetbond 3M 70200742529
VWR micro cover glass VWR 48404-453

References

  1. Dondossola, E., et al. Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone. Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).
  2. Haeger, A., et al. Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche. Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184 (2020).
  3. Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
  4. Eickhoff, S., et al. Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions. Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).
  5. Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
  6. Sammicheli, S., et al. Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses. Science Immunology. 1 (4), (2016).
  7. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  8. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).
  9. Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
  10. Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. Recording the wild lives of immune cells. Science Immunology. 3 (27), (2018).
  11. Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), 29917 (2014).
  12. Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818 (2016).
  13. Anderson, T. L. . Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , (2005).
  14. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088 (2013).
  15. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  16. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  17. Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. Intravital. 5 (1), 1125562 (2016).
  18. Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).

Play Video

Cite This Article
Maiorino, L., Shevik, M., Adrover, J. M., Han, X., Georgas, E., Wilkinson, J. E., Seidner, H., Foerschner, L., Tuveson, D. A., Qin, Y., Egeblad, M. Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows. J. Vis. Exp. (179), e62757, doi:10.3791/62757 (2022).

View Video