Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Продольная прижизненная визуализация через прозрачные силиконовые окна

Published: January 5, 2022 doi: 10.3791/62757
Automatic Translation
*1,2,3, *1,4,5, 1, 1,6, 7,8, 9, 1, 1, 1, 8, 1
1Cold Spring Harbor Laboratory, 2Cold Spring Harbor Laboratory School of Biological Sciences, 3Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 4Medical Scientist Training Program, School of Medicine, Stony Brook University, 5Graduate Program in Pharmacology, Stony Brook University, 6Graduate Program in Genetics, Stony Brook University, 7Graduate Program in Biomedical Engineering, Stony Brook University, 8Department of Biomedical Engineering, Stony Brook University, 9Department of Pathology, University of Michigan
* These authors contributed equally

Summary

Здесь представлен подход для долгосрочной прижизненной визуализации с использованием оптически чистых силиконовых окон, которые могут быть приклеены непосредственно к интересующей ткани / органу и коже. Эти окна дешевле и универсальнее, чем другие, используемые в настоящее время в полевых условиях, а хирургическое введение вызывает ограниченное воспаление и дистресс у животных.

Abstract

Прижизненная микроскопия (IVM) позволяет визуализировать движение, деление и гибель клеток при разрешении одной клетки. IVM через хирургически вставленные окна визуализации особенно мощный, потому что он позволяет продольное наблюдение за одной и той же тканью в течение нескольких дней до недель. Типичные окна для визуализации состоят из стеклянной крышки в биосовместимой металлической раме, пришитой к коже мыши. Эти окна могут мешать свободному движению мышей, вызывать сильную воспалительную реакцию и выходить из строя из-за разбитого стекла или разорванных швов, любой из которых может потребовать эвтаназии. Для решения этих проблем были разработаны окна для долгосрочной визуализации органов брюшной полости и молочных желез из тонкой пленки полидиметилсилоксана (PDMS), оптически прозрачного силиконового полимера, ранее использовавшегося для краниальных окон визуализации. Эти окна можно приклеивать непосредственно к тканям, сокращая время, необходимое для вставки. PDMS является гибким, что способствует его долговечности на мышах с течением времени — было протестировано до 35 дней. Продольная визуализация - это визуализация одной и той же области ткани во время отдельных сеансов. Сетка из нержавеющей стали была встроена в окна, чтобы локализовать одну и ту же область, что позволило визуализировать динамические процессы (например, инволюцию молочной железы) в одних и тех же местах, с интервалом в несколько дней. Это силиконовое окно также позволило контролировать одиночные диссеминированные раковые клетки, развивающиеся в микрометастазы с течением времени. Силиконовые окна, используемые в этом исследовании, проще вставить, чем стеклянные окна с металлическим каркасом, и вызывают ограниченное воспаление изображенных тканей. Кроме того, встроенные сетки позволяют легко отслеживать одну и ту же область ткани в повторных сеансах визуализации.

Introduction

Прижизненная микроскопия (IVM), визуализация тканей у анестезируемых животных, дает представление о динамике физиологических и патологических событий при клеточном разрешении в интактных тканях. Применение этого метода широко варьируется, но IVM сыграл важную роль в области биологии рака, чтобы помочь выяснить, как раковые клетки вторгаются в ткани и метастазируют, взаимодействуют с окружающей микросредой и реагируют на лекарства 1,2,3. Кроме того, IVM был ключом к углублению понимания сложных механизмов, регулирующих иммунные реакции, предоставляя понимание, дополняющее подходы профилирования ex vivo (например, проточная цитометрия). Например, эксперименты с прижизненной визуализацией выявили подробности об иммунных функциях, поскольку они связаны с миграцией клеток и контактом между клетками, и предложили платформу для количественной оценки пространственно-временной динамики в ответ на травму или инфекцию 4,5,6,7. Многие из этих процессов также могут быть изучены с помощью гистологического окрашивания, но только IVM позволяет отслеживать динамические изменения. Фактически, в то время как гистологический срез предлагает снимок ткани в данный момент времени, прижизненная визуализация может отслеживать межклеточные и субклеточные события в одной и той же ткани с течением времени. В частности, прогресс в флуоресцентной маркировке и разработка молекулярных репортеров позволили соотнести молекулярные события с клеточным поведением, таким как пролиферация, смерть, подвижность и взаимодействие с другими клетками или внеклеточным матриксом. Большинство методов IVM основаны на флуоресцентной микроскопии, которая из-за рассеяния света затрудняет визуализацию более глубоких тканей. Поэтому ткань, представляющая интерес, часто нуждается в хирургическом воздействии с помощью часто инвазивной и терминальной процедуры. Таким образом, в зависимости от участка органа, ткань может быть изображена непрерывно в течение периода, варьирующегося от нескольких до 40 ч8. В качестве альтернативы, хирургическое введение окна постоянной визуализации позволяет последовательно визуализировать одну и ту же ткань в течение периода от нескольких дней до недель 7,9.

Разработка новых окон визуализации была подчеркнута как технологическая необходимость дальнейшего совершенствования подходов к прижизненной визуализации10. Прототипное окно прижизненной визуализации представляет собой металлическое кольцо, содержащее стеклянную крышку, закрепленную на коже швами11. Вмешательство в свободное движение, накопление экссудата и повреждение стеклянной крышки являются общими проблемами, наблюдаемыми при использовании таких окон. Кроме того, прототип окна требует специализированного производства, а хирургическая процедура может потребовать обширной подготовки. Для решения этих проблем полидиметилсилоксан (PDMS), силиконовый полимер, который ранее использовался в черепных окнах для долгосрочной визуализации в мозге12, был адаптирован для использования в визуализации органов брюшной полости и молочных желез. Здесь представлен подробный метод создания силиконовых окон на основе PDMS, в том числе о том, как отлить окно вокруг сетки из нержавеющей стали, чтобы обеспечить ориентиры для повторного изображения одних и тех же областей ткани. Кроме того, описана простая, без швов хирургическая процедура введения окна над органами брюшной полости или молочной железой. Этот новый подход преодолевает некоторые из наиболее распространенных проблем с используемыми в настоящее время окнами визуализации и повышает доступность продольной прижизненной визуализации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все описанные процедуры были выполнены в соответствии с Лабораторным хирургическим руководством Колд-Спринг-Харбор и были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в лаборатории Колд-Спринг-Харбор.

1. Литье силиконового окна

  1. Получают силиконовый полимер (PDMS), смешивая базовый эластомер и отверждающий агент в соотношении 10:1 (v/v).
  2. Отлить окно, нанеся небольшое количество PDMS на стерильную, гладкую поверхность и отрегулировать отношение объема к площади до желаемой толщины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование 200 мг раствора полимера для круга диаметром 22 мм на крышке крышки из 24 пластин приводит к хорошему компромиссу между прочностью окна и оптической прозрачностью.
  3. Дополнительно: Чтобы обеспечить ориентиры для повторного изображения одних и тех же областей ткани, слегка вдавите сетку из нержавеющей стали в силикон после того, как PDMS окажется на желаемой поверхности литья.
  4. Чтобы удалить пузырьки воздуха, поместите покрытую поверхность в вакуумный осушитель на 45 мин для дегазации полимера.
  5. Отверните силиконовые окна в духовке при 80 °C в течение 45 мин.
  6. Нанесите полимер по краям формы и аккуратно отклейте отвержденные окна с поверхности, используемой для литья щипцами.
  7. Перед операцией стерилизуйте окна автоклавированием.

2. Подготовка мыши к вставке силиконового окна

  1. Обезболить мышь в индукционной камере с использованием 4% (v/v) изофлурана. Переместите мышь на согревающую прокладку на хирургическом столе, поместите мышь в маску для анестезии носа и понизьте концентрацию изофлурана до 2% для поддержания на протяжении всей операции.
  2. Проверьте глубину анестезии, защемив пальцы задних конечностей. Не продолжайте, пока мышь не станет неактивной и не покажет рефлекторную реакцию пальца ноги.
  3. Нанесите офтальмологическую смазку на глаза, чтобы они не высохли и предотвратили травмы.
  4. Вводят упреждающую анальгезию (бупренорфин 0,05 мг/кг) подкожно.
  5. Побрейте место операции и полностью удалите волосы с помощью крема для удаления волос.
  6. Применяют повидон-йодный раствор (10% v/v) и этанол (70% v/v) последовательно 3x для предотвращения инфекции хирургического участка.

3. Вставка вентрального окна для визуализации в печени; адаптируется для других органов брюшной полости (Рисунок 1)

  1. Поместите мышь в положение лежа на спине.
  2. Сделайте разрез 10 мм, начиная с 3 мм вниз от мечевидного процесса, используя стерильные ножницы и щипцы.
  3. Удалите участок кожи размером 1–1,5см2 вдоль средней линии.
  4. Используйте вторую пару стерильных ножниц и щипцов, чтобы удалить участок брюшины, немного меньший, чем участок кожи.
  5. Необязательно: Чтобы визуализировать большую часть печени, используйте стерильные ватные палочки, смоченные стерильным физиологическим раствором, чтобы вытолкнуть печень вниз от диафрагмы, выявляя фальциформную связку, соединяющую печень с диафрагмой. Разорвите связку, следя за тем, чтобы не перерезать нижнюю полую вену.
  6. Выведите хирургический клей шприцем 31 Г, нанесите небольшое его количество на поверхность печени по краям области, подлежащей изображению. Этот клей создает круглое уплотнение, оставляя центральную область нетронутой для визуализации.
    ВНИМАНИЕ: Ограничьте клей небольшими каплями, образующими круговой рисунок вокруг области визуализации. Ткань, непосредственно контактирующая с клеем, не может быть изображена. Нет необходимости сушить ткань перед нанесением клея.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Любые клеи на основе цианоакрилата могут быть успешно использованы для этой процедуры. Хирургический клей обеспечивает стерильность. Для терминальных процедур универсальные суперклеи дают хорошие результаты.
  7. Расположите окно с помощью щипцов и крепко прижмите его к печени, пока клей не высохнет (~2 мин).
  8. Сложите края окна под брюшину.
  9. Шприцем нанесите небольшое количество хирургического клея на края окна, которые сейчас находятся под брюшиной. Надавите на брюшину щипцами, чтобы закрепить ее к окну.
  10. Аналогичным образом, нанесите небольшое количество хирургического клея на брюшину, прежде чем надавить на кожу щипцами, чтобы закрепить ее на брюшине.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При правильном выполнении круглая область печеночной ткани теперь должна быть видна через окно.
  11. Нанесите клей по краям окна, чтобы создать ободок, который поможет предотвратить рост кожи над окном.
    ВНИМАНИЕ: Если процедура проводится с использованием стерильных хирургических методов и окно стерилизуется перед введением, достаточно герметизации раны хирургическим клеем, чтобы избежать инфекций. Однако несоблюдение надлежащих асептических методов во время хирургического введения или несовершенное закрытие может привести к явной или субклинической инфекции и высыханию ткани.

4. Вставка бокового окна для визуализации в печени; совместима с одновременной инъекцией раковых клеток в воротную вену (рисунок 2)

  1. Поместите мышь в левое боковое положение пролежней
  2. Сделайте 10 мм разрез на правом фланге на 3 мм ниже реберной дуги с помощью стерильных ножниц и щипцов.
  3. Удалите участок кожиразмером 1 см2 .
  4. Используйте вторую пару стерильных ножниц и щипцов, чтобы удалить участок брюшины, немного меньший, чем участок кожи.
  5. Выведите хирургический клей шприцем 31 Г, нанесите небольшое его количество на поверхность печени по краям области, подлежащей изображению.
    ВНИМАНИЕ: Ограничьте клей небольшими каплями, образующими круговой рисунок вокруг области визуализации. Ткань, непосредственно контактирующая с клеем, не может быть изображена.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Любые клеи на основе цианоакрилата могут быть успешно использованы для этой процедуры. Хирургический клей обеспечивает стерильность. Для терминальных процедур универсальные суперклеи дают хорошие результаты.
  6. Расположите окно с помощью щипцов и крепко прижмите его к печени, пока клей не высохнет (~2 мин).
  7. Сложите края окна под брюшину.
  8. Шприцем нанесите небольшое количество хирургического клея на края окна, которые сейчас находятся под брюшиной. Надавите на брюшину щипцами, чтобы закрепить ее к окну.
  9. Аналогичным образом, нанесите небольшое количество хирургического клея на брюшину, прежде чем надавить на кожу щипцами, чтобы закрепить ее на брюшине.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При правильном выполнении круглая область печеночной ткани теперь должна быть видна через окно.
  10. Нанесите клей по краям окна, чтобы создать ободок, который поможет предотвратить рост кожи над окном.
  11. Если требуется инъекция в воротную вену:
    1. Поместите мышь в положение лежа на спине.
    2. Сделайте разрез 10 мм, начиная с мечевидного отростка в коже.
    3. Используя вторую пару стерильных ножниц и щипцов, сделайте 10-миллиметровый разрез в брюшине.
    4. Обмакните два ватных тампона в стерильный физиологический раствор.
    5. Используйте ватные тампоны, чтобы осторожно вытянуть кишечник на стерильную марлю, смоченную стерильным физиологическим раствором, заботясь о том, чтобы не скручивать или иным образом не нарушать ориентацию.
    6. Продолжайте смещать кишечник из брюшной полости до тех пор, пока портальная вена не будет видна с правой стороны живота.
    7. Вставьте иглу 31–33 G 5–7 мм каудальной в точку входа воротной вены в печень, убедившись, что она протекает внутри кровеносного сосуда, а не через него.
    8. Медленно вводят раковые клетки (повторно суспендируют в 100 мкл стерильного PBS).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого эксперимента амуриновую линию раковых раковых клеток поджелудочной железы (например, KPC-BL/6-1199) можно культивировать в полной среде DMEM и 1 х 105 клеток, вводимых в 100 мкл стерильных PBS.
    9. Чтобы предотвратить кровотечение, сразу после извлечения иглы нанесите мягкое давление на место инъекции небольшим кусочком хирургической губки в течение 1–2 мин.
    10. После того, как давление будет снято, контролируйте участок в течение 1–2 мин, чтобы обеспечить гемостаз.
    11. Используя смоченные ватные тампоны, верните кишечник в брюшную полость, следуя физиологической ориентации органа.
    12. Используя стерильные щипцы, вставьте окно сразу под брюшину, с левой стороны брюшной полости мыши.
    13. Зашить 4-0 шелковых швов и скрепить разрез средней линии 7 мм зажимами из нержавеющей стали.
    14. Перемещение мыши в левое боковое пролежнее положение
    15. Сделайте 10 мм разрез на правом фланге 3 мм под реберной дугой через кожу с помощью стерильных ножниц и щипцов.
    16. Удалите участок кожи размером 1см2 вокруг разреза.
    17. Используйте вторую пару стерильных ножниц и щипцов, чтобы удалить участок брюшины, немного меньший, чем участок кожи.
    18. Потяните окно на место над печенью, прежде чем приклеить его на место, как описано в шагах 4.8–4.10.

5. Вставка окна для визуализации в поджелудочной железе (рисунок 3)

  1. Поместите мышь в правое боковое положение пролежней.
  2. Сделайте 10 мм разрез на левом фланге на 3 мм ниже реберной дуги с помощью стерильных ножниц и щипцов.
  3. Удалите участок кожи размером 1см2 вокруг разреза.
  4. Используйте вторую пару стерильных ножниц и щипцов, чтобы удалить участок брюшины, немного меньший, чем участок кожи.
  5. Используя стерильные ватные тампоны, пропитанные стерильным физиологическим раствором, осторожно потяните на селезенку, чтобы визуализировать поджелудочную железу. Приступайте к перемещению поджелудочной железы с помощью смоченных ватных тампонов, чтобы сделать большую площадь поверхности видимой через разрез.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент раковые клетки поджелудочной железы могут быть ортотопически введены в поджелудочную железу, если это является частью экспериментального проекта.
  6. Извлеките хирургический клей шприцем 31 G, нанесите небольшое его количество на поверхность поджелудочной железы по краям области, подлежащей изображению.
    ВНИМАНИЕ: Ограничьте клей небольшими каплями, образующими круговой рисунок вокруг области визуализации. Ткань, непосредственно контактирующая с клеем, не может быть изображена.
  7. Расположите окно с помощью щипцов и крепко прижмите его к поджелудочной железе, пока клей не высохнет (~2 мин).
  8. Сложите края окна под брюшину.
  9. Шприцем нанесите небольшое количество хирургического клея на края окна, которые сейчас находятся под брюшиной. Надавите на брюшину щипцами, чтобы закрепить ее к окну.
  10. Аналогичным образом, нанесите небольшое количество хирургического клея на брюшину, прежде чем надавить на кожу щипцами, чтобы закрепить ее на брюшине.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При правильном выполнении круглая область ткани поджелудочной железы теперь должна быть видна через окно.
  11. Нанесите клей по краям окна, чтобы создать ободок, который поможет предотвратить рост кожи над окном.

6. Вставка окна для визуализации в молочной железе (рисунок 4)

  1. Поместите мышь в положение лежа на спине.
  2. Сделайте 10-миллиметровый разрез медиальным к одному из паховых сосков с помощью стерильных ножниц и щипцов.
  3. Удалите 0,5см2 участка кожи над молочной железой.
  4. Используйте вторую пару стерильных ножниц, чтобы тщательно отделить молочную железу от кожи, распределив ножницы между двумя поверхностями, чтобы нарушить сцепление.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы облегчить визуализацию области паховой молочной железы, будьте осторожны, чтобы рассечь часть кожи над молочной железой, но выше задней ноги, чтобы окно не ограничивало подвижность мыши.
  5. Извлеките хирургический клей шприцем 31 G, нанесите небольшое его количество на поверхность молочной железы по краям области, подлежащей изображению.
    ВНИМАНИЕ: Ограничьте клей небольшими каплями, образующими круговой рисунок вокруг области визуализации. Ткань, непосредственно контактирующая с клеем, не может быть изображена.
  6. Расположите окно с помощью щипцов и крепко прижмите его к молочной железе, пока клей не высохнет (~2 мин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Круглая область ткани молочной железы теперь должна быть видна через окно, если выполнена правильно.
  7. Сложите края окна под кожу.
  8. Шприцем нанесите небольшое количество хирургического клея на края окна, которые сейчас находятся под кожей. Надавите на кожу щипцами, чтобы закрепить кожу к окну.
  9. Нанесите клей по краям окна, чтобы создать ободок, который поможет предотвратить рост кожи над окном.

7. Послеоперационное восстановление

  1. Поместите мышь в чистую клетку для восстановления с достаточным количеством гнездового материала, убедившись, что часть клетки покоится на грелке.
  2. Непрерывно контролируйте мышь, пока она не станет сознательной и подвижной.
  3. При необходимости назначают дополнительную дозу анальгетика через 12 ч после введения упреждающей дозы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительная анальгезия, как правило, не нужна, но проконсультируйтесь с ветеринаром, если мышь проявляет признаки дистресса (например, сгорбленную спину, неопрятный мех или потерянный интерес к пище). Ежедневно контролируйте мышь в течение первых 3 дней после операции на наличие признаков инфекции или других побочных эффектов. Менее 2% мышей нуждаются в ветеринарной помощи или эвтаназии, как правило, из-за частичного отслоения окна. Важно отметить, что для самцов мышей с вентральными окнами визуализации печени борьба между мышами может привести к отслоению окон. Этого можно избежать, разместив мышей отдельно.

8. Визуализация через окно

  1. Обезболить мышь в индукционной камере с использованием 4% (v/v) изофлурана.
  2. Нанесите офтальмологическую смазку на глаза, чтобы они не высохли и предотвратили травмы.
  3. Переместите мышь из индукционной камеры на ступень микроскопа. Поместите мышь в анестезирующую маску для носа и уменьшите концентрацию изофлурана примерно до 1-1,5% для поддерживающей анестезии на протяжении всей процедуры визуализации.
  4. Поместите датчик нажимной панели под мышью, чтобы контролировать частоту дыхания и зафиксировать мышь на сцене с помощью мягкой хирургической ленты.
  5. Вставьте ректальный термометр для мониторинга температуры тела на протяжении всего сеанса визуализации.
  6. Включите нагретую подушку, внимательно следя за мышью, чтобы температура тела не превышала 37 °C.
  7. Используйте программное обеспечение для мониторинга частоты дыхания мыши. Оптимальная скорость составляет ~1 вдох в секунду. Отрегулируйте анестезию по мере необходимости.
  8. Перед каждым сеансом визуализации очищайте окно от любой остаточной среды погружения в линзы и мусора, аккуратно протирая его ватным тампоном, смоченным в 70% этаноле (v/v).
  9. При использовании погружной в воду линзы нанесите ультразвуковой гель на окно, избегая пузырьков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дистиллированная вода также может быть использована, но может потребовать повторного применения во время визуализации.
  10. Чтобы найти оптимальную глубину для визуализации, сначала найдите сетку и поместите ее в фокус.
  11. Определите приблизительную глубину визуализации ткани, установив нижнюю часть сетки на 0. Эта информация необходима для определения местоположения соответствующей плоскости z в последующих сеансах визуализации.
  12. Чтобы определить одно и то же местоположение в течение нескольких сеансов визуализации, используйте квадраты на сетке в качестве контрольной точки. Во время визуализации обратите внимание на ориентацию сетки и расположение в сетке каждого изображенного поля зрения (например,2-я строка сверху,4-й квадрат слева).
  13. Во время последовательных сеансов визуализации используйте сетку для перехода обратно к определенным областям сетки и, таким образом, к полям визуализации.
  14. После каждого сеанса визуализации удаляйте любую остаточную среду погружения в линзы и мусор, осторожно протирая окно ватным тампоном, смоченным в 70% этаноле (v/v).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Прижизненная визуализация через окна визуализации может использоваться для наблюдения, отслеживания и количественной оценки широкого спектра клеточных и молекулярных событий с одноклеточным разрешением в течение периода от часов до недель. К идеальным особенностям окна визуализации относятся: а) ограниченное воздействие на самочувствие мыши и физиологию тканей; б) долговечность; в) простота вставки; и d) четкие ориентиры для повторной визуализации одного и того же региона. Результатом является универсальное, инертное силиконовое окно, которое легко изготавливается и вставляется и которое может быть оснащено сеткой для определения одного и того же поля зрения в течение нескольких сеансов визуализации.

Окно изготовлено из PDMS, который является недорогим, гибким и прозрачным материалом. Окна могут быть отлиты с расходными материалами, которые широко доступны для покупки для большинства лабораторий. Для этих целей хорошо работают круглые формы (диаметром 22 мм), которые уже выгравированы на крышке коммерчески доступных 24 пластин скважин. Варьируя количество используемого полимера на единицу площади, можно регулировать толщину окна. Чтобы задокументировать влияние толщины окна на разрешение изображения, был проведен анализ функции точечного распространения (PSF) флуоресцентных микросфер 40 нм для сравнения изображений через окна PDMS различной толщины со стеклянными покровными листами, обычно используемыми для прижизненных окон визуализации (толщина 0,17 мм). Чтобы воспроизвести установку, используемую для прижизненной визуализации, визуализация PSF была выполнена с использованием того же двухфотонного микроскопа и водной иммерсионной линзы с ультразвуковым гелем, нанесенным в качестве иммерсионной среды.

Полная ширина при половинном максимуме (FWHM) интенсивности сигнала, рассчитанная с помощью подгонки PSF в боковых плоскостях, была сопоставима со стеклом для окон PDMS, отлитых со 100 мг PDMS (рисунок 5A, B). Боковое разрешение по сравнению со стеклянными крышками было уменьшено для окон, отлитых с помощью 150–250 мг PDMS (рисунок 5A,B). В плоскости изображения по оси Z окна PDMS, отлитые из 100–200 мг полимера, работали лучше, чем стеклянные крышки (рисунок 5C). Оптическая четкость была потеряна в окнах, отлитых с 300 мг PDMS, что делало измерения ненадежными (рисунки 5A–C). Соотношение X/Y значений FWHM существенно не отличалось между стеклом и PDMS любой толщины, хотя соотношение для окон, отлитых с 200–250 мг полимера, заметно отклонялось от 1 с использованием ультразвукового геля в качестве иммерсионной среды (рисунок 5D). Однако при использовании воды в качестве погружной среды для оконного литья с 200 мг отклонение от симметрии было гораздо менее выраженным. Поэтому при такой толщине отклонения из-за аберраций в полимере, вероятно, незначительны. Пиковые значения интенсивности флуоресценции также были собраны для каждой микросферы и показали, что стекло и PDMS работают сопоставимо, хотя самый высокий сигнал был записан через стекло (рисунок 5I). Оптимальная толщина окна PDMS будет зависеть от конкретных применений и систем визуализации. Для большинства целей 200 мг раствора полимера для круглого окна диаметром 22 мм является оптимальным компромиссом между прочностью окна и оптической прозрачностью. Действительно, окна, отлитые с менее чем 200 мг, были более оптически чистыми, со значениями FWHM, аналогичными стеклу, но иногда разрывались во время хирургической имплантации, в то время как случаев повреждения окон не наблюдалось при использовании 200 мг (у >100 мышей).

Для измерения этих различий в свойствах материала окна PDMS (200 мг и 150 мг) были загружены в сервогидравлическую машину для испытания материалов под профилем контроля нагрузки 1 Н/с до разрушения материала (рисунок 5J). Значения силы и смещения измерялись на частоте 100 Гц. Затем данные о силовом смещении были преобразованы в напряжение-деформацию с использованием уравнений:

σ = F / A (1)

Ɛ = ΔL / L0 (2)

Где σ — напряжение (Па), F — сила (N), A — площадь поперечного сечения окна, Ɛ — деформация, ΔL — смещение, а L0 — толщина окна. Ударную вязкость материала определяли путем расчета площади суммирования по кривой напряжения-деформации. Ударная вязкость материала относится к его способности пластически деформироваться и поглощать энергию в процессе перед разрушением - ключевое свойство для имплантированных окон13. В соответствии с наблюдениями во время экспериментов по визуализации, окна, отлитые с 200 мг PDMS, имеют значительно большую прочность, чем окна, отлитые с 150 мг (рисунок 5K), и, следовательно, менее склонны к разрушению.

Далее модуль Юнга (E) предпочтительных окон PDMS, отлитых с 200 мг, был определен и сопоставлен со стандартными стеклянными крышками путем извлечения линейной области кривой напряжения-деформации и определения наклона с использованием закона Гука:

σ = EƐ (3)

Модуль Юнга стеклянных окон был значительно больше, чем PDMS, что было ожидаемо, потому что стекло гораздо более жесткое по прочности материала, чем PDMS (рисунок 5L). Таким образом, хотя стекло является более прочным материалом, основанным на его большем модуле Юнга, большая прочность окон PDMS 200 мг поддерживает то, что их можно применять в течение более длительных периодов времени без риска поломки и необходимости повторной хирургической процедуры или эвтаназии.

Основным преимуществом силиконовых окон является универсальность. Важно отметить, что процедура хирургического введения окна может быть легко адаптирована к различным анатомическим местам. Адаптация к операции облегчается тем фактом, что окна могут быть легко изменены хирургическими ножницами и что окна приклеены к поверхности ткани / органа, представляющей интерес, и к коже, полностью устраняя необходимость в швах. Успешное введение окон таким образом было достигнуто для печени, поджелудочной железы и молочной железы (рисунки 6A-C). В частности, были разработаны два различных протокола для имплантации либо вентральных, либо боковых окон для визуализации печени. На рисунке 1 показаны шаги по вставке вентрального окна. Эта процедура может быть адаптирована для других органов брюшной полости и даст наибольшую видимую площадь поверхности. Однако, если не требуется большая (>1см2) область изображения, вставка бокового окна в правую сторону мыши (рисунок 2) предпочтительна для уменьшения артефактов движения, например, из-за дыхания и перистальтики. Кроме того, хирургическая процедура введения бокового окна визуализации совместима с одновременной инъекцией раковых клеток в воротную вену для экспериментального моделирования развития метастазирования в печень. Таким образом, мыши могут проходить одну процедуру вместо двух отдельных, когда у одного и того же животного требуется инъекция воротной вены и введение окна брюшной визуализации. Аналогичная процедура используется для имплантации окна над поджелудочной железой на левом боку мыши (рисунок 3). Окно также может быть вставлено над подкожными тканями, т.е. нормальными молочными железами, а также уже установленными спонтанными или ортотопически пересаженными опухолями молочной железы (рисунок 4). Альтернативно, раковые клетки могут быть введены в молочную железу через окно, чтобы продольно следить за развитием первичной опухоли, так как иглы могут проколоть пленку PDMS без ущерба для целостности окна.

Благодаря малому весу и гибкости силиконовые окна не мешают подвижности мыши (Фильм 1). Таким образом, силиконовые окна преодолевают основные препятствия, связанные со стеклянными окнами, такие как хрупкость, сложный шов и влияние на подвижность животных. Вместо этого основным ограничением, связанным с силиконовыми окнами, является отрастание эпителия под окном. Однако, когда соответствующее количество кожи удаляется и рана полностью запечатывается клеем, повторная эпителизация ограничивается, и визуализация может продолжаться в течение длительных периодов времени (было протестировано до 35 дней, рисунок 6D). После вставки окна мышь может быть изображена продольно в течение примерно одного месяца или до тех пор, пока хирургический клей не выйдет из строя или не произойдет повторное эпителизацию. Короткие ежедневные сеансы визуализации (~ 60 мин) или менее частые, но более длительные сеансы визуализации предпочтительны, чтобы избежать побочных эффектов, вызванных анестезией. Окононосные животные могут быть изображены на любой платформе прижизненной визуализации с помощью как однофотонной, так и многофотонной конфокальной микроскопии с использованием стандартных процедур (см., например, 14). До и после каждого сеанса визуализации желательно очищать окно от грязи и мусора, протирая его ватным тампоном, смоченным в 70% этаноле (v/v).

Чтобы отслеживать одно и то же местоположение с течением времени, сетки из нержавеющей стали могут быть встроены в окно. На рисунке 7A показаны спецификации для изготовленных на заказ, вытравленных лазером сеток, используемых здесь. Коммерческие сети для просвечивающей электронной микроскопии также подходят для этого применения. Сетка встроена в окно во время процедуры литья и хорошо видна над областью визуализации как невооруженным глазом (рисунок 7B), так и через глаза микроскопа (рисунок 7C). Поскольку окно приклеено к поверхности органа, положение полей визуализации относительно сетки стабильно. Во время визуализации обратите внимание на ориентацию сетки и расположение в сетке каждого поля зрения, которое изображено (например,2-я строка сверху,4-й квадрат слева). Затем используйте сетку для возврата к определенным областям сетки - и, следовательно, полям визуализации - во время последовательных сеансов визуализации.

Сетка также полезна для выравнивания поля визуализации во время сеанса визуализации, когда ткань медленно дрейфует из-за, например, дыхания или перистальтики. Большинство окон для визуализации с жестким ободом могут быть привязаны к держателю во время съемки, что повышает стабильность области изображения. Поскольку гибкие окна не могут быть непосредственно стабилизированы, хирургическая лента используется для стабилизации участка тела, содержащего окно, и область визуализации повторно выравнивается по центру соответствующего квадрата сетки или ранее идентифицированных тканевых ориентиров (например, сосудистых ориентиров) через определенные промежутки времени (обычно каждые 30 минут). Дальнейшая коррекция дрейфа для микроскопического смещения поля зрения выполняется в цифровом виде в фазе после сбора с помощью кода, который переравнивает кадры на основе обнаруженных тканевых паттернов (Дополнительный код 1–2).

Чтобы подтвердить, что окно не вызывает каких-либо явных системных побочных реакций, контролировали вес животных, которые подверглись имплантации окна и необработанному возрастному контролю. После первоначальной потери веса, связанной с операцией, большинство мышей со вставленными окнами продолжают набирать вес с течением времени, что указывает на то, что введение окна хорошо переносится (рисунки 8A-C). Для печеночных и молочных желез окон нормальный вес восстанавливается в течение 5 дней после операции. Послеоперационное восстановление происходит медленнее после имплантации окна над поджелудочной железой, при этом мыши возвращаются к предоперационному весу в течение 14 дней. Это наблюдение согласуется с ожидаемыми эффектами, связанными с манипуляциями с поджелудочной железой во время операции. Обратите внимание, что даже в тех случаях, когда потеря веса не достигает порога гуманной конечной точки, мыши, которые не восстанавливают предоперационную массу тела (<5% всех мышей, примером которых является мышь, указанная * на рисунке 8B), обычно подвергаются цензуре из экспериментов по визуализации. Кроме того, количество лейкоцитов, определяемое в различные моменты времени после введения окна, не изменялось почти у любых окононосных мышей по сравнению с контрольной группой и не менялось значительно с течением времени (рисунок 8D), предполагая, что окно не вызывало серьезного системного воспаления.

Далее, чтобы оценить степень местной реакции тканей на окно и клей, мышей усыпляли через 3, 14 и 28 (окна молочной железы) или через 35 дней (окна печени и поджелудочной железы) после хирургического введения окна для гистологического анализа. Оценка окрашенных гематоксилином и эозином (H &E) участков печени показала поверхностное (20-80 мкм), минимальное или мягкое образование капсульной грануляционной ткани под окнами для большинства мышей (2 из 3 мышей, оцененных на 3-й день, и 2 из 3, оцененных на 14-й день). Эти поражения были очаговыми (1–3 мм в длину), что примерно соответствовало ширине клеевого слоя (рисунок 8Е). Через 35 дней у большинства мышей (4 из 6, оцененных в двух отдельных экспериментах) не было зернистой ткани, в то время как у некоторых (2 из 6) наблюдался умеренный очаговый капсулярный склероз и десмоплазия (на глубине 25–250 мкм). Интересно, что никаких значительных поражений на поверхности поджелудочной железы непосредственно под окном в любой момент времени в когорте из девяти мышей не наблюдалось (рисунок 8G). Тем не менее, у некоторых мышей наблюдались области атрофии в поджелудочной железе и воспаления в брюшном жире (стеатит), что согласуется с повреждением, вызванным манипуляциями. Что касается молочной железы, то на 3-й день после имплантации окна у 3 из 3 мышей была либо грануляционная ткань, напоминающая заживляющий разрез, видимый вдоль поверхности железы, либо воспалительная реакция в жировой ткани; на 14-й день у 3 из 3 обследованных мышей была грануляционная ткань. Эти поражения были снова очаговыми и 1–3 мм в длину (рисунок 8I). Мыши с окнами молочной железы, усыпленные через 28 дней после операции, не показали явных гистологических аномалий.

Этот анализ показывает, что окно не ставит под угрозу общую физиологическую архитектуру исследуемых органов (печени, поджелудочной железы, молочной железы). Реакционноспособная ткань, обнаруженная на поверхности печени и молочной железы, вероятно, была реакцией на клей и ограничивалась тканью, непосредственно контактирующей с клеем. Нормальная ткань может быть легко найдена прилегающей (< 100 мкм) к реактивной ткани в областях, не подвергшихся воздействию клея (Рисунок 8E,I), и воспаление ткани, следовательно, не мешает визуализации здоровых областей ткани. Более того, тканевая реакция, вероятно, обратима, поскольку большинство мышей (8 из 9 мышей во всех местах расположения тканей) не показали значительных поражений в поздние моменты времени (28 или 35 дней), хотя прямое подтверждение того, что тканевая реакция разрешается, было бы трудно достичь без продольных измерений у отдельных мышей.

Мультиплексированное иммуногистохимическое окрашивание cd45, CD68 и миелопероксидазы (MPO) также проводилось для характеристики инфильтрации лейкоцитов, моноцитов / макрофагов и нейтрофилов соответственно. Увеличение инфильтрации иммунных клеток, связанное с грануляционной тканью и стеатитом, наблюдалось в молочной железе и печени, но не в поджелудочной железе (рисунок 8F, H, J).  Следует отметить, что эти изменения, вероятно, были преходящими, поскольку инфильтрат иммунных клеток был сопоставим с инфильтрацией необработанных контрольных групп в последние моменты времени (28 дней для окон молочной железы и 35 дней для окон печени и поджелудочной железы).

Печень была выбрана в качестве места для дальнейшей характеристики того, вызывает ли введение окна и визуализация значительную местную иммунную инфильтрацию с использованием визуализации. Для этого использовали мышей c-fms-EGFP (MacGreen)15, у которых миелоидные клетки (в основном макрофаги) помечены зеленым флуоресцентным белком. Печеночные окна были имплантированы трем мышам c-fms-EGFP и визуализировали их на 1, 3 и 5 день после операции с использованием сетки для определения того же поля зрения. Количество макрофагов, присутствующих в области визуализации, не изменялось значительно с течением времени после вставки окна (рисунок 8K).

Затем окно было функционально протестировано путем визуализации разнообразного набора биологических процессов на клеточном уровне (т. Е. Движение, пролиферация, контакт клеток с клетками) и тканевом уровне (т. Е. Рост опухоли в поджелудочной железе, иммунная инфильтрация во время инволюции молочной железы и метастазирование в печень). Поджелудочная железа не является легкодоступным местом для визуализации. Чтобы продемонстрировать, как окно может быть использовано для захвата динамики раковых клеток в этом органе, окна были вставлены над поджелудочной железой шести мышей C57BL/6J одновременно с ортотопической инъекцией клеток KPC-BL/6-1199, клеточной линии рака поджелудочной железы, полученной из широко используемого KPC (KrasLSL-G12D/+;p 53LSL-R172H; Pdx1-Cre) генетически модифицированная мышиная модель рака поджелудочной железы. Для визуализации с помощью конфокальной микроскопии клетки KPC-BL/6-1199 были спроектированы для экспрессии доксициклин-индуцируемого усиленного GFP (iGFP-1199 клеток). Через шесть дней после инъекции мышей посадили на доксициклиновую диету, чтобы вызвать экспрессию зеленого флуоресцентного белка (GFP) в раковых клетках поджелудочной железы. На рисунке 9 показаны репрезентативные изображения с мыши, ортотопически вводимой с клетками iGFP-1199 на 11 и 14 день после инъекции и введения окна. На видео 2 показан край опухоли iGFP-1199 в отрывке 2-часового сеанса визуализации на 11-й день после вставки окна, иллюстрируя способность захватывать динамику проекции клеточной мембраны в поджелудочной железе с помощью силиконовых окон.

Силиконовое окно также может быть использовано для захвата динамической инфильтрации иммунных клеток с течением времени. Чтобы проиллюстрировать это, окна молочной железы были вставлены в лактирующие ACTB-ECFP (Tg(CAG-ECFP)CK6Nagy); Мыши LysM-eGFP (Lyz2tm1.1Graf) сразу после отъема. У этих мышей все клетки, но наиболее высокоэпителиальные клетки, экспрессируют голубой флуоресцентный белок (CFP), управляемый промотором бета-актина, а миелоидные клетки — в первую очередь нейтрофилы, но также и макрофаги — помечены eGFP, управляемым промотором лизоцима M. Мышей визуализировали на 2 и 4 день после введения окна, в процессе инволюции молочной железы, когда ткань молочной железы начинает возвращаться в состояние, предшествовавшее беременности. Два макроса для ImageJ были разработаны для уменьшения артефактов движения и улучшения визуализации, один выравнивает плоскости Z в 4-мерном прижизненном видео (дополнительный код 1), а другой уменьшает колебание из-за дыхания или других артефактов движения (дополнительный код 2). Рисунок 10 и фильм 3A-C показывают инфильтрацию нейтрофилов в ремоделирующей ткани молочной железы в одном и том же месте на днях 2 и 4, иллюстрируя, как окно может быть использовано для мониторинга и отслеживания инфильтрации и движения иммунных клеток в разные дни. Аналогичный эксперимент был проведен на мыши c-fms-EGFP, с миелоидными клетками (в основном макрофагами), экспрессирующими GFP, управляемым промотором c-fms (фильм 4).

Наконец, относительно большая площадь поверхности этого настраиваемого окна позволяет наблюдать редкие события, такие как образование метастазов в печени после внутривенной инокуляции. Чтобы продемонстрировать это явление, печеночные окна были вставлены у мышей C57BL/6J во время инъекции в воротную вену с клетками рака поджелудочной железы KPC-BL/6-1199, конститутивно экспрессирующими белок ядерного синтеза histone2B-CFP (H2B-CFP). Со временем контролировался рост одиночных клеток и небольших кластеров из 2-3 клеток, когда они развивались в микрометастазы (>100 клеток). На рисунке 10 показаны репрезентативные изображения, сделанные в дни 1, 3, 7 и 9 после инъекции и введения окна, и демонстрируется прогрессирование от одиночных клеток к микрометастазам.

Все изображения и фильмы были собраны с помощью многофотонного микроскопа. Проекции максимальной интенсивности и выравнивание фильмов по осям Z и X с течением времени были сгенерированы с помощью программного обеспечения ImageJ. Затем выровненные изображения и фильмы были скомпилированы с помощью программного обеспечения Imaris.

Figure 1
Рисунок 1: Хирургическое введение вентрального окна абдоминальной визуализации над печенью. (А) Мультфильм показывает анатомическое расположение структур, имеющих отношение к операции. Белая пунктирная рамка обрисовывает хирургическое поле, показанное на снимках. (B) Делается разрез, начинающийся на 3 мм ниже мечевидного отростка и продолжающийся вниз таким образом, чтобы участок кожи размером 1-1,5см2 удалялся вдоль средней линии. (C) Немного меньший участок брюшины рассечен. (D) Фальциформная связка (белый наконечник стрелы) разрывается, толкая печень вниз. Примечание: ватные палочки, смоченные стерильным физиологическим раствором, используются для мягкого манипулирования внутренними органами. (E) С помощью шприца небольшое количество хирургического клея наносится каплями вокруг интересующей области на поверхности печени. (F) Окно расположено и крепко удерживается против печени до тех пор, пока клей не высохнет (2 мин). (G) Края окна сложены под брюшиной и кожей. (H) Для закрепления окна на брюшине наносится клей на поверхность окна, соответствующую затененной области, прежде чем надавить на брюшину и приклеить ее на место. Кожа аналогично приклеивается к брюшине. Ободок клея окончательно наносится вдоль красной линии, чтобы предотвратить рост эпителия над окном. (I) То же изображение, что и в (H) без маркировки, показывающей мышь, готовую к послеоперационному восстановлению. Площадь, очерченная пунктирными линиями, увеличена в (J, K). (J) Следы от капель клея видны на поверхности печени (наконечники стрелок) (K) Та же фотография, что и в J, показывающая печень, видимую через окно, очерченное белой пунктирной линией. Капли клея на поверхности печени очерчены красным цветом. Область, подлежащая изображению, выделена белым цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Хирургическое введение окна над правой долей печени. (А) Мультфильм показывает анатомическое расположение структур, имеющих отношение к операции. Черная пунктирная рамка обрисовывает хирургическое поле, просматриваемое на снимках. (B) Мышь помещается в левое боковое пролежнее, делается разрез, начинающийся на 3 мм ниже грудной клетки, и удаляется участок кожи размером примерно 1см2 . (C) Немного меньший участок брюшины рассечен. (D) Печень осторожно опускается ниже грудной клетки с помощью смоченного ватного тампона. (E) С помощью шприца небольшое количество хирургического клея наносится в каплях (белая головка стрелы) на поверхность печени. (F) Окно расположено и крепко удерживается против печени до тех пор, пока клей не высохнет (2 мин). (G) Края окна сложены под брюшиной и кожей. (H) Для закрепления окна на брюшине наносится клей на поверхность окна, соответствующую затененной области, прежде чем надавить на брюшину и приклеить ее на место. Кожа аналогично приклеивается к брюшине. Ободок клея также наносится вдоль красной линии, чтобы предотвратить рост эпителия над окном. (I) При большом увеличении печень (очерченная белой пунктирной линией) видна через окно. Область изображения отмечена сеткой, встроенной в окно (белая стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Хирургическое введение окна над поджелудочной железой. (А) Мультфильм показывает анатомическое расположение структур, имеющих отношение к операции. Черная пунктирная рамка обрисовывает хирургическое поле, просматриваемое на снимках. (B) Мышь помещается в правое боковое пролежнее положение. Селезенка видна через бритую кожу (пунктирная линия) (C) Разрез делается начиная с 3 мм ниже грудной клетки, и удаляется примерно 1 см2 участка кожи. (D) Немного меньший участок брюшины рассечен. (E) Поджелудочная железа (белая головка стрелы) аккуратно расположена с помощью смоченного ватного тампона в месте расположения окна. (F) С помощью шприца небольшое количество хирургического клея наносится на селезенку, а также на поджелудочную железу (вдали от области, подлежащей изображению). (G) Окно расположено и крепко удерживается на поджелудочной железе до тех пор, пока клей не высохнет (2 мин). Края окна складываются под брюшину и кожу. (H) Для закрепления окна на брюшине наносится клей на поверхность окна, соответствующую затененной области, прежде чем надавить на брюшину и приклеить ее на место. Кожа аналогично приклеивается к брюшине. Ободок клея также наносится вдоль красной линии, чтобы предотвратить рост эпителия над окном. (I) При большом увеличении поджелудочная железа (очерченная белой пунктирной линией) видна через окно. Область изображения отмечена сеткой, встроенной в окно (белая стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Хирургическое введение окна над паховой молочной железой. (А) Мультфильм показывает анатомическое расположение структур, имеющих отношение к операции. Черная пунктирная рамка обрисовывает хирургическое поле, просматриваемое на снимках. Отметим, что операция может быть выполнена как на4-й, так и на5-й молочной железе. (B) Мышь помещается в лежачее положение на стерильном хирургическом поле. 5-й правый сосок (наконечник стрелки) используется в качестве ориентира для выполнения разреза. (C) Делается разрез, молочная железа отделяется от вышележащей кожи и удаляется участок кожи примерно 1см2 . (D) С помощью шприца небольшое количество хирургического клея наносится каплями вокруг интересующей области на поверхности молочной железы. (E) Окно позиционируется и удерживается твердо до тех пор, пока клей не высохнет (2 мин). (F) Края окна складываются под кожу с помощью щипцов. (G) Для крепления окна к коже на поверхность окна, соответствующую затененной области, наносится клей, прежде чем надавить на кожу и приклеить ее на место. Ободок клея также наносится вдоль красной линии, чтобы предотвратить рост эпителия над окном.  (H) Приведен пример окна, имплантированного над небольшой опухолью в4-й правой молочной железе. Площадь, очерченная пунктирными линиями, показана в большем увеличении в (I). (I) Капли клея на поверхности молочной железы выделены красным цветом. Область, подлежащая изображению, выделена черным цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Силиконовые окна для визуализации обладают благоприятными оптическими и материальными свойствами. (А–С) Для измерения функции точечного распространения и сравнения свойств визуализации окон PDMS с стеклянными покровными листами 40 нм желто-зеленые флуоресцентные микросферы были изображены через окна PDMS различной толщины или стеклянные крышки (толщина No 1,5)16. Изображения были собраны с использованием ультразвукового геля в качестве иммерсионной среды для соответствия условиям прижизненной визуализации. Графики показывают вычисляемую полную ширину при половинном максимуме (FWHM) в (A) Ось X, (B) ось Y, и (C) Ось Z (средняя ± SD; n = 3/группа, полученная с использованием двух или более отдельных окон; односторонняя ANOVA, сравнивающая все окна PDMS со стеклом с тестом множественных сравнений Даннетта; указываются только существенные различия). (D) Соотношение между расчетными значениями FWHM по осям X и Y (А–Б) показан как мера симметрии точечных исходных изображений вдоль осей X и Y и, следовательно, оптических аберраций. (Э–ГМикросферы были изображены через три отдельных окна, отлитых с 200 мг PDMS (аналогично окнам, используемым для прижизненной визуализации для Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11 и Кинофильм 2, Кинофильм 3, Кинофильм 4) или три стеклянных крышки (толщина #1,5) для измерения функции точечного спреда. В отличие от примеров прижизненной визуализации, изображения для этих расчетов были собраны с использованием воды в качестве иммерсионной среды. Графики показывают рассчитанный FWHM в (E) Ось X, (F) Ось Y и (G) ось Z (средняя ± SD; n = 3/группа с использованием трех отдельных окон; Тест Манна-Уитни, никаких существенных различий выявлено не было). (H) На графике показано соотношение между вычисляемыми значениями FWHM по осям X и Y (Е–Ф). (Я) Графики показывают пиковую интенсивность флуоресценции на микросферу (среднее ± SD; n = 3/группа; Тест Манна-Уитни, никаких существенных различий выявлено не было). Все изображения были собраны на длине волны 960 нм и мощности лазера 3%. Для каждой микросферы был собран z-стек размером 100 мкм с размером шага 0,6 мкм. Рамка изображения была установлена на уровне 69 мкм х 69 мкм с разрешением 1022 пикселей х 1022 пикселей. Анализ проводился с помощью плагина Fiji - MetroloJ. (J) Для проверки свойств материала окна PDMS удерживались в напряжении и крепились между двумя кольцеобразными шайбами с использованием суперклея для обеспечения упругого отклика во время механических испытаний. Эта же процедура использовалась для микрокрытых стеклянных скольжений без натяжения из-за жесткости стекла. Загрузочный наконечник, состоящий из полусферы (диаметром 6 мм) с цилиндрической экструзией (диаметр 4 мм, длина 20 мм), был напечатан на 3D-принтере с использованием нити полимолочной кислоты. Окна загружались в сервогидравлическую машину для испытания материалов под профилем регулирования нагрузки 1 Н/с до выхода материала из строя. Значения силы и смещения измерялись на частоте 100 Гц. На рисунке показано тестирование окна, настроенное с помощью загрузочного наконечника, применяемого в центре окна. (KГрафик показывает ударную вязкость материала, определенную путем расчета площади суммирования по кривой напряжения-деформации с использованием функции Траппца в MATLAB (средняя ± SEM; n = 3/группа с использованием трех отдельных окон PDMS для каждой толщины и стеклянных крышек; односторонняя ANOVA с тестом множественных сравнений Туки). (LНа графике показан модуль Юнга, определяемый по линейной части кривой напряжения-деформации (средняя ± SEM; n = 3/группа с использованием трех отдельных окон PDMS и стеклянных облицовок; t-тест с поправкой Уэлча). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Силиконовое окно демонстрирует высокую переносимость и долговечность. (A) Репрезентативное изображение самца 7-недельной мыши C57BL/6J с вентральным окном визуализации брюшной полости без сетки через 11 дней после операции на окне. (B) Репрезентативное изображение самца 7-недельной мыши C57BL/6J с окном визуализации поджелудочной железы, содержащим сетку через 14 дней после операции на окне. (C) Репрезентативное изображение женского пола 12-недельной мыши C57BL/6J c-fms-EGFP с окном визуализации молочной железы, содержащим сетку >7 дней после операции на окне. (D) Окно визуализации печени у самца 7-недельной мыши c-fms-EGFP , сфотографированной (верхний ряд) и изображенной (нижний ряд) на 0-й день (сразу после операции) и через 35 дней после операции. Удаление соответствующего количества кожи и герметизация раны клеем предотвращает повторное эпителизацию кожи и выталкивание окна вверх и наружу, что позволяет визуализировать орган в долгосрочной перспективе. Шкала = 30 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Сетки внутри окон позволяют отслеживать одно и то же поле зрения. (A) Подробные спецификации на изготовление окон из нержавеющей стали лазерной резки. (B) Сетка, встроенная в окно визуализации, может быть видна над печенью, при этом ободок клея вокруг окна хорошо виден. (C) Вид окна через окуляры двухфотонного микроскопа. Кровеносные сосуды (красный) и зеленый сигнал от печени можно увидеть на заднем плане. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8: Системная и локальная реакция на вставку окна. (А–С) Вес контролировали для 7-недельных самок мышей C57BL/6J в течение 28 дней после введения окна в печень (A), поджелудочной железы (B) или молочной железы (C). Показано процентное изменение массы тела по сравнению с необработанными мышами, соответствующими возрасту. (*) указывает на мышь, которая не восстановила нормальную массу тела и, следовательно, подверглась бы цензуре в результате эксперимента по визуализации. Одни и те же контрольные мыши показаны на всех трех панелях для более легкого сравнения с каждым типом окна. (D) Количество лейкоцитов (WBC) контролируется в дни 3, 14 и 28 (окно молочной железы) или 35 (окно печени или поджелудочной железы) после операции. Нормальный диапазон для подсчета WBC в мыши обозначен пунктирными линиями. (E,G,Я) Окрашивание гематоксилином и эозином участков тканей из необработанных контрольных групп (слева) и 7-недельной мыши C57BL/6J через 14 дней после введения окна визуализации (справа) над (E) печень, (G) поджелудочной железы, или (Я) молочная железа. (E,ЯПоверхностные и очаговые поражения грануляции видны в дискретных местах вдоль поверхности (стрелки) печени и молочной железы, что свидетельствует о реакции на клей. Нормальная ткань, обозначенная *, видна в областях, прилегающих к грануляционным поражениям. Три контрольные группы и три мыши с печеночными окнами оценивались в каждый момент времени (дни 3, 14 и 35 после операции), за исключением того, что 6 мышей с печеночными окнами оценивались на 35-й день после операции. У двух из 3 мышей наблюдалась грануляционная ткань на 3 и 14 день. 1 из 3 мышей демонстрировали грануляционную ткань на 35-й день.  Три контрольные группы и три мыши с окнами молочной железы оценивались в каждый момент времени (дни 3, 14 и 28 после операции). У трех из 3 мышей была грануляционная ткань или воспалительные реакции в жировой ткани молочной железы на 3 и 14 день. Ноль из 3 мышей продемонстрировали поражения грануляции или воспалительные реакции на 28-й день. (G) В поджелудочной железе не видно значительных поражений. Три контрольные группы и три мыши с окнами поджелудочной железы оценивались в каждый момент времени (дни 3, 14 и 35 после операции). Мыши с окнами поджелудочной железы не имели грануляционной ткани в любой момент времени. Шкала бар = 500 мкм (F,H,JМультиплексное иммуногистохимическое окрашивание проводили на участках тканей у необработанных контрольных групп и 7-недельных мышей C57BL/6J через 14 дней после введения окна визуализации над (F) печень, (H) поджелудочная железа или (J) молочная железа. Антитела против CD45, CD68 и миелопероксидазы (МПО) использовались для маркировки лейкоцитов, моноцитов/макрофагов и нейтрофилов соответственно. Окрашивание CD45 и CD68 выполняли на одном и том же участке, в то время как окрашивание MPO выполнялось на последовательном участке той же ткани. Антитело против CD45 было обнаружено с помощью HRP-конъюгированного вторичного антитела и сначала визуализировано, затем хромоген и вторичное антитело были удалены, а слайды инкубированы с вторичным антителом, распознающим анти-CD68. Количественная оценка проводилась с помощью программного обеспечения Фиджи с помощью пороговых значений цвета; параметры корректировались по антителам и тканям. Графики показывают количественное определение как количество ячеек на поле зрения (FOV) (средняя ± SEM; n = 3 / группа; односторонняя ANOVA с тестом множественных сравнений Туки; указаны только значимые различия). (K) Мужской C57BL/6J c-fms-EGFP У мышей в возрасте 8-11 недель силиконовое окно визуализации было вставлено над правой долей печени. Флуоресцентно меченый лектин (100 мкл) вводили внутривенно непосредственно перед каждым сеансом визуализации. Изображения сделаны одной мышью, находящейся в одном и том же локусе сетки на 1, 3 и 5 день после операции, примерно на 200 мкм ниже сетки. Шкала бара = 30 мкм. Изображение с использованием длины волны возбуждения 960 нм, мощности лазера 10%. Кровеносные сосуды выглядят красным цветом. Макрофаги отображаются зеленым цветом (белые стрелки). Представитель трех изображенных мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 9
Рисунок 9: Опухоли могут быть визуализированы в нескольких временных точках в течение нескольких недель после вставки окна. Репрезентативные изображения одного самца 7-недельной мыши C57BL/6J ортотопически вводили 1,5 х 104 iGFP-1199 раковых клеток поджелудочной железы во время введения окна поджелудочной железы и визуализировали на 11 и 14 днях после введения окна. Шкала стержней = 30 мкм. Изображение с использованием длины волны возбуждения 960 нм, мощности лазера 10%. Представитель 6 изображенных мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 10
Рисунок 10: Динамические изменения инфильтрации иммунных клеток при нормальной инволюции молочной железы. Используя металлическую сетку, встроенную в окно визуализации, одно и то же место может быть визуализировано во время нормального ремоделирования тканей, например, во время инволюции молочной железы. Для дальнейшей оценки функциональности силиконовых окон в мониторинге динамических изменений, таких как инфильтрация иммунных клеток, 12-недельная женщина C57BL/6J x BALB/c ACTB-ECFP; Мышь LysM-eGFP с окном визуализации, вставленным над брюшной молочной железой, была изображена на 2 и 4 день после инволюции молочной железы. Нейтрофилы появляются зеленым цветом (белые стрелки). Активность нейтрофильной эластазы визуализировали путем введения флуоресцентного зонда Neutrophil Elastase за 4 часа до начала визуализации и появляются красным (или желтым цветом при колокализации нейтрофилами). Эпителиальные клетки окрашены в синий цвет. Снимки представляют собой проекцию максимальной интенсивности пяти изображений вдоль оси Z (глубина 100–150 мм). Изображения взяты из фильмов 3A и 3B, а на изображениях нижнего ряда отображается только сигнал CFP, а изображения помечаются красной пунктирной линией для визуализации одних и тех же мест в ткани в двух разных точках времени. Шкала стержней = 30 мкм. Изображение получено с использованием длин волн возбуждения 960 нм и 1080 нм, мощность лазера составляет 10% и 15% соответственно. Представитель четырех изображенных мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 11
Рисунок 11: Образование метастазов рака можно отслеживать с течением времени. Самцу C57BL/6J 10-недельной мыши вводили 1 x 105 KPC-BL/6-1199 раковых клеток поджелудочной железы, экспрессирующих ядерный локализованный гистон H2B, конъюгированный голубой флуоресцентный белок (H2B-CFP) через воротную вену во время введения окна. Визуализацию печени проводили через боковое окно через 24 ч (день 1) после инъекции и в трех более поздних временных точках (до 9 дней), как указано. Одна раковая клетка, видимая на 1 и 3 день после инъекции, обозначена белыми стрелками. Второй гармонический сигнал от коллагеновых волокон также визуализировался в голубом канале (желтые стрелки). Изображения с одной и той же мыши в каждый момент времени. Одиночные изображения z-плоскости, сделанные на глубине от 300 мкм до 350 мкм. Шкала стержней = 30 мкм. Изображение с использованием длины волны возбуждения 880 нм. Мощность лазера на уровне 8%.. Представитель трех изображенных мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Фильм 1: Силиконовыеокна хорошо переносятся мышами. Фильм показывает мужскую 9-недельную мышь C57BL/6J через 14 дней после вставки окна. Мышь не демонстрирует никакого стандартного поведения, связанного с болью (например, плохой уход, закрытые глаза или вялость). Представитель шести зарегистрированных мышей и согласуется с более чем 100 мышами, наблюдаемыми после успешной имплантации окна. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Фильм 2: Субклеточная визуализация ортотопически имплантированных раковых клеток поджелудочной железы. Клетки iGFP-1199 вводили ортотопически в поджелудочную железу самца 7-недельной мыши C57BL/6J и визуализировали на 11-й день после инъекции раковых клеток и вставки окна. Фильм представляет собой проекцию максимальной интенсивности шести изображений вдоль оси Z и извлечен из 2-часового периода визуализации. Отметка времени (h:min:s:ms). Представитель шести изображенных мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Фильм 3: Изменения в инфильтрации иммунных клеток в ACTB-ECFP; Мыши LysM-eGFP во время инволюции. Женский C57BL/6J x BALB/c ACTB-ECFP; Мыши LysM-eGFP, экспрессирующие GFP в миелоидных клетках (в основном в гранулоцитах, но также и в макрофагах), и ECFP во всех клетках (но самый высокий в эпителиальных клетках) были выведены в возрасте 8 недель. После родов детенышей нормализовали до шести детенышей на мышь. На 10-й день после родов детенышей отлучили от груди и вставили окна для визуализации брюшной молочной железы. Миелоидные клетки появляются зеленым цветом; активность нейтрофильной эластазы, меченой с помощью зонда Neutrophil Elastase 680 FAST, вводимого за 4 ч до начала визуализации, выглядит красным цветом (будет выглядеть желтым при колокализации нейтрофилами); а эпителиальные клетки окрашены в синий цвет. Фильмы представляют собой проекцию максимальной интенсивности пяти изображений вдоль оси Z (глубина 100–150 мкм). (А) Визуализация на 2 день инволюции молочной железы. Шкала бар = 20 мкм. Изображение получено с использованием длин волн возбуждения 960 нм и 1080 нм, мощность лазера составляет 10% и 15% соответственно. (B) Визуализация на 4 день инволюции молочной железы. Шкала бар = 20 мкм. Фильм из той же мышиной и тканевой области, что и фильм 3A. (C) Более высокое увеличение интересующей области из фильма 3B, показывающее два нейтрофила, взаимодействующих друг с другом и эпителиальными клетками молочной железы. Образование транзиторных мембранных протрузий может наблюдаться на переднем крае во время миграции нейтрофилов. Отметка времени (h:min:s:ms). Представитель четырех изображенных мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать фильм 3A. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать Фильм 3B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать Фильм 3C.     

Фильм 4: Изменения инфильтрации иммунных клеток у мышей c-fms-EGFP во время инволюции. Самки мышей C57BL/6J c-fms-EGFP с мечеными GFP макрофагами были выведены в возрасте 8 недель. После родов пометы были скорректированы до шести детенышей на мышь. На 10-й день после родов детенышей отлучили от груди и вставили окна для визуализации брюшной молочной железы. Фильм, приобретенный на 1-й день инволюции (через день после введения окна), выделяет выдающийся инфильтрат макрофагов во время инволюции. Макрофаги появляются зеленым цветом, коллагеновые волокна (второе гармоническое поколение) появляются синим, а кровеносные сосуды — красным (Lectin-DyLight 594). Шкала бар = 20 мкм. Изображения представляют собой проекции максимальной интенсивности пяти изображений вдоль оси Z (глубина 100–150 мкм). Изображение получено с использованием длин волн возбуждения 960 нм и 800 нм, мощность лазера на 10% и 15% соответственно. Отметка времени (h:min:s:ms). Представитель трех изображенных мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Дополнительный код 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный код 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Окна прижизненной визуализации являются важными инструментами для непосредственной визуализации физиологических и патологических процессов с клеточным разрешением, поскольку они разворачиваются с течением времени. Новая процедура, описанная для литья и вставки гибких силиконовых окон визуализации у мышей, преодолевает некоторые из наиболее распространенных проблем с используемыми в настоящее время окнами визуализации (экссудат, разрушение и вмешательство в нормальную мобильность), обеспечивает дополнительную безопасность для мыши и повышает доступность этого метода.

Наиболее широко используемые окна для визуализации представляют собой металлическую раму, содержащую стеклянную крышку. Основным препятствием для использования этих прототипных окон является то, что закрепление металлического кольца включает в себя трудоемкие процедуры сшивания, требующие персонала с углубленной хирургической подготовкой. Кроме того, изготовление рам является дорогостоящим и требует специализированного оборудования. Окна PDMS преодолевают обе эти проблемы. Процедура вставки окон PDMS исключает сшивание, значительно снижая барьер для изучения техники. Материалы для производства окон также недороги и могут быть легко приобретены. Кроме того, как форма окна, так и хирургическая процедура могут быть адаптированы для визуализации различных органов, включая молочную железу, печень, поджелудочную железу, селезенку и кишечник.

В то время как современные окна прижизненной визуализации позволяют продольную визуализацию в течение обычно нескольких дней, несколько распространенных проблем ограничивают использование этих окон в течение длительных периодов времени. Вес и размер стеклянных окон могут мешать свободному движению мышей, а экссудат может скапливаться против окна. Мыши также могут повредить стеклянную крышку, что приводит к ранам и инфекциям. Напротив, процедура, описанная здесь, поддерживает тот же уровень доступности ткани, сводя к минимуму страдания для животных. PDMS - это безопасный, биостабильный, синтетический полимер, широко используемый для биомедицинских применений у людей, таких как устройства доставки лекарств, хирургия реконструкции лица и грудные имплантаты. Помимо повышения толерантности животных к окну, использование биологически инертного материала, в отличие от стекла, особенно важно для исследований, в которых участвует иммунная система, где местное воспаление будет смешанным эффектом. Кроме того, основным улучшением является устранение швов, так как мыши будут кусать и тянуть их, что может привести к выпадению стеклянных окон с металлическим каркасом. Эта проблема была частично решена более новым поколением окон, которые были спроектированы так, что стежки скрыты в канавке9. Тем не менее, эта последняя стратегия требует наложения швов на кошельке, что является сложной, подверженной ошибкам процедурой, которая часто приводит к слишком плотному натяжению швов, что приводит к некрозу ткани и боли. Таким образом, возможность приклеить окно на место представляет собой основное преимущество подхода силиконовых окон. Кроме того, окно изготовлено из гибкого, прочного материала с незначительным весом, что уменьшает его влияние на движение животного, как ранее оценивалось при сравнении окон, в которых использовался силикон вместо металла для удержания стеклянной крышки17. Полностью устраняя стеклянную крышку, силиконовое окно устраняет проблемы как с металлическими рамами, так и со стеклом. Кроме того, гибкость окна позволяет легко вставлять его и уменьшает силу напряжения, вызванную приклеиванием жесткой поверхности к органам, тем самым уменьшая риск постоянного повреждения наблюдаемой ткани. Кроме того, поскольку окно гораздо легче вставить и удерживать на месте, общая процедура занимает меньше времени, ограничивая возможные побочные эффекты из-за длительной анестезии. Для введения через печень разница во времени процедуры особенно существенна, от 45 мин для окон с металлическим каркасом до 15 мин для силиконовых окон. На самом деле, в то время как введение металлического каркаса над печенью требует рассечения мечевидного отростка (хряща в конце грудины), который также потенциально болезненный и вызывает устойчивое воспаление, это рассечение не нужно для вставки силиконового окна. Наконец, окно визуализации, представленное в этой работе, дает дополнительные преимущества в отношении возможных применений. Например, в отличие от стеклянных окон, силиконовые окна обеспечивают легкий доступ к ткани, поэтому раковые клетки, флуоресцентные красители или лекарства могут вводиться непосредственно через окно.

Недавнобыло описано еще одно силиконовое окно визуализации на основе PDMS, подходящее для введения в различных анатомических местах, включая молочную железу. Это окно формовано для создания формы и специализированного края, что позволяет быстро имплантировать окно без необходимости стежков или клея. Напротив, силиконовое окно, представленное здесь, не требует какой-либо специальной формы и, что важно, может быть разрезано по форме во время хирургической процедуры, чтобы адаптироваться к анатомическому расположению и индивидуальной мыши. Хотя протокол, описанный в настоящем описании, требует использования клея, это дополнительное требование позволяет проводить визуализацию органов брюшной полости, включая печень и селезенку. Кроме того, силиконовое окно, описанное здесь, позволяет встраивать сетку из нержавеющей стали в окно, что обеспечивает опорные ориентиры. Эти ориентиры позволяют отслеживать одно и то же точное местоположение с течением времени и облегчают повторную визуализацию одного и того же участка в течение нескольких сеансов (продольная визуализация) для изучения процессов, которые занимают от нескольких дней до недель, таких как развитие метастатических поражений.

Таким образом, было разработано силиконовое окно визуализации для использования в продольном IVM молочной железы или органов брюшной полости. Окно оптически прозрачное, очень прочное и недорогое. Простота процедуры вставки окон снижает технические навыки, необходимые для реализации подходов к визуализации на основе окон. Адаптивность окна к различным участкам тканей позволяет внедрять IVM в широкий спектр биологических исследований.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

М.Е. является членом исследовательского консультативного совета по бренсокатибу для Insmed, Inc.; член научно-консультативного совета компании Vividion Therapeutics, Inc.; консультант компании Protalix, Inc.; D.A.T. является соучредителем Mestag Therapeutics, входит в научно-консультативный совет и владеет акциями Mestag Therapeutics, Leap Therapeutics, Surface Oncology и Cygnal Therapeutics. Другие авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим Роба Эйферта за его помощь в разработке и оптимизации решеток из нержавеющей стали лазерной резки. Эта работа была поддержана Онкологическим центром CSHL (P30-CA045508) и средствами для M.E. от Национальных институтов здравоохранения (NIH) (1R01CA2374135 и 5P01CA013106-49); CSHL и Northwell Health; Фонд семьи Томпсон; Плавайте по Всей Америке; и грант Фонда Саймонса CSHL. M.S. был поддержан Национальным институтом общих медицинских наук Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) и Национальным институтом рака NIH под номером 1F30CA253993-01. L.M. поддерживается постдокторской стипендией Фонда Джеймса С. Макдоннелла. J.M.A. является получателем стипендии Института исследований рака / Ирвингтонской постдокторской стипендии (CRI Award #3435). D.A.T. поддерживается Специализированной лабораторией по исследованию рака поджелудочной железы Фонда Люстгартена и Фондом семьи Томпсон. Мультфильмы создавались с Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape 3M 70200770819
Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2 Ethicon  N267H
ACTB-ECFP mice Jackson Laboratory 22974
AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole) Vector Laboratories  SK-4200
Alcohol swabs BD  326895
Anesthesia system Molecular Imaging Products Co.
Acqknowledge software and sensors  BIOPAC ACK100W, ACK100M, TSD110
Betadine spray  LORIS 109-08
c-fms-EGFP (MacGreen) mice Jackson Laboratory 18549
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 664
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) Invitrogen 14-0451-82
CD68 Antibody Abcam ab125212
Curity gauze sponges  Covidien
Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP)  Abcam ab6885
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)  Abcam ab97064
Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP)  Abcam ab102182
Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear Electron Microscopy Sciences 24236-10 Two-part, 10:1 mixing ratio
Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness  Electron Microscopy Sciences 72296-08
Ender-3 Pro 3D printer Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD
Far Infrared Heated blanket Kent Scientific RT-0520
Fc Receptor Blocker Innovex Biosciences NB309
Fiji imaging processing package https://imagej.net/software/fiji/
FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515) Invitrogen F8795
Gating system: BIOPAC Systems Inc. The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems.
Acqknowledge software  ACK100W, ACK100M
Diff. Amp. Module, C Series  DA100C
Dual Gating Sys small animal DTU200 
MP160 for Windows - Analysis system MP160WSW 
MouseOx Plus 120V  MOX-120V;015000 
Pressure Pad  TSD110 
Gelfoam Pfizer 9031508 Absorbable gelatin sponge
Hardened fine scissors Fine Science Tools 14090-11 Two pairs; stainless steel, sharp-sharp
tips, straight tip, 26 mm
cutting edge, 11 cm length
Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody R&D Systems AF3667
Hot bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45 Turn on approximately 30 min
before use; sterilize tools at >200
°C for 30 s
Imaris  Bitplane www.bitplane.com
Immersion medium Immersol W 2010 Zeiss 444969-0000-000 
Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc BD 324912
Isoflurane (Fluriso) VetOne 502017
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594 Vector Laboratories  DL-1177-1
LysM-eGFP mice www.mmrrc.org 012039-MU
Micro dissecting forceps Roboz RS-5135 Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length
Micro dissecting forceps Roboz RS-5153 1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip
width, 4" length
MTS MiniBionix II 808 MTS Systems Servohydraulic material testing machine
Neutrophil Elastase 680 FAST probe PerkinElmer NEV11169
Nitrogen General Welding Supply Corp.
Oxygen General Welding Supply Corp.
Polylactic acid filament Hatchbox 1.75 mm diameter
ProLong Diamond Antifade Mountant Invitrogen P36970
Puralube ophthalmic ointment Dechra  NDC17033-211-38
Reflex 7 wound clips Roboz Surgical RS-9255
Stainless steel grid Fotofab One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square.  
Surface Treated SterileTissue Culture Plates Fisher Scientific FB012929 Lid used as curing surface for imaging windows
TriM Scope Multiphoton Microscope  LaVision BioTec Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes:
T560LP
T665LPXXR
T495lxpr
Vetbond 3M 70200742529
VWR micro cover glass VWR 48404-453

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dondossola, E., et al. Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone. Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).
  2. Haeger, A., et al. Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche. Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184 (2020).
  3. Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
  4. Eickhoff, S., et al. Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions. Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).
  5. Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
  6. Sammicheli, S., et al. Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses. Science Immunology. 1 (4), (2016).
  7. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  8. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).
  9. Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
  10. Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. Recording the wild lives of immune cells. Science Immunology. 3 (27), (2018).
  11. Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), 29917 (2014).
  12. Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818 (2016).
  13. Anderson, T. L. Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , CRC Press, Taylor & Francis Group. Florida. (2005).
  14. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088 (2013).
  15. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  16. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  17. Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. Intravital. 5 (1), 1125562 (2016).
  18. Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).

Tags

Исследование рака выпуск 179
Продольная прижизненная визуализация через прозрачные силиконовые окна
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maiorino, L., Shevik, M., Adrover,… More

Maiorino, L., Shevik, M., Adrover, J. M., Han, X., Georgas, E., Wilkinson, J. E., Seidner, H., Foerschner, L., Tuveson, D. A., Qin, Y. X., Egeblad, M. Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows. J. Vis. Exp. (179), e62757, doi:10.3791/62757 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter