Imaging intravitale longitudinale tramite finestre in silicone trasparente

Summary

Viene qui presentato un approccio per l'imaging intravitale a lungo termine utilizzando finestre in silicone otticamente chiare che possono essere incollate direttamente al tessuto / organo di interesse e alla pelle. Queste finestre sono più economiche e versatili di altre attualmente utilizzate sul campo e l'inserimento chirurgico provoca un'infiammazione e un disagio limitati agli animali.

Abstract

La microscopia intravitale (IVM) consente la visualizzazione del movimento, della divisione e della morte cellulare alla risoluzione di una singola cellula. L'IVM attraverso finestre di imaging inserite chirurgicamente è particolarmente potente perché consente l'osservazione longitudinale dello stesso tessuto per giorni o settimane. Le tipiche finestre di imaging comprendono una copertura di vetro in una struttura metallica biocompatibile suturata sulla pelle del topo. Queste finestre possono interferire con il libero movimento dei topi, suscitare una forte risposta infiammatoria e fallire a causa di vetri rotti o suture strappate, ognuna delle quali può richiedere l'eutanasia. Per risolvere questi problemi, sono state sviluppate finestre per l'imaging a lungo termine di organi addominali e ghiandole mammarie da un sottile film di polidimetilsilossano (PDMS), un polimero siliconico otticamente chiaro precedentemente utilizzato per le finestre di imaging cranico. Queste finestre possono essere incollate direttamente ai tessuti, riducendo il tempo necessario per l'inserimento. PDMS è flessibile, contribuendo alla sua durata nei topi nel tempo: sono stati testati fino a 35 giorni. L'imaging longitudinale è l'imaging della stessa regione tissutale durante sessioni separate. Una griglia in acciaio inossidabile è stata incorporata all'interno delle finestre per localizzare la stessa regione, consentendo la visualizzazione di processi dinamici (come l'involuzione della ghiandola mammaria) nelle stesse posizioni, a giorni di distanza. Questa finestra in silicone ha anche permesso il monitoraggio di singole cellule tumorali disseminate che si sviluppano in micro-metastasi nel tempo. Le finestre in silicone utilizzate in questo studio sono più semplici da inserire rispetto alle finestre in vetro con telaio metallico e causano un'infiammazione limitata dei tessuti ripresi. Inoltre, le griglie incorporate consentono un tracciamento diretto della stessa regione tissutale in ripetute sessioni di imaging.

Introduction

La microscopia intravitale (IVM), l'imaging dei tessuti in animali anestetizzati, offre approfondimenti sulla dinamica degli eventi fisiologici e patologici a risoluzione cellulare nei tessuti intatti. Le applicazioni di questa tecnica variano ampiamente, ma IVM è stato determinante nel campo della biologia del cancro per aiutare a chiarire come le cellule tumorali invadono i tessuti e metastatizzano, interagiscono con il microambiente circostante e rispondono ai farmaci ^1,2,3. Inoltre, l'IVM è stata la chiave per far progredire la comprensione dei complessi meccanismi che governano le risposte immunitarie fornendo approfondimenti complementari agli approcci di profilazione ex vivo (ad esempio, citometria a flusso). Ad esempio, esperimenti di imaging intravitale hanno rivelato dettagli sulle funzioni immunitarie in relazione alla migrazione cellulare e al contatto cellula-cellula e hanno offerto una piattaforma per quantificare le dinamiche spazio-temporali in risposta a lesioni o infezioni 4,5,6,7. Molti di questi processi possono anche essere studiati attraverso la colorazione istologica, ma solo IVM consente il tracciamento dei cambiamenti dinamici. Infatti, mentre una sezione istologica offre un'istantanea del tessuto in un dato momento, l'imaging intravitale può tracciare eventi intercellulari e subcellulari all'interno dello stesso tessuto nel tempo. In particolare, i progressi nell'etichettatura della fluorescenza e lo sviluppo di reporter molecolari hanno permesso di correlare eventi molecolari con comportamenti cellulari, come la proliferazione, la morte, la motilità e l'interazione con altre cellule o la matrice extracellulare. La maggior parte delle tecniche IVM si basa sulla microscopia a fluorescenza, che a causa della diffusione della luce, rende difficile l'imaging di tessuti più profondi. Il tessuto di interesse, quindi, ha spesso bisogno di essere esposto chirurgicamente con una procedura spesso invasiva e terminale. Pertanto, a seconda del sito dell'organo, il tessuto può essere ripreso continuamente per un periodo che varia da pochi a 40 h⁸. In alternativa, l'inserimento chirurgico di una finestra di imaging permanente consente l'imaging dello stesso tessuto in sequenza per un periodo da giorni a settimane ^7,9.

Lo sviluppo di nuove finestre di imaging è stato evidenziato come una necessità tecnologica per migliorare ulteriormente gli approcci di imaging intravitale¹⁰. La finestra di imaging intravitale prototipica è un anello metallico contenente una copertura di vetro fissata alla pelle con punti di sutura¹¹. L'interferenza con la libera circolazione, l'accumulo di essudato e il danneggiamento del coperchio di vetro sono problemi comuni riscontrati con l'uso di tali finestre. Inoltre, la finestra prototipica richiede una produzione specializzata e la procedura chirurgica può richiedere una formazione approfondita. Per affrontare questi problemi, il polidimetilsilossano (PDMS), un polimero siliconico, che è stato precedentemente utilizzato nelle finestre craniche per l'imaging a lungo termine nel cervello¹², è stato adattato per l'uso nell'imaging degli organi addominali e delle ghiandole mammarie. Qui, viene presentato un metodo dettagliato per generare finestre in silicone basate su PDMS, incluso come gettare la finestra attorno a una griglia in acciaio inossidabile per fornire punti di riferimento per l'imaging ripetuto delle stesse regioni tissutali. Inoltre, viene descritta una procedura chirurgica semplice e priva di punti per l'inserimento della finestra sugli organi addominali o sulla ghiandola mammaria. Questo nuovo approccio supera alcuni dei problemi più comuni con le finestre di imaging attualmente utilizzate e aumenta l'accessibilità dell'imaging intravitale longitudinale.

Protocol

Tutte le procedure descritte sono state eseguite in conformità con le linee guida chirurgiche del laboratorio di Cold Spring Harbor ed erano state approvate dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso il laboratorio di Cold Spring Harbor.

1. Fusione della finestra in silicone

1. Preparare il polimero siliconico (PDMS) mescolando l'elastomero di base e l'agente polimerizzante in un rapporto 10:1 (v/v).
2. Getta una finestra depositando una piccola quantità di PDMS su una superficie sterile e liscia e regola il rapporto volume-area allo spessore desiderato.
   NOTA: l'utilizzo di 200 mg di soluzione polimerica per un cerchio di 22 mm di diametro sul coperchio di un coperchio a 24 piastre si traduce in un buon compromesso tra robustezza della finestra e chiarezza ottica.
3. Opzionale: per fornire punti di riferimento per l'imaging ripetuto delle stesse regioni tissutali, premere leggermente una griglia in acciaio inossidabile nel silicone dopo che il PDMS si trova sulla superficie di fusione desiderata.
4. Per rimuovere le bolle d'aria, posizionare la superficie rivestita in un essiccatore sottovuoto per 45 minuti per degassare il polimero.
5. Polimerizzare le finestre in silicone in forno a 80 °C per 45 min.
6. Segnare il polimero ai bordi dello stampo e staccare delicatamente le finestre indurite dalla superficie utilizzata per la fusione con pinza.
7. Prima dell'intervento chirurgico, sterilizzare le finestre in autoclave.

2. Preparare il mouse per l'inserimento della finestra in silicone

1. Anestetizzare il mouse in una camera di induzione utilizzando il 4% (v/v) di isoflurano. Spostare il mouse su un cuscinetto riscaldante sul tavolo chirurgico, posizionare il mouse nella maschera nasale per anestesia e abbassare la concentrazione di isoflurano al 2% per il mantenimento durante l'intervento chirurgico.
2. Controllare la profondità dell'anestesia pizzicando le dita dei piedi degli arti posteriori. Non procedere fino a quando il mouse non è inattivo e non mostra la risposta riflessa al pizzico della punta.
3. Applicare lubrificante oftalmico sugli occhi per evitare che si secchino e prevengano traumi.
4. Somministrare analgesia preventiva (buprenorfina 0,05 mg/kg) per via sottocutanea.
5. Rasare il sito chirurgico e rimuovere completamente i peli con una crema depilatoria.
6. Applicare la soluzione di povidone-iodio (10% v/ v) ed etanolo (70% v / v) consecutivamente 3 volte per prevenire l'infezione del sito chirurgico.

3. Inserimento di una finestra ventrale per l'imaging nel fegato; adattabile per altri organi addominali (Figura 1)

1. Posizionare il mouse in posizione supina.
2. Fai un'incisione di 10 mm a partire da 3 mm verso il basso dal processo xifoide usando forbici e pinze sterili.
3. Rimuovere una sezione di pelle di 1-1,5 cm² lungo la linea mediana.
4. Utilizzare un secondo paio di forbici sterili e pinze per rimuovere una sezione del peritoneo leggermente più piccola della sezione di pelle.
5. Opzionale: per visualizzare una porzione più grande del fegato, utilizzare tamponi di cotone sterili inumiditi con soluzione salina sterile per spingere il fegato verso il basso dal diaframma rivelando il legamento falciforme che collega il fegato al diaframma. Tagliare il legamento facendo attenzione a non tagliare la vena cava inferiore.
6. Prelevare l'adesivo chirurgico con una siringa da 31 G, applicarne una piccola quantità sulla superficie del fegato attorno ai bordi dell'area da visualizzare. Questo adesivo crea un sigillo circolare, lasciando intatta l'area centrale per l'imaging.
   ATTENZIONE: Limitare l'adesivo a piccole goccioline che formano un motivo circolare attorno all'area di imaging. Il tessuto immediatamente a contatto con l'adesivo non può essere ripreso. Non è necessario asciugare il tessuto prima di applicare l'adesivo.
   NOTA: qualsiasi adesivo a base di cianoacrilato può essere utilizzato con successo per questa procedura. L'adesivo chirurgico garantisce la sterilità. Per le procedure terminali, le super colle per tutti gli usi producono buoni risultati.
7. Posizionare la finestra con una pinza e tenerla saldamente contro il fegato fino a quando l'adesivo non si è asciugato (~2 min).
8. Piegare i bordi della finestra sotto il peritoneo.
9. Con una siringa, depositare una piccola quantità di adesivo chirurgico sui bordi della finestra che ora si trovano sotto il peritoneo. Spingere verso il basso sul peritoneo con una pinza per fissarlo alla finestra.
10. Allo stesso modo, depositare una piccola quantità di adesivo chirurgico sul peritoneo prima di spingere verso il basso sulla pelle con una pinza per fissarla al peritoneo.
    NOTA: Se eseguita correttamente, un'area circolare di tessuto epatico deve ora essere visibile attraverso la finestra.
11. Applicare la colla intorno ai bordi della finestra per creare un bordo che aiuterà a prevenire la crescita della pelle sopra la finestra.
    ATTENZIONE: Se la procedura viene eseguita utilizzando tecniche chirurgiche sterili e la finestra viene sterilizzata prima dell'inserimento, è sufficiente sigillare la ferita con adesivo chirurgico per evitare infezioni. Tuttavia, la mancata osservanza di tecniche asettiche adeguate durante l'inserimento chirurgico o la chiusura imperfetta può portare a infezioni evidenti o subcliniche e all'essiccazione del tessuto.

4. Inserimento di una finestra laterale per l'imaging nel fegato; compatibile con l'iniezione concomitante di cellule tumorali nella vena porta (Figura 2)

1. Posizionare il mouse sulla posizione del decubito laterale sinistro
2. Fai un'incisione di 10 mm sul fianco destro 3 mm sotto l'arco costale usando forbici e pinze sterili.
3. Rimuovere una sezione di pelle di 1 cm² .
4. Utilizzare un secondo paio di forbici sterili e pinze per rimuovere una sezione del peritoneo leggermente più piccola della sezione di pelle.
5. Prelevare l'adesivo chirurgico con una siringa da 31 G, applicarne una piccola quantità sulla superficie del fegato attorno ai bordi dell'area da visualizzare.
   ATTENZIONE: Limitare l'adesivo a piccole goccioline che formano un motivo circolare attorno all'area di imaging. Il tessuto immediatamente a contatto con l'adesivo non può essere ripreso.
   NOTA: qualsiasi adesivo a base di cianoacrilato può essere utilizzato con successo per questa procedura. L'adesivo chirurgico garantisce la sterilità. Per le procedure terminali, le super colle per tutti gli usi producono buoni risultati.
6. Posizionare la finestra con una pinza e tenerla saldamente contro il fegato fino a quando l'adesivo non si è asciugato (~2 min).
7. Piegare i bordi della finestra sotto il peritoneo.
8. Con una siringa, depositare una piccola quantità di adesivo chirurgico sui bordi della finestra che ora si trovano sotto il peritoneo. Spingere verso il basso sul peritoneo con una pinza per fissarlo alla finestra.
9. Allo stesso modo, depositare una piccola quantità di adesivo chirurgico sul peritoneo prima di spingere verso il basso sulla pelle con una pinza per fissarla al peritoneo.
   NOTA: Se eseguita correttamente, un'area circolare di tessuto epatico deve ora essere visibile attraverso la finestra.
10. Applicare la colla intorno ai bordi della finestra per creare un bordo che aiuterà a prevenire la crescita della pelle sopra la finestra.
11. Se è necessaria un'iniezione di vena porta:
    1. Posizionare il mouse in posizione supina.
    2. Fai un'incisione di 10 mm partendo dal processo xifoide nella pelle.
    3. Usando un secondo paio di forbici sterili e pinze, fare un'incisione di 10 mm nel peritoneo.
    4. Immergere due tamponi di cotone in soluzione salina sterile.
    5. Utilizzare i tamponi di cotone per tirare delicatamente l'intestino su una garza sterile inumidita con soluzione salina sterile, facendo attenzione a non torcere o comunque sconvolgere l'orientamento.
    6. Continuare a spostare l'intestino dalla cavità addominale fino a quando la vena porta è visibile sul lato destro dell'addome.
    7. Inserire un ago da 31-33 G 5-7 mm caudale al punto di ingresso della vena porta nel fegato, assicurandosi di procedere all'interno del vaso sanguigno e non attraverso di esso.
    8. Iniettare lentamente le cellule tumorali (risospese in 100 μL di PBS sterile).
       NOTA: Per questo esperimento la linea cellulare del cancro pancreatico amurina (ad esempio, KPC-BL/6-1199) può essere coltivata in mezzi DMEM completi e 1 x 10⁵ cellule iniettate in 100 μL di PBS sterile.
    9. Per prevenire il sanguinamento, immediatamente dopo aver ritirato l'ago, applicare una leggera pressione sul sito di iniezione con un piccolo pezzo di spugna chirurgica per 1-2 minuti.
    10. Dopo che la pressione è stata rilasciata, monitorare il sito per 1-2 minuti per garantire l'emostasi.
    11. Utilizzando tamponi di cotone inumiditi, riportare l'intestino nella cavità addominale seguendo l'orientamento fisiologico dell'organo.
    12. Usando una pinza sterile, inserire la finestra immediatamente sotto il peritoneo, sul lato sinistro della cavità addominale del mouse.
    13. Sutura con suture di seta 4-0 e pinzatura dell'incisione della linea mediana con clip avvolte in acciaio inossidabile da 7 mm.
    14. Spostare il mouse in posizione di decubito laterale sinistro
    15. Fai un'incisione di 10 mm sul fianco destro 3 mm sotto l'arco costale attraverso la pelle usando forbici e pinze sterili.
    16. Rimuovere una sezione di 1 cm² di pelle intorno all'incisione.
    17. Utilizzare un secondo paio di forbici sterili e pinze per rimuovere una sezione del peritoneo leggermente più piccola della sezione di pelle.
    18. Tirare la finestra in posizione sopra il fegato prima di incollarla in posizione, come descritto nei passaggi 4.8-4.10.

5. Inserimento della finestra per l'imaging nel pancreas (Figura 3)

1. Posizionare il mouse sulla posizione del decubito laterale destro.
2. Fai un'incisione di 10 mm sul fianco sinistro 3 mm sotto l'arco costale usando forbici e pinze sterili.
3. Rimuovere una sezione di 1 cm² di pelle intorno all'incisione.
4. Utilizzare un secondo paio di forbici sterili e pinze per rimuovere una sezione del peritoneo leggermente più piccola della sezione di pelle.
5. Utilizzando tamponi di cotone sterili imbevuti di soluzione salina sterile, tirare delicatamente la milza per visualizzare il pancreas. Procedere al riposizionamento del pancreas con i tamponi di cotone inumiditi per rendere più visibile la superficie attraverso l'incisione.
   NOTA: A questo punto, le cellule tumorali pancreatiche possono essere iniettate ortotopicamente nel pancreas se fa parte del progetto sperimentale.
6. Prelevare l'adesivo chirurgico con una siringa da 31 G, applicarne una piccola quantità sulla superficie del pancreas attorno ai bordi dell'area da fotografare.
   ATTENZIONE: Limitare l'adesivo a piccole goccioline che formano un motivo circolare attorno all'area di imaging. Il tessuto immediatamente a contatto con l'adesivo non può essere ripreso.
7. Posizionare la finestra con una pinza e tenerla saldamente contro il pancreas fino a quando l'adesivo non si è asciugato (~2 min).
8. Piegare i bordi della finestra sotto il peritoneo.
9. Con una siringa, depositare una piccola quantità di adesivo chirurgico sui bordi della finestra che ora si trovano sotto il peritoneo. Spingere verso il basso sul peritoneo con una pinza per fissarlo alla finestra.
10. Allo stesso modo, depositare una piccola quantità di adesivo chirurgico sul peritoneo prima di spingere verso il basso sulla pelle con una pinza per fissarla al peritoneo.
    NOTA: Se eseguita correttamente, un'area circolare del tessuto pancreatico dovrebbe ora essere visibile attraverso la finestra.
11. Applicare la colla intorno ai bordi della finestra per creare un bordo che aiuterà a prevenire la crescita della pelle sopra la finestra.

6. Inserimento della finestra per l'imaging nella ghiandola mammaria (Figura 4)

1. Posizionare il mouse sulla posizione supina.
2. Fai un'incisione mediale di 10 mm su uno dei capezzoli inguinali usando forbici e pinze sterili.
3. Rimuovere una sezione di pelle di 0,5 cm² sopra la ghiandola mammaria.
4. Utilizzare un secondo paio di forbici sterili per separare con cura la ghiandola mammaria dalla pelle allargando le forbici tra le due superfici per interrompere l'aderenza.
   NOTA: Per facilitare l'imaging dell'area della ghiandola mammaria inguinale, fare attenzione a sezionare una porzione di pelle sopra la ghiandola mammaria ma superiore alla zampa posteriore, in modo che la finestra non limiti la mobilità del topo.
5. Prelevare l'adesivo chirurgico con una siringa da 31 G, applicarne una piccola quantità sulla superficie della ghiandola mammaria attorno ai bordi dell'area da visualizzare.
   ATTENZIONE: Limitare l'adesivo a piccole goccioline che formano un motivo circolare attorno all'area di imaging. Il tessuto immediatamente a contatto con l'adesivo non può essere ripreso.
6. Posizionare la finestra con una pinza e tenerla saldamente contro la ghiandola mammaria fino a quando l'adesivo non si è asciugato (~2 min).
   NOTA: Un'area circolare di tessuto della ghiandola mammaria dovrebbe ora essere visibile attraverso la finestra se eseguita correttamente.
7. Piegare i bordi della finestra sotto la pelle.
8. Con una siringa, depositare una piccola quantità di adesivo chirurgico sui bordi della finestra che ora sono sotto la pelle. Spingere verso il basso sulla pelle con una pinza per fissare la pelle alla finestra.
9. Applicare la colla intorno ai bordi della finestra per creare un bordo che aiuterà a prevenire la crescita della pelle sopra la finestra.

7. Recupero post-chirurgico

1. Posizionare il mouse in una gabbia di recupero pulita con ampio materiale di nidificazione, assicurandosi che parte della gabbia sia appoggiata su una piastra riscaldante.
2. Monitorare continuamente il mouse fino a quando non è cosciente e mobile.
3. Se necessario, fornire una dose aggiuntiva di analgesico 12 ore dopo la dose preventiva.
   NOTA: l'analgesia aggiuntiva è generalmente inutile, ma consultare un veterinario se il topo mostra segni di angoscia (come schiena curva, pelliccia trasandata o perso interesse per il cibo). Monitorare il topo ogni giorno per i primi 3 giorni dopo l'intervento chirurgico per segni di infezione o altri effetti avversi. Meno del 2% dei topi richiede cure veterinarie o eutanasia, in genere a causa del distacco parziale della finestra. È importante notare che per i topi maschi con finestre di imaging del fegato ventrale, il combattimento tra topi può comportare il distacco delle finestre. Questo viene evitato alloggiando i topi separatamente.

8. Imaging attraverso la finestra

1. Anestetizzare il mouse in una camera di induzione utilizzando il 4% (v/v) di isoflurano.
2. Applicare lubrificante oftalmico sugli occhi per evitare che si secchino e prevengano traumi.
3. Spostare il mouse dalla camera di induzione allo stadio del microscopio. Posizionare il topo nella maschera nasale per anestesia e abbassare la concentrazione di isoflurano a circa l'1-1,5% per l'anestesia di mantenimento durante la procedura di imaging.
4. Posizionare un sensore di pressione sotto il mouse per monitorare la frequenza respiratoria e fissare il mouse allo stadio utilizzando un nastro chirurgico morbido.
5. Inserire un termometro rettale per monitorare la temperatura corporea durante la sessione di imaging.
6. Accendere il pad riscaldato, monitorando attentamente il mouse per assicurarsi che la temperatura corporea non superi i 37 °C.
7. Utilizzare il software per monitorare la frequenza respiratoria del mouse. La velocità ottimale è ~ 1 respiro / secondo. Regolare l'anestesia come richiesto.
8. Prima di ogni sessione di imaging, pulire la finestra da qualsiasi mezzo di immersione residuo della lente e detriti pulendola delicatamente con un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo al 70% (v / v).
9. Quando si utilizza una lente ad immersione in acqua, applicare il gel ad ultrasuoni alla finestra, evitando le bolle.
   NOTA: l'acqua distillata può anche essere utilizzata, ma potrebbe richiedere una riapplicazione durante l'imaging.
10. Per trovare la profondità ottimale per l'imaging, in primo luogo, individuare la griglia e metterla a fuoco.
11. Determinare la profondità approssimativa dell'imaging tissutale impostando la parte inferiore della griglia su 0. Queste informazioni sono necessarie per individuare il piano z corrispondente nelle sessioni di imaging successive.
12. Per identificare la stessa posizione in più sessioni di imaging, utilizzare i quadrati sulla griglia come punto di riferimento. Durante l'imaging, annotare l'orientamento della griglia e la posizione all'interno della griglia di ciascun campo visivo ripreso (ad esempio,^2a riga dall'alto, 4^° quadrato da sinistra).
13. Durante le sessioni di imaging successive, utilizzare la griglia per tornare a specifiche aree della griglia e quindi campi di imaging.
14. Dopo ogni sessione di imaging, rimuovere eventuali residui di immersione della lente e detriti pulendo delicatamente la finestra con un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo al 70% (v / v).

Representative Results

L'imaging intravitale attraverso finestre di imaging può essere utilizzato per osservare, tracciare e quantificare una vasta gamma di eventi cellulari e molecolari a risoluzione di una singola cellula per un periodo di ore o settimane. Le caratteristiche ideali per una finestra di imaging includono: a) impatto limitato sul benessere del topo e sulla fisiologia del tessuto; b) durata; c) semplicità di inserimento; e d) chiari punti di riferimento per l'imaging ripetuto della stessa regione. Il risultato è una finestra in silicone inerte versatile, facilmente prodotta e inseribile e che può essere dotata di una griglia per individuare lo stesso campo visivo nell'arco di diverse sessioni di imaging.

La finestra è realizzata in PDMS, che è un materiale economico, flessibile e chiaro. Windows può essere fuso con materiali di consumo che sono ampiamente disponibili per l'acquisto per la maggior parte dei laboratori. Per questi scopi, gli stampi circolari (diametro 22 mm) che sono già incisi sul coperchio di 24 piastre di pozzo disponibili in commercio funzionano bene. Variando la quantità di polimero utilizzato per unità di superficie, è possibile regolare lo spessore della finestra. Per documentare l'effetto dello spessore della finestra sulla risoluzione dell'imaging, è stata condotta un'analisi della funzione di diffusione puntuale (PSF) di microsfere fluorescenti a 40 nm per confrontare l'imaging attraverso finestre PDMS di spessore variabile con i coperchi di vetro tipicamente utilizzati per le finestre di imaging intravitale (0,17 mm di spessore). Per replicare il set up utilizzato per l'imaging intravitale, l'imaging PSF è stato eseguito utilizzando lo stesso microscopio a due fotoni e la lente ad immersione in acqua con gel ad ultrasuoni applicato come mezzo di immersione.

La Full Width at Half Maximum (FWHM) dell'intensità del segnale calcolata tramite l'adattamento della PSF nei piani laterali era paragonabile a quella del vetro per finestre PDMS fuse con 100 mg di PDMS (Figura 5A, B). La risoluzione laterale rispetto ai coperchi in vetro è stata ridotta per le finestre fuse con 150-250 mg di PDMS (Figura 5A, B). Nel piano dell'immagine dell'asse z, le finestre PDMS fuse con 100-200 mg di polimero hanno ottenuto risultati migliori rispetto alle coperture in vetro (Figura 5C). La chiarezza ottica è stata persa in finestre fuse con 300 mg di PDMS, rendendo le misurazioni inaffidabili (Figure 5A-C). Il rapporto X/Y dei valori FWHM non differiva significativamente tra vetro e PDMS di qualsiasi spessore, sebbene il rapporto per finestre fuse con 200-250 mg di polimero si discostasse notevolmente da 1 utilizzando il gel ad ultrasuoni come mezzo di immersione (Figura 5D). Tuttavia, quando si utilizza l'acqua come mezzo di immersione per la finestra fusa con 200 mg, la deviazione dalla simmetria era molto meno pronunciata. A questo spessore, le deviazioni dovute alle aberrazioni nel polimero sono quindi probabilmente minori. Sono stati raccolti anche valori di intensità di fluorescenza di picco per ciascuna microsfera e hanno mostrato che il vetro e il PDMS hanno funzionato in modo comparabile, sebbene il segnale più alto sia stato registrato attraverso il vetro (Figura 5I). Lo spessore ottimale della finestra PDMS dipenderà da applicazioni e sistemi di imaging specifici. Per la maggior parte degli scopi, 200 mg di soluzione polimerica per una finestra circolare di 22 mm di diametro sono un compromesso ottimale tra robustezza della finestra e chiarezza ottica. In effetti, le finestre fuse con meno di 200 mg erano più otticamente chiare, con valori FWHM simili al vetro, ma occasionalmente strappate durante l'impianto chirurgico, mentre non sono stati osservati casi di danni alle finestre utilizzando 200 mg (in >100 topi).

Per misurare questa differenza nelle proprietà del materiale, le finestre PDMS (200 mg e 150 mg) sono state caricate in una macchina di prova del materiale servoidraulico sotto un profilo di controllo del carico di 1N / s fino al guasto del materiale (Figura 5J). I valori di forza e spostamento sono stati misurati ad una frequenza di 100 Hz. I dati forza-spostamento sono stati poi convertiti in stress-deformazione usando le equazioni:

σ = F / A (1)

ɛ = ΔL / L₀ (2)

Dove σ è la sollecitazione (Pa), F è la forza (N), A è l'area della sezione trasversale della finestra, Ɛ è la deformazione, ΔL è lo spostamento e L₀ è lo spessore della finestra. La tenacità del materiale è stata determinata calcolando l'area di sommatoria sotto la curva stress-deformazione. La tenacità di un materiale si riferisce alla sua capacità di deformarsi plasticamente e assorbire energia nel processo prima della frattura - una proprietà chiave per le finestre impiantate¹³. In accordo con le osservazioni durante gli esperimenti di imaging, le finestre fuse con 200 mg di PDMS hanno una tenacità significativamente maggiore rispetto alle finestre fuse con 150 mg (Figura 5K) e sono quindi meno inclini alla rottura.

Successivamente, il modulo (E) di Young delle finestre PDMS preferite fuse con 200 mg è stato determinato e confrontato con quello delle coperture di vetro standard estraendo la regione lineare della curva stress-deformazione e determinando la pendenza usando la legge di Hooke:

σ = EƐ (3)

Il modulo di Young delle finestre di vetro era significativamente maggiore del PDMS, il che era previsto perché il vetro è molto più rigido nella resistenza del materiale rispetto al PDMS (Figura 5L). Pertanto, sebbene il vetro sia un materiale più resistente basato sul suo maggiore modulo di Young, la maggiore tenacità delle finestre PDMS da 200 mg supporta che possono essere applicate per periodi più lunghi senza rischio di rottura e necessità di una seconda procedura chirurgica o eutanasia.

Uno dei principali vantaggi delle finestre in silicone è la versatilità. È importante sottolineare che la procedura per inserire chirurgicamente la finestra può essere facilmente adattata a diverse posizioni anatomiche. Gli adattamenti all'intervento chirurgico sono facilitati dal fatto che le finestre possono essere facilmente ridimensionate con forbici chirurgiche e che le finestre sono incollate alla superficie del tessuto/organo di interesse e alla pelle, eliminando completamente la necessità di suture. L'inserimento riuscito di finestre in questo modo è stato ottenuto per il fegato, il pancreas e la ghiandola mammaria (Figure 6A-C). In particolare, sono stati sviluppati due diversi protocolli per impiantare finestre ventrali o laterali per l'imaging epatico. La Figura 1 mostra i passaggi per inserire una finestra ventrale. Questa procedura può essere adattata ad altri organi addominali e produrrà la più grande superficie visualizzabile. Tuttavia, a meno che non sia richiesta un'area di visualizzazione di grandi dimensioni (>1 cm²), l'inserimento di una finestra laterale sul fianco destro del mouse (Figura 2) è preferibile per ridurre gli artefatti di movimento, ad esempio a causa della respirazione e della peristalsi. Inoltre, la procedura chirurgica per l'inserimento della finestra di imaging laterale è compatibile con un'iniezione concomitante di cellule tumorali nella vena porta per modellare sperimentalmente lo sviluppo di metastasi epatiche. Pertanto, i topi possono sottoporsi a una singola procedura invece di due separate quando l'iniezione della vena porta e l'inserimento della finestra di imaging addominale sono necessari nello stesso animale. Una procedura analoga viene utilizzata per impiantare una finestra sul pancreas sul fianco sinistro del topo (Figura 3). La finestra può anche essere inserita su tessuti sottocutanei, cioè ghiandole mammarie normali, nonché tumori mammari spontanei o ortotopicamente trapiantati già stabiliti (Figura 4). In alternativa, le cellule tumorali possono essere iniettate nella ghiandola mammaria attraverso la finestra per seguire longitudinalmente lo sviluppo di un tumore primario, poiché gli aghi possono perforare il film PDMS senza compromettere l'integrità della finestra.

Grazie al loro peso ridotto e alla loro flessibilità, le finestre in silicone non interferiscono con la mobilità del mouse (Filmato 1). Pertanto, le finestre in silicone superano i principali ostacoli associati alle finestre di vetro, come la fragilità, la sutura complessa e l'impatto sulla mobilità degli animali. Invece, la principale limitazione associata alle finestre in silicone è la ricrescita dell'epitelio sotto la finestra. Tuttavia, quando viene rimossa una quantità appropriata di pelle e la ferita è completamente sigillata con colla, la riepitelizzazione è limitata e l'imaging può continuare per periodi di tempo prolungati (sono stati testati fino a 35 giorni, Figura 6D). Dopo aver inserito la finestra, il mouse può essere ripreso longitudinalmente per circa un mese o fino a quando l'adesivo chirurgico non fallisce o si verifica una riepitelizzazione. Brevi sessioni di imaging giornaliere (~ 60 min) o sessioni di imaging meno frequenti ma più lunghe sono favorite per evitare effetti avversi indotti dall'anestesia. Gli animali da finestra possono essere ripresi su qualsiasi piattaforma di imaging intravitale, tramite microscopia confocale a fotone singolo o multifotone, utilizzando procedure standard (vedi, ad esempio, ¹⁴). Prima e dopo ogni sessione di imaging, è consigliabile pulire la finestra da sporcizia e detriti pulendola con un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo al 70% (v / v).

Per tracciare la stessa posizione nel tempo, le griglie in acciaio inossidabile possono essere incorporate all'interno della finestra. La Figura 7A mostra le specifiche per le griglie personalizzate incise al laser utilizzate qui. Anche le griglie commerciali per la microscopia elettronica a trasmissione sono adatte per questa applicazione. La griglia è incorporata all'interno della finestra durante la procedura di fusione ed è chiaramente visibile sull'area di imaging sia ad occhio nudo (Figura 7B) che attraverso gli oculari del microscopio (Figura 7C). Poiché la finestra è incollata alla superficie dell'organo, la posizione dei campi di imaging rispetto alla griglia è stabile. Durante l'imaging, annotare l'orientamento della griglia e la posizione all'interno della griglia di ciascun campo visivo ripreso (ad esempio,^2a riga dall'alto, 4^° quadrato da sinistra). Quindi, utilizzare la griglia per tornare a specifiche aree della griglia - e quindi campi di imaging - durante le sessioni di imaging successive.

La griglia è anche utile per allineare il campo di imaging durante una sessione di imaging quando il tessuto si sposta lentamente a causa, ad esempio, della respirazione o della peristalsi. La maggior parte delle finestre di imaging con un bordo rigido può essere legata a un supporto durante l'imaging, aggiungendo stabilità all'area di imaging. Poiché le finestre flessibili non possono essere stabilizzate direttamente, il nastro chirurgico viene utilizzato per stabilizzare la sezione del corpo contenente la finestra e l'area di imaging viene riallineata al centro del quadrato della griglia corrispondente o dei punti di riferimento del tessuto precedentemente identificati (ad esempio, punti di riferimento vascolari) a intervalli definiti (in genere ogni 30 minuti). Un'ulteriore correzione della deriva per lo spostamento microscopico del campo visivo viene eseguita digitalmente nella fase post-acquisizione attraverso il codice che riallinea i fotogrammi in base ai modelli di tessuto rilevati (codice supplementare 1-2).

Per convalidare che la finestra non causi alcuna reazione avversa sistemica evidente, è stato monitorato il peso degli animali che avevano subito l'impianto della finestra e controlli non trattati in base all'età. Dopo una perdita di peso iniziale associata alla chirurgia, la maggior parte dei topi con finestre inserite continua ad aumentare di peso nel tempo, indicando che l'inserimento della finestra è ben tollerato (Figure 8A-C). Per le finestre del fegato e della ghiandola mammaria, il peso normale viene riacquistato entro 5 giorni dall'intervento chirurgico. Il recupero post-operatorio è più lento dopo l'impianto della finestra sul pancreas, con i topi che ritornano al peso pre-operatorio entro 14 giorni. Questa osservazione è coerente con gli effetti attesi associati alla manipolazione del pancreas al momento dell'intervento chirurgico. Si noti che anche nei casi in cui la perdita di peso non raggiunge la soglia per l'endpoint umano, i topi che non riacquistano il peso corporeo pre-operatorio (<5% di tutti i topi, esemplificato dal topo indicato da * nella Figura 8B) sono in genere censurati dagli esperimenti di imaging. Inoltre, la conta dei globuli bianchi, determinata in vari punti temporali dopo l'inserimento della finestra, non è stata alterata in quasi tutti i topi con finestre rispetto ai controlli e non è cambiata considerevolmente nel tempo (Figura 8D), suggerendo che la finestra non ha causato una grave infiammazione sistemica.

Successivamente, per valutare il grado di risposta tissutale locale alla finestra e alla colla, i topi sono stati eutanasizzati a 3, 14 e 28 (finestre della ghiandola mammaria) o 35 giorni (finestre del fegato e del pancreas) dopo l'inserimento chirurgico della finestra per l'analisi istologica. La valutazione delle sezioni epatiche colorate di ematossilina ed eosina (H & E) ha mostrato una formazione superficiale (20-80 μm), da minima a lieve formazione di tessuto di granulazione capsulare sotto le finestre per la maggior parte dei topi (2 topi su 3 valutati al giorno 3 e 2 su 3 valutati al giorno 14). Queste lesioni erano focali (1-3 mm di lunghezza), corrispondenti approssimativamente alla larghezza dello strato di colla (Figura 8E). Dopo 35 giorni, la maggior parte dei topi (4 su 6 valutati in due esperimenti separati) non presentava tessuto granulare, mentre alcuni (2 su 6) presentavano sclerosi capsulare focale moderata e desmoplasia (a una profondità di 25-250 μm). È interessante notare che non sono state osservate lesioni significative sulla superficie del pancreas direttamente sotto la finestra in qualsiasi momento nella coorte di nove topi (Figura 8G). Tuttavia, alcuni topi hanno mostrato aree di atrofia nella pancreata e infiammazione nel grasso addominale (steatite), coerenti con danni indotti dalla manipolazione. Per la ghiandola mammaria, il giorno 3 dopo l'impianto della finestra, 3 topi su 3 avevano tessuto di granulazione che ricordava un'incisione di guarigione visibile lungo la superficie della ghiandola o una reazione infiammatoria nel tessuto adiposo; al giorno 14, 3 topi su 3 valutati avevano tessuto di granulazione. Queste lesioni erano di nuovo focali e lunghe 1-3 mm (Figura 8I). I topi con finestre della ghiandola mammaria eutanasizzate 28 giorni dopo l'intervento chirurgico non hanno mostrato evidenti anomalie istologiche.

Questa analisi suggerisce che la finestra non compromette l'architettura fisiologica complessiva degli organi testati (fegato, pancreas, ghiandola mammaria). Il tessuto reattivo trovato sulla superficie del fegato e della ghiandola mammaria era probabilmente una reazione alla colla e limitato al tessuto immediatamente a contatto con l'adesivo. Il tessuto normale può essere facilmente trovato adiacente (< 100 μm) al tessuto reattivo in regioni non esposte alla colla (Figura 8E, I) e l'infiammazione del tessuto, quindi, non interferisce con l'imaging delle regioni tissutali sane. Inoltre, la reazione tissutale è probabilmente reversibile in quanto la maggior parte dei topi (8 topi su 9, in tutte le posizioni tissutali) non ha mostrato lesioni significative nei punti temporali tardivi (28 o 35 giorni), anche se la conferma diretta che la reazione tissutale si risolve sarebbe difficile da ottenere senza misurazioni longitudinali nei singoli topi.

La colorazione immunoistochimica multiplexata per CD45, CD68 e mieloperossidasi (MPO) è stata eseguita anche per caratterizzare l'infiltrazione di leucociti, monociti / macrofagi e neutrofili, rispettivamente. Un aumento dell'infiltrazione delle cellule immunitarie associato al tessuto di granulazione e alla steatite è stato osservato nella ghiandola mammaria e nel fegato, ma non nel pancreas (Figura 8F,H,J).  Da notare, questi cambiamenti erano probabilmente transitori in quanto l'infiltrato delle cellule immunitarie era paragonabile a quello dei controlli non trattati negli ultimi punti temporali (28 giorni per le finestre della ghiandola mammaria e 35 giorni per le finestre del fegato e del pancreas).

Il fegato è stato scelto come sito per caratterizzare ulteriormente se l'inserimento della finestra e l'imaging hanno causato una significativa infiltrazione immunitaria locale utilizzando l'imaging. Per fare questo, sono stati utilizzati topi c-fms-EGFP (MacGreen)¹⁵, in cui le cellule mieloidi (per lo più macrofagi) sono etichettate con una proteina fluorescente verde. Le finestre epatiche sono state impiantate in tre topi c-fms-EGFP e le hanno fotografate nei giorni 1, 3 e 5 dopo l'intervento chirurgico utilizzando la griglia per individuare lo stesso campo visivo. Il numero di macrofagi presenti nell'area di imaging non è cambiato considerevolmente nel tempo dopo l'inserimento della finestra (Figura 8K).

Successivamente, la finestra è stata testata funzionalmente mediante l'imaging di una serie diversificata di processi biologici a livello cellulare (cioè movimento, proliferazione, contatto cellula-cellula) e a livello tissutale (cioè crescita tumorale nel pancreas, infiltrazione immunitaria durante l'involuzione della ghiandola mammaria e metastasi epatiche). Il pancreas non è un luogo facilmente accessibile per l'imaging. Per dimostrare come la finestra possa essere utilizzata per catturare la dinamica delle cellule tumorali in questo organo, le finestre sono state inserite sul pancreas di sei topi C57BL / 6J contemporaneamente all'iniezione ortotopica di cellule KPC-BL / 6-1199, una linea cellulare di cancro pancreatico derivata da un KPC comunemente usato (Kras^{LSL- G12D / +} ;p 53^LSL-R172H; Pdx1-Cre) modello murino geneticamente modificato di cancro al pancreas. Per essere visualizzate al microscopio confocale, le cellule KPC-BL/6-1199 sono state progettate per esprimere GFP potenziata inducibile dalla doxiciclina (cellule iGFP-1199). Sei giorni dopo l'iniezione, i topi sono stati sottoposti a una dieta doxiciclina per innescare l'espressione della proteina fluorescente verde (GFP) nelle cellule tumorali del pancreas. La Figura 9 mostra immagini rappresentative di un topo iniettato ortotopicamente con cellule iGFP-1199 nei giorni 11 e 14 successivi all'iniezione e all'inserimento della finestra. Il filmato 2 mostra il bordo del tumore iGFP-1199 in un estratto di una sessione di imaging di 2 ore il giorno 11 dopo l'inserimento della finestra, illustrando la capacità di catturare le dinamiche della proiezione della membrana cellulare nel pancreas utilizzando le finestre in silicone.

La finestra in silicone può anche essere utilizzata per catturare l'infiltrazione dinamica delle cellule immunitarie nel tempo. Per illustrare questo, le finestre della ghiandola mammaria sono state inserite in ACTB-ECFP in allattamento (Tg(CAG-ECFP)CK6Nagy); Topi LysM-eGFP (Lyz2tm1.1Graf) immediatamente dopo lo svezzamento. In questi topi, tutte le cellule, ma la maggior parte delle cellule altamente epiteliali, esprimono la proteina fluorescente ciano (CFP) guidata dal promotore della beta actina e le cellule mieloidi – principalmente neutrofili, ma anche macrofagi – sono etichettate da eGFP guidato dal promotore del lisozima M. I topi sono stati ripresi nei giorni 2 e 4 dopo l'inserimento della finestra, durante il processo di involuzione della ghiandola mammaria, quando il tessuto della ghiandola mammaria inizia a tornare al suo stato pre-gravidanza. Due macro per ImageJ sono state sviluppate per ridurre gli artefatti di movimento e migliorare la visualizzazione, una allinea i piani Z in un video intravitale a 4 dimensioni (codice supplementare 1) e l'altra riduce l'oscillazione dovuta alla respirazione o ad altri artefatti di movimento (codice supplementare 2). La Figura 10 e il Film 3A-C mostrano l'infiltrazione dei neutrofili all'interno del tessuto della ghiandola mammaria rimodellante nella stessa posizione nei giorni 2 e 4, illustrando come la finestra potrebbe essere utilizzata per monitorare e tracciare l'infiltrazione e il movimento delle cellule immunitarie in giorni diversi. Un esperimento analogo è stato condotto in un topo c-fms-EGFP, con cellule mieloidi (principalmente macrofagi) che esprimono GFP guidate dal promotore c-fms (Movie 4).

Infine, la superficie relativamente ampia di questa finestra personalizzabile consente l'osservazione di eventi rari, come la formazione di metastasi epatiche dopo inoculazione endovenosa. Per dimostrare questo fenomeno, le finestre epatiche sono state inserite in topi C57BL/6J al momento dell'iniezione della vena porta con cellule tumorali pancreatiche KPC-BL/6-1199 che esprimono costitutivamente la proteina di fusione nucleare istone2B-CFP (H2B-CFP). Nel corso del tempo, è stata monitorata la crescita di singole cellule e piccoli gruppi di 2-3 cellule mentre si sviluppavano in micrometastasi (>100 cellule). La Figura 10 mostra immagini rappresentative scattate nei giorni 1, 3, 7 e 9 dopo l'iniezione e l'inserimento della finestra e mostra la progressione da singole cellule a micrometastasi.

Tutte le immagini e i filmati sono stati raccolti utilizzando un microscopio multifotone. Le proiezioni di massima intensità e gli allineamenti di filmati lungo gli assi Z e X nel tempo sono stati generati utilizzando il software ImageJ. Immagini e filmati allineati sono stati quindi compilati utilizzando il software Imaris.

Figura 1: Inserimento chirurgico di una finestra di imaging addominale ventrale sul fegato. (A) Il cartone mostra la posizione anatomica delle strutture rilevanti per l'intervento chirurgico. La scatola bianca tratteggiata delinea il campo chirurgico visto nelle immagini. (B) Viene praticata un'incisione a partire da 3 mm sotto il processo xifoide e proseguendo verso il basso in modo che una sezione di pelle di 1-1,5 cm² venga rimossa lungo la linea mediana. (C) Viene sezionata una sezione leggermente più piccola del peritoneo. (D) Il legamento falciforme (punta di freccia bianca) viene reciso, spingendo il fegato verso il basso. Nota: i tamponi di cotone inumiditi con soluzione salina sterile vengono utilizzati per manipolare delicatamente gli organi interni. (E) Utilizzando una siringa, una piccola quantità di adesivo chirurgico viene applicata in goccioline intorno all'area di interesse sulla superficie del fegato. (F) La finestra è posizionata e tenuta saldamente contro il fegato fino a quando l'adesivo non si è asciugato (2 min). (G) I bordi della finestra sono piegati sotto il peritoneo e la pelle. (H) Per fissare la finestra al peritoneo, l'adesivo viene applicato sulla superficie della finestra corrispondente all'area ombreggiata, prima di spingere il peritoneo verso il basso su di esso e incollarlo in posizione. La pelle è similmente incollata sul peritoneo. Un bordo di colla viene infine depositato lungo la linea rossa per impedire la crescita dell'epitelio sopra la finestra. (I) Stessa immagine di (H) senza i segni che mostrano il topo pronto per il recupero post-chirurgico. L'area delineata con linee tratteggiate è ingrandita in (J, K). (J) I segni delle goccioline di adesivo sono visibili sulla superficie del fegato (punte di freccia) (K) Stessa foto di J che mostra il fegato visibile attraverso la finestra delineata da una linea tratteggiata bianca. Le goccioline di adesivo sulla superficie del fegato sono delineate in rosso. L'area da fotografare è delineata in bianco. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Inserimento chirurgico di una finestra sopra il lobo destro del fegato. (A) Il cartone mostra la posizione anatomica delle strutture rilevanti per l'intervento chirurgico. La scatola nera tratteggiata delinea il campo chirurgico visto nelle immagini. (B) Il topo viene posto nella posizione del decubito laterale sinistro, viene praticata un'incisione a partire da 3 mm sotto la gabbia toracica e viene rimossa una sezione di pelle di circa 1 cm² . (C) Viene sezionata una sezione leggermente più piccola del peritoneo. (D) Il fegato viene delicatamente tirato verso il basso sotto la gabbia toracica usando un batuffolo di cotone inumidito. (E) Utilizzando una siringa, una piccola quantità di adesivo chirurgico viene applicata in goccioline (punta di freccia bianca) sulla superficie del fegato. (F) La finestra è posizionata e tenuta saldamente contro il fegato fino a quando l'adesivo non si è asciugato (2 min). (G) I bordi della finestra sono piegati sotto il peritoneo e la pelle. (H) Per fissare la finestra al peritoneo, l'adesivo viene applicato sulla superficie della finestra, corrispondente all'area ombreggiata, prima di spingere il peritoneo verso il basso su di esso e incollarlo in posizione. La pelle è similmente incollata sul peritoneo. Un bordo di colla viene anche depositato lungo la linea rossa per impedire la crescita dell'epitelio sopra la finestra. (I) Ad alto ingrandimento, il fegato (delineato da una linea tratteggiata bianca) è visibile attraverso la finestra. L'area di imaging è contrassegnata dalla griglia incorporata nella finestra (punta freccia bianca). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Inserimento chirurgico di una finestra sul pancreas. (A) Il cartone mostra la posizione anatomica delle strutture rilevanti per l'intervento chirurgico. La scatola nera tratteggiata delinea il campo chirurgico visto nelle immagini. (B) Il topo è posto nella posizione del decubito laterale destro. La milza è visibile attraverso la pelle rasata (linea tratteggiata) (C) Viene praticata un'incisione a partire da 3 mm sotto la gabbia toracica e viene rimossa una sezione di pelle di circa 1 cm² . (D) Viene sezionata una sezione leggermente più piccola del peritoneo. (E) Il pancreas (punta di freccia bianca) viene posizionato delicatamente con un batuffolo di cotone inumidito nella posizione della finestra. (F) Utilizzando una siringa, una piccola quantità di adesivo chirurgico viene applicata alla milza, così come al pancreas (lontano dalla regione da fotografare). (G) La finestra è posizionata e tenuta saldamente contro il pancreas fino a quando l'adesivo non si è asciugato (2 min). I bordi della finestra sono piegati sotto il peritoneo e la pelle. (H) Per fissare la finestra al peritoneo, l'adesivo viene applicato sulla superficie della finestra corrispondente all'area ombreggiata, prima di spingere il peritoneo verso il basso su di esso e incollarlo in posizione. La pelle è similmente incollata sul peritoneo. Un bordo di colla viene anche depositato lungo la linea rossa per impedire la crescita dell'epitelio sopra la finestra. (I) Ad alto ingrandimento, il pancreas (delineato da una linea tratteggiata bianca) è visibile attraverso la finestra. L'area di imaging è contrassegnata dalla griglia incorporata nella finestra (punta freccia bianca). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Inserimento chirurgico di una finestra sopra la ghiandola mammaria inguinale. (A) Il cartone mostra la posizione anatomica delle strutture rilevanti per l'intervento chirurgico. La scatola nera tratteggiata delinea il campo chirurgico visto nelle immagini. Si noti che l'intervento chirurgico può essere eseguito sulla^4a o^{sulla 5a} ghiandola mammaria. (B) Il topo è posto in posizione supina su un campo chirurgico sterile. Il 5^{° capezzolo} destro (punta di freccia) è usato come punto di riferimento per eseguire l'incisione. (C) Viene praticata un'incisione, la ghiandola mammaria viene separata dalla pelle sovrastante e viene rimossa una sezione di pelle di circa 1 cm² . (D) Utilizzando una siringa, una piccola quantità di adesivo chirurgico viene applicata in goccioline intorno all'area di interesse sulla superficie della ghiandola mammaria. (E) La finestra viene posizionata e tenuta saldamente fino a quando l'adesivo non si è asciugato (2 min). (F) I bordi della finestra sono piegati sotto la pelle usando una pinza. (G) Per fissare la finestra alla pelle, l'adesivo viene applicato sulla superficie della finestra corrispondente all'area ombreggiata, prima di spingere la pelle verso il basso su di essa e incollarla in posizione. Un bordo di colla viene anche depositato lungo la linea rossa per impedire la crescita dell'epitelio sopra la finestra.  (H) Viene fornito un esempio di finestra impiantata su un piccolo tumore^{nella 4a} ghiandola mammaria destra. Le aree delineate con linee tratteggiate sono mostrate con ingrandimento più elevato in (I). (I) Le goccioline di adesivo sulla superficie della ghiandola mammaria sono delineate in rosso. L'area da fotografare è delineata in nero. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Le finestre di imaging in silicone hanno proprietà ottiche e materiali favorevoli. (A–C) Per misurare la funzione di diffusione puntuale e confrontare le proprietà di imaging delle finestre PDMS con quelle dei coperchi in vetro, sono state visualizzate microsfere fluorescenti giallo-verdi a 40 nm attraverso finestre PDMS di spessore variabile o coperture in vetro (spessore n. 1,5)¹⁶. Le immagini sono state raccolte utilizzando il gel ad ultrasuoni come mezzo di immersione per soddisfare le condizioni dell'imaging intravitale. I grafici mostrano la larghezza completa calcolata a metà massimo (FWHM) nel (Un) Asse X, (B) Asse Y, e (C) Asse Z (media ± SD; n = 3/gruppo, acquisita utilizzando due o più finestre separate; ANOVA unidirezionale che confronta tutte le finestre PDMS con il vetro con il test di confronto multiplo di Dunnett; sono indicate solo differenze significative). (D) Il rapporto tra i valori FWHM calcolati nell'asse X e Y (A–B) è mostrato come misura della simmetria delle immagini della sorgente puntiforme lungo gli assi X e Y, e quindi delle aberrazioni ottiche. (E–G) Le microsfere sono state riprese attraverso tre finestre separate fuse con 200 mg di PDMS (simile alle finestre utilizzate per l'imaging intravitale per Figura 9, Figura 10, Figura 11 e Film 2, Film 3, Film 4) o tre coverslip in vetro (spessore #1.5) per misurare la funzione di diffusione del punto. In contrasto con gli esempi di imaging intravitale, le immagini per questi calcoli sono state raccolte utilizzando l'acqua come mezzo di immersione. I grafici mostrano l'FWHM calcolato nel (E) Asse X, (F) Asse Y e (G) asse Z (media ± SD; n = 3/gruppo utilizzando tre finestre separate; Test di Mann-Whitney, non sono state rilevate differenze significative). (H) Il grafico mostra il rapporto tra i valori FWHM calcolati nell'asse X e Y (E–F). (Io) I grafici mostrano l'intensità fluorescente di picco per microsfera (media ± SD; n = 3/gruppo; Test di Mann-Whitney, non sono state rilevate differenze significative). Tutte le immagini sono state raccolte a una lunghezza d'onda di 960 nm e una potenza laser del 3%. È stato raccolto uno z-stack da 100 μm per ogni microsfera, con una dimensione del gradino di 0,6 μm. La cornice dell'immagine è stata impostata su 69 μm x 69 μm con una risoluzione di 1022 pixel x 1022 pixel. L'analisi è stata eseguita con il plugin Fiji - MetroloJ. (JPer testare le proprietà del materiale, le finestre PDMS sono state tenute in tensione e fissate tra due rondelle a forma di anello utilizzando super colla per garantire una risposta elastica durante le prove meccaniche. La stessa procedura è stata utilizzata per i micro vetri di copertura senza la tensione dovuta alla rigidità del vetro. Una punta di carico costituita da un emisfero (diametro 6 mm) con un'estrusione del cilindro (diametro 4 mm, lunghezza 20 mm) è stata stampata in 3D utilizzando un filamento di acido polilattico. Le finestre sono state caricate in una macchina di prova servoidraulica sotto un profilo di controllo del carico di 1 N / s fino al guasto del materiale. I valori di forza e spostamento sono stati misurati ad una frequenza di 100 Hz. L'immagine mostra il test della finestra impostato con la punta di caricamento applicata al centro della finestra. (OkayIl grafico mostra la tenacità del materiale determinata calcolando l'area di sommatoria sotto la curva stress-deformazione utilizzando la funzione Trapz in MATLAB (media ± SEM; n = 3/gruppo utilizzando tre finestre PDMS separate per ogni spessore e coperture in vetro; ANOVA unidirezionale con il test di confronto multiplo di Tukey). (LIl grafico mostra il modulo di Young determinato dalla porzione lineare della curva stress-deformazione (media ± SEM; n = 3/gruppo usando tre finestre PDMS separate e coperture di vetro; t-test con correzione di Welch). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: La finestra in silicone dimostra un'elevata tollerabilità e longevità. (A) Un'immagine rappresentativa di un topo C57BL/6J maschio di 7 settimane con una finestra di imaging addominale ventrale senza griglia 11 giorni dopo l'intervento chirurgico alla finestra. (B) Un'immagine rappresentativa di un topo C57BL/6J maschio di 7 settimane con una finestra di imaging pancreatico contenente una griglia 14 giorni dopo l'intervento chirurgico alla finestra. (C) Un'immagine rappresentativa di una femmina di topo C57BL/6J c-fms-EGFP di 12 settimane con una finestra di imaging della ghiandola mammaria contenente una griglia >7 giorni dopo l'intervento chirurgico alla finestra. (D) Finestra di imaging epatico in un topo c-fms-EGFP maschio di 7 settimane fotografato (riga superiore) e ripreso (riga inferiore) il giorno 0 (immediatamente dopo l'intervento chirurgico) e 35 giorni dopo l'intervento chirurgico. La rimozione della quantità appropriata di pelle e la sigillatura della ferita con la colla impediscono alla pelle di riepitelizzare e spingere la finestra verso l'alto e verso l'esterno, consentendo all'organo di essere ripreso a lungo termine. Barre di scala = 30 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Le griglie all'interno delle finestre consentono il tracciamento dello stesso campo visivo. (A) Specifiche dettagliate per la produzione personalizzata di finestre in acciaio inossidabile tagliate al laser. (B) Una griglia incorporata all'interno della finestra di imaging può essere vista sopra il fegato, con il bordo di colla intorno alla finestra chiaramente visibile. (C) Vista della finestra attraverso gli oculari del microscopio a due fotoni. I vasi sanguigni (rosso) e il segnale verde dal fegato possono essere visti sullo sfondo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Risposta sistemica e locale all'inserimento della finestra. (A–C) Il peso è stato monitorato per topi femmina C57BL/6J di 7 settimane per un periodo di 28 giorni dopo l'inserimento della finestra nel fegato (Un), il pancreas (B) o la ghiandola mammaria (C). Viene mostrato un cambiamento percentuale del peso corporeo rispetto ai topi non trattati per età. (*) indica un topo che non ha riacquistato il peso corporeo normale e sarebbe stato quindi censurato da un esperimento di imaging. Gli stessi mouse di controllo sono mostrati in tutti e tre i pannelli per un confronto più facile con ogni tipo di finestra. (D) Conteggio dei globuli bianchi (WBC) monitorato nei giorni 3, 14 e 28 (finestra della ghiandola mammaria) o 35 (finestra del fegato o del pancreas) dopo l'intervento chirurgico. L'intervallo normale per il conteggio WBC nel mouse è indicato da linee tratteggiate. (E,G,Io) Colorazione di ematossilina ed eosina di sezioni di tessuto da controlli non trattati (a sinistra) e un topo C57BL/6J di 7 settimane 14 giorni dopo l'inserimento di una finestra di imaging (a destra) sopra il (E) fegato, (G) pancreas, o (Io) ghiandola mammaria. (E,IoLe lesioni di granulazione superficiali e focali sono visibili in punti discreti lungo la superficie (freccia) del fegato e della ghiandola mammaria, suggerendo una reazione alla colla. Il tessuto normale indicato da * è visibile nelle regioni adiacenti alle lesioni di granulazione. Tre controlli e tre topi con finestre epatiche sono stati valutati in ogni punto temporale (giorni 3, 14 e 35 dopo l'intervento chirurgico), tranne che 6 topi con finestre epatiche sono stati valutati al giorno 35 dopo l'intervento chirurgico. Due topi su 3 hanno mostrato tessuto di granulazione ai giorni 3 e 14. 1 topo su 3 ha mostrato tessuto di granulazione al giorno 35.  Tre controlli e tre topi con finestre della ghiandola mammaria sono stati valutati in ogni punto temporale (giorni 3, 14 e 28 dopo l'intervento chirurgico). Tre topi su 3 hanno avuto tessuto di granulazione o reazioni infiammatorie nel tessuto adiposo della ghiandola mammaria ai giorni 3 e 14. Zero topi su 3 hanno mostrato lesioni di granulazione o reazioni infiammatorie al giorno 28. (GNon sono visibili lesioni significative nel pancreas. Tre controlli e tre topi con finestre del pancreas sono stati valutati in ogni punto temporale (giorni 3, 14 e 35 dopo l'intervento chirurgico). I topi con finestre pancreatiche non avevano tessuto di granulazione in nessun momento. Barra scala = 500 μm (F,H,JLa colorazione immunoistochimica Multiplex è stata eseguita su sezioni di tessuto provenienti da controlli non trattati e topi C57BL/6J di 7 settimane 14 giorni dopo l'inserimento di una finestra di imaging sopra il (F) fegato, (H) pancreas o (J) ghiandola mammaria. Gli anticorpi contro CD45, CD68 e mieloperossidasi (MPO) sono stati utilizzati per etichettare rispettivamente leucociti, monociti/macrofagi e neutrofili. La colorazione CD45 e CD68 è stata eseguita sulla stessa sezione mentre la colorazione MPO è stata eseguita su una sezione seriale dello stesso tessuto. L'anticorpo anti-CD45 è stato rilevato con un anticorpo secondario coniugato HRP e prima è stato ripreso, quindi il cromogeno e l'anticorpo secondario sono stati spogliati e i vetrini sono stati incubati con un anticorpo secondario che riconosce l'anti-CD68. La quantificazione è stata eseguita con il software Fiji mediante soglia di colore; i parametri sono stati regolati tra anticorpi e tessuti. I grafici mostrano la quantificazione come conteggio delle cellule per campo visivo (FOV) (media ± SEM; n = 3 / gruppo; ANOVA unidirezionale con il test di confronti multipli di Tukey; sono indicate solo differenze significative). (Okay) Maschio C57BL/6J c-fms-EGFP i topi di età compresa tra 8 e 11 settimane avevano una finestra di imaging in silicone inserita sopra il lobo destro del fegato. La lectina marcata fluorescentemente (100 μL) è stata iniettata per via endovenosa immediatamente prima di ogni sessione di imaging. Le immagini provengono da un singolo topo, nello stesso locus della griglia nei giorni 1, 3 e 5 dopo l'intervento chirurgico, a circa 200 μm sotto la griglia. Barra della scala = 30 μm. Immagine utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 960 nm, potenza laser 10%. I vasi sanguigni appaiono in rosso. I macrofagi appaiono in verde (frecce bianche). Rappresentante di tre topi ripresi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: I tumori possono essere visualizzati in più punti temporali per settimane dopo l'inserimento della finestra. Immagini rappresentative di un maschio di 7 settimane di topo C57BL / 6J iniettato ortotopicamente con 1,5 x 10⁴ cellule tumorali pancreatiche iGFP-1199 al momento dell'inserimento della finestra pancreatica e immagini nei giorni 11 e 14 dopo l'inserimento della finestra. Barre della scala = 30 μm. Immagine utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 960 nm, potenza laser 10%. Rappresentante di 6 topi ripresi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10: Cambiamenti dinamici nell'infiltrazione delle cellule immunitarie durante la normale involuzione della ghiandola mammaria. Utilizzando la griglia metallica incorporata nella finestra di imaging, la stessa posizione può essere ripresa durante il normale rimodellamento dei tessuti, ad esempio durante l'involuzione della ghiandola mammaria. Per valutare ulteriormente la funzionalità delle finestre in silicone nel monitoraggio dei cambiamenti dinamici come l'infiltrazione delle cellule immunitarie, una femmina di 12 settimane C57BL / 6J x BALB / c ACTB-ECFP; Il topo LysM-eGFP con una finestra di imaging inserita sopra la ghiandola mammaria addominale è stato ripreso nei giorni 2 e 4 dopo l'involuzione della ghiandola mammaria. I neutrofili appaiono in verde (frecce bianche). L'attività dell'elastasi neutrofila è stata visualizzata iniettando una sonda fluorescente neutrofila elastasi 4 ore prima di iniziare l'imaging e appare in rosso (o giallo quando colocalizzata con neutrofili). Le cellule epiteliali appaiono in blu. Le istantanee sono una proiezione di intensità massima di cinque immagini lungo l'asse Z (100-150 mm di profondità). Le immagini provengono dai filmati 3A e 3B e, nelle immagini della riga inferiore, viene mostrato solo il segnale CFP e le immagini sono contrassegnate con una linea tratteggiata rossa per visualizzare le stesse posizioni all'interno del tessuto nei due diversi punti temporali. Barre della scala = 30 μm. Immagine utilizzando lunghezze d'onda di eccitazione di 960 nm e 1080 nm, potenza laser rispettivamente al 10% e al 15%. Rappresentante di quattro topi ripresi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 11: La formazione di metastasi tumorali può essere monitorata nel tempo. Un topo maschio C57BL/6J di 10 settimane ha iniettato 1 x 10⁵ KPC-BL/6-1199 cellule tumorali pancreatiche che esprimono proteina fluorescente ciano coniugata H2B (H2B-CFP) con istone nucleare localizzato (H2B-CFP) attraverso la vena porta al momento dell'inserimento della finestra. L'imaging epatico è stato eseguito attraverso una finestra laterale 24 ore (Giorno 1) dopo l'iniezione e in tre punti temporali successivi (fino a 9 giorni), come indicato. Una singola cellula tumorale visibile nei giorni 1 e 3 successivi all'iniezione è indicata con frecce bianche. Anche il secondo segnale armonico delle fibre di collagene è stato visualizzato nel canale ciano (frecce gialle). Le immagini provengono dallo stesso mouse in ogni punto temporale diverso. Singole immagini del piano z scattate tra 300 μm e 350 μm di profondità. Barre della scala = 30 μm. Ripresa utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 880 nm. Potenza laser all'8%. Rappresentante di tre topi ripresi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Movie 1: Silicone imaging windows sono ben tollerati nei topi. Il film mostra un topo C57BL/6J maschio di 9 settimane 14 giorni dopo l'inserimento della finestra. Il topo non presenta nessuno dei comportamenti standard associati al dolore (ad esempio, scarsa toelettatura, occhi chiusi o letargia). Rappresentativo di sei topi registrati e coerente con oltre 100 topi osservati dopo il successo dell'impianto della finestra. Clicca qui per scaricare questo video.

Film 2: Imaging subcellulare di cellule tumorali pancreatiche impiantate ortotopicamente. Le cellule iGFP-1199 sono state iniettate ortotopicamente nel pancreas di un topo C57BL/6J maschio di 7 settimane e fotografate il giorno 11 dopo l'iniezione di cellule tumorali e l'inserimento della finestra. Il filmato è una proiezione di massima intensità di sei immagini lungo l'asse Z ed estratte da un periodo di imaging di 2 ore. Timestamp (h:min:s:ms). Rappresentante di sei topi ripresi. Clicca qui per scaricare questo video.

Film 3: Cambiamenti nell'infiltrazione delle cellule immunitarie in ACTB-ECFP; Topi LysM-eGFP durante l'involuzione. Femmina C57BL/6J x BALB/c ACTB-ECFP; I topi LysM-eGFP che esprimono GFP nelle cellule mieloidi (principalmente nei granulociti ma anche nei macrofagi) e ECFP in tutte le cellule (ma più alto nelle cellule epiteliali) sono stati allevati a 8 settimane di età. Dopo il parto, i cuccioli sono stati normalizzati a sei cuccioli per topo. Il giorno 10 dopo il parto, i cuccioli sono stati svezzati e sono state inserite finestre di imaging della ghiandola mammaria addominale. Le cellule mieloidi appaiono in verde; l'attività dell'elastasi neutrofila, marcata con la sonda Neutrophil Elastase 680 FAST iniettata 4 ore prima dell'inizio dell'imaging, appare in rosso (apparirà gialla quando colocalizzata con neutrofili); e le cellule epiteliali appaiono in blu. I filmati sono una proiezione di intensità massima di cinque immagini lungo l'asse Z (100-150 μm di profondità). (A) Imaging al giorno 2 dell'involuzione della ghiandola mammaria. Barra della scala = 20 μm. Immagine utilizzando lunghezze d'onda di eccitazione di 960 nm e 1080 nm, potenza laser rispettivamente al 10% e al 15%. (B) Imaging al giorno 4 dell'involuzione della ghiandola mammaria. Barra della scala = 20 μm. Il film proviene dalla stessa regione del topo e del tessuto del film 3A. (C) Ingrandimento più elevato di una regione di interesse dal film 3B, che mostra due neutrofili che interagiscono tra loro e le cellule epiteliali della ghiandola mammaria. La formazione di protrusioni transitorie di membrana può essere osservata sul bordo anteriore durante la migrazione dei neutrofili. Timestamp (h:min:s:ms). Rappresentante di quattro topi ripresi. Clicca qui per scaricare Movie 3A. Clicca qui per scaricare Movie 3B. Clicca qui per scaricare Movie 3C.     

Film 4: Cambiamenti nell'infiltrazione delle cellule immunitarie nei topi c-fms-EGFP durante l'involuzione. Le femmine di topi C57BL / 6J c-fms-EGFP, con macrofagi marcati GFP, sono stati allevati a 8 settimane di età. Dopo il parto, le cucciolate sono state adattate a sei cuccioli per topo. Il giorno 10 dopo il parto, i cuccioli sono stati svezzati e sono state inserite finestre di imaging della ghiandola mammaria addominale. Il film, acquisito il giorno 1 dell'involuzione (un giorno dopo l'inserimento della finestra), evidenzia l'infiltrato macrofagico prominente durante l'involuzione. I macrofagi appaiono in verde, le fibre di collagene (generazione di seconda armonica) appaiono in blu e i vasi sanguigni appaiono in rosso (Lectin-DyLight 594). Barra della scala = 20 μm. Le immagini sono proiezioni di massima intensità di cinque immagini lungo l'asse Z (100-150 um di profondità). Ripresa utilizzando lunghezze d'onda di eccitazione di 960 nm e 800 nm, potenza laser rispettivamente al 10% e al 15%. Timestamp (h:min:s:ms). Rappresentante di tre topi ripresi. Clicca qui per scaricare questo video.

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Discussion

Le finestre di imaging intravitale sono strumenti importanti per visualizzare direttamente i processi fisiologici e patologici a risoluzione cellulare mentre si svolgono nel tempo. La nuova procedura descritta per la fusione e l'inserimento di finestre di imaging flessibili in silicone nei mouse supera alcuni dei problemi più comuni con le finestre di imaging attualmente utilizzate (essudato, rottura e interferenza con la normale mobilità), fornisce ulteriore sicurezza per il mouse e aumenta l'accessibilità di questa tecnica.

Le finestre di imaging più utilizzate comprendono una struttura metallica che contiene una copertura di vetro. Uno dei principali ostacoli all'uso di queste finestre prototipiche è che il fissaggio dell'anello metallico comporta laboriose procedure di cucitura, che richiedono personale con una formazione chirurgica avanzata. Inoltre, la produzione dei telai è costosa e richiede attrezzature specializzate. Le finestre PDMS superano entrambi questi problemi. La procedura per inserire le finestre PDMS elimina le cuciture, abbassando significativamente la barriera all'apprendimento della tecnica. Anche i materiali per produrre le finestre sono economici e possono essere facilmente acquistati. Inoltre, sia la forma della finestra che la procedura chirurgica possono essere adattate per l'imaging di diversi organi, tra cui la ghiandola mammaria, il fegato, il pancreas, la milza e l'intestino.

Mentre le attuali finestre di imaging intravitale consentono l'imaging longitudinale per alcuni giorni, diversi problemi comuni limitano l'uso di queste finestre per lunghi periodi di tempo. Il peso e le dimensioni delle finestre di vetro possono interferire con il libero movimento dei topi e l'essudato può accumularsi contro la finestra. I topi possono anche danneggiare il coperchio di vetro, causando ferite e infezioni. Al contrario, la procedura qui descritta mantiene lo stesso livello di accessibilità al tessuto riducendo al minimo l'angoscia per gli animali. PDMS è un polimero sintetico sicuro, biostabile ampiamente utilizzato per applicazioni biomediche negli esseri umani, come dispositivi di somministrazione di farmaci, chirurgia di ricostruzione facciale e protesi mammarie. Oltre ad aumentare la tolleranza degli animali alla finestra, l'uso di un materiale biologicamente inerte, al contrario del vetro, è particolarmente importante per gli studi che coinvolgono il sistema immunitario, dove l'infiammazione locale sarebbe un effetto confondente. Inoltre, un importante miglioramento è l'eliminazione dei punti di sutura, poiché i topi li mordono e li tirano, il che può causare la caduta delle finestre di imaging in vetro con cornice metallica. Questo problema è stato parzialmente risolto da una nuova generazione di finestre progettate in modo che i punti siano nascosti in una scanalatura⁹. Tuttavia, quest'ultima strategia richiede la sutura del cordone della borsa, che è una procedura complicata e soggetta a errori che spesso causa punti troppo stretti, con conseguente necrosi del tessuto e dolore. Pertanto, la capacità di incollare la finestra in posizione costituisce un grande vantaggio dell'approccio della finestra in silicone. Inoltre, la finestra è realizzata in un materiale flessibile, resistente con un peso trascurabile, che diminuisce il suo impatto sul movimento dell'animale, come precedentemente valutato in un confronto di finestre che utilizzavano silicone anziché metallo per contenere un coperchio di vetro¹⁷. Eliminando completamente il coperchio in vetro, la finestra in silicone elimina i problemi sia con i telai metallici che con il vetro. Inoltre, la flessibilità della finestra consente di inserirla con facilità e diminuisce la forza di sollecitazione causata dall'incollaggio di una superficie rigida agli organi, diminuendo così il rischio di danni permanenti al tessuto osservato. Inoltre, poiché la finestra è molto più facile da inserire e tenere in posizione, la procedura complessiva richiede meno tempo, limitando i possibili effetti collaterali dovuti all'anestesia prolungata. Per l'inserimento sul fegato, la differenza nel tempo della procedura è particolarmente sostanziale, da 45 minuti per le finestre con telaio metallico a 15 minuti per le finestre in silicone. Infatti, mentre l'inserimento del telaio metallico sul fegato richiede la dissezione del processo xifoide (la cartilagine alla fine dello sterno), che è anche potenzialmente doloroso e causa un'infiammazione sostenuta, questa dissezione non è necessaria per l'inserimento della finestra in silicone. Infine, la finestra di imaging presentata in questo lavoro offre ulteriori vantaggi per quanto riguarda le possibili applicazioni. Ad esempio, a differenza delle finestre di vetro, le finestre in silicone forniscono un facile accesso al tessuto, quindi le cellule tumorali, i coloranti fluorescenti o i farmaci possono essere iniettati direttamente attraverso la finestra.

Un'altra finestra di imaging in silicone basata su PDMS adatta per l'inserimento in una varietà di posizioni anatomiche, inclusa la ghiandola mammaria, è stata recentemente descritta¹⁸. Quella finestra è modellata per generare una forma e un bordo specializzato che consente un rapido impianto della finestra senza la necessità di punti o colla. Al contrario, la finestra in silicone qui presentata non richiede alcuna muffa speciale e, soprattutto, può essere tagliata a forma durante la procedura chirurgica per adattarsi alla posizione anatomica e al singolo topo. Sebbene il protocollo qui descritto richieda l'uso di colla, questo requisito aggiuntivo consente l'imaging degli organi addominali, inclusi il fegato e la milza. Inoltre, la finestra in silicone qui descritta consente l'incorporamento di una griglia in acciaio inossidabile all'interno della finestra, che fornisce punti di riferimento di riferimento. Questi punti di riferimento consentono il tracciamento della stessa posizione esatta nel tempo e facilitano l'imaging ripetuto dello stesso sito su più sessioni (imaging longitudinale) per studiare processi che richiedono giorni o settimane come lo sviluppo di lesioni metastatiche.

In sintesi, è stata sviluppata una finestra di imaging in silicone per l'uso in IVM longitudinale della ghiandola mammaria o degli organi addominali. La finestra è otticamente trasparente, altamente resistente e poco costosa. La semplicità della procedura di inserimento della finestra riduce le competenze tecniche necessarie per l'implementazione di approcci di imaging intravitale basati su finestre. L'adattabilità della finestra a diversi siti tissutali consente l'implementazione di IVM in una vasta gamma di studi biologici.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape	3M	70200770819
Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2	Ethicon	N267H
ACTB-ECFP mice	Jackson Laboratory	22974
AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole)	Vector Laboratories	SK-4200
Alcohol swabs	BD	326895
Anesthesia system	Molecular Imaging Products Co.
Acqknowledge software and sensors	BIOPAC	ACK100W, ACK100M, TSD110
Betadine spray	LORIS	109-08
c-fms-EGFP (MacGreen) mice	Jackson Laboratory	18549
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	664
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)	Invitrogen	14-0451-82
CD68 Antibody	Abcam	ab125212
Curity gauze sponges	Covidien
Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP)	Abcam	ab6885
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)	Abcam	ab97064
Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP)	Abcam	ab102182
Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear	Electron Microscopy Sciences	24236-10	Two-part, 10:1 mixing ratio
Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness	Electron Microscopy Sciences	72296-08
Ender-3 Pro 3D printer	Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD
Far Infrared Heated blanket	Kent Scientific	RT-0520
Fc Receptor Blocker	Innovex Biosciences	NB309
Fiji imaging processing package			https://imagej.net/software/fiji/
FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515)	Invitrogen	F8795
Gating system:	BIOPAC Systems Inc.		The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems.
Acqknowledge software		ACK100W, ACK100M
Diff. Amp. Module, C Series		DA100C
Dual Gating Sys small animal		DTU200
MP160 for Windows - Analysis system		MP160WSW
MouseOx Plus 120V		MOX-120V;015000
Pressure Pad		TSD110
Gelfoam	Pfizer	9031508	Absorbable gelatin sponge
Hardened fine scissors	Fine Science Tools	14090-11	Two pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length
Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody	R&D Systems	AF3667
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 s
Imaris	Bitplane	www.bitplane.com
Immersion medium Immersol W 2010	Zeiss	444969-0000-000
Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc	BD	324912
Isoflurane (Fluriso)	VetOne	502017
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594	Vector Laboratories	DL-1177-1
LysM-eGFP mice	www.mmrrc.org	012039-MU
Micro dissecting forceps	Roboz	RS-5135	Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length
Micro dissecting forceps	Roboz	RS-5153	1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length
MTS MiniBionix II 808	MTS Systems		Servohydraulic material testing machine
Neutrophil Elastase 680 FAST probe	PerkinElmer	NEV11169
Nitrogen	General Welding Supply Corp.
Oxygen	General Welding Supply Corp.
Polylactic acid filament	Hatchbox		1.75 mm diameter
ProLong Diamond Antifade Mountant	Invitrogen	P36970
Puralube ophthalmic ointment	Dechra	NDC17033-211-38
Reflex 7 wound clips	Roboz Surgical	RS-9255
Stainless steel grid	Fotofab		One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square.
Surface Treated SterileTissue Culture Plates	Fisher Scientific	FB012929	Lid used as curing surface for imaging windows
TriM Scope Multiphoton Microscope	LaVision BioTec		Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: T560LP T665LPXXR T495lxpr
Vetbond	3M	70200742529
VWR micro cover glass	VWR	48404-453