Summary
Burada, doğrudan ilgilenilen dokuya/organa ve cilde yapıştırılabilen optik olarak net, silikon pencereler kullanılarak uzun süreli intravital görüntüleme için bir yaklaşım sunulmuştur. Bu pencereler şu anda sahada kullanılan diğerlerinden daha ucuz ve çok yönlüdür ve cerrahi yerleştirme hayvanlarda sınırlı iltihaplanma ve sıkıntıya neden olur.
Abstract
İntravital mikroskopi (IVM), hücre hareketinin, bölünmesinin ve ölümünün tek hücre çözünürlüğünde görselleştirilmesini sağlar. Cerrahi olarak yerleştirilmiş görüntüleme pencerelerinden IVM özellikle güçlüdür, çünkü aynı dokunun günler ila haftalar boyunca uzunlamasına gözlemlenmesine izin verir. Tipik görüntüleme pencereleri, farenin derisine dikilmiş biyouyumlu metal bir çerçevede cam bir kapak kaymasından oluşur. Bu pencereler farelerin serbest dolaşımına müdahale edebilir, güçlü bir enflamatuar yanıt ortaya çıkarabilir ve herhangi biri ötenazi gerektirebilecek kırık cam veya yırtık dikişler nedeniyle başarısız olabilir. Bu sorunları ele almak için, uzun süreli abdominal organ ve meme bezi görüntüleme pencereleri, daha önce kranial görüntüleme pencereleri için kullanılan optik olarak berrak bir silikon polimer olan ince bir polidimetilsiloksan (PDMS) filminden geliştirilmiştir. Bu pencereler doğrudan dokulara yapıştırılabilir ve bu da yerleştirme için gereken süreyi azaltır. PDMS esnektir ve zaman içinde farelerde dayanıklılığına katkıda bulunur - 35 güne kadar test edilmiştir. Uzunlamasına görüntüleme, aynı doku bölgesinin ayrı seanslar sırasında görüntülenmesidir. Aynı bölgeyi lokalize etmek için pencerelerin içine paslanmaz çelik bir ızgara yerleştirildi ve dinamik süreçlerin (meme bezi evrimi gibi) aynı yerlerde, günler arayla görselleştirilmesine izin verildi. Bu silikon pencere aynı zamanda zamanla mikro-metastazlara dönüşen tek yayılmış kanser hücrelerinin izlenmesine de izin verdi. Bu çalışmada kullanılan silikon pencerelerin yerleştirilmesi metal çerçeveli cam pencerelere göre daha basittir ve görüntülenen dokuların sınırlı iltihaplanmasına neden olur. Ayrıca, gömülü ızgaralar, tekrarlanan görüntüleme oturumlarında aynı doku bölgesinin doğrudan izlenmesini sağlar.
Introduction
İntravital mikroskopi (IVM), anestezi uygulanan hayvanlarda dokuların görüntülenmesi, bozulmamış dokularda hücresel çözünürlükte fizyolojik ve patolojik olayların dinamikleri hakkında fikir verir. Bu tekniğin uygulamaları büyük ölçüde değişmektedir, ancak IVM, kanser hücrelerinin dokuları nasıl istila ettiğini ve metastaz yaptığını, çevredeki mikro çevre ile etkileşime girdiğini ve ilaçlara nasıl yanıt verdiğini aydınlatmaya yardımcı olmak için kanser biyolojisi alanında etkili olmuştur 1,2,3. Ek olarak, IVM, ex vivo profilleme yaklaşımlarına (örneğin, akış sitometrisi) tamamlayıcı içgörüler sağlayarak bağışıklık tepkilerini yöneten karmaşık mekanizmaların anlaşılmasını ilerletmenin anahtarı olmuştur. Örneğin, intravital görüntüleme deneyleri, hücre göçü ve hücre-hücre teması ile ilgili olarak bağışıklık fonksiyonları hakkında ayrıntıları ortaya çıkarmış ve yaralanma veya enfeksiyona yanıt olarak uzaysal zamansal dinamikleri ölçmek için bir platform sunmuştur 4,5,6,7. Bu süreçlerin birçoğu histolojik boyama yoluyla da incelenebilir, ancak yalnızca IVM dinamik değişikliklerin izlenmesine izin verir. Aslında, histolojik bir kesit belirli bir zamanda dokunun anlık görüntüsünü sunarken, intravital görüntüleme zaman içinde aynı doku içindeki hücreler arası ve hücre altı olayları izleyebilir. Özellikle, floresan etiketlemesindeki ilerleme ve moleküler muhabirlerin gelişimi, moleküler olayların proliferasyon, ölüm, hareketlilik ve diğer hücrelerle veya hücre dışı matriks ile etkileşim gibi hücresel davranışlarla ilişkilendirilmesine izin vermiştir. Çoğu IVM tekniği, ışık saçılması nedeniyle daha derin dokuların görüntülenmesini zorlaştıran floresan mikroskopiye dayanmaktadır. Bu nedenle, ilgilenilen dokunun sıklıkla invaziv ve terminal bir prosedürle cerrahi olarak maruz bırakılması gerekir. Böylece, organ bölgesine bağlı olarak, doku birkaç ila 40 saat8 arasında değişen bir süre boyunca sürekli olarak görüntülenebilir. Alternatif olarak, kalıcı bir görüntüleme penceresinin cerrahi olarak yerleştirilmesi, aynı dokunungünler ila haftalar 7,9 arasında sırayla görüntülenmesine izin verir.
Yeni görüntüleme pencerelerinin geliştirilmesi, intravital görüntüleme yaklaşımlarını daha da geliştirmek için teknolojik bir ihtiyaç olarak vurgulanmıştır10. Prototipik intravital görüntüleme penceresi, dikişlerle cilde sabitlenmiş cam bir örtü içeren metal bir halkadır11. Serbest dolaşıma müdahale, eksüda birikimi ve cam kapak kaymasının zarar görmesi, bu tür pencerelerin kullanılmasında görülen yaygın sorunlardır. Dahası, prototipik pencere özel üretim gerektirir ve cerrahi prosedür kapsamlı bir eğitim gerektirebilir. Bu sorunları ele almak için, daha önce beyin12'de uzun süreli görüntüleme için kraniyal pencerelerde kullanılan bir silikon polimer olan polidimetilsiloksan (PDMS), abdominal organ ve meme bezi görüntülemesinde kullanılmak üzere uyarlanmıştır. Burada, PDMS tabanlı silikon pencereler oluşturmak için, aynı doku bölgelerinin tekrarlanan görüntülenmesi için işaretler sağlamak üzere pencerenin paslanmaz çelik bir ızgaranın etrafına nasıl döküleceği de dahil olmak üzere ayrıntılı bir yöntem sunulmaktadır. Ayrıca, pencerenin karın organlarının veya meme bezinin üzerine yerleştirilmesi için basit, dikişsiz bir cerrahi prosedür tanımlanmıştır. Bu yeni yaklaşım, şu anda kullanılan görüntüleme pencereleriyle ilgili en yaygın sorunlardan bazılarının üstesinden gelir ve uzunlamasına intravital görüntülemenin erişilebilirliğini artırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Açıklanan tüm prosedürler Cold Spring Harbor Laboratuvarı Cerrahi Kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Cold Spring Harbor Laboratuvarı'ndaki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Silikon pencerenin dökümü
- Baz elastomeri ve kürleme maddesini 10:1 (v/v) oranında karıştırarak silikon polimeri (PDMS) hazırlayın.
- Steril, pürüzsüz bir yüzeye az miktarda PDMS koyarak bir pencere açın ve hacim-alan oranını istenen kalınlığa ayarlayın.
NOT: 24 kuyu plakalı kapağın kapağındaki 22 mm çaplı bir daire için 200 mg polimer çözeltisinin kullanılması, pencere sağlamlığı ile optik netlik arasında iyi bir uzlaşma sağlar. - İsteğe bağlı: Aynı doku bölgelerinin tekrar tekrar görüntülenmesi için işaretler sağlamak amacıyla, PDMS istenen döküm yüzeyine geldikten sonra paslanmaz çelik bir ızgarayı silikonun içine hafifçe bastırın.
- Hava kabarcıklarını gidermek için, kaplanmış yüzeyi polimerin gazını gidermek üzere 45 dakika boyunca vakumlu bir kurutucuya yerleştirin.
- Silikon pencereleri 80 °C'de bir fırında 45 dakika kürleyin.
- Polimeri kalıbın kenarlarında puanlayın ve kürlenmiş pencereleri forseps ile döküm için kullanılan yüzeyden yavaşça soyun.
- Ameliyattan önce, pencereleri otoklavlama ile sterilize edin.
2. Fareyi silikon pencerenin yerleştirilmesi için hazırlama
- Fareyi bir indüksiyon odasında %4 (v/v) izofluran kullanarak anestezi altına alın. Fareyi ameliyat masasındaki bir ısıtma pedine getirin, fareyi anestezi burun maskesine yerleştirin ve ameliyat boyunca bakım için izofluran konsantrasyonunu% 2'ye düşürün.
- Arka bacakların ayak parmaklarını sıkıştırarak anestezi derinliğini kontrol edin. Fare devre dışı kalana ve ayak parmağını sıkıştırma refleksi tepkisi göstermeyene kadar devam etmeyin.
- Kurumasını önlemek ve travmayı önlemek için gözlere oftalmik kayganlaştırıcı uygulayın.
- Preemptif analjezi (buprenorfin 0.05 mg/kg) deri altından uygulanır.
- Ameliyat bölgesini tıraş edin ve bir epilasyon kremi ile tüyleri tamamen çıkarın.
- Cerrahi bölge enfeksiyonunu önlemek için povidon-iyot çözeltisi (% 10 v / v) ve etanol (% 70 v / v) art arda 3x uygulayın.
3. Karaciğerde görüntüleme için bir ventral pencere yerleştirmek; diğer karın organları için uyarlanabilir (Şekil 1)
- Fareyi sırtüstü konuma getirin.
- Steril makas ve forseps kullanarak ksifoid işlemden 3 mm aşağıya doğru 10 mm'lik bir kesi yapın.
- Orta hat boyunca cildin 1–1,5cm2'lik bir bölümünü çıkarın.
- Periton bölümünün cilt bölümünden biraz daha küçük bir bölümünü çıkarmak için ikinci bir çift steril makas ve forseps kullanın.
- İsteğe bağlı: Karaciğerin daha büyük bir bölümünü görselleştirmek için, karaciğeri diyaframa bağlayan falsiform ligamenti ortaya çıkaran karaciğeri diyaframdan aşağı itmek için steril salin ile nemlendirilmiş steril pamuklu çubuklar kullanın. İnferior vena kavayı kesmemeye özen göstererek bağı kesin.
- Cerrahi yapıştırıcıyı 31 G'lık bir şırınga ile çekin, görüntülenecek alanın kenarları etrafındaki karaciğer yüzeyine az miktarda uygulayın. Bu yapıştırıcı, görüntüleme için orta alanı sağlam bırakan dairesel bir sızdırmazlık oluşturur.
DİKKAT: Yapıştırıcıyı, görüntüleme alanının etrafında dairesel bir desen oluşturan küçük damlacıklarla sınırlandırın. Yapıştırıcı ile hemen temas eden doku görüntülenemez. Yapıştırıcıyı uygulamadan önce dokuyu kurutmak gerekli değildir.
NOT: Bu prosedür için herhangi bir siyanoakrilat bazlı yapıştırıcı başarıyla kullanılabilir. Cerrahi yapıştırıcı sterilite sağlar. Terminal prosedürleri için, çok amaçlı süper yapıştırıcılar iyi sonuçlar verir. - Forseps kullanarak pencereyi konumlandırın ve yapıştırıcı kuruyana kadar (~ 2 dakika) karaciğere sıkıca tutun.
- Pencerenin kenarlarını periton altına katlayın.
- Bir şırınga ile, şimdi periton altında bulunan pencerenin kenarlarına az miktarda cerrahi yapıştırıcı koyun. Pencereye sabitlemek için forsepslerle periton üzerinde aşağı doğru itin.
- Benzer şekilde, peritona sabitlemek için forseps ile cilde bastırmadan önce periton üzerine az miktarda cerrahi yapıştırıcı koyun.
NOT: Doğru şekilde gerçekleştirilirse, karaciğer dokusunun dairesel bir alanı artık pencereden görülebilmelidir. - Cildin pencerenin üzerinde tekrar büyümesini önlemeye yardımcı olacak bir jant oluşturmak için pencerenin kenarlarına yapıştırıcı uygulayın.
DİKKAT: İşlem steril cerrahi teknikler kullanılarak gerçekleştirilirse ve pencere yerleştirilmeden önce sterilize edilirse, yaranın cerrahi yapıştırıcı ile kapatılması enfeksiyonları önlemek için yeterlidir. Bununla birlikte, cerrahi yerleştirme sırasında uygun aseptik tekniklerin izlenmemesi veya kusurlu kapanma, açık veya subklinik enfeksiyona ve dokudan kurumaya neden olabilir.
4. Karaciğerde görüntüleme için yanal bir pencere yerleştirilmesi; portal vendeki kanser hücrelerinin eşzamanlı enjeksiyonu ile uyumlu (Şekil 2)
- Fareyi sol lateral decubitus pozisyonuna yerleştirin
- Steril makas ve forseps kullanarak kostal kemerin 3 mm altında sağ kanatta 10 mm'lik bir kesi yapın.
- Cildin 1cm2'lik bir bölümünü çıkarın.
- Periton bölümünün cilt bölümünden biraz daha küçük bir bölümünü çıkarmak için ikinci bir çift steril makas ve forseps kullanın.
- Cerrahi yapıştırıcıyı 31 G'lık bir şırınga ile çekin, görüntülenecek alanın kenarları etrafındaki karaciğer yüzeyine az miktarda uygulayın.
DİKKAT: Yapıştırıcıyı, görüntüleme alanının etrafında dairesel bir desen oluşturan küçük damlacıklarla sınırlandırın. Yapıştırıcı ile hemen temas eden doku görüntülenemez.
NOT: Bu prosedür için herhangi bir siyanoakrilat bazlı yapıştırıcı başarıyla kullanılabilir. Cerrahi yapıştırıcı sterilite sağlar. Terminal prosedürleri için, çok amaçlı süper yapıştırıcılar iyi sonuçlar verir. - Forseps kullanarak pencereyi konumlandırın ve yapıştırıcı kuruyana kadar (~ 2 dakika) karaciğere sıkıca tutun.
- Pencerenin kenarlarını periton altına katlayın.
- Bir şırınga ile, şimdi periton altında bulunan pencerenin kenarlarına az miktarda cerrahi yapıştırıcı koyun. Pencereye sabitlemek için forsepslerle periton üzerinde aşağı doğru itin.
- Benzer şekilde, peritona sabitlemek için forseps ile cilde bastırmadan önce periton üzerine az miktarda cerrahi yapıştırıcı koyun.
NOT: Doğru şekilde gerçekleştirilirse, karaciğer dokusunun dairesel bir alanı artık pencereden görülebilmelidir. - Cildin pencerenin üzerinde tekrar büyümesini önlemeye yardımcı olacak bir jant oluşturmak için pencerenin kenarlarına yapıştırıcı uygulayın.
- Portal ven enjeksiyonu gerekiyorsa:
- Fareyi sırtüstü konuma getirin.
- Derideki ksifoid süreçten başlayarak 10 mm'lik bir kesi yapın.
- İkinci bir çift steril makas ve forseps kullanarak, peritonda 10 mm'lik bir kesi yapın.
- İki pamuklu çubuğu steril salin içine batırın.
- Bağırsağı steril salin ile nemlendirilmiş steril gazlı bez üzerine nazikçe çekmek için pamuklu çubukları kullanın, oryantasyonu bükmemeye veya başka bir şekilde üzmemeye dikkat edin.
- Portal ven karnın sağ tarafında görünene kadar bağırsağı karın boşluğundan çıkarmaya devam edin.
- Portal venin karaciğere giriş noktasına 31–33 G iğne 5–7 mm'lik bir kaudal yerleştirin, kan damarı içinde ilerlediğinizden emin olun, içinden geçmediğinizden emin olun.
- Kanser hücrelerini yavaşça enjekte edin (100 μL steril PBS'de yeniden askıya alınır).
NOT: Bu deney için amurin pankreas kanseri hücre hattı (örneğin, KPC-BL / 6-1199) tam DMEM ortamında kültürlenebilir ve 100 μL steril PBS'ye enjekte edilen 1 x 105 hücre. - Kanamayı önlemek için, iğneyi çektikten hemen sonra, enjeksiyon bölgesine 1-2 dakika boyunca küçük bir cerrahi sünger parçası ile hafif bir baskı uygulayın.
- Basınç serbest bırakıldıktan sonra, hemostazı sağlamak için bölgeyi 1-2 dakika izleyin.
- Nemlendirilmiş pamuklu çubuklar kullanarak, organın fizyolojik yönelimini takiben bağırsağı karın boşluğuna geri döndürün.
- Steril forseps kullanarak, pencereyi periton altına, farenin karın boşluğunun sol tarafına yerleştirin.
- 4-0 ipek dikişle sütür ve 7 mm paslanmaz çelik sargı klipsleri ile orta hat kesisini zımbalayın.
- Fareyi sol lateral decubitus konumuna getirin
- Steril makas ve forseps kullanarak kostal kemerin 3 mm altında sağ kanatta deriden 10 mm'lik bir kesi yapın.
- Kesinin etrafındaki cildin 1cm2'lik bir bölümünü çıkarın.
- Periton bölümünün cilt bölümünden biraz daha küçük bir bölümünü çıkarmak için ikinci bir çift steril makas ve forseps kullanın.
- 4.8-4.10 adımlarında açıklandığı gibi, pencereyi yerine yapıştırmadan önce karaciğerin üzerine çekin.
5. Pankreasta görüntüleme için pencerenin yerleştirilmesi (Şekil 3)
- Fareyi sağ lateral decubitus pozisyonuna getirin.
- Sol kanatta kostal kemerin 3 mm altında steril makas ve forseps kullanarak 10 mm'lik bir kesi yapın.
- Kesinin etrafındaki cildin 1cm2'lik bir bölümünü çıkarın.
- Periton bölümünün cilt bölümünden biraz daha küçük bir bölümünü çıkarmak için ikinci bir çift steril makas ve forseps kullanın.
- Steril salin ile ıslatılmış steril pamuklu çubuklar kullanarak, pankreası görselleştirmek için dalağı yavaşça çekin. Kesi boyunca daha fazla yüzey alanı görünür hale getirmek için pankreası nemlendirilmiş pamuklu çubuklarla yeniden konumlandırmaya devam edin.
NOT: Bu noktada, pankreas kanseri hücreleri, deneysel tasarımın bir parçasıysa, pankreasa ortopik olarak enjekte edilebilir. - Cerrahi yapıştırıcıyı 31 G'lık bir şırınga ile çekin, görüntülenecek alanın kenarları etrafındaki pankreasın yüzeyine az miktarda uygulayın.
DİKKAT: Yapıştırıcıyı, görüntüleme alanının etrafında dairesel bir desen oluşturan küçük damlacıklarla sınırlandırın. Yapıştırıcı ile hemen temas eden doku görüntülenemez. - Forseps kullanarak pencereyi konumlandırın ve yapıştırıcı kuruyana kadar (~ 2 dakika) pankreasa sıkıca tutun.
- Pencerenin kenarlarını periton altına katlayın.
- Bir şırınga ile, şimdi periton altında bulunan pencerenin kenarlarına az miktarda cerrahi yapıştırıcı koyun. Pencereye sabitlemek için forsepslerle periton üzerinde aşağı doğru itin.
- Benzer şekilde, peritona sabitlemek için forseps ile cilde bastırmadan önce periton üzerine az miktarda cerrahi yapıştırıcı koyun.
NOT: Doğru şekilde gerçekleştirilirse, pankreas dokusunun dairesel bir alanı artık pencereden görülebilmelidir. - Cildin pencerenin üzerinde tekrar büyümesini önlemeye yardımcı olacak bir jant oluşturmak için pencerenin kenarlarına yapıştırıcı uygulayın.
6. Meme bezinde görüntüleme için pencerenin yerleştirilmesi (Şekil 4)
- Fareyi sırtüstü pozisyona getirin.
- Steril makas ve forseps kullanarak kasık meme uçlarından birine medial 10 mm'lik bir kesi yapın.
- Meme bezinin üzerindeki cildin 0,5cm2'lik bir bölümünü çıkarın.
- Yapışmayı bozmak için makası iki yüzey arasına yayarak meme bezini ciltten dikkatlice ayırmak için ikinci bir çift steril makas kullanın.
NOT: Kasık meme bezi alanının görüntülenmesini kolaylaştırmak için, memeli bezin üzerindeki cildin bir kısmını diseke etmeye dikkat edin, ancak arka bacaktan daha üstündür, böylece pencere farenin hareketliliğini sınırlamaz. - Cerrahi yapıştırıcıyı 31 G'lık bir şırınga ile çekin, görüntülenecek alanın kenarları etrafındaki meme bezinin yüzeyine az miktarda uygulayın.
DİKKAT: Yapıştırıcıyı, görüntüleme alanının etrafında dairesel bir desen oluşturan küçük damlacıklarla sınırlandırın. Yapıştırıcı ile hemen temas eden doku görüntülenemez. - Forseps kullanarak pencereyi konumlandırın ve yapıştırıcı kuruyana kadar (~ 2 dakika) meme bezine sıkıca tutun.
NOT: Doğru yapıldığında meme bezi dokusunun dairesel bir alanı artık pencereden görülebilmelidir. - Pencerenin kenarlarını cildin altına katlayın.
- Bir şırınga ile, şimdi cildin altında bulunan pencerenin kenarlarına az miktarda cerrahi yapıştırıcı koyun. Cildi pencereye sabitlemek için forseps ile cildi aşağı doğru itin.
- Cildin pencerenin üzerinde tekrar büyümesini önlemeye yardımcı olacak bir jant oluşturmak için pencerenin kenarlarına yapıştırıcı uygulayın.
7. Ameliyat sonrası iyileşme
- Fareyi, geniş yuvalama malzemesine sahip temiz bir kurtarma kafesine yerleştirin ve kafesin bir kısmının bir ısıtma yastığı üzerinde durduğundan emin olun.
- Fareyi bilinçli ve hareketli olana kadar sürekli izleyin.
- Gerekirse, önleyici dozdan 12 saat sonra ek bir analjezik dozu sağlayın.
NOT: Ek analjezi genellikle gereksizdir, ancak fare sıkıntı belirtileri gösteriyorsa (kambur sırt, dağınık kürk veya yiyeceğe olan ilginin kaybolması gibi) bir veterinere danışın. Fareyi ameliyattan sonraki ilk 3 gün boyunca enfeksiyon belirtileri veya diğer olumsuz etkiler açısından günlük olarak izleyin. Farelerin% 2'sinden azı, tipik olarak pencerenin kısmen ayrılması nedeniyle veteriner dikkati veya ötenazi gerektirir. Ventral karaciğer görüntüleme pencerelerine sahip erkek fareler için, fareler arasındaki kavganın pencerelerin ayrılmasıyla sonuçlanabileceğine dikkat etmek önemlidir. Bu, fareleri ayrı ayrı barındırarak önlenir.
8. Pencereden görüntüleme
- Fareyi bir indüksiyon odasında %4 (v/v) izofluran kullanarak anestezi altına alın.
- Kurumasını önlemek ve travmayı önlemek için gözlere oftalmik kayganlaştırıcı uygulayın.
- Fareyi indüksiyon odasından mikroskop aşamasına getirin. Fareyi anestezi burun maskesine yerleştirin ve görüntüleme prosedürü boyunca idame anestezisi için izofluran konsantrasyonunu yaklaşık% 1-1.5'e düşürün.
- Nefes alma hızını izlemek için farenin altına bir basınç yastığı sensörü yerleştirin ve yumuşak cerrahi bant kullanarak fareyi sahneye sabitleyin.
- Görüntüleme oturumu boyunca vücut sıcaklığını izlemek için bir rektal termometre takın.
- Isıtılmış pedi açın, vücut sıcaklığının 37 ° C'yi geçmemesini sağlamak için fareyi yakından izleyin.
- Farenin nefes hızını izlemek için yazılımı kullanın. En uygun hız ~ 1 nefes / saniyedir. Anesteziyi gerektiği gibi ayarlayın.
- Her görüntüleme seansından önce, pencereyi herhangi bir artık lens daldırma ortamından ve kalıntılarından, %70 etanol (v/v) içine batırılmış bir pamuklu çubukla nazikçe silerek temizleyin.
- Bir suya daldırma lensi kullanırken, kabarcıklardan kaçınarak pencereye ultrason jeli uygulayın.
NOT: Damıtılmış su da kullanılabilir, ancak görüntüleme sırasında yeniden uygulanması gerekebilir. - Görüntüleme için en uygun derinliği bulmak için, önce ızgarayı bulun ve odağa yerleştirin.
- Izgaranın alt kısmını 0 olarak ayarlayarak yaklaşık doku görüntüleme derinliğini belirleyin. Bu bilgi, sonraki görüntüleme oturumlarında karşılık gelen z düzlemini bulmak için gereklidir.
- Birden fazla görüntüleme oturumunda aynı konumu tanımlamak için, ızgaradaki kareleri referans noktası olarak kullanın. Görüntüleme sırasında, görüntülenen her görüş alanının ızgarası içindeki ızgaranın yönünü ve konumunu not edin (örneğin, üstten 2. sıra, soldan 4. kare).
- Ardışık görüntüleme oturumları sırasında, belirli ızgara alanlarına ve dolayısıyla görüntüleme alanlarına geri dönmek için ızgarayı kullanın.
- Her görüntüleme seansını takiben, pencereyi %70 etanol (v/v) içine batırılmış pamuklu çubukla nazikçe silerek artık lens daldırma ortamını ve kalıntılarını temizleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Görüntüleme pencereleri aracılığıyla intravital görüntüleme, saatler ila haftalar boyunca tek hücre çözünürlüğünde çok çeşitli hücresel ve moleküler olayları gözlemlemek, izlemek ve ölçmek için kullanılabilir. Bir görüntüleme penceresi için ideal özellikler şunlardır: a) farenin refahı ve dokunun fizyolojisi üzerinde sınırlı etki; b) dayanıklılık; c) yerleştirme kolaylığı; ve d) aynı bölgenin tekrar tekrar görüntülenmesi için açık yer işaretleri. Sonuç, kolayca üretilebilen ve yerleştirilebilen ve birkaç görüntüleme seansı boyunca aynı görüş alanını bulmak için bir ızgara ile donatılabilen çok yönlü, inert bir silikon penceredir.
Pencere, ucuz, esnek ve berrak bir malzeme olan PDMS'den yapılmıştır. Pencereler, çoğu laboratuvar için yaygın olarak satın alınabilen malzemelerle dökülebilir. Bu amaçlar için, ticari olarak temin edilebilen 24 kuyu plakasının kapağına zaten kazınmış olan dairesel kalıplar (22 mm çapında) iyi çalışır. Birim alan başına kullanılan polimer miktarını değiştirerek, pencerenin kalınlığını ayarlamak mümkündür. Pencerenin kalınlığının görüntüleme çözünürlüğü üzerindeki etkisini belgelemek için, 40 nm floresan mikrosferlerin nokta yayılma fonksiyonu (PSF) analizi, farklı kalınlıklardaki PDMS pencereleri aracılığıyla görüntülemeyi, tipik olarak intravital görüntüleme pencereleri (0.17 mm kalınlığında) için kullanılan cam kapaklarla karşılaştırmak için gerçekleştirildi. İntravital görüntüleme için kullanılan kurulumu çoğaltmak için, PSF görüntüleme, daldırma ortamı olarak uygulanan ultrason jeli ile aynı iki foton mikroskobu ve su daldırma lensi kullanılarak gerçekleştirildi.
PSF'nin yanal düzlemlere oturtulmasıyla hesaplanan sinyal yoğunluğunun Yarım Maksimumda Tam Genişliği (FWHM), 100 mg PDMS ile dökülen PDMS pencereleri için camınkiyle karşılaştırılabilir (Şekil 5A, B). Cam kapaklara kıyasla yanal çözünürlük, 150-250 mg PDMS ile dökülen pencereler için azaltılmıştır (Şekil 5A, B). Z ekseni görüntü düzleminde, 100-200 mg polimer ile dökülen PDMS pencereleri, cam kapaklardan daha iyi performans gösterdi (Şekil 5C). 300 mg PDMS ile dökülen pencerelerde optik netlik kaybolmuş ve ölçümler güvenilmez hale gelmiştir (Şekil 5A-C). FWHM değerlerinin X / Y oranı, cam ve herhangi bir kalınlıktaki PDMS arasında anlamlı bir farklılık göstermemiştir, ancak 200-250 mg polimer ile dökülen pencereler için oran, daldırma ortamı olarak ultrason jeli kullanılarak özellikle 1'den sapmıştır (Şekil 5D). Bununla birlikte, 200 mg'lık pencere dökümü için daldırma ortamı olarak su kullanıldığında, simetriden sapma çok daha az belirgindi. Bu kalınlıkta, polimerdeki sapmalardan kaynaklanan sapmalar bu nedenle muhtemelen küçüktür. Her mikrosfer için pik floresan yoğunluk değerleri de toplandı ve en yüksek sinyal cam yoluyla kaydedilmesine rağmen, cam ve PDMS'nin karşılaştırılabilir bir şekilde performans gösterdiğini gösterdi (Şekil 5I). PDMS penceresinin optimum kalınlığı, belirli uygulamalara ve görüntüleme sistemlerine bağlı olacaktır. Çoğu amaç için, 22 mm çapında dairesel bir pencere için 200 mg polimer çözeltisi, pencere sağlamlığı ve optik netlik arasında en uygun uzlaşmadır. Gerçekten de, 200 mg'dan daha az olan pencereler, cama benzer FWHM değerleri ile optik olarak daha açıktı, ancak cerrahi implantasyon sırasında bazen yırtılırken, 200 mg (>100 farede) kullanılarak hiçbir pencere hasarı örneği gözlenmedi.
Malzeme özelliklerindeki bu farklılıkları ölçmek için, PDMS pencereleri (200 mg ve 150 mg), malzeme arızasına kadar 1N/s yük kontrol profili altında bir servohidrolik malzeme test cihazına yüklenmiştir (Şekil 5J). Kuvvet ve yer değiştirme değerleri 100 Hz frekansta ölçüldü. Kuvvet-yer değiştirme verileri daha sonra denklemler kullanılarak gerilim-gerinime dönüştürüldü:
σ = F / A (1)
Ɛ = Δ L / L0 (2)
Burada σ gerilim (Pa), F kuvvet (N), A pencerenin kesit alanı, Ɛ gerinim, ΔL yer değiştirmedir ve L0 pencerenin kalınlığıdır. Malzemenin tokluğu, gerilim-gerinim eğrisi altındaki toplama alanı hesaplanarak belirlendi. Bir malzemenin tokluğu, plastik olarak deforme olma ve kırılmadan önceki süreçte enerjiyi emme kabiliyetini ifade eder - implante edilmiş pencereler13 için önemli bir özellik. Görüntüleme deneyleri sırasındaki gözlemlerle uyumlu olarak, 200 mg PDMS ile dökülen pencereler, 150 mg ile dökülen pencerelerden önemli ölçüde daha fazla tokluğa sahiptir (Şekil 5K) ve bu nedenle kırılmaya daha az eğilimlidir.
Daha sonra, 200 mg ile dökülen tercih edilen PDMS pencerelerinin Young Modülü (E) belirlendi ve gerilme-gerinim eğrisinin doğrusal bölgesini çıkararak ve Hooke yasasını kullanarak eğimi belirleyerek standart cam kapaklarınkiyle karşılaştırıldı:
σ = EƐ (3)
Young'ın cam pencerelerin modülü PDMS'den önemli ölçüde daha büyüktü, çünkü cam malzeme mukavemetinde PDMS'den çok daha sertti (Şekil 5L). Bu nedenle, cam daha büyük Young modülüne dayanan daha güçlü bir malzeme olmasına rağmen, 200 mg PDMS pencerelerinin daha fazla tokluğu, kırılma riski olmadan ve ikinci bir cerrahi prosedür veya ötenazi gerektirmeden daha uzun süre uygulanabileceklerini desteklemektedir.
Silikon pencerelerin en büyük avantajı çok yönlülüktür. Daha da önemlisi, pencereyi cerrahi olarak yerleştirme prosedürü, farklı anatomik yerlere kolayca uyarlanabilir. Pencerelerin cerrahi makasla kolayca yeniden boyutlandırılabilmesi ve pencerelerin ilgilenilen doku/organ yüzeyine ve cilde yapıştırılarak dikiş ihtiyacını tamamen ortadan kaldırması ile ameliyata adaptasyonlar kolaylaştırılmıştır. Pencerelerin bu şekilde başarılı bir şekilde yerleştirilmesi karaciğer, pankreas ve meme bezi için sağlanmıştır (Şekil 6A-C). Özellikle, karaciğer görüntülemesi için ventral veya lateral pencereleri implante etmek için iki farklı protokol geliştirilmiştir. Şekil 1'de ventral pencere ekleme adımları gösterilmektedir. Bu prosedür diğer karın organları için uyarlanabilir ve en büyük görüntülenebilir yüzey alanını verecektir. Bununla birlikte, büyük (>1cm2) görüntülenebilir bir alan gerekmediği sürece, farenin sağ kanadına yanal bir pencere yerleştirmek (Şekil 2), örneğin solunum ve peristalsis nedeniyle hareket artefaktlarını azaltmak için tercih edilir. Ek olarak, lateral görüntüleme penceresinin yerleştirilmesi için cerrahi prosedür, karaciğer metastazı gelişimini deneysel olarak modellemek için portal vende eşzamanlı kanser hücrelerinin enjeksiyonu ile uyumludur. Böylece, fareler aynı hayvanda portal ven enjeksiyonu ve abdominal görüntüleme penceresi yerleştirme gerektiğinde iki ayrı prosedür yerine tek bir prosedürden geçebilirler. Farenin sol kanadındaki pankreasın üzerine bir pencere yerleştirmek için benzer bir prosedür kullanılır (Şekil 3). Pencere ayrıca deri altı dokulara, yani normal meme bezlerine ve ayrıca önceden kurulmuş spontan veya ortopik olarak nakledilmiş meme tümörlerine de yerleştirilebilir (Şekil 4). Alternatif olarak, kanser hücreleri, birincil tümörün gelişimini uzunlamasına takip etmek için pencereden meme bezine enjekte edilebilir, çünkü iğneler pencerenin bütünlüğünden ödün vermeden PDMS filmini delebilir.
Düşük ağırlıkları ve esneklikleri nedeniyle, silikon pencereler farenin hareketliliğini engellemez (Film 1). Böylece, silikon pencereler kırılganlık, karmaşık dikiş ve hayvan hareketliliği üzerindeki etki gibi cam pencerelerle ilişkili büyük engellerin üstesinden gelir. Bunun yerine, silikon pencerelerle ilişkili ana sınırlama, pencerenin altındaki epitelin yeniden büyümesidir. Bununla birlikte, uygun miktarda cilt çıkarıldığında ve yara yapıştırıcı ile tamamen kapatıldığında, yeniden epitelizasyon sınırlıdır ve görüntüleme uzun süre devam edebilir (35 güne kadar test edilmiştir, Şekil 6D). Pencereyi yerleştirdikten sonra, fare yaklaşık bir ay boyunca veya cerrahi yapıştırıcı başarısız olana veya yeniden epitelizasyon gerçekleşene kadar uzunlamasına görüntülenebilir. Kısa günlük görüntüleme seansları (~ 60 dakika) veya daha az sıklıkta ancak anestezi kaynaklı yan etkilerden kaçınmak için daha uzun görüntüleme seansları tercih edilir. Pencere taşıyan hayvanlar, standart prosedürler kullanılarak hem tek foton hem de çok fotonlu konfokal mikroskopi yoluyla herhangi bir intravital görüntüleme platformunda görüntülenebilir (bkz., örneğin, 14). Her görüntüleme seansından önce ve sonra, pencereyi% 70 etanol (v / v) içine batırılmış bir pamuklu çubukla silerek kir ve döküntülerden temizlemeniz önerilir.
Zaman içinde aynı yeri izlemek için, paslanmaz çelik ızgaralar pencerenin içine gömülebilir. Şekil 7A, burada kullanılan ısmarlama, lazerle kazınmış ızgaraların özelliklerini göstermektedir. İletim elektron mikroskobu için ticari şebekeler de bu uygulama için uygundur. Izgara, döküm işlemi sırasında pencerenin içine gömülür ve görüntüleme alanı üzerinde hem çıplak gözle (Şekil 7B) hem de mikroskopun okülerlerinden (Şekil 7C) açıkça görülebilir. Pencere organın yüzeyine yapıştırıldığından, görüntüleme alanlarının ızgaraya göre konumu sabittir. Görüntüleme sırasında, görüntülenen her görüş alanının ızgarası içindeki ızgaranın yönünü ve konumunu not edin (örneğin, üstten 2. sıra, soldan 4. kare). Ardından, ardışık görüntüleme oturumları sırasında belirli ızgara alanlarına ve dolayısıyla görüntüleme alanlarına geri dönmek için ızgarayı kullanın.
Izgara, örneğin solunum veya peristalsis nedeniyle doku yavaşça sürüklendiğinde bir görüntüleme oturumu sırasında görüntüleme alanını hizalamak için de yararlıdır. Sert kenarlı görüntüleme pencerelerinin çoğu, görüntüleme sırasında bir tutucuya bağlanabilir ve görüntüleme alanına stabilite katar. Esnek pencereler doğrudan stabilize edilemediğinden, pencereyi içeren vücut bölümünü stabilize etmek için cerrahi bant kullanılır ve görüntüleme alanı, belirli aralıklarla (tipik olarak her 30 dakikada bir) karşılık gelen ızgara karesinin veya önceden tanımlanmış doku işaretlerinin (örneğin, vasküler yer işaretleri) merkezine yeniden hizalanır. Görüş alanının mikroskobik kayması için daha fazla sapma düzeltmesi, elde etme sonrası aşamada, tespit edilen doku modellerine göre çerçeveleri yeniden hizalayan kod aracılığıyla dijital olarak gerçekleştirilir (Ek kod 1-2).
Pencerenin herhangi bir açık sistemik advers reaksiyona neden olmadığını doğrulamak için, pencere implantasyonu ve tedavi edilmemiş yaşa uygun kontroller geçiren hayvanların ağırlığı izlendi. Ameliyatla ilişkili ilk kilo kaybından sonra, pencereleri takılı olan farelerin çoğu zamanla kilo almaya devam eder ve bu da pencere yerleştirmenin iyi tolere edildiğini gösterir (Şekil 8A-C). Karaciğer ve meme bezi pencereleri için, ameliyattan sonraki 5 gün içinde normal kilo geri kazanılır. Ameliyat sonrası iyileşme, pencerenin pankreas üzerine implantasyonundan sonra daha yavaştır ve fareler 14 gün içinde ameliyat öncesi ağırlığa geri döner. Bu gözlem, ameliyat sırasında pankreasın manipülasyonu ile ilişkili beklenen etkilerle tutarlıdır. Kilo kaybının insancıl bitiş noktası eşiğine ulaşmadığı durumlarda bile, ameliyat öncesi vücut ağırlığını geri kazanamayan farelerin ( Şekil 8B'de * ile belirtilen fare tarafından örneklenen tüm farelerin% <5'i) tipik olarak görüntüleme deneylerinden sansürlendiğini unutmayın. Ek olarak, pencere yerleştirildikten sonra çeşitli zaman noktalarında belirlenen beyaz kan hücresi sayımları, kontrollere kıyasla hemen hemen hiçbir pencere taşıyan farede değişmedi ve zamanla önemli ölçüde değişmedi (Şekil 8D), pencerenin majör sistemik inflamasyona neden olmadığını düşündürmektedir.
Daha sonra, pencereye ve yapıştırıcıya lokal doku yanıtının derecesini değerlendirmek için, fareler histolojik analiz için pencerenin cerrahi olarak yerleştirilmesinden sonra 3, 14 ve 28'de (meme bezi pencereleri) veya 35 günde (karaciğer ve pankreas pencereleri) ötenazi yapıldı. Hematoksilin ve eozin (H&E) boyalı karaciğer kesitlerinin değerlendirilmesinde yüzeysel (20-80 μm), çoğu fare için pencerelerin altında minimal ila hafif kapsüler granülasyon dokusu oluşumu görüldü (3. günde değerlendirilen 3 fareden 2'si ve 14. günde değerlendirilen 3 fareden 2'si). Bu lezyonlar fokal (1-3 mm uzunluğunda) idi ve tutkal tabakasının genişliğine yaklaşık olarak karşılık geliyordu (Şekil 8E). 35 gün sonra, çoğu fare (iki ayrı deneyde değerlendirilen 6 kişiden 4'ü) granüler doku göstermezken, birkaçında (6'dan 2'si) orta derecede fokal kapsüler skleroz ve desmoplazi (25-250 μm derinlikte) vardı. İlginçtir ki, pankreasın yüzeyinde, dokuz farenin kohortunda herhangi bir zaman noktasında doğrudan pencerenin altında anlamlı bir lezyon gözlenmemiştir (Şekil 8G). Bununla birlikte, bazı fareler pankreasta atrofi alanları ve karın yağında (steatit) iltihaplanma alanları gösterdi ve manipülasyona bağlı hasarla tutarlı olarak ortaya çıktı. Meme bezi için, pencere implantasyonundan sonraki 3. günde, 3 fareden 3'ünde ya bezin yüzeyi boyunca görülebilen iyileştirici bir insizyonu andıran granülasyon dokusu ya da yağ dokusunda enflamatuar bir reaksiyon vardı; 14. günde, değerlendirilen 3 fareden 3'ünde granülasyon dokusu vardı. Bu lezyonlar yine fokal ve 1-3 mm uzunluğundaydı (Şekil 8I). Ameliyattan 28 gün sonra meme bezi pencereleri ötenazi yapılan farelerde belirgin bir histolojik anormallik görülmedi.
Bu analiz, pencerenin test edilen organların (karaciğer, pankreas, meme bezi) genel fizyolojik mimarisini tehlikeye atmadığını göstermektedir. Karaciğer yüzeyinde ve meme bezinde bulunan reaktif doku muhtemelen yapıştırıcıya bir reaksiyondu ve yapıştırıcı ile hemen temas halinde olan doku ile sınırlıydı. Normal doku, yapıştırıcıya maruz kalmayan bölgelerde reaktif dokuya bitişik (< 100 μm) kolayca bulunabilir (Şekil 8E, I) ve bu nedenle doku iltihabı, sağlıklı doku bölgelerinin görüntülenmesine müdahale etmez. Dahası, doku reaksiyonu muhtemelen geri dönüşümlüdür, çünkü çoğu fare (tüm doku konumlarında 9 fareden 8'i) geç zaman noktalarında (28 veya 35 gün) önemli bir lezyon göstermemiştir, ancak doku reaksiyonunun çözüldüğünün doğrudan doğrulanması, bireysel farelerde uzunlamasına ölçümler olmadan elde edilmesi zor olacaktır.
CD45, CD68 ve miyeloperoksidaz (MPO) için multipleks immünohistokimyasal boyama, sırasıyla lökositlerin, monositlerin / makrofajların ve nötrofillerin infiltrasyonunu karakterize etmek için de yapıldı. Granülasyon dokusu ve steatit ile ilişkili immün hücre infiltrasyonunda artış meme bezinde ve karaciğerde görüldü, ancak pankreasta görülmedi (Şekil 8F,H,J). Not olarak, bağışıklık hücresi infiltrasyonu son zaman noktalarında tedavi edilmeyen kontrollerinkiyle karşılaştırılabilir olduğu için bu değişiklikler muhtemelen geçiciydi (meme bezi pencereleri için 28 gün ve karaciğer ve pankreas pencereleri için 35 gün).
Karaciğer, pencere yerleştirme ve görüntülemenin görüntüleme kullanılarak önemli lokal immün infiltrasyona neden olup olmadığını daha da karakterize etmek için bölge olarak seçildi. Bunu yapmak için, miyeloid hücrelerin (çoğunlukla makrofajlar) yeşil bir floresan proteini ile etiketlendiği c-fms-EGFP (MacGreen) fareleri15 kullanılmıştır. Karaciğer pencereleri üç c-fms-EGFP faresine implante edildi ve aynı görüş alanını bulmak için ızgarayı kullanarak ameliyattan sonraki 1, 3 ve 5. günlerde görüntülendi. Görüntüleme alanında bulunan makrofajların sayısı, pencere yerleştirilmesini takiben zaman içinde önemli ölçüde değişmedi (Şekil 8K).
Daha sonra, pencere hücresel düzeyde (yani hareket, proliferasyon, hücre-hücre teması) ve doku seviyesinde (yani, pankreasta tümör büyümesi, meme bezi evrimi sırasında immün infiltrasyon ve karaciğer metastazları) çeşitli biyolojik süreçler görüntülenerek işlevsel olarak test edildi. Pankreas görüntüleme için kolay erişilebilir bir yer değildir. Pencerenin bu organdaki kanser hücresi dinamiklerini yakalamak için nasıl kullanılabileceğini göstermek için, pencereler, yaygın olarak kullanılan bir KPC'den (KrasLSL- G12D / +;p 53LSL-R172H; Pdx1-Cre) pankreas kanserinin genetiği değiştirilmiş fare modeli. Konfokal mikroskopi ile görselleştirilebilmesi için, KPC-BL / 6-1199 hücreleri, doksisiklin ile indüklenebilir gelişmiş GFP'yi (iGFP-1199 hücreleri) eksprese edecek şekilde tasarlanmıştır. Enjeksiyondan altı gün sonra, fareler pankreas kanseri hücrelerinde yeşil floresan proteininin (GFP) ekspresyonunu tetiklemek için bir doksisiklin diyetine tabi tutuldu. Şekil 9 , enjeksiyon ve pencere yerleştirmeyi takiben 11. ve 14. günlerde iGFP-1199 hücreleri ile ortopik olarak enjekte edilen bir fareden temsili görüntüleri göstermektedir. Film 2, iGFP-1199 tümör kenarını, pencere yerleştirildikten sonraki 11. günde 2 saatlik bir görüntüleme oturumunun bir alıntısında gösterir ve silikon pencereleri kullanarak pankreastaki hücre zarı projeksiyonunun dinamiklerini yakalama yeteneğini gösterir.
Silikon pencere, zaman içinde dinamik bağışıklık hücresi infiltrasyonunu yakalamak için de kullanılabilir. Bunu göstermek için, meme bezi pencereleri emziren ACTB-ECFP (Tg (CAG-ECFP) CK6Nagy) içine yerleştirildi; LysM-eGFP (Lyz2tm1.1Graf) fareleri sütten kesildikten hemen sonra. Bu farelerde, tüm hücreler, ancak en yüksek epitel hücreleri, beta aktin promotörü tarafından tahrik edilen camgöbeği floresan proteinini (CFP) eksprese eder ve miyeloid hücreler - öncelikle nötrofiller, aynı zamanda makrofajlar - lizozim M promotörü tarafından tahrik edilen eGFP tarafından etiketlenir. Fareler, pencere yerleştirildikten sonraki 2. ve 4. günlerde, meme bezi evrimi sürecinde, meme bezi dokusunun hamilelik öncesi durumuna dönmeye başladığı zaman görüntülendi. Hareket artefaktlarını azaltmak ve görselleştirmeyi geliştirmek için ImageJ için iki makro geliştirilmiştir, biri Z düzlemlerini 4 boyutlu bir intravital videoda hizalar (Ek kod 1), diğeri ise solunum veya diğer hareket artefaktlarından kaynaklanan yalpalamaları azaltır (Ek kod 2). Şekil 10 ve Film 3A-C, 2. ve 4. günlerde aynı yerde yeniden şekillenen meme bezi dokusu içindeki nötrofil infiltrasyonunu göstererek, pencerenin farklı günlerde bağışıklık hücresi infiltrasyonunu ve hareketini izlemek ve izlemek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Benzer bir deney, bir c-fms-EGFP faresinde, c-fms promotörü tarafından yönlendirilen GFP'yi eksprese eden miyeloid hücrelerle (esas olarak makrofajlar) gerçekleştirildi (Film 4).
Son olarak, bu özelleştirilebilir pencerenin nispeten geniş yüzey alanı, intravenöz aşılamadan sonra karaciğer metastazı oluşumu gibi nadir olayların gözlemlenmesine izin verir. Bu fenomeni göstermek için, portal ven enjeksiyonu sırasında C57BL / 6J farelerine, nükleer füzyon proteini histone2B-CFP'yi (H2B-CFP) yapısal olarak eksprese eden KPC-BL / 6-1199 pankreas kanseri hücreleri ile karaciğer pencereleri yerleştirildi. Zamanla, tek hücrelerin ve mikrometastazlara (>100 hücre) dönüştüklerinde 2-3 hücreli küçük kümelerin büyümesi izlendi. Şekil 10 , enjeksiyon ve pencere yerleştirmeden sonra 1, 3, 7 ve 9. günlerde çekilen temsili görüntüleri gösterir ve tek hücrelerden mikrometastazlara ilerlemeyi gösterir.
Tüm görüntüler ve filmler çok foton mikroskop kullanılarak toplandı. Zaman içinde Z ve X eksenleri boyunca maksimum yoğunluk projeksiyonları ve film hizalamaları ImageJ yazılımı kullanılarak oluşturuldu. Hizalanmış görüntüler ve filmler daha sonra Imaris yazılımı kullanılarak derlendi.
Şekil 1: Ventral abdominal görüntüleme penceresinin karaciğer üzerine cerrahi olarak yerleştirilmesi . (A) Karikatür, ameliyatla ilgili yapıların anatomik yerini göstermektedir. Beyaz kesikli kutu, resimlerde görüntülenen cerrahi alanı özetler. (B) Ksifoid işlemin 3 mm altından başlayıp aşağı doğru devam eden bir kesi yapılır, böylece cildin 1-1,5cm2'lik bir bölümü orta hat boyunca çıkarılır. (C) Peritonun biraz daha küçük bir bölümü diseke edilir. (D) Falciform ligament (beyaz ok ucu) kesilir ve karaciğeri aşağı iter. Not: Steril salin ile nemlendirilmiş pamuklu çubuklar, iç organları nazikçe manipüle etmek için kullanılır. (E) Bir şırınga kullanılarak, karaciğer yüzeyindeki ilgi alanı etrafındaki damlacıklara az miktarda cerrahi yapıştırıcı uygulanır. (F) Pencere, yapıştırıcı kuruyana kadar (2 dakika) karaciğere karşı sıkıca tutulur ve tutulur. (G) Pencerenin kenarları periton ve deri altında katlanır. (H) Pencereyi peritona sabitlemek için, periton üzerine itilmeden ve yerine yapıştırılmadan önce, gölgeli alana karşılık gelen pencerenin yüzeyine yapıştırıcı uygulanır. Cilt benzer şekilde periton üzerine yapıştırılır. Epitelin pencere üzerinde büyümesini önlemek için nihayet kırmızı çizgi boyunca bir tutkal kenarı biriktirilir. (I) Fareyi ameliyat sonrası iyileşme için hazır gösteren işaretler olmadan (H) ile aynı görüntü. Kesikli çizgilerle özetlenen alan (J, K) olarak büyütülür. (J) Yapışkan damlacıklarından gelen izler karaciğerin yüzeyinde görülebilir (ok başları) (K) J'deki ile aynı fotoğraf, beyaz kesikli bir çizgiyle özetlenen pencereden görülebilen karaciğeri gösterir. Karaciğer yüzeyindeki yapışkan damlacıkları kırmızı renkle özetlenmiştir. Görüntülenecek alan beyaz renkle özetlenmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Karaciğerin sağ lobunun üzerine cerrahi olarak bir pencere yerleştirilmesi. (A) Karikatür, ameliyatla ilgili yapıların anatomik yerini gösterir. Siyah kesikli kutu, resimlerde görüntülenen cerrahi alanı özetler. (B) Fare sol lateral dekübit pozisyonuna yerleştirilir, göğüs kafesinin 3 mm altından başlayarak bir kesi yapılır ve cildin yaklaşık 1cm2'lik bir bölümü çıkarılır. (C) Peritonun biraz daha küçük bir bölümü diseke edilir. (D) Karaciğer, nemlendirilmiş pamuklu çubukla göğüs kafesinin altına nazikçe aşağı çekilir. (E) Bir şırınga kullanılarak, karaciğer yüzeyindeki damlacıklara (beyaz ok başı) az miktarda cerrahi yapıştırıcı uygulanır. (F) Pencere, yapıştırıcı kuruyana kadar (2 dakika) karaciğere karşı sıkıca tutulur ve tutulur. (G) Pencerenin kenarları periton ve deri altında katlanır. (H) Pencereyi peritona sabitlemek için, periton üzerine itilmeden ve yerine yapıştırılmadan önce, pencerenin yüzeyine, gölgeli alana karşılık gelen yapıştırıcı uygulanır. Cilt benzer şekilde periton üzerine yapıştırılır. Epitelin pencere üzerinde büyümesini önlemek için kırmızı çizgi boyunca bir tutkal kenarı da biriktirilir. (I) Yüksek büyütmede, karaciğer (beyaz kesikli bir çizgi ile özetlenmiş) pencereden görülebilir. Görüntüleme alanı, pencereye gömülü ızgara (beyaz ok başı) ile işaretlenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Pankreas üzerine cerrahi olarak bir pencere yerleştirilmesi. (A) Karikatür, ameliyatla ilgili yapıların anatomik yerini gösterir. Siyah kesikli kutu, resimlerde görüntülenen cerrahi alanı özetler. (B) Fare sağ lateral decubitus pozisyonuna yerleştirilir. Dalak tıraş edilen deriden görülebilir (kesikli çizgi) (C) Göğüs kafesinin 3 mm altından başlayarak bir kesi yapılır ve cildin yaklaşık 1cm2'lik bir bölümü çıkarılır. (D) Peritonun biraz daha küçük bir bölümü diseke edilir. (E) Pankreas (beyaz ok başı), pencerenin bulunduğu yere nemlendirilmiş pamuklu çubukla hafifçe yerleştirilir. (F) Bir şırınga kullanılarak, dalağa ve pankreasa (görüntülenecek bölgeden uzakta) az miktarda cerrahi yapıştırıcı uygulanır. (G) Pencere, yapıştırıcı kuruyana kadar (2 dakika) pankreasa karşı sıkıca yerleştirilir ve tutulur. Pencerenin kenarları periton ve cildin altına katlanır. (H) Pencereyi peritona sabitlemek için, periton üzerine itilmeden ve yerine yapıştırılmadan önce, gölgeli alana karşılık gelen pencerenin yüzeyine yapıştırıcı uygulanır. Cilt benzer şekilde periton üzerine yapıştırılır. Epitelin pencere üzerinde büyümesini önlemek için kırmızı çizgi boyunca bir tutkal kenarı da biriktirilir. (I) Yüksek büyütmede, pankreas (beyaz kesikli bir çizgi ile özetlenmiş) pencereden görülebilir. Görüntüleme alanı, pencereye gömülü ızgara (beyaz ok başı) ile işaretlenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kasık meme bezi üzerine cerrahi olarak bir pencere yerleştirildi. (A) Karikatür, ameliyatla ilgili yapıların anatomik yerini gösterir. Siyah kesikli kutu, resimlerde görüntülenen cerrahi alanı özetler. Ameliyatın 4. veya 5. meme bezlerinde yapılabileceğini unutmayın. (B) Fare, steril bir cerrahi alanda sırtüstü pozisyonda yerleştirilir. 5. sağ meme ucu (ok başı) insizyonu gerçekleştirmek için bir dönüm noktası olarak kullanılır. (C) Bir kesi yapılır, meme bezi üstteki deriden ayrılır ve cildin yaklaşık 1cm2'lik bir bölümü çıkarılır. (D) Bir şırınga kullanılarak, meme bezinin yüzeyindeki ilgi alanı etrafındaki damlacıklara az miktarda cerrahi yapıştırıcı uygulanır. (E) Pencere konumlandırılır ve yapıştırıcı kuruyana kadar sıkıca tutulur (2 dk). (F) Pencerenin kenarları forseps kullanılarak cildin altına katlanır. (G) Pencereyi cilde sabitlemek için, cildi üzerine itmeden ve yerine yapıştırmadan önce, gölgeli alana karşılık gelen pencerenin yüzeyine yapıştırıcı uygulanır. Epitelin pencere üzerinde büyümesini önlemek için kırmızı çizgi boyunca bir tutkal kenarı da biriktirilir. (H) 4. sağ meme bezindeki küçük bir tümörün üzerine implante edilen bir pencere örneği verilmiştir. Kesikli çizgilerle özetlenen alan, (I) içinde daha yüksek büyütme ile gösterilir. (I) Meme bezi yüzeyindeki yapışkan damlacıkları kırmızı renkle özetlenmiştir. Görüntülenecek alan siyah renkle özetlenmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Silikon görüntüleme pencereleri uygun optik ve malzeme özelliklerine sahiptir. (A-C) Nokta yayılma fonksiyonunu ölçmek ve PDMS pencerelerinin görüntüleme özelliklerini cam kapaklarınkiyle karşılaştırmak için, 40 nm sarı-yeşil floresan mikrosferler, değişen kalınlıktaki PDMS pencereleri veya cam kapaklar (# 1.5 kalınlık) aracılığıyla görüntülendi.16. Görüntüler, intravital görüntüleme koşullarına uymak için daldırma ortamı olarak ultrason jeli kullanılarak toplandı. Grafikler, hesaplanan Tam Genişliği Yarım Maksimum (FWHM) olarak gösterir (A) X ekseni, (B) Y ekseni ve (C) Z-ekseni (ortalama ± SD; n = 3 / grup, iki veya daha fazla ayrı pencere kullanılarak elde edilir; Dunnett'in çoklu karşılaştırma testi ile tüm PDMS pencerelerini camla karşılaştıran tek yönlü ANOVA; sadece önemli farklılıklar belirtilmiştir). (D) X ve Y ekseninde hesaplanan FWHM değerleri arasındaki oran (A–B), X ve Y eksenleri boyunca nokta kaynak görüntülerinin simetrisinin ve dolayısıyla optik sapmaların bir ölçüsü olarak gösterilir. (E-G) Mikrosferler, 200 mg PDMS ile dökülen üç ayrı pencereden görüntülendi (intravital görüntüleme için kullanılan pencerelere benzer). Şekil 9, Şekil 10, Şekil 11 ve Film 2, Film 3, Film 4) veya nokta yayılma fonksiyonunu ölçmek için üç cam kapak kayması (# 1.5 kalınlık). İntravital görüntüleme örneklerinin aksine, bu hesaplamalar için görüntüler daldırma ortamı olarak su kullanılarak toplanmıştır. Grafikler hesaplanan FWHM'yi (E) X ekseni, (F) Y ekseni ve (G) Z-ekseni (ortalama ± SD; n = 3/üç ayrı pencere kullanan grup; Mann-Whitney testinde anlamlı bir fark saptanmadı). (H) Grafik, X ve Y ekseninde hesaplanan FWHM değerleri arasındaki oranı gösterir (E-F). (Ben) Grafikler mikrosfer başına tepe floresan yoğunluğunu gösterir (ortalama ± SD; n = 3/grup; Mann-Whitney testinde anlamlı bir fark saptanmadı). Tüm görüntüler 960 nm dalga boyunda ve% 3'lük bir lazer gücünde toplandı. Her mikrosfer için 0.6 μm'lik bir adım boyutuna sahip 100 μm'lik bir z-yığını toplandı. Görüntü çerçevesi, 1022 piksel x 1022 piksel çözünürlükte 69 μm x 69 μm olarak ayarlanmıştır. Fiji - MetroloJ eklentisi ile analiz yapıldı. (J) Malzeme özelliklerini test etmek için, PDMS pencereleri gergin tutuldu ve mekanik test sırasında elastik bir tepki sağlamak için süper yapıştırıcı kullanılarak halka şeklindeki iki yıkayıcı arasına sabitlendi. Aynı prosedür, camın sertliği nedeniyle gerginlik olmadan mikro kapak camı kaymaları için de kullanılmıştır. Bir silindir ekstrüzyonuna (4 mm çap, 20 mm uzunluk) sahip bir yarım küreden (6 mm çap) oluşan bir yükleme ucu, polilaktik asit filamenti kullanılarak 3D olarak basılmıştır. Pencereler, malzeme arızasına kadar 1 N/s yük kontrol profili altında bir servohidrolik malzeme test makinesine yüklendi. Kuvvet ve yer değiştirme değerleri 100 Hz frekansta ölçüldü. Resimde, pencerenin ortasına yüklenen yükleme ucu ile ayarlanan pencere testi gösterilmektedir. (K) Grafik, MATLAB'daki Trapz fonksiyonu kullanılarak gerilim-gerinim eğrisi altındaki toplama alanının hesaplanmasıyla belirlenen malzemenin tokluğunu gösterir (ortalama ± SEM; n = 3 / grup, her kalınlık ve cam kapak kaymaları için üç ayrı PDMS penceresi kullanarak; Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile tek yönlü ANOVA). (L) Grafik, gerilim-gerinim eğrisinin doğrusal kısmından belirlenen Young Modülünü göstermektedir (ortalama ± SEM; n = 3 / grup, üç ayrı PDMS penceresi ve cam kapaklar kullanılarak yapılır; Welch'in düzeltmesi ile t-testi). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Silikon pencere yüksek tolere edilebilirlik ve uzun ömürlülük göstermektedir . (A) Pencere ameliyatından 11 gün sonra ızgarasız ventral abdominal görüntüleme penceresine sahip, 7 haftalık bir erkek C57BL/6J farenin temsili görüntüsü. (B) Pencere ameliyatından 14 gün sonra ızgara içeren pankreas görüntüleme penceresine sahip 7 haftalık bir erkek C57BL/6J farenin temsili görüntüsü. (C) Pencere ameliyatından >7 gün sonra ızgara içeren meme bezi görüntüleme penceresine sahip 12 haftalık bir kadın C57BL/6J c-fms-EGFP farenin temsili görüntüsü. (D) 7 haftalık bir erkek c-fms-EGFP faresinde 0. günde (ameliyattan hemen sonra) ve ameliyattan 35 gün sonra fotoğraflanmış (üst sıra) ve görüntülenmiş (alt sıra) karaciğer görüntüleme penceresi. Uygun miktarda cildin çıkarılması ve yaranın yapıştırıcı ile kapatılması, cildin yeniden epitelleşmesini ve pencereyi yukarı ve dışarı itmesini önler ve organın uzun süreli görüntülenmesini sağlar. Ölçek çubukları = 30 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Pencerelerdeki ızgaralar aynı görüş alanının izlenmesini sağlar. (A) Lazer kesimli paslanmaz çelik pencerelerin özel üretimi için ayrıntılı özellikler. (B) Görüntüleme penceresinin içine gömülü bir ızgara, pencerenin etrafındaki yapıştırıcı kenarı açıkça görülebilecek şekilde, karaciğer üzerinde görülebilir. (C) Pencerenin iki foton mikroskobunun okülerlerinden görünümü. Arka planda karaciğerden gelen kan damarları (kırmızı) ve yeşil sinyal görülebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Pencere yerleştirmeye sistemik ve lokal yanıt. (A-C) 7 haftalık C57BL/6J dişi fareler için karaciğere pencere yerleştirilmesini takiben 28 günlük bir süre boyunca ağırlık izlendi (A), pankreas (B) veya meme bezi (C). Tedavi edilmeyen yaş uyumlu farelere kıyasla yüzde vücut ağırlığı değişimi gösterilmiştir. (*) normal vücut ağırlığını geri kazanmayan ve bu nedenle bir görüntüleme deneyinden sansürlenmiş bir fareyi gösterir. Her bir pencere tipine daha kolay karşılaştırma için aynı kontrol fareleri her üç panelde de gösterilmiştir. (D) Beyaz kan hücresi (WBC) sayısı, ameliyattan sonra 3, 14 ve 28. günlerde (meme bezi penceresi) veya 35. günlerde (karaciğer veya pankreas penceresi) izlenir. Faredeki WBC sayısı için normal aralık kesikli çizgilerle gösterilir. (E,G,Ben) Tedavi edilmeyen kontrollerden (solda) doku kesitlerinin hematoksilin ve eozin boyanması ve 7 haftalık bir C57BL/6J farenin üzerine bir görüntüleme penceresinin (sağda) yerleştirilmesinden 14 gün sonra (E) karaciğer, (G) pankreas veya (Ben) meme bezi. (E,Ben) Yüzeysel ve fokal granülasyon lezyonları, karaciğer ve meme bezinin yüzeyi (ok) boyunca ayrı yerlerde görülür ve tutkala reaksiyon gösterir. * ile belirtilen normal doku, granülasyon lezyonlarına bitişik bölgelerde görülebilir. Her zaman noktasında üç kontrol ve karaciğer pencereli üç fare (ameliyattan sonraki 3, 14 ve 35. günler) değerlendirildi, ancak karaciğer pencereli 6 fare ameliyattan sonraki 35. günde değerlendirildi. 3 fareden ikisi, 3. ve 14. günlerde granülasyon dokusu sergiledi. 3 fareden 1'i 35. günde granülasyon dokusu sergiledi. Üç kontrol ve meme bezi pencereli üç fare, her zaman noktasında değerlendirildi (ameliyattan sonraki 3, 14 ve 28. günler). 3 fareden üçü, 3. ve 14. günlerde meme bezinin yağ dokusunda granülasyon dokusu veya enflamatuar reaksiyonlara sahipti. 3 fareden sıfırı, 28. günde granülasyon lezyonları veya enflamatuar reaksiyonlar sergiledi. (G) Pankreasta belirgin lezyonlar görülmez. Üç kontrol ve pankreas pencereli üç fare her zaman noktasında değerlendirildi (ameliyattan sonraki 3, 14 ve 35. günler). Pankreas pencereli farelerde herhangi bir zaman noktasında granülasyon dokusu yoktu. Ölçek çubuğu = 500 μm (F,H,J) Tedavi edilmemiş kontrollerden ve 7 haftalık C57BL/6J farelerden doku kesitlerine görüntüleme penceresinin yerleştirilmesinden 14 gün sonra multipleks immünohistokimyasal boyama yapıldı (F) karaciğer, (H) pankreas veya (J) meme bezi. CD45, CD68 ve miyeloperoksidaza (MPO) karşı antikorlar sırasıyla lökositleri, monositleri / makrofajları ve nötrofilleri etiketlemek için kullanıldı. CD45 ve CD68 boyaması aynı bölümde, MPO boyama ise aynı dokunun seri kesitinde yapıldı. Anti-CD45 antikoru HRP konjuge sekonder antikor ile tespit edildi ve önce görüntülendi, daha sonra kromojen ve sekonder antikor soyuldu ve slaytlar anti-CD68'i tanıyan sekonder bir antikor ile inkübe edildi. Niceleme, Fiji yazılımı ile renk eşikleme ile gerçekleştirildi; parametreler antikorlar ve dokular arasında ayarlandı. Grafikler, nicelemeyi görüş alanı başına hücre sayıları (FOV) olarak gösterir (ortalama ± SEM; n = 3 / grup; Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile tek yönlü ANOVA; sadece önemli farklılıklar belirtilmiştir). (K) Erkek C57BL/6J c-fms-EGFP 8-11 haftalık farelerde, karaciğerin sağ lobunun üzerine yerleştirilmiş silikon bir görüntüleme penceresi vardı. Floresan etiketli lektin (100 μL), her görüntüleme seansından hemen önce intravenöz olarak enjekte edildi. Görüntüler, ameliyattan sonraki 1, 3 ve 5. günlerde aynı ızgara lokusunda, ızgaranın yaklaşık 200 μm altında tek bir fareden alınmıştır. Ölçek çubuğu = 30 μm. 960 nm uyarma dalga boyu, lazer gücü% 10 kullanılarak görüntülenmiştir. Kan damarları kırmızı renkte görünür. Makrofajlar yeşil renkte görünür (beyaz oklar). Üç resimli farenin temsilcisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: Tümörler, pencere yerleştirildikten sonraki haftalar boyunca birden fazla zaman noktasında görselleştirilebilir. 7 haftalık bir erkek C57BL / 6J fareden elde edilen temsili görüntüler, pankreas penceresi yerleştirildiği sırada 1.5 x 104 iGFP-1199 pankreas kanseri hücreleri ile ortopik olarak enjekte edildi ve pencere yerleştirildikten sonra 11 ve 14. günlerde görüntülendi. Ölçek çubukları = 30 μm. 960 nm uyarma dalga boyu, lazer gücü% 10 kullanılarak görüntülenmiştir. 6 resimli farenin temsilcisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 10: Normal meme bezi evrimi sırasında immün hücre infiltrasyonunda dinamik değişiklikler. Görüntüleme penceresine gömülü metal ızgara kullanılarak, meme bezi evrimi sırasında olduğu gibi normal doku yeniden şekillendirme sırasında aynı konum görüntülenebilir. Silikon pencerelerin immün hücre infiltrasyonu gibi dinamik değişiklikleri izlemedeki işlevselliğini daha fazla değerlendirmek için, 12 haftalık bir dişi C57BL / 6J x BALB / c ACTB-ECFP; Abdominal meme bezinin üzerine yerleştirilmiş bir görüntüleme penceresine sahip LysM-eGFP fare, meme bezi evriminin ardından 2. ve 4. günlerde görüntülendi. Nötrofiller yeşil renkte görünür (beyaz oklar). Nötrofil elastaz aktivitesi, görüntülemeye başlamadan 4 saat önce bir Nötrofil Elastaz floresan probu enjekte edilerek görselleştirildi ve kırmızı (veya nötrofiller ile kolokalize edildiğinde sarı) olarak görünür. Epitel hücreleri mavi renkte görünür. Anlık görüntüler, Z ekseni boyunca beş görüntünün (100-150 mm derinlikte) maksimum yoğunlukta projeksiyonudur. Görüntüler Film 3A ve 3B'den alınmıştır ve alt sıradaki görüntülerde yalnızca CFP sinyali gösterilir ve görüntüler iki farklı zaman noktasında doku içindeki aynı konumları görselleştirmek için kırmızı kesikli bir çizgiyle işaretlenir. Ölçek çubukları = 30 μm. 960 nm ve 1080 nm uyarma dalga boyları, lazer gücü sırasıyla% 10 ve% 15 kullanılarak görüntülenmiştir. Dört resimli farenin temsilcisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 11: Kanser metastazı oluşumu zamanla izlenebilir. Pencere yerleştirilmesi sırasında portal ven yoluyla nükleer lokalize histon H2B konjuge camgöbeği floresan proteini (H2B-CFP) eksprese eden 1 x 10 5 KPC-BL/6-1199 pankreas kanseri hücreleri enjekte edilen 1 x 10 haftalık bir erkekC57BL /6J fare. Karaciğer görüntülemesi, enjeksiyondan 24 saat sonra (Gün 1) ve belirtildiği gibi üç sonraki zaman noktasında (9 güne kadar) lateral bir pencereden gerçekleştirildi. Enjeksiyonu takip eden 1. ve 3. günlerde görülebilen tek bir kanser hücresi beyaz oklarla gösterilir. Kollajen liflerinden gelen ikinci harmonik sinyal de camgöbeği kanalında (sarı oklar) görselleştirildi. Görüntüler her farklı zaman noktasında aynı faredendir. 300 μm ile 350 μm arasında derinlikte çekilen tek z-düzlemli görüntüler. Ölçek çubukları = 30 μm. 880 nm uyarma dalga boyu kullanılarak görüntülenmiştir. % 8'de lazer gücü. Üç resimli farenin temsilcisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Film 1: Silikon imaging pencereleri farelerde iyi tolere edilir. Film, pencerenin yerleştirilmesinden 14 gün sonra 9 haftalık bir erkek C57BL/6J fareyi gösteriyor. Fare, ağrıyla ilişkili standart davranışların hiçbirini göstermez (örneğin, zayıf tımar, kapalı gözler veya uyuşukluk). Kaydedilen altı farenin temsilcisi ve başarılı pencere implantasyonunu takiben gözlemlenen 100'den fazla fareyle tutarlı. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Film 2: Ortopik olarak implante edilmiş pankreas kanseri hücrelerinin hücre altı görüntülemesi. iGFP-1199 hücreleri, 7 haftalık bir erkek C57BL / 6J farenin pankreasına ortopik olarak enjekte edildi ve kanser hücrelerinin enjeksiyonu ve pencere yerleştirilmesinden sonra 11. günde görüntülendi. Film, Z ekseni boyunca altı görüntünün maksimum yoğunlukta projeksiyonudur ve 2 saatlik bir görüntüleme periyodundan çıkarılmıştır. Zaman damgası (h:min:s:ms). Altı resimli farenin temsilcisi. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Film 3: ACTB-ECFP'de immün hücre infiltrasyonundaki değişiklikler; LysM-eGFP fareleri evrimleşme sırasında. Dişi C57BL/6J x BALB/c ACTB-ECFP; Miyeloid hücrelerde (esas olarak granülositlerde değil, aynı zamanda makrofajlarda) GFP'yi eksprese eden LysM-eGFP fareleri ve tüm hücrelerde ECFP (ancak epitel hücrelerinde en yüksek) 8 haftalıkken yetiştirildi. Doğumu takiben, yavrular fare başına altı yavruya normalleştirildi. Doğumdan sonraki 10. günde yavrular sütten kesildi ve abdominal meme bezi görüntüleme pencereleri yerleştirildi. Miyeloid hücreler yeşil renkte görünür; Görüntülemeye başlamadan 4 saat önce enjekte edilen Nötrofil Elastaz 680 FAST probu kullanılarak etiketlenen nötrofil elastaz aktivitesi kırmızı renkte görünür (nötrofiller ile kolokalize edildiğinde sarı görünür); ve epitel hücreleri mavi renkte görünür. Filmler, Z ekseni boyunca beş görüntünün maksimum yoğunlukta projeksiyonudur (100-150 μm derinlikte). (A) Meme bezi evriminin 2. gününde görüntüleme. Ölçek çubuğu = 20 μm. 960 nm ve 1080 nm uyarma dalga boyları, lazer gücü sırasıyla% 10 ve% 15 kullanılarak görüntülenmiştir. (B) Meme bezi evriminin 4. gününde görüntüleme. Ölçek çubuğu = 20 μm. Film, Film 3A ile aynı fare ve doku bölgesindendir. (C) Film 3B'den ilgi duyulan bir bölgenin daha yüksek büyütülmesi, birbirleriyle etkileşime giren iki nötrofil ve meme bezinin epitel hücrelerini gösterir. Geçici membran çıkıntılarının oluşumu, nötrofil göçü sırasında ön kenarda gözlenebilir. Zaman damgası (h:min:s:ms). Dört resimli farenin temsilcisi. Movie 3A'yı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Movie 3B'yi indirmek için lütfen buraya tıklayın. Movie 3C'yi indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Film 4: Evrim sırasında c-fms-EGFP farelerinde bağışıklık hücresi infiltrasyonundaki değişiklikler. GFP etiketli makrofajlara sahip dişi C57BL / 6J c-fms-EGFP fareleri 8 haftalıkken yetiştirildi. Doğumu takiben, litreler fare başına altı yavruya ayarlandı. Doğumdan sonraki 10. günde yavrular sütten kesildi ve abdominal meme bezi görüntüleme pencereleri yerleştirildi. Evrim günü 1'de (pencerenin yerleştirilmesinden bir gün sonra) elde edilen film, evrim sırasında belirgin makrofaj sızmasını vurgular. Makrofajlar yeşil, kollajen lifleri (ikinci harmonik nesil) mavi ve kan damarları kırmızı renkte görünür (Lectin-DyLight 594). Ölçek çubuğu = 20 μm. Görüntüler, Z ekseni boyunca beş görüntünün maksimum yoğunluk projeksiyonlarıdır (100-150 um derinlikte). 960 nm ve 800 nm uyarma dalga boyları kullanılarak görüntülendi, lazer gücü sırasıyla% 10 ve% 15'te. Zaman damgası (h:min:s:ms). Üç resimli farenin temsilcisi. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İntravital görüntüleme pencereleri, fizyolojik ve patolojik süreçleri zaman içinde ortaya çıktıklarında hücresel çözünürlükte doğrudan görselleştirmek için önemli araçlardır. Farelerde esnek, silikon görüntüleme pencerelerinin dökümü ve yerleştirilmesi için açıklanan yeni prosedür, şu anda kullanılan görüntüleme pencereleriyle (eksüda, kırılma ve normal hareketliliğe müdahale) ilgili en yaygın sorunlardan bazılarının üstesinden gelir, fare için ek güvenlik sağlar ve bu tekniğin erişilebilirliğini artırır.
En yaygın kullanılan görüntüleme pencereleri, cam bir kapak kayması tutan metal bir çerçeveden oluşur. Bu prototipik pencerelerin kullanımının önündeki en büyük engel, metal halkanın sabitlenmesinin zahmetli dikiş prosedürlerini içermesi ve ileri cerrahi eğitime sahip personel gerektirmesidir. Ek olarak, çerçevelerin üretimi maliyetlidir ve özel ekipman gerektirir. PDMS pencereleri bu sorunların her ikisinin de üstesinden gelir. PDMS pencerelerini yerleştirme prosedürü, tekniği öğrenmenin önündeki engeli önemli ölçüde azaltarak dikişleri ortadan kaldırır. Pencereleri üretecek malzemeler de ucuzdur ve kolayca satın alınabilir. Ek olarak, hem pencerenin şekli hem de cerrahi prosedür, meme bezi, karaciğer, pankreas, dalak ve bağırsak dahil olmak üzere farklı organları görüntülemek için uyarlanabilir.
Mevcut intravital görüntüleme pencereleri tipik olarak birkaç gün boyunca uzunlamasına görüntülemeye izin verirken, bazı yaygın sorunlar bu pencerelerin kullanımını uzun süre sınırlandırmaktadır. Cam pencerelerin ağırlığı ve boyutu, farelerin serbest dolaşımını engelleyebilir ve eksüda pencereye karşı birikebilir. Fareler ayrıca cam kapak kaymasına zarar verebilir, bu da yaralara ve enfeksiyonlara neden olabilir. Buna karşılık, burada açıklanan prosedür, hayvanlar için sıkıntıyı en aza indirirken dokuya aynı erişilebilirlik seviyesini korur. PDMS, ilaç dağıtım cihazları, yüz rekonstrüksiyon cerrahisi ve meme implantları gibi insanlarda biyomedikal uygulamalar için yaygın olarak kullanılan güvenli, biyostabil, sentetik bir polimerdir. Hayvanların pencereye toleransını arttırmanın ötesinde, camın aksine biyolojik olarak inert bir malzemenin kullanılması, lokal inflamasyonun kafa karıştırıcı bir etki olacağı bağışıklık sistemini içeren çalışmalar için özellikle önemlidir. Ek olarak, büyük bir gelişme, fareler onları ısırıp çekeceğinden, metal çerçeveli cam görüntüleme pencerelerinin düşmesine neden olabileceğinden, dikişlerin ortadan kaldırılmasıdır. Bu sorun, dikişler bir oluk9'da gizlenecek şekilde tasarlanmış yeni nesil pencereler tarafından kısmen giderilmiştir. Bununla birlikte, bu ikinci strateji, genellikle dikişlerin çok sıkı çekilmesine neden olan ve doku nekrozuna ve ağrıya neden olan karmaşık, hataya eğilimli bir prosedür olan çanta ipi dikişini gerektirir. Bu nedenle, pencereyi yerine yapıştırma yeteneği, silikon pencere yaklaşımının önemli bir avantajını oluşturur. Ayrıca, pencere, ihmal edilebilir ağırlığa sahip esnek, dayanıklı bir malzemeden yapılmıştır, bu da daha önce bir cam kapak kayması17'yi tutmak için metal yerine silikon kullanan pencerelerin karşılaştırılmasında değerlendirildiği gibi, hayvanın hareketi üzerindeki etkisini azaltır. Cam kapak kaymasını tamamen ortadan kaldırarak, silikon pencere hem metal çerçeveler hem de cam ile ilgili sorunları ortadan kaldırır. Ayrıca, pencerenin esnekliği kolaylıkla yerleştirilmesini sağlar ve sert bir yüzeyin organlara yapıştırılmasının neden olduğu gerilme kuvvetini azaltır, böylece gözlenen dokuda kalıcı hasar riskini azaltır. Ek olarak, pencerenin yerleştirilmesi ve yerinde tutulması çok daha kolay olduğu için, genel prosedür daha az zaman alır ve uzun süreli anestezi nedeniyle olası yan etkileri sınırlar. Karaciğerin üzerine yerleştirme için, prosedür süresindeki fark, metal çerçeveli pencereler için 45 dakikadan silikon pencereler için 15 dakikaya kadar özellikle önemlidir. Aslında, metal çerçevenin karaciğer üzerine yerleştirilmesi, potansiyel olarak ağrılı olan ve sürekli iltihaplanmaya neden olan ksifoid sürecin (sternumun sonundaki kıkırdak) diseksiyonunu gerektirirken, bu diseksiyon silikon pencerenin yerleştirilmesi için gereksizdir. Son olarak, bu çalışmada sunulan görüntüleme penceresi, olası uygulamalar açısından ek avantajlar sağlamaktadır. Örneğin, cam pencerelerin aksine, silikon pencereler dokuya kolay erişim sağlar, böylece kanser hücreleri, floresan boyalar veya ilaçlar doğrudan pencereden enjekte edilebilir.
Meme bezi de dahil olmak üzere çeşitli anatomik yerlere yerleştirilmeye uygun bir başka PDMS tabanlı silikon görüntüleme penceresi yakın zamanda tanımlanmıştır18. Bu pencere, dikiş veya yapıştırıcıya ihtiyaç duymadan pencerenin hızlı bir şekilde implante edilmesini sağlayan bir şekil ve özel kenar oluşturmak için kalıplanmıştır. Buna karşılık, burada sunulan silikon pencere herhangi bir özel kalıp gerektirmez ve daha da önemlisi, anatomik konuma ve bireysel fareye uyum sağlamak için cerrahi prosedür sırasında şekillendirilmek üzere kesilebilir. Burada açıklanan protokol tutkal kullanımını gerektirse de, bu ek gereklilik karaciğer ve dalak dahil olmak üzere abdominal organların görüntülenmesine izin verir. Dahası, burada açıklanan silikon pencere, referans işaretleri sağlayan pencerenin içine paslanmaz çelik bir ızgaranın gömülmesine izin verir. Bu işaretler, zaman içinde aynı kesin konumun izlenmesini sağlar ve metastatik lezyonların gelişimi gibi günler ila haftalar süren süreçleri incelemek için aynı bölgenin birden fazla seansta (uzunlamasına görüntüleme) tekrarlanmasını kolaylaştırır.
Özetle, meme bezinin veya abdominal organların uzunlamasına IVM'sinde kullanılmak üzere silikon görüntüleme penceresi geliştirilmiştir. Pencere optik olarak net, son derece dayanıklı ve ucuzdur. Pencere yerleştirme prosedürünün basitliği, pencere tabanlı intravital görüntüleme yaklaşımlarını uygulamak için gereken teknik becerileri azaltır. Pencerenin çeşitli doku bölgelerine uyarlanabilirliği, IVM'nin çok çeşitli biyolojik çalışmalarda uygulanmasına izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
M.E., Insmed, Inc. için brensocatib'in araştırma danışma kurulu üyesidir; Vividion Therapeutics, Inc.'in bilimsel danışma kurulu üyesi; Protalix, Inc. için bir danışman; D.A.T., Mestag Therapeutics'in kurucu ortağıdır ve bilimsel danışma kurulunda yer almaktadır ve Mestag Therapeutics, Leap Therapeutics, Surface Oncology ve Cygnal Therapeutics'te hisselere sahiptir. Diğer yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Rob Eifert'e lazer kesimli paslanmaz çelik ızgaraların tasarlanması ve optimize edilmesindeki yardımı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, CSHL Kanser Merkezi (P30-CA045508) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (NIH) M.E. için fonlar (1R01CA2374135 ve 5P01CA013106-49) tarafından desteklenmiştir; CSHL ve Northwell Health; Thompson Aile Vakfı; Amerika'da Yüzmek; ve Simons Vakfı'ndan CSHL'ye bir hibe. Yüksek Lisans, Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü Tıp Bilimcisi Eğitim Programı Eğitim Ödülü (T32-GM008444) ve NIH Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından 1F30CA253993-01 ödül numarası altında desteklenmiştir. L.M., James S. McDonnell Vakfı Doktora Sonrası Bursu tarafından desteklenmektedir. J.M.A., Kanser Araştırma Enstitüsü / Irvington Doktora Sonrası Bursu (CRI Ödülü #3435) sahibidir. D.A.T., Lustgarten Vakfı Pankreas Kanseri Araştırmaları Özel Laboratuvarı ve Thompson Aile Vakfı tarafından desteklenmektedir. Karikatürler Biorender.com ile yaratıldı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape | 3M | 70200770819 | |
| Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2 | Ethicon | N267H | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 22974 | |
| AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole) | Vector Laboratories | SK-4200 | |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Anesthesia system | Molecular Imaging Products Co. | ||
| Acqknowledge software and sensors | BIOPAC | ACK100W, ACK100M, TSD110 | |
| Betadine spray | LORIS | 109-08 | |
| c-fms-EGFP (MacGreen) mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) | Invitrogen | 14-0451-82 | |
| CD68 Antibody | Abcam | ab125212 | |
| Curity gauze sponges | Covidien | ||
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6885 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab97064 | |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab102182 | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Two-part, 10:1 mixing ratio |
| Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness | Electron Microscopy Sciences | 72296-08 | |
| Ender-3 Pro 3D printer | Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD | ||
| Far Infrared Heated blanket | Kent Scientific | RT-0520 | |
| Fc Receptor Blocker | Innovex Biosciences | NB309 | |
| Fiji imaging processing package | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515) | Invitrogen | F8795 | |
| Gating system: | BIOPAC Systems Inc. | The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems. | |
| Acqknowledge software | ACK100W, ACK100M | ||
| Diff. Amp. Module, C Series | DA100C | ||
| Dual Gating Sys small animal | DTU200 | ||
| MP160 for Windows - Analysis system | MP160WSW | ||
| MouseOx Plus 120V | MOX-120V;015000 | ||
| Pressure Pad | TSD110 | ||
| Gelfoam | Pfizer | 9031508 | Absorbable gelatin sponge |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Two pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length |
| Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody | R&D Systems | AF3667 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 s |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc | BD | 324912 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | 502017 | |
| Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594 | Vector Laboratories | DL-1177-1 | |
| LysM-eGFP mice | www.mmrrc.org | 012039-MU | |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 | Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5153 | 1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length |
| MTS MiniBionix II 808 | MTS Systems | Servohydraulic material testing machine | |
| Neutrophil Elastase 680 FAST probe | PerkinElmer | NEV11169 | |
| Nitrogen | General Welding Supply Corp. | ||
| Oxygen | General Welding Supply Corp. | ||
| Polylactic acid filament | Hatchbox | 1.75 mm diameter | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36970 | |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra | NDC17033-211-38 | |
| Reflex 7 wound clips | Roboz Surgical | RS-9255 | |
| Stainless steel grid | Fotofab | One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square. | |
| Surface Treated SterileTissue Culture Plates | Fisher Scientific | FB012929 | Lid used as curing surface for imaging windows |
| TriM Scope Multiphoton Microscope | LaVision BioTec | Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: T560LP T665LPXXR T495lxpr |
|
| Vetbond | 3M | 70200742529 | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48404-453 |
References
- Dondossola, E., et al. Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone. Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).
- Haeger, A., et al. Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche. Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184 (2020).
- Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
- Eickhoff, S., et al. Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions. Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).
- Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
- Sammicheli, S., et al. Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses. Science Immunology. 1 (4), (2016).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
- Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. Recording the wild lives of immune cells. Science Immunology. 3 (27), (2018).
- Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), 29917 (2014).
- Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818 (2016).
- Anderson, T. L. Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , CRC Press, Taylor & Francis Group. Florida. (2005).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088 (2013).
- Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
- Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
- Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. Intravital. 5 (1), 1125562 (2016).
- Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
