Summary
Ett tillvägagångssätt presenteras här för långsiktig intravital avbildning med optiskt klara silikonfönster som kan limmas direkt på vävnaden / organet av intresse och huden. Dessa fönster är billigare och mer mångsidiga än andra som för närvarande används i fältet, och den kirurgiska insättningen orsakar begränsad inflammation och nöd för djuren.
Abstract
Intravital mikroskopi (IVM) möjliggör visualisering av cellrörelse, delning och död vid encellsupplösning. IVM genom kirurgiskt införda bildfönster är särskilt kraftfull eftersom det möjliggör longitudinell observation av samma vävnad över dagar till veckor. Typiska bildfönster består av en glasöverdragsglas i en biokompatibel metallram suturerad till musens hud. Dessa fönster kan störa mössens fria rörlighet, framkalla ett starkt inflammatoriskt svar och misslyckas på grund av trasigt glas eller sönderrivna suturer, varav någon kan kräva eutanasi. För att ta itu med dessa problem utvecklades fönster för långvarig bukorgan- och bröstkörtelavbildning från en tunn film av polydimetylsiloxan (PDMS), en optiskt klar silikonpolymer som tidigare användes för kranialavbildningsfönster. Dessa fönster kan limmas direkt på vävnaderna, vilket minskar den tid som behövs för insättning. PDMS är flexibelt, vilket bidrar till dess hållbarhet hos möss över tid - upp till 35 dagar har testats. Longitudinell avbildning är avbildning av samma vävnadsregion under separata sessioner. Ett rostfritt stålnät var inbäddat i fönstren för att lokalisera samma region, vilket möjliggjorde visualisering av dynamiska processer (som bröstkörtelinvolution) på samma platser, med några dagars mellanrum. Detta silikonfönster möjliggjorde också övervakning av enskilda spridda cancerceller som utvecklades till mikrometastaser över tiden. Silikonfönstren som används i denna studie är enklare att sätta in än metallinramade glasfönster och orsakar begränsad inflammation i de avbildade vävnaderna. Dessutom möjliggör inbäddade rutnät enkel spårning av samma vävnadsregion i upprepade avbildningssessioner.
Introduction
Intravital mikroskopi (IVM), avbildning av vävnader i bedövade djur, ger insikter i dynamiken i fysiologiska och patologiska händelser vid cellulär upplösning i intakta vävnader. Tillämpningarna av denna teknik varierar mycket, men IVM har varit avgörande inom cancerbiologiområdet för att hjälpa till att belysa hur cancerceller invaderar vävnader och metastaserar, interagerar med den omgivande mikromiljön och svarar på läkemedel 1,2,3. Dessutom har IVM varit nyckeln till att främja förståelsen av de komplexa mekanismerna som styr immunsvar genom att ge insikter som kompletterar ex vivo-profileringsmetoder (t.ex. flödescytometri). Till exempel har intravitala avbildningsexperiment avslöjat detaljer om immunfunktioner som de relaterar till cellmigration och cell-cellkontakt och har erbjudit en plattform för att kvantitera spatiotemporal dynamik som svar på skada eller infektion 4,5,6,7. Många av dessa processer kan också studeras genom histologisk färgning, men endast IVM tillåter spårning av dynamiska förändringar. Faktum är att medan en histologisk sektion erbjuder en ögonblicksbild av vävnaden vid en given tidpunkt, kan intravital avbildning spåra intercellulära och subcellulära händelser inom samma vävnad över tiden. I synnerhet har framsteg inom fluorescensmärkning och utveckling av molekylära reportrar gjort det möjligt för molekylära händelser att korreleras med cellulära beteenden, såsom proliferation, död, rörlighet och interaktion med andra celler eller den extracellulära matrisen. De flesta IVM-tekniker är baserade på fluorescensmikroskopi, vilket på grund av ljusspridning gör avbildning av djupare vävnader utmanande. Vävnaden av intresse behöver därför ofta exponeras kirurgiskt med ett ofta invasivt och terminalt förfarande. Således, beroende på organplatsen, kan vävnaden avbildas kontinuerligt under en period som varierar från några till 40 h8. Alternativt tillåter den kirurgiska införandet av ett permanent bildfönster avbildning av samma vävnad sekventiellt under en period av dagar till veckor 7,9.
Utvecklingen av nya bildfönster har lyfts fram som ett tekniskt behov av att ytterligare förbättra intravitala bildmetoder10. Det prototypiska intravitala bildfönstret är en metallring som innehåller en glasöverdragslip fäst vid huden med suturer11. Störning av fri rörlighet, ackumulering av exsudat och skador på glasöverdraget är vanliga problem som ses med att använda sådana fönster. Dessutom kräver det prototypiska fönstret specialiserad produktion, och det kirurgiska ingreppet kan kräva omfattande utbildning. För att ta itu med dessa problem anpassades polydimetylsiloxan (PDMS), en silikonpolymer, som tidigare har använts i kranialfönster för långvarig avbildning i hjärnan12, för användning i bukorgan- och bröstkörtelavbildning. Här presenteras en detaljerad metod för att generera PDMS-baserade silikonfönster, inklusive hur man gjuter fönstret runt ett rostfritt stålnät för att ge landmärken för upprepad avbildning av samma vävnadsregioner. Vidare beskrivs ett enkelt, stygnfritt kirurgiskt ingrepp för att sätta in fönstret över bukorganen eller bröstkörteln. Detta nya tillvägagångssätt övervinner några av de vanligaste problemen med för närvarande använda bildfönster och ökar tillgängligheten för longitudinell intravital avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla beskrivna procedurer utfördes i enlighet med Cold Spring Harbor Laboratory Surgical Guidelines och hade godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee vid Cold Spring Harbor Laboratory.
1. Gjutning av silikonfönstret
- Förbered silikonpolymeren (PDMS) genom att blanda baseastomeren och härdningsmedlet i ett förhållande 10:1 (v/v).
- Gjut ett fönster genom att deponera en liten mängd PDMS på en steril, slät yta och justera volym-till-yta-förhållandet till önskad tjocklek.
OBS: Att använda 200 mg polymerlösning för en cirkel med en diameter på 22 mm på locket på ett 24 brunnsplåtslock resulterar i en bra kompromiss mellan fönstertupphet och optisk klarhet. - Valfritt: För att tillhandahålla landmärken för upprepad avbildning av samma vävnadsområden, tryck lätt in ett rostfritt stålgaller i silikonet efter att PDMS är på önskad gjutyta.
- För att avlägsna luftbubblor, placera den belagda ytan i en vakuumtorkare i 45 minuter för att avgasa polymeren.
- Härda silikonfönstren i en ugn vid 80 °C i 45 min.
- Poängsätt polymeren vid formens kanter och skala försiktigt de härdade fönstren från ytan som används för gjutning med pincett.
- Före operationen, sterilisera fönstren genom autoklavering.
2. Förbereda musen för insättning av silikonfönstret
- Bedöva musen i en induktionskammare med 4% (v / v) isofluran. Flytta musen till en värmedyna på operationsbordet, placera musen i anestesinosmasken och sänk isoflurankoncentrationen till 2% för underhåll under hela operationen.
- Kontrollera djupet av anestesi genom att klämma fast tårna på bakbenen. Fortsätt inte förrän musen är inaktiv och inte visar tå nypa reflexrespons.
- Applicera oftalmiskt smörjmedel på ögonen för att hålla dem från att torka och förhindra trauma.
- Administrera förebyggande analgesi (buprenorfin 0,05 mg/kg) subkutant.
- Raka det kirurgiska stället och ta bort håret helt med en hårborttagningskräm.
- Applicera povidon-jodlösning (10% v / v) och etanol (70% v / v) i följd 3x för att förhindra infektion på operationsstället.
3. Sätta in ett ventralt fönster för avbildning i levern; anpassningsbar för andra bukorgan (Figur 1)
- Placera musen i ryggläge.
- Gör ett 10 mm snitt som börjar 3 mm ner från xiphoidprocessen med steril sax och pincett.
- Ta bort en 1-1,5 cm2 sektion av huden längs mittlinjen.
- Använd en andra par sterila saxar och pincett för att ta bort en del av bukhinnan som är något mindre än hudsektionen.
- Valfritt: För att visualisera en större del av levern, använd sterila bomullspinnar fuktade med steril saltlösning för att trycka levern ner från membranet som avslöjar det falciforma ligamentet som förbinder levern med membranet. Klipp av ligamentet och var försiktig så att du inte skär den sämre vena cava.
- Dra tillbaka kirurgiskt lim med en 31 G spruta, applicera en liten mängd av den på leverns yta runt kanterna på det område som ska avbildas. Detta lim skapar en cirkulär tätning och lämnar mittområdet intakt för avbildning.
VARNING: Begränsa limet till små droppar som bildar ett cirkulärt mönster runt bildområdet. Vävnad som är omedelbart i kontakt med limet kan inte avbildas. Det är inte nödvändigt att torka vävnaden innan limet appliceras.
OBS: Alla cyanoakrylatbaserade lim kan användas framgångsrikt för denna procedur. Kirurgiskt lim säkerställer sterilitet. För terminalprocedurer ger allsidiga superlim bra resultat. - Placera fönstret med pincett och håll det stadigt mot levern tills limet har torkat (~ 2 min).
- Vik kanterna på fönstret under bukhinnan.
- Med en spruta, deponera en liten mängd kirurgiskt lim på kanterna av fönstret som nu ligger under bukhinnan. Tryck ner på bukhinnan med pincett för att fästa den i fönstret.
- På samma sätt deponera en liten mängd kirurgiskt lim på bukhinnan innan du trycker ner på huden med pincett för att säkra den i bukhinnan.
OBS: Om det utförs korrekt bör ett cirkulärt område av levervävnad nu vara synligt genom fönstret. - Applicera lim runt kanterna på fönstret för att skapa en fälg som hjälper till att förhindra att huden växer tillbaka över fönstret.
VARNING: Om proceduren utförs med steril kirurgisk teknik och fönstret steriliseras före insättning är det tillräckligt att försegla såret med kirurgiskt lim för att undvika infektioner. Underlåtenhet att följa lämpliga aseptiska tekniker under kirurgisk insättning eller ofullständig stängning kan dock leda till overk eller subklinisk infektion och uttorkning av vävnaden.
4. Infoga ett sidofönster för avbildning i levern; kompatibelt med samtidig injektion av cancerceller i portalvenen (Figur 2)
- Placera musen på vänster lateral decubitusposition
- Gör ett snitt på 10 mm på höger flank 3 mm under kostbågen med steril sax och pincett.
- Ta bort en 1 cm2 sektion av huden.
- Använd en andra par sterila saxar och pincett för att ta bort en del av bukhinnan som är något mindre än hudsektionen.
- Dra tillbaka kirurgiskt lim med en 31 G spruta, applicera en liten mängd av den på leverns yta runt kanterna på det område som ska avbildas.
VARNING: Begränsa limet till små droppar som bildar ett cirkulärt mönster runt bildområdet. Vävnad som är omedelbart i kontakt med limet kan inte avbildas.
OBS: Alla cyanoakrylatbaserade lim kan användas framgångsrikt för denna procedur. Kirurgiskt lim säkerställer sterilitet. För terminalprocedurer ger allsidiga superlim bra resultat. - Placera fönstret med pincett och håll det stadigt mot levern tills limet har torkat (~ 2 min).
- Vik kanterna på fönstret under bukhinnan.
- Med en spruta, deponera en liten mängd kirurgiskt lim på kanterna av fönstret som nu ligger under bukhinnan. Tryck ner på bukhinnan med pincett för att fästa den i fönstret.
- På samma sätt deponera en liten mängd kirurgiskt lim på bukhinnan innan du trycker ner på huden med pincett för att säkra den i bukhinnan.
OBS: Om det utförs korrekt bör ett cirkulärt område av levervävnad nu vara synligt genom fönstret. - Applicera lim runt kanterna på fönstret för att skapa en fälg som hjälper till att förhindra att huden växer tillbaka över fönstret.
- Om en portalveninjektion krävs:
- Placera musen i ryggläge.
- Gör ett snitt på 10 mm som börjar ner från xiphoidprocessen i huden.
- Använd ett andra par sterila saxar och pincett, gör ett 10 mm snitt i bukhinnan.
- Doppa två bomullspinne i steril saltlösning.
- Använd bomullspinnen för att försiktigt dra tarmen på steril gasväv fuktad med steril saltlösning, var försiktig så att du inte vrider eller på annat sätt stör orienteringen.
- Fortsätt att förskjuta tarmen från bukhålan tills portalvenen är synlig på höger sida av buken.
- Sätt in en 31-33 G nål 5-7 mm kaudal till portalvenens ingångspunkt i levern, se till att fortsätta i blodkärlet och inte genom det.
- Injicera långsamt cancercellerna (resuspenderas i 100 μL steril PBS).
OBS: För detta experiment kan amurin bukspottkörtelcancercellinjen (t.ex. KPC-BL / 6-1199) odlas i komplett DMEM-media och 1 x 105 celler injiceras i 100 μL steril PBS. - För att förhindra blödning, omedelbart efter att nålen har dragits tillbaka, applicera försiktigt tryck på injektionsstället med en liten bit kirurgisk svamp i 1-2 min.
- När trycket har släppts, övervaka platsen i 1-2 minuter för att säkerställa hemostas.
- Använd fuktade bomullspinne och återför tarmen i bukhålan efter organets fysiologiska orientering.
- Använd sterila pincett, sätt in fönstret omedelbart under bukhinnan, på vänster sida av musens bukhåla.
- Sutur med 4-0 silkessuturer och häfta mittlinjesnittet med 7 mm rostfria sårklämmor.
- Flytta musen till vänster lateral decubitusposition
- Gör ett 10 mm snitt på höger flank 3 mm under kostbågen genom huden med steril sax och pincett.
- Ta bort en 1 cm2 sektion av huden runt snittet.
- Använd en andra par sterila saxar och pincett för att ta bort en del av bukhinnan som är något mindre än hudsektionen.
- Dra fönstret på plats över levern innan du limmar det på plats, enligt beskrivningen i steg 4.8–4.10.
5. Sätta in fönstret för avbildning i bukspottkörteln (Figur 3)
- Placera musen på höger lateral decubitusposition.
- Gör ett 10 mm snitt på vänster flank 3 mm under kostbågen med steril sax och pincett.
- Ta bort en 1 cm2 sektion av huden runt snittet.
- Använd en andra par sterila saxar och pincett för att ta bort en del av bukhinnan som är något mindre än hudsektionen.
- Använd sterila bomullspinnar blötlagda med steril saltlösning, dra försiktigt i mjälten för att visualisera bukspottkörteln. Fortsätt att flytta bukspottkörteln med de fuktade bomullspinnen för att göra mer yta synlig genom snittet.
OBS: Vid denna tidpunkt kan bukspottkörtelcancerceller injiceras ortotopiskt i bukspottkörteln om det är en del av den experimentella designen. - Dra tillbaka kirurgiskt lim med en 31 G spruta, applicera en liten mängd av den på ytan av bukspottkörteln runt kanterna på det område som ska avbildas.
VARNING: Begränsa limet till små droppar som bildar ett cirkulärt mönster runt bildområdet. Vävnad som är omedelbart i kontakt med limet kan inte avbildas. - Placera fönstret med pincett och håll det stadigt mot bukspottkörteln tills limet har torkat (~ 2 min).
- Vik kanterna på fönstret under bukhinnan.
- Med en spruta, deponera en liten mängd kirurgiskt lim på kanterna av fönstret som nu ligger under bukhinnan. Tryck ner på bukhinnan med pincett för att fästa den i fönstret.
- På samma sätt deponera en liten mängd kirurgiskt lim på bukhinnan innan du trycker ner på huden med pincett för att säkra den i bukhinnan.
OBS: Om det utförs korrekt bör ett cirkulärt område av bukspottkörtelvävnad nu vara synligt genom fönstret. - Applicera lim runt kanterna på fönstret för att skapa en fälg som hjälper till att förhindra att huden växer tillbaka över fönstret.
6. Sätta in fönstret för avbildning i bröstkörteln (Figur 4)
- Placera musen på ryggläge.
- Gör ett 10 mm snitt medialt till en av inguinalnipplarna med steril sax och pincett.
- Ta bort en 0,5 cm2 sektion av huden ovanför bröstkörteln.
- Använd en andra steril sax för att försiktigt separera bröstkörteln från huden genom att sprida saxen mellan de två ytorna för att störa vidhäftningen.
OBS: För att underlätta avbildning av inguinal bröstkörtelområdet, var försiktig med att dissekera en del av huden ovanför bröstkörteln men överlägsen bakbenet, så att fönstret inte begränsar musens rörlighet. - Dra tillbaka kirurgiskt lim med en 31 G spruta, applicera en liten mängd av den på bröstkörtelns yta runt kanterna på det område som ska avbildas.
VARNING: Begränsa limet till små droppar som bildar ett cirkulärt mönster runt bildområdet. Vävnad som är omedelbart i kontakt med limet kan inte avbildas. - Placera fönstret med pincett och håll det stadigt mot bröstkörteln tills limet har torkat (~ 2 min).
OBS: Ett cirkulärt område av bröstkörtelvävnad bör nu vara synligt genom fönstret om det utförs korrekt. - Vik kanterna på fönstret under huden.
- Med en spruta, deponera en liten mängd kirurgiskt lim på kanterna av fönstret som nu ligger under huden. Tryck ner på huden med pincett för att fästa huden i fönstret.
- Applicera lim runt kanterna på fönstret för att skapa en fälg som hjälper till att förhindra att huden växer tillbaka över fönstret.
7. Postkirurgisk återhämtning
- Placera musen i en ren återhämtningsbur med gott om häckningsmaterial, så att en del av buret vilar på en värmepanna.
- Övervaka musen kontinuerligt tills den är medveten och mobil.
- Om det behövs, ge en extra dos smärtstillande medel 12 timmar efter den förebyggande dosen.
OBS: Ytterligare analgesi är i allmänhet onödigt, men rådfråga en veterinär om musen visar tecken på nöd (som böjd rygg, oförskämd päls eller förlorat intresse för mat). Övervaka musen dagligen under de första 3 dagarna efter operationen för tecken på infektion eller andra biverkningar. Mindre än 2% av mössen kräver veterinärvård eller eutanasi, vanligtvis på grund av partiell lossning av fönstret. Det är viktigt att notera att för manliga möss med ventrala leverbildsfönster kan strider mellan möss leda till att fönster lossnar. Detta undviks genom att hysa mössen separat.
8. Avbildning genom fönstret
- Bedöva musen i en induktionskammare med 4% (v / v) isofluran.
- Applicera oftalmiskt smörjmedel på ögonen för att hålla dem från att torka och förhindra trauma.
- Flytta musen från induktionskammaren till mikroskopsteget. Placera musen i anestesinosmasken och sänk isoflurankoncentrationen till cirka 1-1,5% för underhållsanestesi under hela avbildningsproceduren.
- Placera en tryckkuddesensor under musen för att övervaka andningsfrekvensen och fixera musen på scenen med mjuk kirurgisk tejp.
- Sätt i en rektal termometer för att övervaka kroppstemperaturen under hela bildsessionen.
- Slå på den uppvärmda dynan och övervaka musen noga för att säkerställa att kroppstemperaturen inte överstiger 37 °C.
- Använd programvara för att övervaka musens andningsfrekvens. Den optimala hastigheten är ~ 1 andetag / sekund. Justera anestesi efter behov.
- Rengör fönstret från eventuellt nedsänkningsmedium och skräp från linsen före varje bildbehandling genom att försiktigt torka av det med en bomullspinne doppad i 70% etanol (v / v).
- När du använder en vattennedsänkningslins, applicera ultraljudsgel på fönstret och undvik bubblor.
OBS: Destillerat vatten kan också användas men kan kräva återanvändning under avbildning. - För att hitta det optimala djupet för avbildning, leta först upp rutnätet och placera det i fokus.
- Bestäm det ungefärliga vävnadsavbildningsdjupet genom att ställa in botten av gallret till 0. Denna information är nödvändig för att hitta motsvarande z-plan i efterföljande bildsessioner.
- Om du vill identifiera samma plats under flera bildsessioner använder du rutorna i rutnätet som referenspunkt. Under avbildningen noterar du rutnätets orientering och plats i rutnätet för varje bildfält (t.ex. 2:a raden uppifrån, 4:e kvadraten från vänster).
- Under på varandra följande bildsessioner använder du rutnätet för att navigera tillbaka till specifika rutnätsområden - och därmed bildfält.
- Efter varje bildbehandling, ta bort eventuellt kvarvarande linsnedsänkningsmedium och skräp genom att försiktigt torka av fönstret med en bomullspinne doppad i 70% etanol (v / v).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intravital avbildning genom bildfönster kan användas för att observera, spåra och kvantifiera ett brett spektrum av cellulära och molekylära händelser vid encellsupplösning under en period av timmar till veckor. Idealiska funktioner för ett bildfönster inkluderar: a) begränsad inverkan på musens välbefinnande och vävnadens fysiologi; b) hållbarhet, c) enkelhet i införandet; och d) tydliga landmärken för upprepad avbildning av samma region. Resultatet är ett mångsidigt, inert silikonfönster som enkelt kan produceras och sättas in och som kan utrustas med ett rutnät för att lokalisera samma synfält under flera bildsessioner.
Fönstret är tillverkat av PDMS, vilket är ett billigt, flexibelt och klart material. Windows kan gjutas med tillbehör som är allmänt tillgängliga för köp för de flesta laboratorier. För dessa ändamål fungerar de cirkulära formarna (22 mm diameter) som redan är etsade på locket på kommersiellt tillgängliga 24 brunnsplattor bra. Genom att variera mängden polymer som används per ytenhet är det möjligt att justera fönstrets tjocklek. För att dokumentera effekten av fönstrets tjocklek på bildupplösningen genomfördes en PSF-analys (Point Spread Function) av 40 nm fluorescerande mikrosfärer för att jämföra avbildningen genom PDMS-fönster av varierande tjocklek med glasöverdrag som vanligtvis används för intravitala bildfönster (0,17 mm tjocka). För att replikera den uppsättning som användes för intravital avbildning utfördes PSF-avbildningen med samma tvåfotonmikroskop och vattennedsänkningslins med ultraljudsgel applicerad som ett nedsänkningsmedium.
Den fulla bredden vid halv maximum (FWHM) av signalintensiteten beräknad via PSF: s passform i sidoplanen var jämförbar med glaset för PDMS-fönster gjutna med 100 mg PDMS (figur 5A,B). Den laterala upplösningen jämfört med glasöverdrag reducerades för fönster gjutna med 150–250 mg PDMS (figur 5A,B). I z-axelns bildplan presterade PDMS-fönster gjutna med 100–200 mg polymer bättre än glasöverdrag (figur 5C). Optisk klarhet gick förlorad i fönster gjutna med 300 mg PDMS, vilket gjorde mätningarna opålitliga (figurerna 5A–C). X / Y-förhållandet mellan FWHM-värdena skilde sig inte signifikant mellan glas och PDMS av någon tjocklek, även om förhållandet för fönster gjutna med 200–250 mg polymer avvek särskilt från 1 med ultraljudsgel som nedsänkningsmedium (figur 5D). Men när man använde vatten som ett nedsänkningsmedium för fönstret gjutet med 200 mg var avvikelsen från symmetri mycket mindre uttalad. Vid denna tjocklek är avvikelser på grund av avvikelser i polymeren därför sannolikt mindre. Toppfluorescensintensitetsvärden samlades också in för varje mikrosfär och visade att glas och PDMS presterade jämförbart, även om den högsta signalen registrerades genom glas (Figur 5I). Den optimala tjockleken på PDMS-fönstret beror på specifika applikationer och bildsystem. För de flesta ändamål är 200 mg polymerlösning för ett cirkulärt fönster med en diameter på 22 mm en optimal kompromiss mellan fönsters robusthet och optisk klarhet. Faktum är att fönster gjutna med mindre än 200 mg var mer optiskt tydliga, med FWHM-värden som liknar glas, men ibland rev under kirurgisk implantation, medan inga fall av fönsterskador observerades med 200 mg (hos >100 möss).
För att mäta dessa skillnader i materialegenskaper laddades PDMS-fönster (200 mg och 150 mg) i en testmaskin för servohydrauliskt material under en belastningskontrollprofil på 1N/s tills materialfel (figur 5J). Kraft- och förskjutningsvärden mättes med en frekvens av 100 Hz. Kraftförskjutningsdata omvandlades sedan till spänningsbelastning med hjälp av ekvationerna:
σ = F / A (1)
Ɛ = ΔL / L0 (2)
Där σ är spänning (Pa), F är kraft (N), A är fönstrets tvärsnittsarea, Ɛ är belastning, ΔL är förskjutningen och L0 är fönstrets tjocklek. Materialets seghet bestämdes genom att beräkna summeringsområdet under spänningsspänningskurvan. Ett materials seghet avser dess förmåga att deformeras plastiskt och absorbera energi i processen före fraktur - en nyckelegenskap för implanterade fönster13. I överensstämmelse med observationer under bildexperiment har fönster gjutna med 200 mg PDMS signifikant större seghet än fönster gjutna med 150 mg (figur 5K) och är därför mindre benägna att bryta.
Därefter bestämdes Youngs modul (E) av de föredragna PDMS-fönstren gjutna med 200 mg och jämfördes med den för vanliga glasöverdrag genom att extrahera den linjära regionen av spänningsspänningskurvan och bestämma lutningen med hookes lag:
σ = EƐ (3)
Youngs modul av glasfönstren var betydligt större än PDMS, vilket förväntades eftersom glas är mycket styvare i materialstyrka än PDMS (Figur 5L). Således, även om glas är ett starkare material baserat på dess större Youngs modul, stöder den större segheten hos 200 mg PDMS-fönstren att de kan appliceras under längre perioder utan risk för att bryta och kräva ett andra kirurgiskt ingrepp eller eutanasi.
En stor fördel med silikonfönstren är mångsidigheten. Viktigt är att proceduren för att kirurgiskt sätta in fönstret enkelt kan skräddarsys till olika anatomiska platser. Anpassningar till operationen underlättas av det faktum att fönstren enkelt kan ändras med kirurgisk sax och att fönster limmas på ytan av vävnaden / organet av intresse och på huden, vilket helt eliminerar kravet på suturer. Framgångsrik insättning av fönster på detta sätt har uppnåtts för levern, bukspottkörteln och bröstkörteln (figur 6A–C). I synnerhet utvecklades två olika protokoll för att implantera antingen ventrala eller laterala fönster för leveravbildning. Figur 1 visar stegen för att sätta in ett ventralt fönster. Denna procedur kan anpassas för andra bukorgan och ger den största bildbara ytan. Men om inte ett stort (>1 cm2) bildbart område krävs, är det att föredra att infoga ett sidofönster i musens högra flank (figur 2) för att minska rörelseartefakter, t.ex. på grund av andning och peristaltik. Dessutom är det kirurgiska ingreppet för att sätta in det laterala bildfönstret kompatibelt med en samtidig injektion av cancerceller i portalvenen för att experimentellt modellera utvecklingen av levermetastasering. Således kan möss genomgå ett enda förfarande istället för två separata när portalveninjektion och insättning av bukavbildningsfönster behövs i samma djur. En analog procedur används för att implantera ett fönster över bukspottkörteln på musens vänstra flank (figur 3). Fönstret kan också sättas in över subkutana vävnader, dvs normala bröstkörtlar, liksom redan etablerade spontana eller ortotopiskt transplanterade brösttumörer (Figur 4). Alternativt kan cancerceller injiceras i bröstkörteln genom fönstret för att i längdriktningen följa utvecklingen av en primär tumör, eftersom nålar kan punktera PDMS-filmen utan att äventyra fönstrets integritet.
På grund av sin låga vikt och flexibilitet stör silikonfönster inte musens rörlighet (film 1). Således övervinner silikonfönster stora hinder i samband med glasfönster, såsom bräcklighet, komplex suturering och påverkan på djurens rörlighet. Istället är den huvudsakliga begränsningen i samband med silikonfönster återväxten av epitelet under fönstret. Men när en lämplig mängd hud avlägsnas och såret är helt förseglat med lim, är återepitelialisering begränsad och avbildningen kan fortsätta under längre tidsperioder (upp till 35 dagar har testats, figur 6D). Efter att ha satt in fönstret kan musen avbildas i längdriktningen i ungefär en månad eller tills det kirurgiska limet misslyckas eller återepitelisering sker. Korta dagliga avbildningssessioner (~ 60 min) eller mindre frekventa men längre bildsessioner gynnas för att undvika anestesiinducerade biverkningar. Fönsterbärande djur kan avbildas på vilken intravital bildplattform som helst, via både enfoton- eller multifotonkonfokalmikroskopi, med hjälp av standardförfaranden (se t.ex. 14). Före och efter varje avbildningssession är det lämpligt att rengöra fönstret från smuts och skräp genom att torka av det med en bomullspinne doppad i 70% etanol (v / v).
För att spåra samma plats över tid kan rostfria galler bäddas in i fönstret. Figur 7A visar specifikationerna för de skräddarsydda, laseretsade galler som används här. Kommersiella nät för transmissionselektronmikroskopi är också lämpliga för denna applikation. Rutnätet är inbäddat i fönstret under gjutningsförfarandet och är tydligt synligt över avbildningsområdet både för blotta ögat (figur 7B) och genom mikroskopets okular (figur 7C). Eftersom fönstret är limmat på organets yta är positionen för bildfält i förhållande till gallret stabil. Under avbildningen, notera rutnätets orientering och plats inom rutnätet för varje synfält som avbildas (t.ex. 2: a raden från toppen, 4: e kvadraten från vänster). Använd sedan rutnätet för att navigera tillbaka till specifika rutnätsområden - och därmed bildfält - under på varandra följande bildsessioner.
Rutnätet är också användbart för att justera bildfältet under en avbildningssession när vävnaden långsamt driver på grund av t.ex. andning eller peristaltik. De flesta bildfönster med en styv fälg kan fästas vid en hållare under avbildning, vilket ger stabilitet till bildområdet. Eftersom de flexibla fönstren inte kan stabiliseras direkt används kirurgisk tejp för att stabilisera kroppsdelen som innehåller fönstret, och bildområdet justeras om till mitten av motsvarande rutnätskvadrat eller tidigare identifierade vävnadsmärken (t.ex. vaskulära landmärken) med definierade intervall (vanligtvis var 30: e minut). Ytterligare avdriftskorrigering för mikroskopisk förskjutning av synfältet utförs digitalt i fasen efter förvärv genom kod som justerar ramarna baserat på detekterade vävnadsmönster (tilläggskod 1–2).
För att validera att fönstret inte orsakar någon öppen systemisk biverkning övervakades vikten av djur som hade genomgått fönsterimplantation och obehandlade åldersmatchade kontroller. Efter en initial viktminskning i samband med operationen fortsätter de flesta möss med infogade fönster att gå upp i vikt över tiden, vilket indikerar att fönsterinsättning tolereras väl (figur 8A-C). För lever- och bröstkörtelfönster återfås normal vikt inom 5 dagar från operationen. Postoperativ återhämtning är långsammare efter implantation av fönstret över bukspottkörteln, med möss som återgår till preoperativ vikt inom 14 dagar. Denna observation överensstämmer med de förväntade effekterna i samband med manipulation av bukspottkörteln vid tidpunkten för operationen. Observera att även i fall då viktminskning inte når tröskeln för humant effektmått censureras möss som inte återfår preoperativ kroppsvikt (<5% av alla möss, exemplifierat av musen som indikeras av * i figur 8B) vanligtvis från bildexperiment. Dessutom förändrades inte antalet vita blodkroppar, som bestämdes vid olika tidpunkter efter fönsterinsättning, hos nästan alla fönsterbärande möss jämfört med kontroller och förändrades inte avsevärt över tiden (figur 8D), vilket tyder på att fönstret inte orsakade större systemisk inflammation.
Därefter, för att utvärdera graden av lokalt vävnadssvar på fönstret och limet, avlivades möss vid 3, 14 och 28 (bröstkörtelfönster) eller 35 dagar (lever- och bukspottkörtelfönster) efter kirurgisk införande av fönstret för histologisk analys. Utvärdering av hematoxylin och eosin (H & E) färgade leversektioner visade ytliga (20-80 μm), minimal till mild kapselgranuleringsvävnadsbildning under fönstren för de flesta möss (2 av 3 möss utvärderade vid dag 3 och 2 av 3 utvärderade vid dag 14). Dessa lesioner var fokala (1-3 mm långa), vilket motsvarar ungefär limskiktets bredd (figur 8E). Efter 35 dagar presenterade de flesta möss (4 av 6 utvärderade i två separata experiment) ingen granulär vävnad, medan några (2 av 6) hade måttlig fokal kapselskleros och desmoplasi (på ett djup av 25-250 μm). Intressant nog observerades inga signifikanta lesioner på ytan av bukspottkörteln direkt under fönstret vid någon tidpunkt i kohorten av nio möss (Figur 8G). Vissa möss visade emellertid områden av atrofi i bukspottkörteln och inflammation i bukfettet (steatit), i överensstämmelse med manipulationsinducerad skada. För bröstkörteln, på dag 3 efter fönsterimplantation, hade 3 av 3 möss antingen granuleringsvävnad som påminner om ett helande snitt synligt längs körtelns yta eller en inflammatorisk reaktion i fettvävnaden; vid dag 14 hade 3 av 3 utvärderade möss granuleringsvävnad. Dessa lesioner var återigen fokala och 1-3 mm långa (figur 8I). Möss med bröstkörtelfönster som avlivades 28 dagar efter operationen visade inga uppenbara histologiska avvikelser.
Denna analys tyder på att fönstret inte äventyrar den övergripande fysiologiska arkitekturen hos de testade organen (lever, bukspottkörtel, bröstkörtel). Den reaktiva vävnaden som hittades på ytan av levern och bröstkörteln var sannolikt en reaktion på limet och begränsad till vävnad omedelbart i kontakt med limet. Normal vävnad kan lätt hittas intill (< 100 μm) till den reaktiva vävnaden i regioner som inte utsätts för lim (figur 8E,I), och vävnadsinflammationen stör därför inte avbildningen av friska vävnadsregioner. Dessutom är vävnadsreaktionen sannolikt reversibel eftersom de flesta möss (8 av 9 möss, över alla vävnadsplatser) inte visade några signifikanta lesioner vid de sena tidpunkterna (28 eller 35 dagar), även om direkt bekräftelse på att vävnadsreaktionen löser sig skulle vara svår att uppnå utan longitudinella mätningar hos enskilda möss.
Multiplexerad immunohistokemisk färgning för CD45, CD68 och myeloperoxidas (MPO) utfördes också för att karakterisera infiltrationen av leukocyter, monocyter / makrofager respektive neutrofiler. En ökning av immuncellsinfiltration i samband med granuleringsvävnad och steatit sågs i bröstkörteln och levern, men inte i bukspottkörteln (Figur 8F, H, J). Observera att dessa förändringar sannolikt var övergående eftersom immuncellsinfiltrationen var jämförbar med den för de obehandlade kontrollerna vid de senaste tidpunkterna (28 dagar för bröstkörtelfönster och 35 dagar för lever- och bukspottkörtelfönster).
Levern valdes som plats för att ytterligare karakterisera huruvida fönsterinsättning och avbildning orsakade signifikant lokal immuninfiltration med hjälp av bildbehandling. För att göra detta användes c-fms-EGFP (MacGreen) möss15, där myeloida celler (mestadels makrofager) är märkta med ett grönt fluorescerande protein. Leverfönster implanterades i tre c-fms-EGFP-möss och avbildade dem på dag 1, 3 och 5 efter operationen med hjälp av gallret för att lokalisera samma synfält. Antalet makrofager som fanns i avbildningsområdet förändrades inte nämnvär över tid efter fönsterinsättning (figur 8K).
Därefter testades fönstret funktionellt genom att avbilda en mångsidig uppsättning biologiska processer på cellulär nivå (dvs rörelse, proliferation, cell-cellkontakt) och vävnadsnivå (dvs tumörtillväxt i bukspottkörteln, immuninfiltration under bröstkörtelinvolution och levermetastas). Bukspottkörteln är inte en lättillgänglig plats för avbildning. För att demonstrera hur fönstret kan användas för att fånga cancercelldynamik i detta organ sattes fönster in över bukspottkörteln på sex C57BL / 6J-möss samtidigt som ortotopisk injektion av KPC-BL / 6-1199-celler, en bukspottkörtelcancercellinje härledd från en vanligt använd KPC (KrasLSL- G12D / + ;p 53LSL-R172H; Pdx1-Cre) genetiskt konstruerad musmodell av bukspottkörtelcancer. För att visualiseras med konfokalmikroskopi konstruerades KPC-BL/6-1199-celler för att uttrycka doxycyklininducerbar förbättrad GFP (iGFP-1199-celler). Sex dagar efter injektionen sattes mössen på en doxycyklindiet för att utlösa uttryck av grönt fluorescerande protein (GFP) i bukspottkörtelcancercellerna. Figur 9 visar representativa bilder från en mus som ortotopiskt injicerats med iGFP-1199-celler på dag 11 och 14 efter injektion och fönsterinsättning. Film 2 visar iGFP-1199 tumörkanten i ett utdrag av en 2-timmars bildsession på dag 11 efter fönsterinsättning, vilket illustrerar förmågan att fånga dynamiken i cellmembranprojektionen i bukspottkörteln med silikonfönstren.
Silikonfönstret kan också användas för att fånga dynamisk immuncellsinfiltration över tiden. För att illustrera detta insterades bröstkörtelns fönster i ammande ACTB-ECFP (Tg(CAG-ECFP)CK6Nagy); LysM-eGFP (Lyz2tm1.1Graf) möss omedelbart efter avvänjning. I dessa möss uttrycker alla celler, men mest epitelceller, cyanfluorescensprotein (CFP) som drivs av beta-aktinpromotorn och myeloida celler - främst neutrofiler, men även makrofager - märkta av eGFP som drivs av lysozym M-promotorn. Mössen avbildades på dag 2 och 4 efter fönsterinsättning, under processen med bröstkörtelinvolution, när bröstkörtelvävnad börjar återgå till sitt tillstånd före graviditeten. Två makron för ImageJ utvecklades för att minska rörelseartefakter och förbättra visualiseringen, en justerar Z-planen i en 4-dimensionell intravital video (kompletterande kod 1) och den andra minskar vingligheten på grund av andning eller andra rörelseartefakter (kompletterande kod 2). Figur 10 och film 3A–C visar neutrofil infiltration i den ombyggda bröstkörtelvävnaden på samma plats vid dag 2 och 4, vilket illustrerar hur fönstret kan användas för att övervaka och spåra immuncellsinfiltration och rörelse under olika dagar. Ett analogt experiment utfördes i en c-fms-EGFP-mus, med myeloida celler (främst makrofager) som uttrycker GFP som drivs av c-fms-promotorn (film 4).
Slutligen möjliggör den relativt stora ytan av detta anpassningsbara fönster observation av sällsynta händelser, såsom bildandet av levermetastas efter intravenös ympning. För att demonstrera detta fenomen infördes leverfönster i C57BL/6J-möss vid tidpunkten för portalveninjektion med KPC-BL/6-1199 bukspottkörtelcancerceller som konstitutivt uttrycker kärnfusionsproteinet histon2B-CFP (H2B-CFP). Med tiden övervakades utväxten av enskilda celler och små kluster av 2-3 celler när de utvecklades till mikrometastaser (>100 celler). Figur 10 visar representativa bilder tagna på dag 1, 3, 7 och 9 efter injektion och fönsterinsättning och visar progressionen från enskilda celler till mikrometastaser.
Alla bilder och filmer samlades in med hjälp av ett multifotonmikroskop. Projektioner med maximal intensitet och filmjusteringar längs Z- och X-axlarna över tid genererades med hjälp av ImageJ-programvaran. Justerade bilder och filmer sammanställdes sedan med hjälp av Imaris programvara.
Figur 1: Kirurgisk insättning av ett ventralt bukavbildningsfönster över levern. (A) Tecknad film visar den anatomiska placeringen av strukturer som är relevanta för operationen. Den vita streckade rutan beskriver det kirurgiska fältet som visas på bilderna. (B) Ett snitt görs med början 3 mm under xiphoidprocessen och fortsätter nedåt så att en 1–1,5 cm2 sektion av huden avlägsnas längs mittlinjen. (C) En något mindre del av bukhinnan dissekeras. (D) Det falciforma ligamentet (vit pilspets) är avskuret och trycker ner levern. Obs: bomullspinne fuktad med steril saltlösning används för att försiktigt manipulera inre organ. (E) Med hjälp av en spruta appliceras en liten mängd kirurgiskt lim i droppar runt det intressanta området på leverns yta. (F) Fönstret är placerat och hålls stadigt mot levern tills limet har torkat (2 min). (G) Fönstrets kanter viks under bukhinnan och huden. (H) För att fästa fönstret i bukhinnan appliceras lim på ytan av fönstret som motsvarar det skuggade området innan bukhinnan trycks ner på det och limmar det på plats. Huden limmas på samma sätt på bukhinnan. En limfälg deponeras slutligen längs den röda linjen för att förhindra tillväxt av epitelet över fönstret. (I) Samma bild som i (H) utan markeringar som visar musen redo för återhämtning efter kirurgisk återhämtning. Område som skisseras med streckade linjer förstoras i (J, K). (J) Märken från dropparna av lim är synliga på leverns yta (pilhuvuden) (K) Samma foto som i J som visar levern synlig genom fönstret skisserad av en vit streckad linje. Dropparna av lim på leverytan är skisserade i rött. Området som ska avbildas är skisserat i vitt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Kirurgisk insättning av ett fönster över leverns högra lob. (A) Tecknad film visar den anatomiska placeringen av strukturer som är relevanta för operationen. Den svarta streckade rutan beskriver det kirurgiska fältet som visas på bilderna. (B) Musen placeras i vänster lateral decubitusposition, ett snitt görs med början 3 mm under bröstkorgen och en cirka 1 cm2 sektion av huden avlägsnas. (C) En något mindre del av bukhinnan dissekeras. (D) Levern dras försiktigt ner under bröstkorgen med en fuktad bomullspinne. (E) Med hjälp av en spruta appliceras en liten mängd kirurgiskt lim i droppar (vitt pilhuvud) på leverns yta. (F) Fönstret är placerat och hålls stadigt mot levern tills limet har torkat (2 min). (G) Fönstrets kanter viks under bukhinnan och huden. (H) För att fästa fönstret i bukhinnan appliceras lim på fönstrets yta, som motsvarar det skuggade området, innan bukhinnan trycks ner på det och limmar det på plats. Huden limmas på samma sätt på bukhinnan. En limfälg deponeras också längs den röda linjen för att förhindra tillväxt av epitelet över fönstret. (I) Vid hög förstoring är levern (skisserad av en vit streckad linje) synlig genom fönstret. Bildområdet markeras av rutnätet inbäddat i fönstret (vitt pilhuvud). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Kirurgisk insättning av ett fönster över bukspottkörteln. (A) Tecknad film visar den anatomiska placeringen av strukturer som är relevanta för operationen. Den svarta streckade rutan beskriver det kirurgiska fältet som visas på bilderna. (B) Musen placeras i höger lateral decubitusposition. Mjälten är synlig genom den rakade huden (streckad linje) (C) Ett snitt görs med början 3 mm under bröstkorgen och en cirka 1 cm2 sektion av huden avlägsnas. (D) En något mindre del av bukhinnan dissekeras. (E) Bukspottkörteln (det vita pilhuvudet) placeras försiktigt med en fuktad bomullspinne på platsen för fönstret. (F) Med hjälp av en spruta appliceras en liten mängd kirurgiskt lim på mjälten, liksom bukspottkörteln (bort från regionen som ska avbildas). (G) Fönstret är placerat och hålls stadigt mot bukspottkörteln tills limmet har torkat (2 min). Fönstrets kanter viks under bukhinnan och huden. (H) För att fästa fönstret i bukhinnan appliceras lim på ytan av fönstret som motsvarar det skuggade området innan bukhinnan trycks ner på det och limmar det på plats. Huden limmas på samma sätt på bukhinnan. En limfälg deponeras också längs den röda linjen för att förhindra tillväxt av epitelet över fönstret. (I) Vid hög förstoring är bukspottkörteln (skisserad av en vit streckad linje) synlig genom fönstret. Bildområdet markeras av rutnätet inbäddat i fönstret (vitt pilhuvud). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Kirurgisk insättning av ett fönster över inguinal bröstkörteln. (A) Tecknad film visar den anatomiska placeringen av strukturer som är relevanta för operationen. Den svarta streckade rutan beskriver det kirurgiska fältet som visas på bilderna. Observera att operationen kan utföras på antingen den 4: e eller den 5: e bröstkörtlarna. (B) Musen placeras i ryggläge på ett sterilt kirurgiskt fält. Den 5: e högra bröstvårtan (pilhuvudet) används som ett landmärke för att utföra snittet. (C) Ett snitt görs, bröstkörteln separeras från den överlagrade huden och en cirka 1 cm2 sektion av huden avlägsnas. (D) Med hjälp av en spruta appliceras en liten mängd kirurgiskt lim i droppar runt det intressanta området på bröstkörtelns yta. (E) Fönstret är placerat och hålls stadigt tills limmet har torkat (2 min). (F) Fönstrets kanter viks under huden med hjälp av pincett. (G) För att fästa fönstret på huden appliceras lim på ytan av fönstret som motsvarar det skuggade området innan du trycker ner huden på den och limmar den på plats. En limfälg deponeras också längs den röda linjen för att förhindra tillväxt av epitelet över fönstret. (H) Ett exempel på ett fönster implanterat över en liten tumör i den 4: e högra bröstkörteln tillhandahålls. Område som skisseras med streckade linjer visas i högre förstoring i (I). (I) Dropparna av lim på bröstkörtelns yta är skisserade i rött. Området som ska avbildas är skisserat i svart. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Silikonavbildningsfönster har gynnsamma optiska och materialegenskaper. (A–C) För att mäta punktspridningsfunktionen och jämföra PDMS-fönstrens bildegenskaper med glasöverdragsglas avbildades 40 nm gulgröna fluorescerande mikrosfärer genom PDMS-fönster av varierande tjocklek eller glasöverdrag (#1.5 tjocklek)16. Bilder samlades in med hjälp av ultraljudsgel som nedsänkningsmedium för att matcha villkoren för intravital avbildning. Diagram visar den beräknade fulla bredden vid halv max (FWHM) i (A) X-axeln, (B) Y-axeln, och (C) Z-axeln (medelvärde ± SD; n = 3/grupp, förvärvad med hjälp av två eller flera separata fönster; enkelriktad ANOVA som jämför alla PDMS-fönster med glas med Dunnetts multipeljämförelsetest; endast signifikanta skillnader anges). (D) Förhållandet mellan beräknade FWHM-värden i X- och Y-axeln (A–B) visas som ett mått på symmetrin hos punktkällbilderna längs X- och Y-axlarna och därmed på optiska avvikelser. (E–G) Mikrosfärer avbildades genom tre separata fönster gjutna med 200 mg PDMS (liknande de fönster som används för intravital avbildning för Figur 9, Figur 10, Figur 11 och Film 2, Film 3, Film 4) eller tre glasöverdrag (#1,5 tjocklek) för att mäta punktspridningsfunktionen. Till skillnad från de intravitala avbildningsexemplen samlades bilder för dessa beräkningar in med vatten som nedsänkningsmedium. Diagram visar den beräknade FWHM i (E) X-axeln, (F) Y-axeln och (G) Z-axeln (medelvärde ± SD; n = 3/grupp med tre separata fönster. Mann-Whitney-testet upptäcktes inga signifikanta skillnader). (H) Diagrammet visar förhållandet mellan beräknade FWHM-värden i X- och Y-axeln (E–F). (Jag) Diagram visar den högsta fluorescerande intensiteten per mikrosfär (medelvärde ± SD; n = 3/grupp; Mann-Whitney-testet upptäcktes inga signifikanta skillnader). Alla bilder samlades in vid en våglängd på 960 nm och en lasereffekt på 3%. En 100 μm z-stack samlades in för varje mikrosfär, med en stegstorlek på 0,6 μm. Bildramen sattes till 69 μm x 69 μm med en upplösning på 1022 pixlar x 1022 pixlar. Analysen utfördes med Fiji - MetroloJ plugin. (J) För att testa materialegenskaper hölls PDMS-fönster i spänning och säkrades mellan två ringformade brickor med hjälp av superlim för att säkerställa ett elastiskt svar under mekanisk provning. Samma procedur användes för mikroskyddsglasglidningar utan spänning på grund av glasets styvhet. En lastspets bestående av en halvklot (6 mm diameter) med en cylindersträngsprutning (4 mm diameter, 20 mm längd) 3D-printades med en polymjölksyrafilament. Fönstren lastades i en testmaskin för servohydrauliskt material under en lastkontrollprofil på 1 N/s tills materialfel. Kraft- och förskjutningsvärden mättes med en frekvens av 100 Hz. Bilden visar fönstertestningen som ställts in med laddningsspetsen som appliceras i mitten av fönstret. (K) Diagrammet visar materialets seghet bestämd genom beräkning av summeringsarean under spänningstöjningskurvan med hjälp av Trapz-funktionen i MATLAB (medelvärde ± SEM; n = 3/grupp med tre separata PDMS-fönster för varje tjocklek och glasöverdrag; enkelriktad ANOVA med Tukeys multipeljämförelsetest). (L) Diagrammet visar Youngs modul bestämd från den linjära delen av spännings-töjningskurvan (medelvärde ± SEM; n = 3 /grupp med tre separata PDMS-fönster och glasöverdrag; t-test med Welchs korrigering). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Silikonfönstret visar hög tolerans och livslängd. (A) En representativ bild av en manlig, 7 veckor gammal C57BL / 6J-mus med ett ventralt bukbildfönster utan rutnät 11 dagar efter fönsteroperation. (B) En representativ bild av en manlig 7 veckor gammal C57BL/6J-mus med ett bukspottkörtelbildsfönster som innehåller ett rutnät 14 dagar efter fönsteroperationen. (C) En representativ bild av en kvinnlig 12 veckor gammal C57BL/6J c-fms-EGFP-mus med ett bröstkörtelavbildningsfönster som innehåller ett rutnät >7 dagar efter fönsteroperationen. (D) Leveravbildningsfönster i en manlig 7 veckor gammal c-fms-EGFP-mus fotograferad (översta raden) och avbildad (nedre raden) på dag 0 (omedelbart efter operationen) och 35 dagar efter operationen. Att ta bort lämplig mängd hud och försegla såret med lim förhindrar att huden återepiteliserar och skjuter fönstret upp och ut, vilket gör att organet kan avbildas på lång sikt. Skalstänger = 30 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 7: Rutnät i fönstren möjliggör spårning av samma synfält. (A) Detaljerade specifikationer för anpassad tillverkning av laserskurna fönster i rostfritt stål. (B) Ett rutnät inbäddat i bildfönstret kan ses över levern, med limkanten runt fönstret tydligt synlig. (C) Utsikt över fönstret genom ögonriket i tvåfotonmikroskopet. Blodkärl (röd) och grön signal från levern kan ses i bakgrunden. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Systemiskt och lokalt svar på fönsterinsättning. (A–C) Vikten övervakades för 7 veckor gamla C57BL/6J-honmöss under en period av 28 dagar efter fönsterinsättning i levern (A), bukspottkörteln (B) eller bröstkörteln (C). Procentuell kroppsviktsförändring jämfört med obehandlade åldersmatchade möss visas. (*) anger en mus som inte återfått normal kroppsvikt och därför skulle ha censurerats från ett avbildningsexperiment. Samma kontrollmöss visas i alla tre panelerna för enklare jämförelse med varje typ av fönster. (D) Antal vita blodkroppar (WBC) som övervakas på dag 3, 14 och 28 (bröstkörtelfönster) eller 35 (lever- eller bukspottkörtelfönster) efter operationen. Det normala intervallet för WBC-antal i musen indikeras med streckade linjer. (E,G,Jag) Hematoxylin- och eosinfärgning av vävnadssektioner från obehandlade kontroller (vänster) och en 7 veckor gammal C57BL/6J-mus 14 dagar efter införandet av ett bildfönster (höger) över (E) lever, (G) bukspottkörteln, eller (Jag) bröstkörtel. (E,Jag) Ytliga och fokala granuleringsskador är synliga på diskreta platser längs ytan (pilen) av lever och bröstkörtel, vilket tyder på en reaktion på limet. Normal vävnad indikerad av * är synlig i regionerna intill granuleringsskadorna. Tre kontroller och tre möss med leverfönster utvärderades vid varje tidpunkt (dag 3, 14 och 35 efter operationen), förutom att 6 möss med leverfönster utvärderades vid dag 35 efter operationen. Två av 3 möss uppvisade granuleringsvävnad vid dag 3 och 14. 1 av 3 möss uppvisade granuleringsvävnad vid dag 35. Tre kontroller och tre möss med bröstkörtelfönster utvärderades vid varje tidpunkt (dag 3, 14 och 28 efter operationen). Tre av 3 möss hade granuleringsvävnad eller inflammatoriska reaktioner i bröstkörtelns fettvävnad vid dag 3 och 14. Noll av 3 möss uppvisade granuleringsskador eller inflammatoriska reaktioner vid dag 28. (G) Inga signifikanta skador är synliga i bukspottkörteln. Tre kontroller och tre möss med bukspottkörtelfönster utvärderades vid varje tidpunkt (dag 3, 14 och 35 efter operationen). Möss med bukspottkörtelfönster hade inte granuleringsvävnad vid någon tidpunkt. Skalstång = 500 μm (F,H,J) Multiplex immunohistokemisk färgning utfördes på vävnadssektioner från obehandlade kontroller och 7 veckor gamla C57BL/6J-möss 14 dagar efter införandet av ett bildfönster över (F) lever, (H) bukspottkörteln eller (J) bröstkörtel. Antikroppar mot CD45, CD68 och myeloperoxidas (MPO) användes för att märka leukocyter, monocyter/makrofager respektive neutrofiler. CD45- och CD68-färgning utfördes på samma sektion medan MPO-färgning utfördes på en seriell sektion av samma vävnad. Anti-CD45-antikroppen detekterades med en HRP-konjugerad sekundär antikropp och avbildades först, sedan avlägsnades kromogenen och den sekundära antikroppen och diabilder inkuberades med en sekundär antikropp som kände igen anti-CD68. Kvantifiering utfördes med Fiji-programvara genom färgtröskel; parametrar justerades över antikroppar och vävnader. Diagram visar kvantifieringen som cellantal per synfält (FOV) (medelvärde ± SEM; n = 3 / grupp; enkelriktad ANOVA med Tukeys multipeljämförelsetest; endast signifikanta skillnader anges). (K) Hane C57BL/6J c-fms-EGFP möss i åldern 8–11 veckor hade ett silikonavbildningsfönster infört över leverns högra lob. Fluorescerande märkt lektin (100 μL) injicerades intravenöst omedelbart före varje avbildningssession. Bilderna är från en enda mus, vid samma rutnätsplats på dag 1, 3 och 5 efter operationen, cirka 200 μm under rutnätet. Skalstång = 30 μm. Avbildad med en excitationsvåglängd på 960 nm, lasereffekt 10%. Blodkärlen förekommer i rött. Makrofager visas i grönt (vita pilar). Representant för tre avbildade möss. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9: Tumörer kan visualiseras vid flera tidpunkter under veckor efter fönsterinsättning. Representativa bilder från en manlig 7 veckor gammal C57BL / 6J-mus ortotopiskt injicerad med 1,5 x 104 iGFP-1199 bukspottkörtelcancerceller vid tidpunkten för bukspottkörtelfönstrets insättning och avbildad på dag 11 och 14 efter fönsterinsättning. Skalstänger = 30 μm. Avbildad med en excitationsvåglängd på 960 nm, lasereffekt 10%. Representant för 6 avbildade möss. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 10: Dynamiska förändringar i immuncellsinfiltration under normal bröstkörtelinvolution. Med hjälp av metallnätet inbäddat i bildfönstret kan samma plats avbildas under normal vävnadsombyggnad, såsom under bröstkörtelns involution. För att ytterligare utvärdera silikonfönstens funktionalitet vid övervakning av dynamiska förändringar som immuncellsinfiltration, en 12 veckor gammal kvinnlig C57BL / 6J x BALB / c ACTB-ECFP; LysM-eGFP-mus med ett bildfönster infört över bukbårkörteln avbildades på dag 2 och 4 efter bröstkörtelns involution. Neutrofiler förekommer i grönt (vita pilar). Neutrofil elastasaktivitet visualiserades genom att injicera en neutrofil elastas fluorescerande sond 4 timmar innan avbildning påbörjas och visas i rött (eller gult när det samlokaliseras med neutrofiler). Epitelcellerna visas i blått. Ögonblicksbilder är en projektion med maximal intensitet på fem bilder längs Z-axeln (100–150 mm djup). Bilderna är från filmer 3A och 3B, och på de nedre radbilderna visas endast CFP-signalen och bilderna markeras med en röd streckad linje för att visualisera samma platser i vävnad vid de två olika tidpunkterna. Skalstänger = 30 μm. Avbildad med 960 nm och 1080 nm excitationsvåglängder, lasereffekt vid 10% respektive 15%. Representant för fyra avbildade möss. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 11: Bildandet av cancermetastaser kan spåras över tiden. En manlig C57BL / 6J 10 veckor gammal mus injicerad med 1 x 105 KPC-BL / 6-1199 bukspottkörtelcancerceller som uttrycker kärnlokaliserad histon H2B konjugerat cyanfluorescerande protein (H2B-CFP) genom portalvenen vid tidpunkten för fönsterinsättning. Leveravbildning utfördes genom ett sidofönster 24 timmar (dag 1) efter injektion och vid tre senare tidpunkter (upp till 9 dagar), som anges. En enda cancercell synlig på dag 1 och 3 efter injektion indikeras med vita pilar. Andra harmoniska signalen från kollagenfibrer visualiserades också i cyankanalen (gula pilar). Bilderna kommer från samma mus vid varje annan tidpunkt. Enstaka z-planbilder tagna mellan 300 μm och 350 μm djup. Skalstänger = 30 μm. Avbildad med en excitationsvåglängd på 880 nm. Lasereffekt vid 8%. Representant för tre avbildade möss. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Film 1: Silikon imaging fönster tolereras väl hos möss. Filmen visar en manlig 9 veckor gammal C57BL/6J-mus 14 dagar efter fönsterinsättning. Mus uppvisar inte något av de standardbeteenden som är förknippade med smärta (t.ex. dålig grooming, slutna ögon eller slöhet). Representativ för sex registrerade möss, och överensstämmer med över 100 möss observerade efter framgångsrik fönsterimplantation. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Film 2: Subcellulär avbildning av ortotopiskt implanterade bukspottkörtelcancerceller. iGFP-1199-celler injicerades ortotopiskt i bukspottkörteln hos en manlig 7-veckors gammal C57BL / 6J-mus och avbildades på dag 11 efter injektion av cancerceller och fönsterinsättning. Filmen är en maximal intensitetsprojektion av sex bilder längs Z-axeln och extraherad från en 2-timmars bildperiod. Tidsstämpel (h:min:s:ms). Representant för sex avbildade möss. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Film 3: Förändringar i immuncellsinfiltration i ACTB-ECFP; LysM-eGFP-möss under involution. Hona C57BL/6J x BALB/c ACTB-ECFP; LysM-eGFP-möss som uttrycker GFP i myeloida celler (främst i granulocyter men även i makrofager) och ECFP i alla celler (men högst i epitelceller) föddes vid 8 veckors ålder. Efter förlossning normaliserades valparna till sex valpar per mus. På dag 10 efter förlossningen avvänjdes valparna och bukens bröstkörtelbildfönster sattes in. Myeloida celler förekommer i grönt; neutrofil elastasaktivitet, märkt med neutrofil elastas 680 FAST-sonden injicerad 4 timmar före avbildningens början, visas i rött (kommer att visas gult när det samlokaliseras med neutrofiler); och epitelceller förekommer i blått. Filmer är en maximal intensitetsprojektion av fem bilder längs Z-axeln (100–150 μm djup). (A) Avbildning vid dag 2 av bröstkörtelns involution. Skalstång = 20 μm. Avbildad med 960 nm och 1080 nm excitationsvåglängder, lasereffekt vid 10% respektive 15%. (B) Avbildning vid dag 4 av bröstkörtelns involution. Skalstång = 20 μm. Filmen är från samma mus- och vävnadsregion som film 3A. (C) Högre förstoring av en region av intresse från film 3B, som visar två neutrofiler som interagerar med varandra och epitelcellerna i bröstkörteln. Bildandet av övergående membranutsprång kan observeras vid framkanten under neutrofilmigration. Tidsstämpel (h:min:s:ms). Representant för fyra avbildade möss. Klicka här för att ladda ner Film 3A. Klicka här för att ladda ner Film 3B. Klicka här för att ladda ner Film 3C.
Film 4: Förändringar i immuncellsinfiltration hos c-fms-EGFP-möss under involution. Kvinnliga C57BL / 6J c-fms-EGFP-möss, med GFP-märkta makrofager, föddes vid 8 veckors ålder. Efter förlossningen justerades kullarna till sex valpar per mus. På dag 10 efter förlossningen avvänjdes valparna och bukens bröstkörtelbildfönster sattes in. Filmen, som förvärvades på involutionsdag 1 (en dag efter införandet av fönstret), belyser det framträdande makrofaginfiltret under involutionen. Makrofager förekommer i grönt, kollagenfibrer (andra harmoniska generationen) förekommer i blått och blodkärl förekommer i rött (Lectin-DyLight 594). Skalstång = 20 μm. Bilder är projektioner med maximal intensitet av fem bilder längs Z-axeln (100–150 um i djup). Avbildad med 960 nm och 800 nm excitationsvåglängder, lasereffekt vid 10% respektive 15%. Tidsstämpel (h:min:s:ms). Representant för tre avbildade möss. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Kompletterande kod 1. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kod 2. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intravitala bildfönster är viktiga verktyg för att direkt visualisera fysiologiska och patologiska processer vid cellulär upplösning när de utvecklas över tiden. Den nya proceduren som beskrivs för gjutning och insättning av flexibla silikonbildfönster hos möss övervinner några av de vanligaste problemen med för närvarande använda bildfönster (exsudat, brytning och störning av normal rörlighet), ger ytterligare säkerhet för musen och ökar tillgängligheten för denna teknik.
De mest använda bildfönstren består av en metallram som håller en glasöverdragslip. Ett stort hinder för användningen av dessa prototypiska fönster är att säkring av metallringen innebär mödosamma sömnadsprocedurer, vilket kräver personal med avancerad kirurgisk utbildning. Dessutom är tillverkningen av ramarna dyr och kräver specialutrustning. PDMS-fönstren övervinner båda dessa problem. Proceduren för att sätta in PDMS-fönstren eliminerar sömnad, vilket avsevärt sänker barriären för att lära sig tekniken. Materialen för att producera fönstren är också billiga och kan enkelt köpas. Dessutom kan både fönstrets form och det kirurgiska ingreppet anpassas för avbildning av olika organ, inklusive bröstkörteln, levern, bukspottkörteln, mjälten och tarmen.
Medan nuvarande intravitala bildfönster tillåter longitudinell avbildning i vanligtvis några dagar, begränsar flera vanliga problem användningen av dessa fönster under längre perioder. Vikten och storleken på glasfönster kan störa mössens fria rörlighet, och exsudat kan ackumuleras mot fönstret. Möss kan också skada glasglaset, vilket resulterar i sår och infektioner. Däremot upprätthåller det förfarande som beskrivs här samma nivå av tillgänglighet till vävnaden samtidigt som nöden för djuren minimeras. PDMS är en säker, biostabil, syntetisk polymer som ofta används för biomedicinska tillämpningar hos människor, såsom läkemedelsleveransanordningar, ansiktsrekonstruktionskirurgi och bröstimplantat. Utöver att öka djurens tolerans för fönstret är användningen av ett biologiskt inert material, i motsats till glas, särskilt viktigt för studier som involverar immunsystemet, där lokal inflammation skulle vara en förvirrande effekt. Dessutom är en stor förbättring eliminering av stygn, eftersom möss kommer att bita och dra i dem, vilket kan orsaka att de metallinramade glasbildsfönstren faller ut. Problemet åtgärdades delvis av en nyare generation fönster som utformades så att stygnen döljs i ett spår9. Denna senare strategi kräver emellertid suturering av handväska, vilket är ett komplicerat, felbenäget förfarande som ofta gör att stygn dras för hårt, vilket resulterar i nekros i vävnaden och smärta. Därför utgör möjligheten att limma fönstret på plats en stor fördel med silikonfönstrets tillvägagångssätt. Dessutom är fönstret tillverkat av ett flexibelt, hållbart material med försumbar vikt, vilket minskar dess inverkan på djurets rörelse, vilket tidigare bedömts i en jämförelse av fönster som använde silikon istället för metall för att hålla englasöverdragslip 17. Genom att helt eliminera glasskivan eliminerar silikonfönstret problemen med både metallramarna och glaset. Dessutom gör fönstrets flexibilitet att det enkelt kan sättas in och minskar spänningskraften som orsakas av limning av en styv yta på organen, vilket minskar risken för permanent skada på vävnaden som observeras. Dessutom, eftersom fönstret är mycket lättare att sätta in och hålla på plats, tar det övergripande förfarandet mindre tid, vilket begränsar de möjliga biverkningarna på grund av långvarig anestesi. För insättning över levern är skillnaden i procedurtid särskilt stor, från 45 min för metallinramade fönster till 15 min för silikonfönstren. Faktum är att medan införandet av metallramen över levern kräver dissektion av xiphoidprocessen (brosket i slutet av bröstbenet), vilket också är potentiellt smärtsamt och orsakar långvarig inflammation, är denna dissektion onödig för att sätta in silikonfönstret. Slutligen ger det bildfönster som presenteras i detta arbete ytterligare fördelar med avseende på möjliga tillämpningar. Till exempel, till skillnad från glasfönster, ger silikonfönster enkel åtkomst till vävnaden, så cancerceller, fluorescerande färgämnen eller läkemedel kan injiceras direkt genom fönstret.
Ett annat PDMS-baserat silikonavbildningsfönster som är lämpligt för insättning på en mängd olika anatomiska platser, inklusive bröstkörteln, beskrevs nyligen18. Det fönstret är gjutet för att generera en form och specialiserad kant som möjliggör snabb implantation av fönstret utan behov av stygn eller lim. Däremot kräver silikonfönstret som presenteras här ingen speciell form och viktigare, kan skäras till form under det kirurgiska ingreppet för att anpassa sig till den anatomiska platsen och den enskilda musen. Även om protokollet som beskrivs här kräver användning av lim, tillåter detta ytterligare krav avbildning av bukorgan, inklusive lever och mjälte. Dessutom möjliggör silikonfönstret som beskrivs här inbäddning av ett rostfritt stålnät i fönstret, vilket ger referensmärken. Dessa landmärken möjliggör spårning av samma exakta plats över tid och underlättar upprepad avbildning av samma plats under flera sessioner (longitudinell avbildning) för att studera processer som tar dagar till veckor, såsom utveckling av metastatiska lesioner.
Sammanfattningsvis utvecklades ett silikonavbildningsfönster för användning i längsgående IVM i bröstkörteln eller bukorganen. Fönstret är optiskt klart, mycket hållbart och billigt. Enkelheten i fönsterinsättningsproceduren minskar de tekniska färdigheter som krävs för att implementera fönsterbaserade intravitala avbildningsmetoder. Fönstrets anpassningsförmåga till olika vävnadsställen möjliggör implementering av IVM i ett stort antal biologiska studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
M.E. är medlem i forskningsrådet för brensocatib för Insmed, Inc.; medlem av den vetenskapliga rådgivande nämnden för Vividion Therapeutics, Inc.; en konsult för Protalix, Inc.; D.A.T. är medgrundare av Mestag Therapeutics och sitter i den vetenskapliga rådgivande styrelsen och innehar aktier i Mestag Therapeutics, Leap Therapeutics, Surface Oncology och Cygnal Therapeutics. De andra författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Rob Eifert för hans hjälp med att designa och optimera de laserskurna rostfria gallren. Detta arbete stöddes av CSHL Cancer Center (P30-CA045508) och medel för ME från National Institutes of Health (NIH) (1R01CA2374135 och 5P01CA013106-49); CSHL och Northwell Health; Thompson Family Foundation; Simma över Amerika; och ett bidrag från Simons Foundation till CSHL. MS stöddes av National Institute of General Medical Sciences Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) och National Cancer Institute of the NIH under tilldelningsnummer 1F30CA253993-01. L.M. stöds av ett James S. McDonnell Foundation Postdoctoral Fellowship. J.M.A. är mottagare av ett Cancer Research Institute / Irvington Postdoctoral Fellowship (CRI Award #3435). D.A.T. stöds av Lustgarten Foundation Dedicated Laboratory for Pancreatic Cancer Research och Thompson Family Foundation. Tecknade serier skapades med Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape | 3M | 70200770819 | |
| Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2 | Ethicon | N267H | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 22974 | |
| AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole) | Vector Laboratories | SK-4200 | |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Anesthesia system | Molecular Imaging Products Co. | ||
| Acqknowledge software and sensors | BIOPAC | ACK100W, ACK100M, TSD110 | |
| Betadine spray | LORIS | 109-08 | |
| c-fms-EGFP (MacGreen) mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) | Invitrogen | 14-0451-82 | |
| CD68 Antibody | Abcam | ab125212 | |
| Curity gauze sponges | Covidien | ||
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6885 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab97064 | |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab102182 | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Two-part, 10:1 mixing ratio |
| Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness | Electron Microscopy Sciences | 72296-08 | |
| Ender-3 Pro 3D printer | Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD | ||
| Far Infrared Heated blanket | Kent Scientific | RT-0520 | |
| Fc Receptor Blocker | Innovex Biosciences | NB309 | |
| Fiji imaging processing package | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515) | Invitrogen | F8795 | |
| Gating system: | BIOPAC Systems Inc. | The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems. | |
| Acqknowledge software | ACK100W, ACK100M | ||
| Diff. Amp. Module, C Series | DA100C | ||
| Dual Gating Sys small animal | DTU200 | ||
| MP160 for Windows - Analysis system | MP160WSW | ||
| MouseOx Plus 120V | MOX-120V;015000 | ||
| Pressure Pad | TSD110 | ||
| Gelfoam | Pfizer | 9031508 | Absorbable gelatin sponge |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Two pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length |
| Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody | R&D Systems | AF3667 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 s |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc | BD | 324912 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | 502017 | |
| Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594 | Vector Laboratories | DL-1177-1 | |
| LysM-eGFP mice | www.mmrrc.org | 012039-MU | |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 | Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5153 | 1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length |
| MTS MiniBionix II 808 | MTS Systems | Servohydraulic material testing machine | |
| Neutrophil Elastase 680 FAST probe | PerkinElmer | NEV11169 | |
| Nitrogen | General Welding Supply Corp. | ||
| Oxygen | General Welding Supply Corp. | ||
| Polylactic acid filament | Hatchbox | 1.75 mm diameter | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36970 | |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra | NDC17033-211-38 | |
| Reflex 7 wound clips | Roboz Surgical | RS-9255 | |
| Stainless steel grid | Fotofab | One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square. | |
| Surface Treated SterileTissue Culture Plates | Fisher Scientific | FB012929 | Lid used as curing surface for imaging windows |
| TriM Scope Multiphoton Microscope | LaVision BioTec | Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: T560LP T665LPXXR T495lxpr |
|
| Vetbond | 3M | 70200742529 | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48404-453 |
References
- Dondossola, E., et al. Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone. Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).
- Haeger, A., et al. Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche. Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184 (2020).
- Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
- Eickhoff, S., et al. Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions. Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).
- Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
- Sammicheli, S., et al. Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses. Science Immunology. 1 (4), (2016).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
- Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. Recording the wild lives of immune cells. Science Immunology. 3 (27), (2018).
- Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), 29917 (2014).
- Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818 (2016).
- Anderson, T. L. Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , CRC Press, Taylor & Francis Group. Florida. (2005).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088 (2013).
- Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
- Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
- Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. Intravital. 5 (1), 1125562 (2016).
- Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
