Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

التصوير الطولي داخل الحيوية من خلال نوافذ السيليكون الشفافة

Published: January 5, 2022 doi: 10.3791/62757
Automatic Translation
*1,2,3, *1,4,5, 1, 1,6, 7,8, 9, 1, 1, 1, 8, 1
1Cold Spring Harbor Laboratory, 2Cold Spring Harbor Laboratory School of Biological Sciences, 3Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 4Medical Scientist Training Program, School of Medicine, Stony Brook University, 5Graduate Program in Pharmacology, Stony Brook University, 6Graduate Program in Genetics, Stony Brook University, 7Graduate Program in Biomedical Engineering, Stony Brook University, 8Department of Biomedical Engineering, Stony Brook University, 9Department of Pathology, University of Michigan
* These authors contributed equally

Summary

يتم تقديم نهج هنا للتصوير داخل الحيوية على المدى الطويل باستخدام نوافذ سيليكون واضحة بصريا يمكن لصقها مباشرة على الأنسجة / العضو محل الاهتمام والجلد. هذه النوافذ أرخص وأكثر تنوعا من غيرها المستخدمة حاليا في هذا المجال ، ويسبب الإدخال الجراحي التهابا محدودا وضيقا للحيوانات.

Abstract

يتيح الفحص المجهري داخل الحيوية (IVM) تصور حركة الخلية وانقسامها وموتها بدقة خلية واحدة. IVM من خلال نوافذ التصوير التي يتم إدخالها جراحيا قوية بشكل خاص لأنها تسمح بالمراقبة الطولية لنفس الأنسجة على مدار أيام إلى أسابيع. تشتمل نوافذ التصوير النموذجية على غطاء زجاجي في إطار معدني متوافق حيويا يتم خياطته على جلد الماوس. يمكن أن تتداخل هذه النوافذ مع الحركة الحرة للفئران ، وتثير استجابة التهابية قوية ، وتفشل بسبب الزجاج المكسور أو الغرز الممزقة ، والتي قد يتطلب أي منها القتل الرحيم. لمعالجة هذه المشكلات ، تم تطوير نوافذ لتصوير أعضاء البطن والغدة الثديية على المدى الطويل من فيلم رقيق من polydimethylsiloxane (PDMS) ، وهو بوليمر سيليكون شفاف بصريا كان يستخدم سابقا لنوافذ التصوير في الجمجمة. يمكن لصق هذه النوافذ مباشرة على الأنسجة ، مما يقلل من الوقت اللازم للإدخال. يتميز نظام PDMS بالمرونة ، مما يساهم في متانته في الفئران بمرور الوقت - تم اختبار ما يصل إلى 35 يوما. التصوير الطولي هو تصوير لنفس منطقة الأنسجة خلال جلسات منفصلة. تم تضمين شبكة من الفولاذ المقاوم للصدأ داخل النوافذ لتوطين نفس المنطقة ، مما يسمح بتصور العمليات الديناميكية (مثل التفاف الغدة الثديية) في نفس المواقع ، بفارق أيام. سمحت نافذة السيليكون هذه أيضا بمراقبة الخلايا السرطانية المنتشرة المفردة التي تتطور إلى نقائل صغيرة بمرور الوقت. نوافذ السيليكون المستخدمة في هذه الدراسة أبسط في الإدخال من النوافذ الزجاجية ذات الإطار المعدني وتسبب التهابا محدودا في الأنسجة المصورة. علاوة على ذلك ، تسمح الشبكات المدمجة بالتتبع المباشر لنفس منطقة الأنسجة في جلسات التصوير المتكررة.

Introduction

يقدم الفحص المجهري داخل الحيوية (IVM) ، وهو تصوير الأنسجة في الحيوانات المخدرة ، نظرة ثاقبة على ديناميكيات الأحداث الفسيولوجية والمرضية بدقة خلوية في الأنسجة السليمة. تختلف تطبيقات هذه التقنية على نطاق واسع ، ولكن IVM كان له دور فعال في مجال بيولوجيا السرطان للمساعدة في توضيح كيفية غزو الخلايا السرطانية للأنسجة وانتشارها ، والتفاعل مع البيئة الدقيقة المحيطة ، والاستجابة للأدوية1،2،3. بالإضافة إلى ذلك ، كان IVM مفتاحا لتعزيز فهم الآليات المعقدة التي تحكم الاستجابات المناعية من خلال توفير رؤى مكملة لنهج التنميط خارج الجسم الحي (على سبيل المثال ، قياس التدفق الخلوي). على سبيل المثال ، كشفت تجارب التصوير داخل الحيوية عن تفاصيل حول وظائف المناعة من حيث صلتها بهجرة الخلايا والاتصال الخلوي الخلوي وقدمت منصة لتحديد الديناميكيات الزمانية المكانية استجابة للإصابة أو العدوى4،5،6،7. يمكن أيضا دراسة العديد من هذه العمليات من خلال التلطيخ النسيجي ، ولكن IVM فقط يسمح بتتبع التغييرات الديناميكية. في الواقع ، في حين أن القسم النسيجي يقدم لقطة للأنسجة في وقت معين ، يمكن للتصوير داخل الحيوية تتبع الأحداث بين الخلايا وتحت الخلايا داخل نفس النسيج بمرور الوقت. على وجه الخصوص ، سمح التقدم في وضع العلامات الفلورية وتطوير المراسلين الجزيئيين بربط الأحداث الجزيئية بالسلوكيات الخلوية ، مثل الانتشار والموت والحركة والتفاعل مع الخلايا الأخرى أو المصفوفة خارج الخلية. تعتمد معظم تقنيات IVM على الفحص المجهري الفلوري ، والذي بسبب تشتت الضوء ، يجعل تصوير الأنسجة العميقة أمرا صعبا. لذلك ، غالبا ما تحتاج الأنسجة المثيرة للاهتمام إلى التعرض جراحيا من خلال إجراء جراحي ونهائي في كثير من الأحيان. وبالتالي ، اعتمادا على موقع العضو ، يمكن تصوير الأنسجة بشكل مستمر لفترة تتراوح من عدد قليل إلى 40 ساعة8. بدلا من ذلك ، يسمح الإدخال الجراحي لنافذة تصوير دائمة بتصوير نفس الأنسجة بالتتابع على مدى فترة من الأيام إلى الأسابيع 7,9.

تم تسليط الضوء على تطوير نوافذ تصوير جديدة كحاجة تكنولوجية لزيادة تحسين أساليب التصوير داخل الحيوية10. نافذة التصوير النموذجية داخل الحيوية هي حلقة معدنية تحتوي على غطاء زجاجي مثبت على الجلد باستخدام خيوط11. التداخل مع حرية الحركة ، وتراكم الإفرازات ، وتلف الغطاء الزجاجي هي مشاكل شائعة شوهدت مع استخدام هذه النوافذ. علاوة على ذلك ، تتطلب النافذة النموذجية إنتاجا متخصصا ، ويمكن أن يتطلب الإجراء الجراحي تدريبا مكثفا. لمعالجة هذه القضايا ، تم تكييف polydimethylsiloxane (PDMS) ، وهو بوليمر سيليكون ، والذي تم استخدامه سابقا في نوافذ الجمجمة للتصوير طويل الأجل في الدماغ12 ، للاستخدام في تصوير أعضاء البطن والغدة الثديية. هنا ، يتم تقديم طريقة مفصلة لتوليد نوافذ السيليكون القائمة على PDMS ، بما في ذلك كيفية إلقاء النافذة حول شبكة من الفولاذ المقاوم للصدأ لتوفير معالم للتصوير المتكرر لنفس مناطق الأنسجة. علاوة على ذلك ، يتم وصف إجراء جراحي بسيط وخالي من الغرز لإدخال النافذة فوق أعضاء البطن أو الغدة الثديية. يتغلب هذا النهج الجديد على بعض المشكلات الأكثر شيوعا مع نوافذ التصوير المستخدمة حاليا ويزيد من إمكانية الوصول إلى التصوير الطولي داخل الحيوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات الموصوفة وفقا للمبادئ التوجيهية الجراحية لمختبر كولد سبرينج هاربور وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في مختبر كولد سبرينج هاربور.

1. صب نافذة السيليكون

  1. تحضير بوليمر السيليكون (PDMS) عن طريق خلط المطاط الصناعي الأساسي وعامل المعالجة بنسبة 10: 1 (v / v).
  2. قم بصب نافذة عن طريق إيداع كمية صغيرة من PDMS على سطح معقم وأملس وضبط نسبة الحجم إلى المساحة إلى السماكة المطلوبة.
    ملاحظة: يؤدي استخدام 200 ملغ من محلول البوليمر لدائرة قطرها 22 مم على غطاء غطاء 24 صفيحة جيدة إلى حل وسط جيد بين متانة النافذة والوضوح البصري.
  3. اختياري: لتوفير معالم للتصوير المتكرر لنفس مناطق الأنسجة، اضغط برفق على شبكة من الفولاذ المقاوم للصدأ في السيليكون بعد أن يكون PDMS على سطح الصب المطلوب.
  4. لإزالة فقاعات الهواء ، ضع السطح المطلي في مجفف فراغ لمدة 45 دقيقة لإزالة غاز البوليمر.
  5. عالج نوافذ السيليكون في فرن على درجة حرارة 80 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
  6. سجل البوليمر عند حواف القالب وقشر النوافذ المعالجة بلطف من السطح المستخدم في الصب باستخدام الملقط.
  7. قبل الجراحة ، قم بتعقيم النوافذ عن طريق التعقيم.

2. إعداد الماوس لإدخال نافذة السيليكون

  1. تخدير الماوس في غرفة الحث باستخدام 4٪ (v / v) isoflurane. حرك الماوس إلى وسادة الاحترار على الطاولة الجراحية ، وضع الماوس في قناع الأنف المخدر ، وخفض تركيز الأيزوفلوران إلى 2٪ للصيانة طوال الجراحة.
  2. تحقق من عمق التخدير عن طريق قرص أصابع القدم من الأطراف الخلفية. لا تتابع حتى يصبح الماوس غير نشط ولا يظهر استجابة منعكسة لقرصة إصبع القدم.
  3. ضع مواد التشحيم العينية على العينين لمنعهما من الجفاف ومنع الصدمة.
  4. إدارة التسكين الوقائي (البوبرينورفين 0.05 ملغم / كغ) تحت الجلد.
  5. حلق الموقع الجراحي وإزالة الشعر تماما باستخدام كريم إزالة الشعر.
  6. تطبيق محلول البوفيدون اليود (10٪ v / v) والإيثانول (70٪ v / v) على التوالي 3x لمنع عدوى الموقع الجراحي.

3. إدخال نافذة بطنية للتصوير في الكبد ؛ قابلة للتكيف مع أعضاء البطن الأخرى (الشكل 1)

  1. ضع الماوس في وضع ضعيف.
  2. قم بعمل شق 10 مم بدءا من 3 مم لأسفل من عملية الخناق باستخدام مقص وملقط معقمين.
  3. إزالة قسم 1-1.5 سم2 من الجلد على طول خط الوسط.
  4. استخدم زوجا ثانيا من المقص المعقم والملقط لإزالة جزء من الصفاق أصغر قليلا من قسم الجلد.
  5. اختياري: لتصور جزء أكبر من الكبد، استخدم مسحات قطنية معقمة مبللة بمحلول ملحي معقم لدفع الكبد لأسفل من الحجاب الحاجز الذي يكشف عن الرباط المنجلي الذي يربط الكبد بالحجاب الحاجز. اقطع الرباط مع الحرص على عدم قطع الوريد الأجوف السفلي.
  6. اسحب المادة اللاصقة الجراحية باستخدام حقنة 31 جم ، وقم بتطبيق كمية صغيرة منها على سطح الكبد حول حواف المنطقة المراد تصويرها. تخلق هذه المادة اللاصقة ختما دائريا ، تاركة المنطقة المركزية سليمة للتصوير.
    تنبيه: قصر المادة اللاصقة على قطرات صغيرة تشكل نمطا دائريا حول منطقة التصوير. لا يمكن تصوير الأنسجة الملامسة مباشرة للمادة اللاصقة. ليس من الضروري تجفيف الأنسجة قبل تطبيق المادة اللاصقة.
    ملاحظة: يمكن استخدام أي مواد لاصقة قائمة على سيانو أكريليت بنجاح لهذا الإجراء. لاصق جراحي يضمن العقم. بالنسبة للإجراءات الطرفية ، تحقق الغراء الفائق لجميع الأغراض نتائج جيدة.
  7. ضع النافذة باستخدام الملقط وأمسكها بإحكام على الكبد حتى تجف المادة اللاصقة (~ 2 دقيقة).
  8. قم بطي حواف النافذة تحت الصفاق.
  9. باستخدام حقنة ، قم بإيداع كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية على حواف النافذة الموجودة الآن تحت الصفاق. اضغط لأسفل على الصفاق باستخدام ملقط لتثبيته على النافذة.
  10. وبالمثل ، قم بإيداع كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية على الصفاق قبل الضغط على الجلد باستخدام ملقط لتثبيته على الصفاق.
    ملاحظة: إذا تم تنفيذها بشكل صحيح ، فيجب أن تكون منطقة دائرية من أنسجة الكبد مرئية الآن من خلال النافذة.
  11. ضع الغراء حول حواف النافذة لإنشاء حافة تساعد على منع الجلد من النمو مرة أخرى فوق النافذة.
    تنبيه: إذا تم تنفيذ الإجراء باستخدام تقنيات جراحية معقمة وتم تعقيم النافذة قبل الإدخال ، فإن إغلاق الجرح بمادة لاصقة جراحية يكفي لتجنب العدوى. ومع ذلك ، فإن الفشل في اتباع تقنيات التعقيم المناسبة أثناء الإدخال الجراحي أو الإغلاق غير الكامل يمكن أن يؤدي إلى عدوى علنية أو تحت السريرية وتجفيف الأنسجة.

4. إدخال نافذة جانبية للتصوير في الكبد ؛ متوافقة مع الحقن المتزامن للخلايا السرطانية في الوريد البابي (الشكل 2)

  1. ضع الماوس على موضع الاستلقاء الجانبي الأيسر
  2. قم بعمل شق 10 مم على الجناح الأيمن 3 مم أسفل القوس الساحلي باستخدام مقص وملقط معقمين.
  3. إزالة 1 سم2 قسم من الجلد.
  4. استخدم زوجا ثانيا من المقص المعقم والملقط لإزالة جزء من الصفاق أصغر قليلا من قسم الجلد.
  5. اسحب المادة اللاصقة الجراحية باستخدام حقنة 31 جم ، وقم بتطبيق كمية صغيرة منها على سطح الكبد حول حواف المنطقة المراد تصويرها.
    تنبيه: قصر المادة اللاصقة على قطرات صغيرة تشكل نمطا دائريا حول منطقة التصوير. لا يمكن تصوير الأنسجة الملامسة مباشرة للمادة اللاصقة.
    ملاحظة: يمكن استخدام أي مواد لاصقة قائمة على سيانو أكريليت بنجاح لهذا الإجراء. لاصق جراحي يضمن العقم. بالنسبة للإجراءات الطرفية ، تحقق الغراء الفائق لجميع الأغراض نتائج جيدة.
  6. ضع النافذة باستخدام الملقط وأمسكها بإحكام على الكبد حتى تجف المادة اللاصقة (~ 2 دقيقة).
  7. قم بطي حواف النافذة تحت الصفاق.
  8. باستخدام حقنة ، قم بإيداع كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية على حواف النافذة الموجودة الآن تحت الصفاق. اضغط لأسفل على الصفاق باستخدام ملقط لتثبيته على النافذة.
  9. وبالمثل ، قم بإيداع كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية على الصفاق قبل الضغط على الجلد باستخدام ملقط لتثبيته على الصفاق.
    ملاحظة: إذا تم تنفيذها بشكل صحيح ، فيجب أن تكون منطقة دائرية من أنسجة الكبد مرئية الآن من خلال النافذة.
  10. ضع الغراء حول حواف النافذة لإنشاء حافة تساعد على منع الجلد من النمو مرة أخرى فوق النافذة.
  11. إذا كانت هناك حاجة إلى حقن الوريد البابي:
    1. ضع الماوس في وضع ضعيف.
    2. قم بعمل شق 10 مم بدءا من عملية الخناق في الجلد.
    3. باستخدام زوج ثان من المقص المعقم والملقط ، قم بعمل شق 10 مم في الصفاق.
    4. اغمس مسحتين من القطن في محلول ملحي معقم.
    5. استخدم مسحات القطن لسحب الأمعاء بلطف إلى شاش معقم مبلل بمحلول ملحي معقم ، مع الحرص على عدم التواء الاتجاه أو إزعاجه بطريقة أخرى.
    6. استمر في إزاحة الأمعاء من تجويف البطن حتى يصبح الوريد البابي مرئيا على الجانب الأيمن من البطن.
    7. أدخل إبرة 31-33 جم ذيلية 5-7 مم إلى نقطة دخول الوريد البابي إلى الكبد ، مع التأكد من المضي قدما داخل الوعاء الدموي وليس من خلاله.
    8. حقن الخلايا السرطانية ببطء (أعيد تعليقها في 100 ميكرولتر من PBS المعقمة).
      ملاحظة: بالنسبة لهذه التجربة ، يمكن استزراع خط خلايا سرطان البنكرياس الامورين (على سبيل المثال ، KPC-BL/6-1199) في وسائط DMEM كاملة وخلايا 1 × 105 يتم حقنها في 100 ميكرولتر من PBS المعقمة.
    9. لمنع النزيف ، مباشرة بعد سحب الإبرة ، ضع ضغطا لطيفا على موقع الحقن بقطعة صغيرة من الإسفنج الجراحي لمدة 1-2 دقيقة.
    10. بعد تحرير الضغط ، راقب الموقع لمدة 1-2 دقيقة لضمان الإرقاء.
    11. باستخدام مسحات القطن المبللة ، أعد الأمعاء إلى تجويف البطن بعد التوجه الفسيولوجي للعضو.
    12. باستخدام ملقط معقم ، أدخل النافذة مباشرة تحت الصفاق ، على الجانب الأيسر من تجويف البطن للماوس.
    13. خياطة مع 4-0 خيوط الحرير وتدبيس شق خط الوسط مع مشابك الجرح 7 مم من الفولاذ المقاوم للصدأ.
    14. حرك الماوس إلى موضع الاستلقاء الجانبي الأيسر
    15. قم بعمل شق 10 مم على الجناح الأيمن 3 مم تحت القوس الساحلي من خلال الجلد باستخدام مقص وملقط معقم.
    16. إزالة قسم 1 سم2 من الجلد حول الشق.
    17. استخدم زوجا ثانيا من المقص المعقم والملقط لإزالة جزء من الصفاق أصغر قليلا من قسم الجلد.
    18. اسحب النافذة إلى مكانها فوق الكبد قبل لصقها في مكانها ، كما هو موضح في الخطوات 4.8-4.10.

5. إدخال نافذة للتصوير في البنكرياس (الشكل 3)

  1. ضع الماوس على موضع الاستلقاء الجانبي الأيمن.
  2. قم بعمل شق 10 مم على الجناح الأيسر 3 مم أسفل القوس الساحلي باستخدام مقص وملقط معقمين.
  3. إزالة قسم 1 سم2 من الجلد حول الشق.
  4. استخدم زوجا ثانيا من المقص المعقم والملقط لإزالة جزء من الصفاق أصغر قليلا من قسم الجلد.
  5. باستخدام مسحات قطنية معقمة غارقة في محلول ملحي معقم ، اسحب الطحال بلطف لتصور البنكرياس. انتقل إلى إعادة وضع البنكرياس باستخدام مسحات القطن المبللة لجعل مساحة السطح مرئية من خلال الشق.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن حقن خلايا سرطان البنكرياس عن طريق تقويم العظام في البنكرياس إذا كان جزءا من التصميم التجريبي.
  6. اسحب المادة اللاصقة الجراحية باستخدام حقنة 31 جم ، وقم بتطبيق كمية صغيرة منها على سطح البنكرياس حول حواف المنطقة المراد تصويرها.
    تنبيه: قصر المادة اللاصقة على قطرات صغيرة تشكل نمطا دائريا حول منطقة التصوير. لا يمكن تصوير الأنسجة الملامسة مباشرة للمادة اللاصقة.
  7. ضع النافذة باستخدام الملقط وأمسكها بإحكام على البنكرياس حتى تجف المادة اللاصقة (~ 2 دقيقة).
  8. قم بطي حواف النافذة تحت الصفاق.
  9. باستخدام حقنة ، قم بإيداع كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية على حواف النافذة الموجودة الآن تحت الصفاق. اضغط لأسفل على الصفاق باستخدام ملقط لتثبيته على النافذة.
  10. وبالمثل ، قم بإيداع كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية على الصفاق قبل الضغط على الجلد باستخدام ملقط لتثبيته على الصفاق.
    ملاحظة: إذا تم تنفيذها بشكل صحيح ، فيجب أن تكون منطقة دائرية من أنسجة البنكرياس مرئية الآن من خلال النافذة.
  11. ضع الغراء حول حواف النافذة لإنشاء حافة تساعد على منع الجلد من النمو مرة أخرى فوق النافذة.

6. إدخال نافذة للتصوير في الغدة الثديية (الشكل 4)

  1. ضع الماوس على وضع الاستلقاء.
  2. اصنعي شقا إنسيابيا بمقدار 10 مم لإحدى الحلمات الإربية باستخدام مقص وملقط معقمين.
  3. إزالة 0.5 سم2 جزء من الجلد فوق الغدة الثديية.
  4. استخدم زوجا ثانيا من المقص المعقم لفصل الغدة الثديية بعناية عن الجلد عن طريق نشر المقص بين السطحين لتعطيل الالتصاق.
    ملاحظة: لتسهيل تصوير منطقة الغدة الثديية الأربية، احرصي على تشريح جزء من الجلد فوق الغدة الثديية ولكن متفوقا على الساق الخلفية، بحيث لا تحد النافذة من حركة الماوس.
  5. اسحب المادة اللاصقة الجراحية باستخدام حقنة 31 جم ، وقم بتطبيق كمية صغيرة منها على سطح الغدة الثديية حول حواف المنطقة المراد تصويرها.
    تنبيه: قصر المادة اللاصقة على قطرات صغيرة تشكل نمطا دائريا حول منطقة التصوير. لا يمكن تصوير الأنسجة الملامسة مباشرة للمادة اللاصقة.
  6. ضع النافذة باستخدام الملقط وأمسكها بإحكام ضد الغدة الثديية حتى تجف المادة اللاصقة (~ 2 دقيقة).
    ملاحظة: يجب أن تكون المنطقة الدائرية من أنسجة الغدة الثديية مرئية الآن من خلال النافذة إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.
  7. أضعاف حواف النافذة تحت الجلد.
  8. باستخدام حقنة ، قم بإيداع كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية على حواف النافذة الموجودة الآن تحت الجلد. اضغط لأسفل على الجلد باستخدام الملقط لتثبيت الجلد على النافذة.
  9. ضع الغراء حول حواف النافذة لإنشاء حافة تساعد على منع الجلد من النمو مرة أخرى فوق النافذة.

7. التعافي بعد الجراحة

  1. ضع الماوس في قفص استرداد نظيف مع مواد تعشيش وافرة ، مما يضمن أن جزءا من القفص يستريح على وسادة تدفئة.
  2. راقب الماوس باستمرار حتى يصبح واعيا ومتحركا.
  3. إذا لزم الأمر ، قدم جرعة إضافية من المسكن 12 ساعة بعد الجرعة الوقائية.
    ملاحظة: التسكين الإضافي غير ضروري بشكل عام ، ولكن استشر الطبيب البيطري إذا أظهر الفأر علامات الضيق (مثل الظهر المنحني أو الفراء غير المهذب أو فقد الاهتمام بالطعام). راقب الفأر يوميا لأول 3 أيام بعد الجراحة بحثا عن علامات العدوى أو الآثار الضارة الأخرى. أقل من 2٪ من الفئران تتطلب عناية بيطرية أو القتل الرحيم ، وعادة ما يكون ذلك بسبب الانفصال الجزئي للنافذة. من المهم ملاحظة أنه بالنسبة للفئران الذكور التي لديها نوافذ تصوير الكبد البطني ، يمكن أن يؤدي القتال بين الفئران إلى انفصال النوافذ. يتم تجنب ذلك عن طريق إيواء الفئران بشكل منفصل.

8. التصوير من خلال النافذة

  1. تخدير الماوس في غرفة الحث باستخدام 4٪ (v / v) isoflurane.
  2. ضع مواد التشحيم العينية على العينين لمنعهما من الجفاف ومنع الصدمة.
  3. حرك الماوس من غرفة الحث إلى مرحلة المجهر. ضع الفأرة في قناع الأنف المخدر ، وخفض تركيز الأيزوفلوران إلى حوالي 1-1.5٪ لتخدير الصيانة طوال عملية التصوير.
  4. ضع مستشعر وسادة الضغط أسفل الماوس لمراقبة معدل التنفس وتثبيت الماوس على المسرح باستخدام شريط جراحي ناعم.
  5. أدخل ميزان حرارة مستقيمي لمراقبة درجة حرارة الجسم طوال جلسة التصوير.
  6. قم بتشغيل الوسادة المسخنة ، وراقب الماوس عن كثب للتأكد من أن درجة حرارة الجسم لا تتجاوز 37 درجة مئوية.
  7. استخدم البرنامج لمراقبة معدل تنفس الماوس. المعدل الأمثل هو ~ 1 التنفس / الثانية. اضبط التخدير كما هو مطلوب.
  8. قبل كل جلسة تصوير، نظف النافذة من أي وسط غمر للعدسة المتبقية والحطام عن طريق مسحها بلطف باستخدام قطعة قطن مغموسة في 70٪ من الإيثانول (v/v).
  9. عند استخدام عدسة الغمر بالماء ، ضع هلام الموجات فوق الصوتية على النافذة ، وتجنب الفقاعات.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام الماء المقطر ولكن قد يتطلب إعادة تطبيقه أثناء التصوير.
  10. للعثور على العمق الأمثل للتصوير ، أولا ، حدد موقع الشبكة ووضعها في التركيز البؤري.
  11. حدد عمق تصوير الأنسجة التقريبي عن طريق تعيين الجزء السفلي من الشبكة إلى 0. هذه المعلومات ضرورية لتحديد موقع المستوى z المقابل في جلسات التصوير اللاحقة.
  12. لتحديد نفس الموقع عبر جلسات تصوير متعددة، استخدم المربعات الموجودة على الشبكة كنقطة مرجعية. أثناء التصوير ، لاحظ اتجاه الشبكة والموقع داخل شبكة كل مجال رؤية تم تصويره (على سبيل المثال ، الصف 2الثاني من الأعلى، المربع 4 من اليسار).
  13. أثناء جلسات التصوير المتتالية، استخدم الشبكة للانتقال مرة أخرى إلى مناطق شبكة محددة - وبالتالي حقول التصوير.
  14. بعد كل جلسة تصوير، قم بإزالة أي وسيط غمر للعدسة المتبقية والحطام عن طريق مسح النافذة بلطف باستخدام قطعة قطن مغموسة في 70٪ من الإيثانول (v/v).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يمكن استخدام التصوير داخل الحيوية من خلال نوافذ التصوير لمراقبة وتتبع وتحديد مجموعة واسعة من الأحداث الخلوية والجزيئية بدقة خلية واحدة على مدى فترة من ساعات إلى أسابيع. وتشمل الميزات المثالية لنافذة التصوير ما يلي: (أ) التأثير المحدود على رفاه الفأر وفسيولوجيا الأنسجة؛ (ب) التأثير المحدود على رفاه الفأر وفسيولوجيا الأنسجة؛ (ب) التأثير المحدود على رفاه الفأر وفسيولوجيا الأنسجة؛ (ب) التأثير المحدود على رفاه الفأر وفسيولوجيا الأنسجة؛ (ب) التأثير المحدود على رفاه الفأر وفسيولوجيا ب) المتانة؛ ج) بساطة الإدراج ؛ د) معالم واضحة للتصوير المتكرر لنفس المنطقة. والنتيجة هي نافذة سيليكون خاملة متعددة الاستخدامات يمكن إنتاجها وإدخالها بسهولة ويمكن تجهيزها بشبكة لتحديد نفس مجال الرؤية على مدى عدة جلسات تصوير.

النافذة مصنوعة من PDMS ، وهي مادة غير مكلفة ومرنة وواضحة. يمكن إرسال Windows بالمستلزمات المتوفرة على نطاق واسع للشراء لمعظم المختبرات. لهذه الأغراض ، تعمل القوالب الدائرية (قطرها 22 مم) المحفورة بالفعل على غطاء 24 لوحة بئر متوفرة تجاريا بشكل جيد. من خلال تغيير كمية البوليمر المستخدمة لكل وحدة مساحة ، من الممكن ضبط سمك النافذة. لتوثيق تأثير سمك النافذة على دقة التصوير ، تم إجراء تحليل دالة انتشار النقطة (PSF) للميكروسفير الفلوري 40 نانومتر لمقارنة التصوير من خلال نوافذ PDMS ذات السماكات المتفاوتة مع أغطية الزجاج المستخدمة عادة لنوافذ التصوير داخل الحيوية (بسماكة 0.17 مم). لتكرار الإعداد المستخدم للتصوير داخل الحيوية ، تم إجراء تصوير PSF باستخدام نفس المجهر ثنائي الفوتون وعدسة غمر الماء مع هلام الموجات فوق الصوتية المطبق كوسيط غمر.

كان العرض الكامل عند نصف الحد الأقصى (FWHM) لشدة الإشارة المحسوبة من خلال ملاءمة PSF في المستويات الجانبية مشابها للعرض الزجاجي لنوافذ PDMS المصبوبة ب 100 ملغ من PDMS (الشكل 5A ، B). تم تقليل الدقة الجانبية مقارنة بأغطية الزجاج للنوافذ المصبوبة ب 150-250 ملغ من PDMS (الشكل 5A ، B). في مستوى صورة المحور z ، كان أداء نوافذ PDMS المصبوب ب 100-200 ملغ من البوليمر أفضل من أغطية الزجاج (الشكل 5C). تم فقدان الوضوح البصري في النوافذ المصبوبة ب 300 ملغ من PDMS ، مما يجعل القياسات غير موثوقة (الأشكال 5A - C). لم تختلف نسبة X / Y لقيم FWHM اختلافا كبيرا بين الزجاج و PDMS من أي سمك ، على الرغم من أن نسبة النوافذ المصبوبة مع 200-250 ملغ من البوليمر انحرفت بشكل ملحوظ عن 1 باستخدام هلام الموجات فوق الصوتية كوسيط غمر (الشكل 5D). ومع ذلك ، عند استخدام الماء كوسيط غمر للنافذة المصبوبة ب 200 ملغ ، كان الانحراف عن التماثل أقل وضوحا. عند هذا السمك ، من المحتمل أن تكون الانحرافات الناجمة عن الانحرافات في البوليمر طفيفة. كما تم جمع قيم كثافة التألق القصوى لكل ميكروسفير وأظهرت أن الزجاج و PDMS أديا بشكل مقارن ، على الرغم من تسجيل أعلى إشارة من خلال الزجاج (الشكل 5I). يعتمد السماكة المثلى لنافذة PDMS على تطبيقات وأنظمة تصوير محددة. بالنسبة لمعظم الأغراض ، يعد 200 ملغ من محلول البوليمر لنافذة دائرية قطرها 22 مم حلا وسطا مثاليا بين متانة النافذة والوضوح البصري. في الواقع ، كانت النوافذ المصبوبة بأقل من 200 ملغ أكثر وضوحا بصريا ، مع قيم FWHM مشابهة للزجاج ، ولكنها تمزق أحيانا أثناء الزرع الجراحي ، في حين لم تلاحظ أي حالات تلف النوافذ باستخدام 200 ملغ (في >100 فأر).

لقياس هذا الاختلاف في خصائص المواد ، تم تحميل نوافذ PDMS (200 mg و 150 mg) في آلة اختبار المواد الهيدروليكية المؤازرة تحت ملف تعريف التحكم في الحمل من 1N / s حتى فشل المواد (الشكل 5J). تم قياس قيم القوة والإزاحة على تردد 100 هرتز. ثم تم تحويل بيانات إزاحة القوة إلى إجهاد باستخدام المعادلات:

σ = F / A (1)

Ɛ = Δ L / L0 (2)

حيث σ هو الإجهاد (Pa) ، F هو القوة (N) ، A هو منطقة المقطع العرضي للنافذة ، Ɛ هو الإجهاد ، ΔL هو الإزاحة ، و L0 هو سمك النافذة. تم تحديد صلابة المادة عن طريق حساب منطقة التجميع تحت منحنى الإجهاد والإجهاد. تشير صلابة المادة إلى قدرتها على التشوه البلاستيكي وامتصاص الطاقة في العملية قبل الكسر - وهي خاصية رئيسية للنوافذ المزروعة13. وبالاتفاق مع الملاحظات أثناء تجارب التصوير، فإن النوافذ المصبوبة ب 200 ملغ من PDMS تتمتع بصلابة أكبر بكثير من النوافذ المصبوبة ب 150 ملغ (الشكل 5K) وبالتالي فهي أقل عرضة للكسر.

بعد ذلك ، تم تحديد معامل يونغ (E) لنوافذ PDMS المفضلة المصبوبة ب 200 ملغ ومقارنتها بمعامل الغطاء الزجاجي القياسي عن طريق استخراج المنطقة الخطية من منحنى إجهاد الإجهاد وتحديد المنحدر باستخدام قانون هوك:

σ = EƐ (3)

كان معامل يونغ للنوافذ الزجاجية أكبر بكثير من PDMS ، والذي كان متوقعا لأن الزجاج أكثر صلابة في قوة المواد من PDMS (الشكل 5L). وبالتالي ، على الرغم من أن الزجاج مادة أقوى بناء على معامل يونغ الأكبر ، إلا أن الصلابة الأكبر لنوافذ PDMS 200 mg تدعم أنه يمكن تطبيقها لفترات أطول دون التعرض لخطر الكسر واستلزم إجراء عملية جراحية ثانية أو القتل الرحيم.

الميزة الرئيسية لنوافذ السيليكون هي التنوع. الأهم من ذلك ، يمكن تصميم إجراء إدخال النافذة جراحيا بسهولة لمواقع تشريحية مختلفة. يتم تسهيل التكيف مع الجراحة من خلال حقيقة أنه يمكن تغيير حجم النوافذ بسهولة باستخدام المقص الجراحي وأن النوافذ ملتصقة بسطح الأنسجة / العضو محل الاهتمام والجلد ، مما يلغي تماما متطلبات الغرز. تم تحقيق الإدخال الناجح للنوافذ بهذه الطريقة للكبد والبنكرياس والغدة الثديية (الأشكال 6A - C). على وجه الخصوص ، تم تطوير بروتوكولين مختلفين لزرع نوافذ بطنية أو جانبية لتصوير الكبد. يوضح الشكل 1 خطوات إدراج نافذة بطنية. يمكن تكييف هذا الإجراء مع أعضاء البطن الأخرى وسينتج عنه أكبر مساحة سطح قابلة للتصوير. ومع ذلك ، ما لم تكن هناك حاجة إلى مساحة كبيرة (>1 سم 2) قابلة للتصوير ، يفضل إدخال نافذة جانبية في الجناح الأيمن للماوس (الشكل 2) لتقليل القطع الأثرية المتحركة ، على سبيل المثال ، بسبب التنفس والتمعج. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الإجراء الجراحي لإدخال نافذة التصوير الجانبية متوافق مع الحقن المتزامن للخلايا السرطانية في الوريد البابي لنمذجة تطور ورم خبيث في الكبد تجريبيا. وبالتالي ، يمكن أن تخضع الفئران لإجراء واحد بدلا من إجراءين منفصلين عندما تكون هناك حاجة إلى حقن الوريد البابي وإدخال نافذة تصوير البطن في نفس الحيوان. يتم استخدام إجراء مماثل لزرع نافذة فوق البنكرياس على الجناح الأيسر للفأر (الشكل 3). يمكن أيضا إدخال النافذة فوق الأنسجة تحت الجلد ، أي الغدد الثديية الطبيعية ، وكذلك أورام الثدي العفوية أو المزروعة تقويميا (الشكل 4). بدلا من ذلك ، يمكن حقن الخلايا السرطانية في الغدة الثديية من خلال النافذة لمتابعة تطور الورم الأساسي طوليا ، حيث يمكن للإبر ثقب فيلم PDMS دون المساس بسلامة النافذة.

نظرا لانخفاض وزنها ومرونتها ، لا تتداخل نوافذ السيليكون مع حركة الماوس (الفيلم 1). وبالتالي ، فإن نوافذ السيليكون تتغلب على العقبات الرئيسية المرتبطة بالنوافذ الزجاجية ، مثل الهشاشة ، والخياطة المعقدة ، والتأثير على حركة الحيوانات. بدلا من ذلك ، فإن القيد الرئيسي المرتبط بنوافذ السيليكون هو إعادة نمو الظهارة تحت النافذة. ومع ذلك ، عندما تتم إزالة كمية مناسبة من الجلد ويتم إغلاق الجرح بالكامل بالغراء ، تكون إعادة الظهارة محدودة ، ويمكن أن يستمر التصوير على مدى فترات طويلة من الزمن (تم اختبار ما يصل إلى 35 يوما ، الشكل 6D). بعد إدخال النافذة ، يمكن تصوير الماوس طوليا لمدة شهر تقريبا أو حتى تفشل المادة اللاصقة الجراحية أو تحدث إعادة الظهارة. يفضل جلسات تصوير يومية قصيرة (~ 60 دقيقة) أو جلسات تصوير أقل تواترا ولكنها أطول لتجنب الآثار الضارة الناجمة عن التخدير. يمكن تصوير الحيوانات الحاملة للنوافذ على أي منصة تصوير داخل الجسم ، عبر كل من المجهر البؤري أحادي الفوتون أو متعدد الفوتونات ، باستخدام الإجراءات القياسية (انظر ، على سبيل المثال ، 14). قبل وبعد كل جلسة تصوير ، ينصح بتنظيف النافذة من الأوساخ والحطام عن طريق مسحها بقطعة قطن مغموسة في 70٪ من الإيثانول (v / v).

من أجل تتبع نفس الموقع بمرور الوقت ، يمكن تضمين شبكات الفولاذ المقاوم للصدأ داخل النافذة. يوضح الشكل 7A مواصفات الشبكات المحفورة بالليزر المصممة خصيصا والمستخدمة هنا. الشبكات التجارية لنقل المجهر الإلكتروني هي أيضا مناسبة لهذا التطبيق. يتم تضمين الشبكة داخل النافذة أثناء إجراء الصب وهي مرئية بوضوح فوق منطقة التصوير بالعين المجردة (الشكل 7B) ومن خلال مناظير المجهر (الشكل 7C). نظرا لأن النافذة ملتصقة بسطح العضو ، فإن موضع حقول التصوير بالنسبة للشبكة مستقر. أثناء التصوير ، لاحظ اتجاه الشبكة والموقع داخل شبكة كل مجال رؤية يتم تصويره (على سبيل المثال ، الصف 2الثاني من الأعلى ، 4المربع من اليسار). بعد ذلك ، استخدم الشبكة للانتقال مرة أخرى إلى مناطق شبكة محددة - وبالتالي حقول التصوير - أثناء جلسات التصوير المتتالية.

الشبكة مفيدة أيضا لمحاذاة مجال التصوير أثناء جلسة التصوير عندما ينجرف النسيج ببطء بسبب ، على سبيل المثال ، التنفس أو التمعج. يمكن ربط معظم نوافذ التصوير ذات الحافة الصلبة بحامل أثناء التصوير ، مما يضيف استقرارا إلى منطقة التصوير. نظرا لأنه لا يمكن تثبيت النوافذ المرنة مباشرة ، يتم استخدام الشريط الجراحي لتحقيق الاستقرار في قسم الجسم الذي يحتوي على النافذة ، ويتم إعادة محاذاة منطقة التصوير إلى مركز مربع الشبكة المقابل أو معالم الأنسجة المحددة مسبقا (على سبيل المثال ، معالم الأوعية الدموية) على فترات محددة (عادة كل 30 دقيقة). يتم إجراء مزيد من تصحيح الانجراف للتحول المجهري لمجال الرؤية رقميا في مرحلة ما بعد الاستحواذ من خلال التعليمات البرمجية التي تعيد محاذاة الإطارات بناء على أنماط الأنسجة المكتشفة (الرمز التكميلي 1-2).

للتحقق من أن النافذة لا تسبب أي رد فعل سلبي نظامي علني ، تم مراقبة وزن الحيوانات التي خضعت لزرع النوافذ والضوابط غير المعالجة المطابقة للعمر. بعد فقدان الوزن الأولي المرتبط بالجراحة ، تستمر معظم الفئران ذات النوافذ المدمجة في زيادة الوزن بمرور الوقت ، مما يشير إلى أن إدخال النافذة جيد التحمل (الأشكال 8A - C). بالنسبة لنوافذ الكبد والغدة الثديية ، يتم استعادة الوزن الطبيعي في غضون 5 أيام من الجراحة. يكون التعافي بعد العملية الجراحية أبطأ بعد زرع النافذة فوق البنكرياس ، حيث تعود الفئران إلى وزن ما قبل الجراحة في غضون 14 يوما. تتفق هذه الملاحظة مع الآثار المتوقعة المرتبطة بالتلاعب بالبنكرياس في وقت الجراحة. لاحظ أنه حتى في الحالات التي لا يصل فيها فقدان الوزن إلى عتبة نقطة النهاية الإنسانية ، فإن الفئران التي لا تستعيد وزن الجسم قبل الجراحة (<5٪ من جميع الفئران ، والتي يمثلها الفأر المشار إليه في * في الشكل 8B) تخضع عادة للرقابة من تجارب التصوير. بالإضافة إلى ذلك ، لم يتم تغيير عدد خلايا الدم البيضاء ، التي تم تحديدها في نقاط زمنية مختلفة بعد إدخال النافذة ، في أي فئران تحمل النافذة تقريبا مقارنة بالضوابط ولم تتغير بشكل كبير بمرور الوقت (الشكل 8D) ، مما يشير إلى أن النافذة لم تسبب التهابا جهازيا كبيرا.

بعد ذلك ، لتقييم درجة استجابة الأنسجة المحلية للنافذة والغراء ، تم قتل الفئران في 3 و 14 و 28 (نوافذ الغدة الثديية) أو 35 يوما (نوافذ الكبد والبنكرياس) بعد الإدخال الجراحي للنافذة للتحليل النسيجي. أظهر تقييم أقسام الكبد الملطخة بالهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) سطحية (20-80 ميكرومتر) ، والحد الأدنى إلى تكوين الأنسجة الحبيبية الكبسولة الخفيفة تحت النوافذ لمعظم الفئران (2 من أصل 3 فئران تم تقييمها في اليوم 3 ، و 2 من أصل 3 تم تقييمها في اليوم 14). كانت هذه الآفات بؤرية (طولها 1-3 مم) ، أي ما يعادل تقريبا عرض طبقة الغراء (الشكل 8E). بعد 35 يوما، لم تقدم معظم الفئران (4 من أصل 6 تم تقييمها في تجربتين منفصلتين) أي أنسجة حبيبية، في حين أن عددا قليلا منها (2 من أصل 6) كان يعاني من تصلب كبسولة بؤري معتدل وديسموبلاسيا (على عمق 25-250 ميكرومتر). ومن المثير للاهتمام أنه لم تلاحظ أي آفات كبيرة على سطح البنكرياس مباشرة تحت النافذة في أي وقت في مجموعة من تسعة فئران (الشكل 8G). ومع ذلك ، أظهرت بعض الفئران مناطق ضمور في البنكرياس والتهاب في دهون البطن (التهاب التنخر) ، بما يتفق مع الضرر الناجم عن التلاعب. بالنسبة للغدة الثديية ، في اليوم 3 بعد زرع النافذة ، كان لدى 3 من أصل 3 فئران إما أنسجة حبيبية تذكرنا بشق شفاء مرئي على طول سطح الغدة أو تفاعل التهابي في الأنسجة الدهنية. في اليوم 14 ، كان لدى 3 من أصل 3 فئران تم تقييمها أنسجة حبيبية. كانت هذه الآفات مرة أخرى بؤرية وطولها 1-3 مم (الشكل 8I). لم تظهر الفئران ذات نوافذ الغدة الثديية التي تم قتلها الرحيم بعد 28 يوما من الجراحة أي تشوهات نسيجية واضحة.

يشير هذا التحليل إلى أن النافذة لا تضر بالبنية الفسيولوجية الشاملة للأعضاء التي تم اختبارها (الكبد والبنكرياس والغدة الثديية). من المحتمل أن يكون النسيج التفاعلي الموجود على سطح الكبد والغدة الثديية رد فعل على الغراء ويقتصر على الأنسجة التي تتلامس مباشرة مع المادة اللاصقة. يمكن العثور بسهولة على الأنسجة الطبيعية المجاورة (< 100 ميكرومتر) للأنسجة التفاعلية في المناطق غير المعرضة للغراء (الشكل 8E ، I) ، وبالتالي ، لا يتداخل التهاب الأنسجة مع تصوير مناطق الأنسجة السليمة. علاوة على ذلك ، من المحتمل أن يكون تفاعل الأنسجة قابلا للانعكاس لأن معظم الفئران (8 من أصل 9 فئران ، عبر جميع مواقع الأنسجة) لم تظهر أي آفات كبيرة في نقاط الوقت المتأخرة (28 أو 35 يوما) ، على الرغم من أن التأكيد المباشر على أن رد فعل الأنسجة يحل سيكون من الصعب تحقيقه دون قياسات طولية في الفئران الفردية.

كما تم إجراء تلطيخ كيميائي مناعي متعدد الإرسال ل CD45 و CD68 و myeloperoxidase (MPO) لتوصيف تسلل الكريات البيض والخلايا الوحيدة / البلاعم والعدلات ، على التوالي. شوهدت زيادة في تسلل الخلايا المناعية المرتبطة بالأنسجة الحبيبية والتهاب الستاتيس في الغدة الثديية والكبد ، ولكن ليس في البنكرياس (الشكل 8F ، H ، J).  ومن الجدير بالذكر أن هذه التغييرات كانت عابرة على الأرجح لأن تسلل الخلايا المناعية كان مشابها لتسلل عناصر التحكم غير المعالجة في آخر نقاط زمنية (28 يوما لنوافذ الغدة الثديية و 35 يوما لنوافذ الكبد والبنكرياس).

تم اختيار الكبد كموقع لزيادة توصيف ما إذا كان إدخال النافذة والتصوير قد تسبب في تسلل مناعي محلي كبير باستخدام التصوير. للقيام بذلك ، تم استخدام الفئران c-fms-EGFP (MacGreen)15 ، حيث يتم تصنيف الخلايا النخاعية (معظمها من البلاعم) ببروتين فلورسنت أخضر. تم زرع نوافذ الكبد في ثلاثة فئران c-fms-EGFP وتصويرها في الأيام 1 و 3 و 5 بعد الجراحة باستخدام الشبكة لتحديد نفس مجال الرؤية. لم يتغير عدد البلاعم الموجودة في منطقة التصوير بشكل كبير بمرور الوقت بعد إدخال النافذة (الشكل 8K).

بعد ذلك ، تم اختبار النافذة وظيفيا عن طريق تصوير مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية على المستوى الخلوي (أي الحركة ، الانتشار ، اتصال الخلايا الخلوية) ومستوى الأنسجة (أي نمو الورم في البنكرياس ، والتسلل المناعي أثناء التفاف الغدة الثديية ، وورم خبيث في الكبد). البنكرياس ليس موقعا يسهل الوصول إليه للتصوير. ولتوضيح كيفية استخدام النافذة لالتقاط ديناميات الخلايا السرطانية في هذا العضو، تم إدخال النوافذ فوق البنكرياس لستة فئران من طراز C57BL/6J في نفس الوقت الذي يتم فيه الحقن التقويمي لخلايا KPC-BL/6-1199، وهو خط خلايا سرطانية في البنكرياس مشتق من مؤسسة البترول الكويتية شائعة الاستخدام (Kras LSL- G12D/+;p 53 LSL-R172H; Pdx1-Cre) نموذج الفأر المعدل وراثيا لسرطان البنكرياس. ومن أجل تصورها بواسطة المجهر البؤري، صممت خلايا KPC-BL/6-1199 للتعبير عن خلايا GFP المحسنة القابلة للتحريض بالدوكسيسيكلين (خلايا iGFP-1199). بعد ستة أيام من الحقن ، تم وضع الفئران على نظام غذائي دوكسيسيكلين لتحفيز التعبير عن بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) في خلايا سرطان البنكرياس. يوضح الشكل 9 صورا تمثيلية من فأر تم حقنه بشكل تقويمي بخلايا iGFP-1199 في اليومين 11 و 14 بعد الحقن وإدخال النافذة. يعرض الفيلم 2 حافة الورم iGFP-1199 في مقتطف من جلسة تصوير لمدة 2 ساعة في اليوم 11 بعد إدخال النافذة ، مما يوضح القدرة على التقاط ديناميكيات إسقاط غشاء الخلية في البنكرياس باستخدام نوافذ السيليكون.

يمكن أيضا استخدام نافذة السيليكون لالتقاط تسلل الخلايا المناعية الديناميكي بمرور الوقت. ولتوضيح ذلك، تم دمج نوافذ الغدة الثديية في ACTB-ECFP المرضعات (Tg(CAG-ECFP)CK6Nagy)؛ الفئران LysM-eGFP (Lyz2tm1.1Graf) مباشرة بعد الفطام. في هذه الفئران ، يتم تصنيف جميع الخلايا ، ولكن معظم الخلايا الظهارية للغاية ، والبروتين الفلوري السماوي (CFP) المدفوع بمروج بيتا أكتين ، والخلايا النخاعية - العدلات في المقام الأول ، ولكن أيضا البلاعم - بواسطة eGFP مدفوعا بمروج الليزوزيم M. تم تصوير الفئران في اليومين 2 و 4 بعد إدخال النافذة ، أثناء عملية التفاف الغدة الثديية ، عندما تبدأ أنسجة الغدة الثديية في العودة إلى حالتها قبل الحمل. تم تطوير اثنين من وحدات الماكرو ل ImageJ لتقليل القطع الأثرية المتحركة وتحسين التصور ، أحدهما يحاذي طائرات Z في فيديو حيوي 4 أبعاد (الرمز التكميلي 1) والآخر يقلل من التذبذب بسبب التنفس أو غيرها من القطع الأثرية المتحركة (الرمز التكميلي 2). يوضح الشكل 10 والفيلم 3A-C تسلل العدلات داخل أنسجة الغدة الثديية المعاد تشكيلها في نفس الموقع في اليومين 2 و 4 ، مما يوضح كيف يمكن استخدام النافذة لمراقبة وتتبع تسلل الخلايا المناعية وحركتها على مدار أيام مختلفة. أجريت تجربة مماثلة في فأر c-fms-EGFP ، مع خلايا نخاعية (البلاعم بشكل رئيسي) تعبر عن GFP مدفوعا بمروج c-fms (الفيلم 4).

وأخيرا ، تسمح المساحة السطحية الكبيرة نسبيا لهذه النافذة القابلة للتخصيص بمراقبة الأحداث النادرة ، مثل تكوين ورم خبيث في الكبد بعد التلقيح الوريدي. ولإثبات هذه الظاهرة، تم إدخال نوافذ الكبد في الفئران C57BL/6J في وقت حقن الوريد البابي باستخدام خلايا سرطان البنكرياس KPC-BL/6-1199 التي تعبر بشكل أساسي عن بروتين الاندماج النووي histone2B-CFP (H2B-CFP). مع مرور الوقت ، تم رصد نمو الخلايا المفردة والمجموعات الصغيرة من 2-3 خلايا أثناء تطورها إلى نقائل دقيقة (>100 خلية). يوضح الشكل 10 الصور التمثيلية التي تم التقاطها في الأيام 1 و 3 و 7 و 9 بعد الحقن وإدخال النافذة ويوضح التقدم من الخلايا المفردة إلى النقائل الدقيقة.

تم جمع جميع الصور والأفلام باستخدام مجهر متعدد الفوتونات. تم إنشاء إسقاطات الكثافة القصوى ومحاذاة الأفلام على طول المحورين Z وX بمرور الوقت باستخدام برنامج ImageJ. ثم تم تجميع الصور والأفلام المحاذاة باستخدام برنامج Imaris.

Figure 1
الشكل 1: الإدخال الجراحي لنافذة تصوير البطن البطنية فوق الكبد . (أ) يوضح الرسم الكاريكاتوري الموقع التشريحي للهياكل ذات الصلة بالجراحة. يحدد المربع الأبيض المتقطع المجال الجراحي الذي تم عرضه في الصور. (ب) يتم إجراء شق يبدأ من 3 مم تحت عملية الخناق ويستمر لأسفل بحيث تتم إزالة قسم 1-1.5 سم2 من الجلد على طول خط الوسط. (ج) يتم تشريح جزء أصغر قليلا من الصفاق. (د) يتم قطع الرباط المنجلي (رأس السهم الأبيض) ، مما يدفع الكبد إلى أسفل. ملاحظة: تستخدم مسحات القطن المبللة بمحلول ملحي معقم لمعالجة الأعضاء الداخلية بلطف. (ه) باستخدام حقنة ، يتم تطبيق كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية في قطرات حول المنطقة ذات الأهمية على سطح الكبد. (F) يتم وضع النافذة وتثبيتها بإحكام على الكبد حتى تجف المادة اللاصقة (2 دقيقة). (ز) يتم طي حواف النافذة تحت الصفاق والجلد. (ح) لتثبيت النافذة على الصفاق ، يتم تطبيق مادة لاصقة على سطح النافذة المقابلة للمنطقة المظللة ، قبل دفع الصفاق لأسفل عليها ولصقها في مكانها. يتم لصق الجلد بالمثل على الصفاق. يتم أخيرا ترسيب حافة من الغراء على طول الخط الأحمر لمنع نمو الظهارة فوق النافذة. (I) نفس الصورة كما في (H) بدون علامات تظهر الماوس جاهزا للتعافي بعد الجراحة. يتم تكبير المساحة المحددة بخطوط متقطعة في (J ، K). (ي) علامات من قطرات لاصقة مرئية على سطح الكبد (رؤوس الأسهم) (K) نفس الصورة كما في J تظهر الكبد مرئية من خلال النافذة المحددة بخط أبيض متقطع. يتم تحديد قطرات المادة اللاصقة على سطح الكبد باللون الأحمر. المنطقة المراد تصويرها موضحة باللون الأبيض. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الإدخال الجراحي لنافذة فوق الفص الأيمن من الكبد. (أ) يظهر الرسم الكاريكاتوري الموقع التشريحي للهياكل ذات الصلة بالجراحة. يحدد الصندوق الأسود المتقطع المجال الجراحي الذي تم عرضه في الصور. (ب) يتم وضع الفأر في وضع الاستلقاء الجانبي الأيسر ، ويتم إجراء شق يبدأ من 3 مم أسفل القفص الصدري ، ويتم إزالة قسم من الجلد يبلغ طوله حوالي 1 سم2 . (ج) يتم تشريح جزء أصغر قليلا من الصفاق. (د) يتم سحب الكبد بلطف أسفل القفص الصدري باستخدام قطعة قطن مبللة. (ه) باستخدام حقنة ، يتم تطبيق كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية في قطرات (رأس السهم الأبيض) على سطح الكبد. (F) يتم وضع النافذة وتثبيتها بإحكام على الكبد حتى تجف المادة اللاصقة (2 دقيقة). (ز) يتم طي حواف النافذة تحت الصفاق والجلد. (ح) لتأمين النافذة إلى الصفاق ، يتم تطبيق مادة لاصقة على سطح النافذة ، المقابلة للمنطقة المظللة ، قبل دفع الصفاق لأسفل عليها ولصقها في مكانها. يتم لصق الجلد بالمثل على الصفاق. كما يتم ترسيب حافة من الغراء على طول الخط الأحمر لمنع نمو الظهارة فوق النافذة. (I) عند التكبير العالي ، يكون الكبد (الموضح بخط أبيض متقطع) مرئيا من خلال النافذة. يتم تمييز منطقة التصوير بالشبكة المضمنة في النافذة (رأس السهم الأبيض). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الإدخال الجراحي لنافذة فوق البنكرياس. (أ) يظهر الرسم الكاريكاتوري الموقع التشريحي للهياكل ذات الصلة بالجراحة. يحدد الصندوق الأسود المتقطع المجال الجراحي الذي تم عرضه في الصور. (ب) يتم وضع الماوس في موضع الاستلقاء الجانبي الأيمن. الطحال مرئي من خلال الجلد الحليق (خط متقطع) (C) يتم إجراء شق يبدأ من 3 مم أسفل القفص الصدري ، ويتم إزالة جزء من الجلد يبلغ طوله حوالي 1 سم2 . (د) يتم تشريح جزء أصغر قليلا من الصفاق. (ه) يتم وضع البنكرياس (رأس السهم الأبيض) بلطف باستخدام قطعة قطن مبللة في موقع النافذة. (و) باستخدام حقنة ، يتم تطبيق كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية على الطحال ، وكذلك البنكرياس (بعيدا عن المنطقة المراد تصويرها). (ز) يتم وضع النافذة وتثبيتها بإحكام ضد البنكرياس حتى تجف المادة اللاصقة (2 دقيقة). يتم طي حواف النافذة تحت الصفاق والجلد. (ح) لتثبيت النافذة على الصفاق ، يتم تطبيق مادة لاصقة على سطح النافذة المقابلة للمنطقة المظللة ، قبل دفع الصفاق لأسفل عليها ولصقها في مكانها. يتم لصق الجلد بالمثل على الصفاق. كما يتم ترسيب حافة من الغراء على طول الخط الأحمر لمنع نمو الظهارة فوق النافذة. (I) عند التكبير العالي ، يكون البنكرياس (المحدد بخط أبيض متقطع) مرئيا من خلال النافذة. يتم تمييز منطقة التصوير بالشبكة المضمنة في النافذة (رأس السهم الأبيض). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: الإدخال الجراحي لنافذة فوق الغدة الثديية الأربية. (أ) يظهر الرسم الكاريكاتوري الموقع التشريحي للهياكل ذات الصلة بالجراحة. يحدد الصندوق الأسود المتقطع المجال الجراحي الذي تم عرضه في الصور. لاحظ أنه يمكن إجراء الجراحة إما على الغدد الثديية4 أو 5. (ب) يتم وضع الفأر في وضع ضعيف في حقل جراحي معقم. يتم استخدام الحلمة اليمنىرقم 5 (رأس السهم) كمعلم لإجراء الشق. (ج) يتم إجراء شق ، ويتم فصل الغدة الثديية عن الجلد العلوي ، ويتم إزالة جزء من الجلد حوالي 1 سم2. (د) باستخدام حقنة ، يتم تطبيق كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية في قطرات حول المنطقة ذات الأهمية على سطح الغدة الثديية. (ه) يتم وضع النافذة وتثبيتها بإحكام حتى تجف المادة اللاصقة (2 دقيقة). (و) يتم طي حواف النافذة تحت الجلد باستخدام الملقط. (ز) لتثبيت النافذة على الجلد ، يتم تطبيق مادة لاصقة على سطح النافذة المقابلة للمنطقة المظللة ، قبل دفع الجلد لأسفل عليها ولصقها في مكانها. كما يتم ترسيب حافة من الغراء على طول الخط الأحمر لمنع نمو الظهارة فوق النافذة.  (ح) يتم تقديم مثال على نافذة مزروعة فوق ورم صغير في الغدة الثدييةاليمنى رقم 4. تظهر المساحة الموضحة بخطوط متقطعة بتكبير أعلى في (I). (I) قطرات المادة اللاصقة على سطح الغدة الثديية موضحة باللون الأحمر. المنطقة المراد تصويرها محددة باللون الأسود. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: نوافذ التصوير السيليكوني لها خصائص بصرية ومادية مواتية. (أ–ج) لقياس دالة انتشار النقطة ومقارنة خصائص التصوير لنوافذ PDMS بخصائص الأغطية الزجاجية ، تم تصوير 40 نانومتر من الميكروسفير الفلورسنت الأصفر والأخضر من خلال نوافذ PDMS ذات السماكة المتفاوتة أو أغطية الزجاج (# 1.5 سمك)16. تم جمع الصور باستخدام هلام الموجات فوق الصوتية كوسيلة غمر لتتناسب مع ظروف التصوير داخل الحيوية. تظهر قطع الأراضي العرض الكامل المحسوب عند نصف الحد الأقصى (FWHM) في (A) المحور العاشر، (B) المحور Y، و (C) Z-axis (متوسط ± SD ؛ n = 3 / group ، تم الحصول عليه باستخدام نافذتين منفصلتين أو أكثر ؛ ANOVA أحادية الاتجاه تقارن جميع نوافذ PDMS بالزجاج مع اختبار المقارنات المتعددة ل Dunnett ؛ يشار إلى الاختلافات المهمة فقط). (D) النسبة بين قيم FWHM المحسوبة في المحورين X و Y (أ – ب) كمقياس لتماثل صور مصدر النقطة على طول المحورين X وY، وبالتالي للانحرافات البصرية. (E–G) تم تصوير الميكروسفير من خلال ثلاث نوافذ منفصلة مصبوبة مع 200 ملغ من PDMS (على غرار النوافذ المستخدمة في التصوير داخل الحيوية ل الشكل 9, الشكل 10, الشكل 11 و فيلم 2, فيلم 3, فيلم 4) أو ثلاثة أغطية زجاجية (بسماكة #1.5) لقياس وظيفة انتشار النقاط. على النقيض من أمثلة التصوير داخل الحيوية ، تم جمع صور لهذه الحسابات باستخدام الماء كوسط غمر. تظهر قطع الأراضي FWHM المحسوبة في (E) المحور العاشر، (F) المحور Y و (G) المحور Z (متوسط ± SD؛ n = 3/group باستخدام ثلاث نوافذ منفصلة؛ اختبار مان ويتني ، لم يتم الكشف عن أي اختلافات كبيرة). (H) يوضح الرسم البياني النسبة بين قيم FWHM المحسوبة في المحورين X و Y (هاء-إف). (أنا) تظهر قطع الأراضي ذروة كثافة الفلورسنت لكل ميكروسفير (متوسط ± SD؛ n = 3/group؛ اختبار مان ويتني ، لم يتم الكشف عن أي اختلافات كبيرة). تم جمع جميع الصور بطول موجي يبلغ 960 نانومتر وقوة ليزر تبلغ 3٪. تم جمع مكدس z-stack 100 ميكرومتر لكل ميكروسفير ، بحجم خطوة 0.6 ميكرومتر. تم تعيين إطار الصورة عند 69 ميكرومتر × 69 ميكرومتر بدقة 1022 بكسل × 1022 بكسل. تم إجراء التحليل باستخدام فيجي - المكون الإضافي MetroloJ. (J) لاختبار خصائص المواد، تم تثبيت نوافذ PDMS في حالة توتر وتثبيتها بين غسالتين على شكل حلقة باستخدام الغراء الفائق لضمان استجابة مرنة أثناء الاختبار الميكانيكي. تم استخدام نفس الإجراء للانزلاقات الزجاجية ذات الغطاء الصغير دون توتر بسبب صلابة الزجاج. تم طباعة طرف تحميل يتكون من نصف الكرة الأرضية (قطره 6 مم) مع بثق أسطوانة (قطر 4 مم ، طول 20 مم) باستخدام خيوط حمض البوليلاكتيك. تم تحميل النوافذ في آلة اختبار المواد الهيدروليكية المؤازرة تحت ملف تعريف التحكم في الحمل من 1 N / s حتى فشل المواد. تم قياس قيم القوة والإزاحة على تردد 100 هرتز. تعرض الصورة اختبار النافذة الذي تم إعداده مع تطبيق طرف التحميل في وسط النافذة. (K) يوضح الرسم البياني صلابة المادة التي تم تحديدها عن طريق حساب منطقة التجميع تحت منحنى إجهاد الإجهاد باستخدام دالة Trapz في MATLAB (متوسط ± SEM ؛ n = 3 / group باستخدام ثلاث نوافذ PDMS منفصلة لكل سماكة وأغطية زجاجية ؛ ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار المقارنات المتعددة من Tukey). (L) تظهر المؤامرة معامل يونغ المحدد من الجزء الخطي من منحنى الإجهاد والإجهاد (متوسط ± SEM ؛ n = 3 / مجموعة باستخدام ثلاث نوافذ PDMS منفصلة وأغطية زجاجية ؛ اختبار t مع تصحيح ويلش). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: تظهر نافذة السيليكون قدرة عالية على التحمل وطول العمر. (أ) صورة تمثيلية لذكر يبلغ من العمر 7 أسابيع من فأر C57BL/6J مع نافذة تصوير بطنية للبطن بدون شبكة بعد 11 يوما من جراحة النافذة. (ب) صورة تمثيلية لفأر C57BL/6J يبلغ من العمر 7 أسابيع مع نافذة تصوير البنكرياس تحتوي على شبكة بعد 14 يوما من جراحة النافذة. (ج) صورة تمثيلية لأنثى تبلغ من العمر 12 أسبوعا من طراز C57BL/6J c-fms-EGFP مع نافذة تصوير للغدة الثديية تحتوي على شبكة >7 أيام بعد جراحة النافذة. (د) نافذة تصوير الكبد في فأر c-fms-EGFP يبلغ من العمر 7 أسابيع تم تصويره (الصف العلوي) وتصويره (الصف السفلي) في اليوم 0 (مباشرة بعد الجراحة) و 35 يوما بعد الجراحة. إن إزالة الكمية المناسبة من الجلد وإغلاق الجرح بالغراء يمنع الجلد من إعادة الظهارة ودفع النافذة لأعلى وللخارج ، مما يسمح بتصوير العضو على المدى الطويل. أشرطة المقياس = 30 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: تسمح الشبكات داخل النوافذ بتتبع نفس مجال الرؤية. (أ) المواصفات التفصيلية للإنتاج المخصص للنوافذ المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ المقطوعة بالليزر. (ب) يمكن رؤية شبكة مضمنة داخل نافذة التصوير فوق الكبد ، مع حافة الغراء حول النافذة مرئية بوضوح. (ج) منظر النافذة من خلال مناظير المجهرين الفوتونيين. يمكن رؤية الأوعية الدموية (الحمراء) والإشارة الخضراء من الكبد في الخلفية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: الاستجابة النظامية والمحلية لإدراج النوافذ. (أ–ج) تم رصد الوزن لإناث الفئران C57BL/6J البالغة من العمر 7 أسابيع لمدة 28 يوما بعد إدخال النافذة في الكبد (A)، البنكرياس (B) أو الغدة الثديية (C). يظهر التغير في وزن الجسم مقارنة بالفئران غير المعالجة المطابقة للعمر. يشير (*) إلى فأر لم يستعيد وزن جسمه الطبيعي وبالتالي كان سيخضع للرقابة من تجربة تصوير. يتم عرض نفس فئران التحكم في جميع اللوحات الثلاث لتسهيل المقارنة مع كل نوع من النوافذ. (D) يتم مراقبة عدد خلايا الدم البيضاء (WBC) في الأيام 3 و 14 و 28 (نافذة الغدة الثديية) أو 35 (نافذة الكبد أو البنكرياس) بعد الجراحة. يشار إلى النطاق الطبيعي لعدد WBC في الماوس بواسطة خطوط متقطعة. (E,G,أنا) تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين لأقسام الأنسجة من عناصر التحكم غير المعالجة (يسار) وماوس C57BL/6J عمره 7 أسابيع بعد 14 يوما من إدخال نافذة تصوير (يمين) فوق (E) الكبد، (G) البنكرياس، أو (أنا) الغدة الثديية. (E,أنا) تظهر آفات التحبيب السطحية والبؤرية في أماكن منفصلة على طول سطح (سهم) الكبد والغدة الثديية ، مما يشير إلى وجود رد فعل على الغراء. الأنسجة الطبيعية المشار إليها ب * مرئية في المناطق المجاورة لآفات التحبيب. تم تقييم ثلاثة عناصر تحكم وثلاثة فئران ذات نوافذ كبدية في كل نقطة زمنية (الأيام 3 و 14 و 35 بعد الجراحة) ، باستثناء أنه تم تقييم 6 فئران ذات نوافذ كبدية في اليوم 35 بعد الجراحة. أظهر اثنان من كل 3 فئران أنسجة حبيبية في اليومين 3 و 14. 1 من أصل 3 فئران أظهرت أنسجة حبيبية في اليوم 35.  تم تقييم ثلاثة عناصر تحكم وثلاثة فئران ذات نوافذ غدة ثديية في كل نقطة زمنية (الأيام 3 و 14 و 28 بعد الجراحة). ثلاثة من كل 3 فئران كان لديها أنسجة حبيبية أو تفاعلات التهابية في الأنسجة الدهنية للغدة الثديية في اليومين 3 و 14. أظهر صفر من أصل 3 فئران آفات حبيبية أو تفاعلات التهابية في اليوم 28. (G) لا توجد آفات كبيرة مرئية في البنكرياس. تم تقييم ثلاثة عناصر تحكم وثلاثة فئران لديها نوافذ البنكرياس في كل نقطة زمنية (الأيام 3 و 14 و 35 بعد الجراحة). لم يكن لدى الفئران ذات النوافذ البنكرياسية أنسجة حبيبية في أي وقت. شريط المقياس = 500 ميكرومتر (F,H,J) تم إجراء تلطيخ كيميائي مناعي متعدد الإرسال على أقسام الأنسجة من عناصر التحكم غير المعالجة والفئران C57BL/6J البالغة من العمر 7 أسابيع بعد 14 يوما من إدخال نافذة تصوير فوق (F) الكبد، (H) البنكرياس أو (J) الغدة الثديية. تم استخدام الأجسام المضادة ضد CD45 و CD68 و myeloperoxidase (MPO) لتسمية الكريات البيض والخلايا الوحيدة / البلاعم والعدلات على التوالي. تم إجراء تلطيخ CD45 و CD68 على نفس القسم بينما تم إجراء تلطيخ MPO على قسم تسلسلي من نفس الأنسجة. تم الكشف عن الجسم المضاد ل CD45 مع جسم مضاد ثانوي مقترن ب HRP وتم تصويره أولا ، ثم تم تجريد الكروموجين والجسم المضاد الثانوي وتم احتضان الشرائح بجسم مضاد ثانوي يتعرف على مضاد CD68. وأجري القياس الكمي باستخدام برامجيات فيجي عن طريق تحديد حدود الألوان؛ تم تعديل المعلمات عبر الأجسام المضادة والأنسجة. تظهر المؤامرات القياس الكمي كعدد الخلايا لكل مجال رؤية (FOV) (متوسط ± SEM ؛ n = 3 / group ؛ ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار المقارنات المتعددة ل Tukey ؛ يشار إلى الاختلافات المهمة فقط). (K) ذكر C57BL/6J c-fms-EGFP كان لدى الفئران التي يتراوح عمرها بين 8 و 11 أسبوعا نافذة تصوير سيليكون تم إدخالها فوق الفص الأيمن من الكبد. تم حقن الليكتين الموسوم بالفلورسنت (100 ميكرولتر) عن طريق الوريد مباشرة قبل كل جلسة تصوير. الصور من فأر واحد ، في نفس موضع الشبكة في الأيام 1 و 3 و 5 بعد الجراحة ، على بعد حوالي 200 ميكرومتر تحت الشبكة. شريط المقياس = 30 ميكرومتر. تم تصويره باستخدام طول موجي مثير يبلغ 960 نانومتر ، وقوة الليزر 10٪. تظهر الأوعية الدموية باللون الأحمر. تظهر البلاعم باللون الأخضر (الأسهم البيضاء). ممثل لثلاثة فئران مصورة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: يمكن تصور الأورام في نقاط زمنية متعددة على مدى أسابيع بعد إدخال النافذة. صور تمثيلية من فأر C57BL/6J يبلغ من العمر 7 أسابيع تم حقنه بشكل تقويمي بخلايا سرطان البنكرياس 1.5 × 104 iGFP-1199 في وقت إدخال نافذة البنكرياس ، وتم تصويرها في اليومين 11 و 14 بعد إدخال النافذة. أشرطة المقياس = 30 ميكرومتر. تم تصويره باستخدام طول موجي مثير يبلغ 960 نانومتر ، وقوة الليزر 10٪. ممثل 6 فئران مصورة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 10
الشكل 10: التغيرات الديناميكية في تسلل الخلايا المناعية أثناء انقلاب الغدة الثديية الطبيعي. باستخدام الشبكة المعدنية المضمنة في نافذة التصوير ، يمكن تصوير نفس الموقع أثناء إعادة تشكيل الأنسجة الطبيعية ، مثل أثناء التفاف الغدة الثديية. لمواصلة تقييم وظائف نوافذ السيليكون في مراقبة التغيرات الديناميكية مثل تسلل الخلايا المناعية ، أنثى C57BL/6J x BALB / c ACTB-ECFP تبلغ من العمر 12 أسبوعا ؛ تم تصوير ماوس LysM-eGFP مع نافذة تصوير تم إدخالها فوق الغدة الثديية البطنية في اليومين 2 و 4 بعد التفاف الغدة الثديية. تظهر العدلات باللون الأخضر (الأسهم البيضاء). تم تصور نشاط العدلات elastase عن طريق حقن مسبار الفلورسنت Neutrophil Elastase قبل 4 ساعات من بدء التصوير ، ويظهر باللون الأحمر (أو الأصفر عند تشاركه مع العدلات). تظهر الخلايا الظهارية باللون الأزرق. اللقطات هي إسقاط أقصى كثافة لخمس صور على طول المحور Z (عمق 100-150 مم). الصور مأخوذة من فيلمي 3A و 3B ، وفي صور الصف السفلي ، يتم عرض إشارة CFP فقط ويتم تمييز الصور بخط أحمر متقطع لتصور نفس المواقع داخل الأنسجة في نقطتين زمنيتين مختلفتين. أشرطة المقياس = 30 ميكرومتر. تم تصويره باستخدام أطوال موجية مثيرة تبلغ 960 نانومتر و 1080 نانومتر ، وطاقة الليزر بنسبة 10٪ و 15٪ على التوالي. ممثل لأربعة فئران مصورة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 11
الشكل 11: يمكن تتبع تكوين ورم خبيث سرطاني بمرور الوقت. فأر ذكر C57BL/6J يبلغ من العمر 10 أسابيع تم حقنه ب 1 × 105 KPC-BL/6-1199 خلايا سرطان البنكرياس التي تعبر عن بروتين الفلورسنت السماوي المترافق الموضعي النووي H2B (H2B-CFP) من خلال الوريد البابي في وقت إدخال النافذة. تم إجراء تصوير الكبد من خلال نافذة جانبية 24 ساعة (اليوم 1) بعد الحقن وفي ثلاث نقاط زمنية لاحقة (حتى 9 أيام) ، كما هو موضح. يشار إلى خلية سرطانية واحدة مرئية في اليومين 1 و 3 بعد الحقن بأسهم بيضاء. كما تم تصور الإشارة التوافقية الثانية من ألياف الكولاجين في القناة السماوية (الأسهم الصفراء). الصور من نفس الماوس في كل نقطة زمنية مختلفة. صور أحادية المستوى z تم التقاطها بعمق يتراوح بين 300 ميكرومتر و350 ميكرومتر. أشرطة المقياس = 30 ميكرومتر. تم تصويره باستخدام طول موجي للإثارة يبلغ 880 نانومتر. قوة الليزر بنسبة 8٪. ممثل لثلاثة فئران مصورة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الفيلم 1: يتم تحمل نوافذ السيليكون imaging بشكل جيد في الفئران. يظهر الفيلم ماوس C57BL/6J البالغ من العمر 9 أسابيع بعد 14 يوما من إدخال النافذة. لا يظهر الماوس أيا من السلوكيات القياسية المرتبطة بالألم (على سبيل المثال ، الاستمالة السيئة أو العيون المغلقة أو الخمول). تمثل ستة فئران مسجلة ، وتتفق مع أكثر من 100 فأر لوحظت بعد زرع النافذة بنجاح. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

الفيلم 2: التصوير تحت الخلوي لخلايا سرطان البنكرياس المزروعة تقويميا. تم حقن خلايا iGFP-1199 بشكل تقويمي في البنكرياس لفأر C57BL/6J يبلغ من العمر 7 أسابيع وتم تصويرها في اليوم 11 بعد حقن الخلايا السرطانية وإدخال النافذة. الفيلم عبارة عن إسقاط أقصى كثافة من ست صور على طول المحور Z ويتم استخراجه من فترة تصوير مدتها 2 ساعة. الطابع الزمني (h:min:s:ms). ممثل ستة فئران مصورة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

الفيلم 3: التغيرات في تسلل الخلايا المناعية في ACTB-ECFP. الفئران LysM-eGFP أثناء الانقلاب. أنثى C57BL/6J × BALB/c ACTB-ECFP; تم تربية فئران LysM-eGFP التي تعبر عن GFP في الخلايا النخاعية (بشكل رئيسي في الخلايا المحببة ولكن أيضا في البلاعم) ، و ECFP في جميع الخلايا (ولكن أعلى في الخلايا الظهارية) في عمر 8 أسابيع. بعد الولادة ، تم تطبيع الجراء إلى ستة جراء لكل ماوس. في اليوم 10 بعد الولادة ، تم فطام الجراء وتم إدخال نوافذ تصوير الغدة الثديية البطنية. تظهر الخلايا النخاعية باللون الأخضر. يظهر نشاط العدلات elastase ، المسمى باستخدام مسبار العدلات Elastase 680 FAST الذي يتم حقنه قبل 4 ساعات من بدء التصوير ، باللون الأحمر (سيظهر باللون الأصفر عند توطينه مع العدلات) ؛ وتظهر الخلايا الظهارية باللون الأزرق. الأفلام هي إسقاط أقصى كثافة لخمس صور على طول محور Z (عمق 100-150 ميكرومتر). (أ) التصوير في اليوم 2 من دوران الغدة الثديية. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. تم تصويره باستخدام أطوال موجية مثيرة تبلغ 960 نانومتر و 1080 نانومتر ، وطاقة الليزر بنسبة 10٪ و 15٪ على التوالي. (ب) التصوير في اليوم 4 من دوران الغدة الثديية. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الفيلم من نفس منطقة الفأر والأنسجة مثل الفيلم 3A. (C) تكبير أعلى لمنطقة ذات أهمية من الفيلم 3B ، حيث يظهر اثنين من العدلات يتفاعلان مع بعضهما البعض والخلايا الظهارية للغدة الثديية. يمكن ملاحظة تكوين نتوءات غشائية عابرة عند الحافة الأمامية أثناء هجرة العدلات. الطابع الزمني (h:min:s:ms). ممثل لأربعة فئران مصورة. يرجى النقر هنا لتنزيل Movie 3A. يرجى النقر هنا لتنزيل Movie 3B. يرجى النقر هنا لتنزيل Movie 3C.     

الفيلم 4: التغيرات في تسلل الخلايا المناعية في الفئران c-fms-EGFP أثناء الانقلاب. تم تربية إناث الفئران C57BL/6J c-fms-EGFP ، مع البلاعم التي تحمل علامة GFP ، في عمر 8 أسابيع. بعد الولادة ، تم تعديل الفضلات إلى ستة جراء لكل ماوس. في اليوم 10 بعد الولادة ، تم فطام الجراء وتم إدخال نوافذ تصوير الغدة الثديية البطنية. الفيلم ، الذي تم الحصول عليه في يوم الالتفاف 1 (بعد يوم واحد من إدخال النافذة) ، يسلط الضوء على تسلل البلاعم البارزة أثناء الانقلاب. تظهر البلاعم باللون الأخضر ، وتظهر ألياف الكولاجين (الجيل التوافقي الثاني) باللون الأزرق ، وتظهر الأوعية الدموية باللون الأحمر (Lectin-DyLight 594). شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الصور هي إسقاطات قصوى الكثافة لخمس صور على طول المحور Z (عمق 100-150 أم). تم تصويره باستخدام أطوال موجية مثيرة 960 نانومتر و 800 نانومتر ، وطاقة الليزر بنسبة 10٪ و 15٪ على التوالي. الطابع الزمني (h:min:s:ms). ممثل لثلاثة فئران مصورة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

الرمز التكميلي 1. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الرمز التكميلي 2. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تعد نوافذ التصوير داخل الحيوية أدوات مهمة للتصور المباشر للعمليات الفسيولوجية والمرضية بدقة خلوية أثناء تكشفها بمرور الوقت. يتغلب الإجراء الجديد الموصوف لصب وإدخال نوافذ تصوير مرنة من السيليكون في الفئران على بعض المشكلات الأكثر شيوعا مع نوافذ التصوير المستخدمة حاليا (الإفرازات والكسر والتداخل مع التنقل العادي) ، ويوفر أمانا إضافيا للماوس ، ويزيد من إمكانية الوصول إلى هذه التقنية.

تتكون نوافذ التصوير الأكثر استخداما على نطاق واسع من إطار معدني يحمل غطاء زجاجي. تتمثل إحدى العقبات الرئيسية أمام استخدام هذه النوافذ النموذجية في أن تأمين الحلقة المعدنية ينطوي على إجراءات خياطة شاقة ، مما يتطلب موظفين حاصلين على تدريب جراحي متقدم. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تصنيع الإطارات مكلف ويتطلب معدات متخصصة. تتغلب نوافذ PDMS على كلتا المشكلتين. الإجراء الخاص بإدخال نوافذ PDMS يزيل الخياطة ، مما يقلل بشكل كبير من الحاجز أمام تعلم التقنية. المواد اللازمة لإنتاج النوافذ هي أيضا غير مكلفة ويمكن شراؤها بسهولة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تكييف كل من شكل النافذة والإجراء الجراحي لتصوير الأعضاء المختلفة ، بما في ذلك الغدة الثديية والكبد والبنكرياس والطحال والأمعاء.

في حين أن نوافذ التصوير داخل الحيوية الحالية تسمح بالتصوير الطولي لبضعة أيام عادة ، فإن العديد من المشكلات الشائعة تحد من استخدام هذه النوافذ لفترات طويلة من الزمن. يمكن أن يتداخل وزن وحجم النوافذ الزجاجية مع الحركة الحرة للفئران ، ويمكن أن يتراكم الإفرازات ضد النافذة. يمكن أن تتلف الفئران أيضا الغطاء الزجاجي ، مما يؤدي إلى جروح وعدوى. في المقابل ، يحافظ الإجراء الموصوف هنا على نفس المستوى من إمكانية الوصول إلى الأنسجة مع تقليل الضيق للحيوانات. PDMS هو بوليمر اصطناعي آمن ومستقر بيولوجيا يستخدم على نطاق واسع للتطبيقات الطبية الحيوية في البشر ، مثل أجهزة توصيل الأدوية ، وجراحة إعادة بناء الوجه ، وزرع الثدي. بالإضافة إلى زيادة تحمل الحيوانات للنافذة، فإن استخدام مادة خاملة بيولوجيا، على عكس الزجاج، مهم بشكل خاص للدراسات التي تنطوي على الجهاز المناعي، حيث يكون الالتهاب الموضعي تأثيرا مربكا. بالإضافة إلى ذلك ، هناك تحسن كبير يتمثل في القضاء على الغرز ، حيث ستعض الفئران وتسحبها ، مما قد يتسبب في سقوط نوافذ التصوير الزجاجية ذات الإطار المعدني. تمت معالجة هذه المشكلة جزئيا بواسطة جيل أحدث من النوافذ التي تم تصميمها بحيث يتم إخفاء الغرز في أخدود9. ومع ذلك ، تتطلب هذه الاستراتيجية الأخيرة خياطة سلسلة المحفظة ، وهو إجراء معقد وعرضة للخطأ وغالبا ما يتسبب في سحب الغرز بشكل ضيق للغاية ، مما يؤدي إلى نخر الأنسجة والألم. لذلك ، فإن القدرة على لصق النافذة في مكانها تشكل ميزة رئيسية لنهج نافذة السيليكون. علاوة على ذلك ، فإن النافذة مصنوعة من مادة مرنة ومتينة ذات وزن ضئيل ، مما يقلل من تأثيرها على حركة الحيوان ، كما تم تقييمه سابقا في مقارنة النوافذ التي استخدمت السيليكون بدلا من المعدن لحمل غطاء زجاجي17. من خلال القضاء التام على الغطاء الزجاجي ، تقضي نافذة السيليكون على المشكلات المتعلقة بكل من الإطارات المعدنية والزجاج. علاوة على ذلك ، تسمح مرونة النافذة بإدخالها بسهولة وتقلل من قوة الإجهاد الناجمة عن لصق سطح صلب بالأعضاء ، مما يقلل من خطر حدوث تلف دائم للأنسجة التي تتم ملاحظتها. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن النافذة أسهل بكثير في الإدخال والاحتفاظ بها في مكانها ، فإن الإجراء العام يستغرق وقتا أقل ، مما يحد من الآثار الجانبية المحتملة بسبب التخدير لفترات طويلة. بالنسبة للإدخال فوق الكبد ، يكون الفرق في وقت الإجراء كبيرا بشكل خاص ، من 45 دقيقة للنوافذ ذات الإطارات المعدنية إلى 15 دقيقة لنوافذ السيليكون. في الواقع ، في حين أن إدخال الإطار المعدني فوق الكبد يتطلب تشريح عملية الخناق (الغضروف في نهاية القص) ، والذي يحتمل أيضا أن يكون مؤلما ويسبب التهابا مستمرا ، فإن هذا التشريح غير ضروري لإدخال نافذة السيليكون. وأخيرا، توفر نافذة التصوير المعروضة في هذا العمل مزايا إضافية فيما يتعلق بالتطبيقات الممكنة. على سبيل المثال ، على عكس النوافذ الزجاجية ، توفر نوافذ السيليكون سهولة الوصول إلى الأنسجة ، لذلك يمكن حقن الخلايا السرطانية أو الأصباغ الفلورية أو الأدوية مباشرة من خلال النافذة.

تم مؤخرا وصف نافذة تصوير سيليكون أخرى قائمة على PDMS مناسبة للإدراج في مجموعة متنوعة من المواقع التشريحية ، بما في ذلك الغدة الثديية ،18. تم تشكيل هذه النافذة لتوليد شكل وحافة متخصصة تسمح بالزرع السريع للنافذة دون الحاجة إلى غرز أو غراء. في المقابل ، لا تتطلب نافذة السيليكون المعروضة هنا أي قالب خاص ، والأهم من ذلك ، يمكن قطعها لشكلها أثناء الإجراء الجراحي للتكيف مع الموقع التشريحي والماوس الفردي. على الرغم من أن البروتوكول الموصوف هنا يتطلب استخدام الغراء ، إلا أن هذا الشرط الإضافي يسمح بتصوير أعضاء البطن ، بما في ذلك الكبد والطحال. علاوة على ذلك ، تسمح نافذة السيليكون الموصوفة هنا بتضمين شبكة من الفولاذ المقاوم للصدأ داخل النافذة ، والتي توفر معالم مرجعية. تمكن هذه المعالم من تتبع نفس الموقع الدقيق بمرور الوقت وتسهل التصوير المتكرر لنفس الموقع على مدار جلسات متعددة (التصوير الطولي) لدراسة العمليات التي تستغرق أياما إلى أسابيع مثل تطور الآفات النقيلية.

باختصار ، تم تطوير نافذة تصوير سيليكون لاستخدامها في IVM الطولي للغدة الثديية أو أعضاء البطن. النافذة واضحة بصريا ومتينة للغاية وغير مكلفة. تقلل بساطة إجراء إدخال النافذة من المهارات التقنية المطلوبة لتنفيذ نهج التصوير داخل الحيوية القائمة على النوافذ. تسمح قدرة النافذة على التكيف مع مواقع الأنسجة المتنوعة بتنفيذ IVM في مجموعة واسعة من الدراسات البيولوجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

M.E. هو عضو في المجلس الاستشاري البحثي لشركة brensocatib لشركة Insmed، Inc. ؛ عضو في المجلس الاستشاري العلمي لشركة Vividion Therapeutics, Inc.؛ مستشار لشركة Protalix, Inc.; وتمتلك أسهما في شركة أجيوس للأدوية، وشركة D.A.T. هي المؤسس المشارك لشركة Mestag Therapeutics، وهي عضو في المجلس الاستشاري العلمي وتمتلك أسهما في Mestag Therapeutics و Leap Therapeutics و Surface Oncology و Cygnal Therapeutics. ولا يعلن المؤلفون الآخرون عن أي مصالح متنافسة.

Acknowledgments

نشكر روب إيفرت على مساعدته في تصميم وتحسين شبكات الفولاذ المقاوم للصدأ المقطوعة بالليزر. تم دعم هذا العمل من قبل مركز السرطان CSHL (P30-CA045508) وأموال ل M.E. من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) (1R01CA2374135 و 5P01CA013106-49) ؛ CSHL ونورثويل هيلث; مؤسسة عائلة طومسون؛ السباحة في جميع أنحاء أمريكا. ومنحة من مؤسسة سيمونز إلى CSHL. تم دعم MS من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة جائزة تدريب العلماء الطبيين (T32-GM008444) والمعهد الوطني للسرطان التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة 1F30CA253993-01. L.M. مدعوم من قبل زمالة ما بعد الدكتوراه من مؤسسة جيمس إس ماكدونيل. حصل J.M.A. على زمالة ما بعد الدكتوراه من معهد أبحاث السرطان / Irvington (جائزة CRI # 3435). يتم دعم D.A.T. من قبل مختبر مؤسسة لوستغارتن المخصص لأبحاث سرطان البنكرياس ومؤسسة عائلة طومسون. تم إنشاء الرسوم المتحركة مع Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape 3M 70200770819
Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2 Ethicon  N267H
ACTB-ECFP mice Jackson Laboratory 22974
AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole) Vector Laboratories  SK-4200
Alcohol swabs BD  326895
Anesthesia system Molecular Imaging Products Co.
Acqknowledge software and sensors  BIOPAC ACK100W, ACK100M, TSD110
Betadine spray  LORIS 109-08
c-fms-EGFP (MacGreen) mice Jackson Laboratory 18549
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 664
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) Invitrogen 14-0451-82
CD68 Antibody Abcam ab125212
Curity gauze sponges  Covidien
Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP)  Abcam ab6885
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)  Abcam ab97064
Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP)  Abcam ab102182
Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear Electron Microscopy Sciences 24236-10 Two-part, 10:1 mixing ratio
Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness  Electron Microscopy Sciences 72296-08
Ender-3 Pro 3D printer Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD
Far Infrared Heated blanket Kent Scientific RT-0520
Fc Receptor Blocker Innovex Biosciences NB309
Fiji imaging processing package https://imagej.net/software/fiji/
FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515) Invitrogen F8795
Gating system: BIOPAC Systems Inc. The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems.
Acqknowledge software  ACK100W, ACK100M
Diff. Amp. Module, C Series  DA100C
Dual Gating Sys small animal DTU200 
MP160 for Windows - Analysis system MP160WSW 
MouseOx Plus 120V  MOX-120V;015000 
Pressure Pad  TSD110 
Gelfoam Pfizer 9031508 Absorbable gelatin sponge
Hardened fine scissors Fine Science Tools 14090-11 Two pairs; stainless steel, sharp-sharp
tips, straight tip, 26 mm
cutting edge, 11 cm length
Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody R&D Systems AF3667
Hot bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45 Turn on approximately 30 min
before use; sterilize tools at >200
°C for 30 s
Imaris  Bitplane www.bitplane.com
Immersion medium Immersol W 2010 Zeiss 444969-0000-000 
Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc BD 324912
Isoflurane (Fluriso) VetOne 502017
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594 Vector Laboratories  DL-1177-1
LysM-eGFP mice www.mmrrc.org 012039-MU
Micro dissecting forceps Roboz RS-5135 Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length
Micro dissecting forceps Roboz RS-5153 1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip
width, 4" length
MTS MiniBionix II 808 MTS Systems Servohydraulic material testing machine
Neutrophil Elastase 680 FAST probe PerkinElmer NEV11169
Nitrogen General Welding Supply Corp.
Oxygen General Welding Supply Corp.
Polylactic acid filament Hatchbox 1.75 mm diameter
ProLong Diamond Antifade Mountant Invitrogen P36970
Puralube ophthalmic ointment Dechra  NDC17033-211-38
Reflex 7 wound clips Roboz Surgical RS-9255
Stainless steel grid Fotofab One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square.  
Surface Treated SterileTissue Culture Plates Fisher Scientific FB012929 Lid used as curing surface for imaging windows
TriM Scope Multiphoton Microscope  LaVision BioTec Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes:
T560LP
T665LPXXR
T495lxpr
Vetbond 3M 70200742529
VWR micro cover glass VWR 48404-453

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dondossola, E., et al. Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone. Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).
  2. Haeger, A., et al. Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche. Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184 (2020).
  3. Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
  4. Eickhoff, S., et al. Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions. Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).
  5. Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
  6. Sammicheli, S., et al. Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses. Science Immunology. 1 (4), (2016).
  7. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  8. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).
  9. Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
  10. Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. Recording the wild lives of immune cells. Science Immunology. 3 (27), (2018).
  11. Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), 29917 (2014).
  12. Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818 (2016).
  13. Anderson, T. L. Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , CRC Press, Taylor & Francis Group. Florida. (2005).
  14. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088 (2013).
  15. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  16. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  17. Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. Intravital. 5 (1), 1125562 (2016).
  18. Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).

Tags

أبحاث السرطان العدد 179
التصوير الطولي داخل الحيوية من خلال نوافذ السيليكون الشفافة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maiorino, L., Shevik, M., Adrover,… More

Maiorino, L., Shevik, M., Adrover, J. M., Han, X., Georgas, E., Wilkinson, J. E., Seidner, H., Foerschner, L., Tuveson, D. A., Qin, Y. X., Egeblad, M. Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows. J. Vis. Exp. (179), e62757, doi:10.3791/62757 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter