Summary
관심 조직/기관 및 피부에 직접 접착할 수 있는 광학적으로 투명한 실리콘 창을 사용하여 장기간 생체 내 이미징을 위한 접근법이 제시됩니다. 이 창문은 현재 현장에서 사용되는 다른 창문보다 저렴하고 다재다능하며 외과 적 삽입은 동물에게 제한된 염증과 고통을 유발합니다.
Abstract
생체 내 현미경 검사 (IVM)는 단일 세포 분해능에서 세포 이동, 분열 및 사망의 시각화를 가능하게합니다. 외과적으로 삽입된 이미징 윈도우를 통한 IVM은 수일 내지 수주에 걸쳐 동일한 조직의 종방향 관찰을 허용하기 때문에 특히 강력하다. 일반적인 이미징 창은 마우스의 피부에 봉합된 생체적합성 금속 프레임의 유리 커버슬립을 포함한다. 이 창문은 생쥐의 자유로운 움직임을 방해하고 강한 염증 반응을 이끌어 낼 수 있으며 깨진 유리 또는 찢어진 봉합사로 인해 실패 할 수 있으며 그 중 어느 것도 안락사가 필요할 수 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 장기 복부 장기 및 유선 이미징을위한 창문은 이전에 두개골 이미징 창에 사용 된 광학적으로 투명한 실리콘 폴리머 인 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)의 박막으로 개발되었습니다. 이 창문은 조직에 직접 접착 할 수있어 삽입에 필요한 시간을 줄일 수 있습니다. PDMS는 유연하여 시간이 지남에 따라 마우스의 내구성에 기여하며 최대 35 일이 테스트되었습니다. 종방향 영상화는 개별 세션 동안 동일한 조직 영역의 영상화이다. 스테인리스 스틸 그리드가 창문 내에 내장되어 동일한 지역을 현지화하여 며칠 간격으로 동일한 위치에서 동적 프로세스 (예 : 유선의 개입)를 시각화 할 수있었습니다. 이 실리콘 창은 또한 시간이 지남에 따라 미세 전이로 발전하는 단일 전파 암 세포를 모니터링 할 수있었습니다. 이 연구에 사용 된 실리콘 창은 금속 프레임 유리 창보다 삽입하기가 간단하며 이미지 된 조직의 제한된 염증을 일으 킵니다. 또한, 임베디드 그리드는 반복 이미징 세션에서 동일한 조직 영역의 간단한 추적을 허용합니다.
Introduction
마취 된 동물의 조직 이미징 인 Intravital Microscopy (IVM)는 손상되지 않은 조직에서 세포 분해능에서 생리 학적 및 병리학 적 사건의 역학에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 기술의 적용은 매우 다양하지만 IVM은 암 생물학 분야에서 암세포가 조직을 침범하고 전이하는 방법을 밝히고 주변 미세 환경과 상호 작용하며 약물 1,2,3에 반응하는 데 도움이되었습니다. 또한, IVM은 생체외 프로파일링 접근법(예를 들어, 유세포 분석기)에 상보적인 통찰을 제공함으로써 면역 반응을 지배하는 복잡한 메카니즘의 이해를 증진시키는 열쇠가 되었다. 예를 들어, 생체 내 영상 실험은 세포 이동 및 세포 - 세포 접촉과 관련된 면역 기능에 대한 세부 사항을 밝혀 냈으며 부상이나 감염에 대한 반응으로 시공간 역학을 정량화하는 플랫폼을 제공했습니다 4,5,6,7. 이러한 과정의 대부분은 조직 학적 염색을 통해 연구 될 수도 있지만 IVM 만이 동적 변화를 추적 할 수 있습니다. 사실, 조직학적 섹션이 주어진 시간에 조직의 스냅샷을 제공하는 반면, 생체내 영상은 시간이 지남에 따라 동일한 조직 내의 세포간 및 세포내 사건을 추적할 수 있다. 특히, 형광 표지의 진행과 분자 리포터의 개발은 분자 사건이 증식, 사망, 운동성 및 다른 세포 또는 세포외 매트릭스와의 상호 작용과 같은 세포 거동과 상관되도록 허용했다. 대부분의 IVM 기술은 형광 현미경을 기반으로하며, 이는 광 산란으로 인해 더 깊은 조직을 이미징하는 것을 어렵게 만듭니다. 따라서 관심있는 조직은 종종 종종 침습적 및 말단 절차로 외과 적으로 노출되어야합니다. 따라서, 기관 부위에 따라, 조직은 몇 내지 40h8에서 변화하는 기간 동안 연속적으로 영상화될 수 있다. 대안적으로, 영구적인 이미징 윈도우의 외과적 삽입은 7,9주까지의 기간에 걸쳐 순차적으로 동일한 조직의 영상화를 허용한다.
새로운 이미징 윈도우의 개발은 인트라바이탈 이미징 접근법(10)을 더욱 개선하기 위한 기술적 필요성으로서 강조되고 있다. 원형 생체내 영상화 창은 봉합사(11)로 피부에 고정된 유리 커버슬립을 포함하는 금속 링이다. 자유로운 움직임에 대한 간섭, 삼출물의 축적 및 유리 커버 슬립의 손상은 이러한 창문을 사용할 때 볼 수있는 일반적인 문제입니다. 또한, 프로토 타입 창은 전문적인 생산이 필요하며 외과 수술은 광범위한 교육이 필요할 수 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 이전에 뇌(12)의 장기 이미징을 위해 두개골 창문에 사용되어온 실리콘 폴리머인 폴리디메틸실록산(PDMS)이 복부 장기 및 유선 영상화에 사용하도록 조정되었다. 여기에서, 동일한 조직 영역의 반복적인 이미징을 위한 랜드마크를 제공하기 위해 스테인리스강 그리드 주위에 윈도우를 캐스팅하는 방법을 포함하는 PDMS 기반 실리콘 윈도우를 생성하기 위한 상세한 방법이 제시된다. 또한, 복부 장기 또는 유선에 창을 삽입하기위한 간단하고 스티치가없는 수술 절차가 설명되어 있습니다. 이 새로운 접근 방식은 현재 사용되는 이미징 창의 가장 일반적인 문제 중 일부를 극복하고 종방향 생체 내 영상의 접근성을 높입니다.
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Protocol
설명 된 모든 절차는 콜드 스프링 하버 실험실 외과 지침에 따라 수행되었으며 콜드 스프링 하버 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.
1. 실리콘 창 주조
- 베이스 엘라스토머와 경화제를 10:1 (v/v) 비율로 혼합하여 실리콘 폴리머(PDMS)를 준비합니다.
- 멸균되고 매끄러운 표면에 소량의 PDMS를 증착하여 창을 캐스팅하고 부피 대 면적비를 원하는 두께로 조정한다.
참고: 24웰 플레이트 뚜껑의 뚜껑에 직경 22mm 원형에 200mg의 폴리머 용액을 사용하면 창의 견고성과 광학 선명도 간에 좋은 절충안이 나타납니다. - 옵션: 동일한 조직 영역의 반복 이미징을 위한 랜드마크를 제공하려면 PDMS가 원하는 주조 표면에 있는 후 실리콘으로 스테인리스 스틸 그리드를 가볍게 누릅니다.
- 기포를 제거하려면 코팅된 표면을 진공 데시케이터에 45분 동안 놓고 폴리머를 탈기시킨다.
- 실리콘 창문을 80°C의 오븐에서 45분 동안 경화시킨다.
- 금형의 가장자리에서 폴리머를 스코어링하고 포셉으로 주조하는 데 사용되는 표면에서 경화 된 창을 부드럽게 벗겨냅니다.
- 수술 전에 오토클레이빙으로 창문을 살균하십시오.
2. 실리콘 윈도우의 삽입을 위한 마우스 준비
- 4% (v/v) 이소플루란을 사용하여 유도 챔버에서 마우스를 마취하십시오. 마우스를 수술대 위의 온난 패드로 옮기고, 마우스를 마취 코 마스크에 넣고, 수술 내내 유지를 위해 이소플루란 농도를 2%로 낮춘다.
- 뒷다리의 발가락을 꼬집어 마취의 깊이를 확인하십시오. 마우스가 비활성 상태이고 발가락 핀치 반사 반응이 나타나지 않을 때까지 진행하지 마십시오.
- 안과 윤활제를 눈에 바르면 건조하지 않고 외상을 예방할 수 있습니다.
- 선제 진통 (buprenorphine 0.05 mg / kg)을 피하로 투여하십시오.
- 수술 부위를 면도하고 제모 크림으로 머리카락을 완전히 제거하십시오.
- 수술 부위 감염을 예방하기 위해 포비돈 요오드 용액 (10 % v / v)과 에탄올 (70 % v / v)을 3 배 연속으로 바르십시오.
3. 간에서 이미징을위한 복부 창 삽입; 다른 복부 장기에 적응 가능 (그림 1)
- 마우스를 수핀 위치에 놓습니다.
- 멸균 가위와 포셉을 사용하여 xiphoid 공정에서 3mm 아래로 시작하여 10mm 절개를 만듭니다.
- 중간 선을 따라 피부의 1-1.5cm2 부분을 제거하십시오.
- 두 번째 쌍의 멸균 가위와 포셉을 사용하여 복막의 부분을 피부 부분보다 약간 작은 부분을 제거하십시오.
- 선택 사항: 간장의 더 큰 부분을 시각화하려면 멸균 식염수로 적신 멸균 면봉을 사용하여 횡격막에서 간을 아래로 밀어 내면서 간과 횡격막을 연결하는 팔시폼 인대를 드러냅니다. 열등한 정맥 카바를 자르지 않도록 인대를 절단하십시오.
- 31 G 주사기로 수술 용 접착제를 철회하고 이미지 할 부위의 가장자리 주위의 간 표면에 소량을 바르십시오. 이 접착제는 원형 씰을 생성하여 이미징을 위해 중앙 영역을 그대로 유지합니다.
주의: 접착제를 이미징 영역 주위에 원형 패턴을 형성하는 작은 액적으로 제한하십시오. 접착제와 즉시 접촉하는 조직은 이미징 할 수 없습니다. 접착제를 적용하기 전에 조직을 건조 할 필요는 없습니다.
참고: 모든 시아노아크릴레이트 기반 접착제를 이 절차에 성공적으로 사용할 수 있습니다. 외과 용 접착제는 멸균을 보장합니다. 터미널 절차의 경우 다목적 슈퍼 접착제가 좋은 결과를 산출합니다. - 포셉을 사용하여 창을 놓고 접착제가 건조 될 때까지 간을 단단히 잡으십시오 (~ 2 분).
- 복막 아래 창 가장자리를 접습니다.
- 주사기를 사용하면 복막 아래에있는 창 가장자리에 소량의 외과 용 접착제를 증착하십시오. 포셉으로 복막을 아래로 밀어 창문에 고정시킵니다.
- 마찬가지로, 복막에 고정하기 위해 포셉으로 피부를 아래로 밀기 전에 소량의 외과 용 접착제를 복막에 고정하십시오.
참고 : 올바르게 수행되면 이제 간 조직의 원형 영역이 창을 통해 표시되어야합니다. - 창 가장자리 주위에 접착제를 바르면 피부가 창 위로 다시 자라는 것을 방지하는 데 도움이되는 림을 만듭니다.
주의: 멸균 수술 기술을 사용하여 수술을 수행하고 삽입 전에 창문을 멸균 한 경우 수술 용 접착제로 상처를 밀봉하면 감염을 피할 수 있습니다. 그러나 외과 적 삽입 또는 불완전한 폐쇄 중에 적절한 무균 기술을 따르지 않으면 명백한 또는 임상 적 감염으로 이어질 수 있으며 조직이 건조해질 수 있습니다.
4. 간에서 이미징을위한 측면 창 삽입; 문맥 정맥에 암세포의 동시 주입과 호환 (그림 2)
- 마우스를 왼쪽 측면 욕창 위치에 놓습니다.
- 멸균 가위와 포셉을 사용하여 늑골 아치 아래 3mm 아래 오른쪽 측면에 10mm 절개를하십시오.
- 피부의 1cm2 부분을 제거하십시오.
- 두 번째 쌍의 멸균 가위와 포셉을 사용하여 복막의 부분을 피부 부분보다 약간 작은 부분을 제거하십시오.
- 31 G 주사기로 수술 용 접착제를 철회하고 이미지 할 부위의 가장자리 주위의 간 표면에 소량을 바르십시오.
주의: 접착제를 이미징 영역 주위에 원형 패턴을 형성하는 작은 액적으로 제한하십시오. 접착제와 즉시 접촉하는 조직은 이미징 할 수 없습니다.
참고: 모든 시아노아크릴레이트 기반 접착제를 이 절차에 성공적으로 사용할 수 있습니다. 외과 용 접착제는 멸균을 보장합니다. 터미널 절차의 경우 다목적 슈퍼 접착제가 좋은 결과를 산출합니다. - 포셉을 사용하여 창을 놓고 접착제가 건조 될 때까지 간을 단단히 잡으십시오 (~ 2 분).
- 복막 아래 창 가장자리를 접습니다.
- 주사기를 사용하면 복막 아래에있는 창 가장자리에 소량의 외과 용 접착제를 증착하십시오. 포셉으로 복막을 아래로 밀어 창문에 고정시킵니다.
- 마찬가지로, 복막에 고정하기 위해 포셉으로 피부를 아래로 밀기 전에 소량의 외과 용 접착제를 복막에 고정하십시오.
참고 : 올바르게 수행되면 이제 간 조직의 원형 영역이 창을 통해 표시되어야합니다. - 창 가장자리 주위에 접착제를 바르면 피부가 창 위로 다시 자라는 것을 방지하는 데 도움이되는 림을 만듭니다.
- 포털 정맥 주입이 필요한 경우:
- 마우스를 수핀 위치에 놓습니다.
- 피부의 xiphoid 과정에서 시작하여 10mm 절개를하십시오.
- 두 번째 쌍의 멸균 가위와 포셉을 사용하여 복막에 10mm 절개를하십시오.
- 두 면봉을 멸균 식염수에 담그십시오.
- 면봉을 사용하여 멸균 식염수로 적신 멸균 거즈에 내장을 부드럽게 당기고 방향을 비틀거나 뒤틀리지 않도록주의하십시오.
- 복부의 오른쪽에 포털 정맥이 보일 때까지 복강에서 장을 옮기십시오.
- 31-33 G 바늘 5-7 mm 코달을 문맥 정맥이 간으로 들어가는 지점에 삽입하여 혈관을 통과하지 않고 혈관 내에서 진행되도록하십시오.
- 암세포를 천천히 주입한다(100 μL의 멸균 PBS에 재현탁).
참고: 본 실험을 위해 아뮤린 췌장암 세포주 (예를 들어, KPC-BL/6-1199)는 멸균 PBS 100 μL에 주입된 완전한 DMEM 배지 및 1 x 105 세포에서 배양될 수 있다. - 출혈을 예방하려면 바늘을 뽑은 직후에 1-2 분 동안 작은 수술 스폰지로 주사 부위에 부드러운 압력을 가하십시오.
- 압력이 풀리면 지혈을 보장하기 위해 1-2 분 동안 사이트를 모니터링하십시오.
- 축축한 면봉을 사용하여 장기의 생리적 방향에 따라 장을 복강으로 되돌립니다.
- 멸균 포셉을 사용하여 마우스의 복강 왼쪽에있는 복막 바로 아래에 창을 삽입하십시오.
- 4-0 실크 봉합사로 봉합하고 7mm 스테인레스 스틸 상처 클립으로 미드 라인 절개를 스테이플하십시오.
- 마우스를 왼쪽 측면 욕창 위치로 이동
- 멸균 된 가위와 포셉을 사용하여 피부를 통해 늑골 아치 아래 오른쪽 측면 3mm에 10mm 절개를하십시오.
- 절개 주위의 피부 1cm2 부분을 제거하십시오.
- 두 번째 쌍의 멸균 가위와 포셉을 사용하여 복막의 부분을 피부 부분보다 약간 작은 부분을 제거하십시오.
- 4.8-4.10 단계에 설명된 대로 창을 간 위로 당겨 제자리에 붙이십시오.
5. 췌장에 이미징을 위한 창 삽입(그림 3)
- 마우스를 오른쪽 측면 욕창 위치에 놓습니다.
- 멸균 가위와 포셉을 사용하여 늑골 아치 아래 3mm 아래 왼쪽 측면에 10mm 절개를 만듭니다.
- 절개 주위의 피부 1cm2 부분을 제거하십시오.
- 두 번째 쌍의 멸균 가위와 포셉을 사용하여 복막의 부분을 피부 부분보다 약간 작은 부분을 제거하십시오.
- 멸균 식염수에 담근 멸균 면봉을 사용하여 비장을 부드럽게 당겨 췌장을 시각화합니다. 축축한 면봉으로 췌장을 재배치하여 절개를 통해 더 많은 표면적을 볼 수 있도록하십시오.
참고 :이 시점에서 췌장암 세포는 실험 설계의 일부인 경우 췌장에 정형 외과 적으로 주사 될 수 있습니다. - 31 G 주사기로 외과 용 접착제를 철회하고 이미지 할 부위의 가장자리 주위에 췌장 표면에 소량을 바르십시오.
주의: 접착제를 이미징 영역 주위에 원형 패턴을 형성하는 작은 액적으로 제한하십시오. 접착제와 즉시 접촉하는 조직은 이미징 할 수 없습니다. - 포셉을 사용하여 창을 놓고 접착제가 건조 될 때까지 췌장에 단단히 고정하십시오 (~ 2 분).
- 복막 아래 창 가장자리를 접습니다.
- 주사기를 사용하면 복막 아래에있는 창 가장자리에 소량의 외과 용 접착제를 증착하십시오. 포셉으로 복막을 아래로 밀어 창문에 고정시킵니다.
- 마찬가지로, 복막에 고정하기 위해 포셉으로 피부를 아래로 밀기 전에 소량의 외과 용 접착제를 복막에 고정하십시오.
참고 : 올바르게 수행되면 췌장 조직의 원형 영역이 창을 통해 표시되어야합니다. - 창 가장자리 주위에 접착제를 바르면 피부가 창 위로 다시 자라는 것을 방지하는 데 도움이되는 림을 만듭니다.
6. 유선에 이미징을 위한 창 삽입(그림 4)
- 마우스를 수핀 위치에 놓습니다.
- 멸균 가위와 포셉을 사용하여 사타구니 젖꼭지 중 하나에 10mm 절개 내측을 만듭니다.
- 유선의 위 피부의 0.5cm2 부분을 제거하십시오.
- 두 번째 한 쌍의 멸균 가위를 사용하여 두 표면 사이에 가위를 퍼뜨려 부착을 방해하여 유선을 조심스럽게 피부에서 분리하십시오.
참고 : 사타구니 유선 영역의 이미징을 용이하게하려면 유선보다 우월하지만 뒷다리보다 우수한 피부 부분을 해부하여 창문이 마우스의 이동성을 제한하지 않도록주의하십시오. - 31 G 주사기로 외과 용 접착제를 철회하고 이미징 할 부위의 가장자리 주위의 유선의 표면에 소량을 바르십시오.
주의: 접착제를 이미징 영역 주위에 원형 패턴을 형성하는 작은 액적으로 제한하십시오. 접착제와 즉시 접촉하는 조직은 이미징 할 수 없습니다. - 포셉을 사용하여 창을 놓고 접착제가 건조 될 때까지 유선에 단단히 고정하십시오 (~ 2 분).
참고 : 유선 조직의 원형 영역이 올바르게 수행되면 창을 통해 볼 수 있어야합니다. - 창 가장자리를 피부 아래에 접습니다.
- 주사기를 사용하면 현재 피부 아래에있는 창 가장자리에 소량의 외과 용 접착제를 증착하십시오. 포셉으로 피부를 아래로 밀어 피부를 창문에 고정시킵니다.
- 창 가장자리 주위에 접착제를 바르면 피부가 창 위로 다시 자라는 것을 방지하는 데 도움이되는 림을 만듭니다.
7. 수술 후 회복
- 마우스를 충분한 중첩 재료가있는 깨끗한 회복 케이지에 넣고 케이지의 일부가 가열 패드에 놓여 있는지 확인하십시오.
- 마우스가 의식이 있고 움직일 때까지 마우스를 지속적으로 모니터링합니다.
- 필요한 경우, 선제 투여 후 12 시간 후에 진통제의 추가 복용량을 제공하십시오.
참고: 추가 진통제는 일반적으로 불필요하지만, 마우스가 고통의 징후(예: 허리 구부러짐, 헐렁한 모피 또는 음식에 대한 관심 상실)가 나타나는 경우 수의사와 상의하십시오. 수술 후 처음 3 일 동안 매일 마우스를 모니터링하여 감염 징후 또는 기타 부작용이 있는지 확인하십시오. 마우스의 2 % 미만은 수의사의 관심이나 안락사가 필요하며, 일반적으로 창문의 부분적인 분리로 인해 발생합니다. 복부 간 영상 창이있는 수컷 마우스의 경우 생쥐 간의 싸움으로 인해 창문이 분리 될 수 있다는 점에 유의해야합니다. 이것은 마우스를 별도로 하우징함으로써 피할 수 있습니다.
8. 창을 통한 이미징
- 4% (v/v) 이소플루란을 사용하여 유도 챔버에서 마우스를 마취하십시오.
- 안과 윤활제를 눈에 바르면 건조하지 않고 외상을 예방할 수 있습니다.
- 마우스를 유도 챔버에서 현미경 단계로 옮깁니다. 마우스를 마취 코 마스크에 넣고 이미징 절차 전반에 걸쳐 유지 마취를 위해 이소플루란 농도를 약 1-1.5 %로 낮 춥니 다.
- 압력 패드 센서를 마우스 아래에 놓아 호흡률을 모니터링하고 부드러운 수술 테이프를 사용하여 마우스를 무대에 고정시킵니다.
- 직장 온도계를 삽입하여 이미징 세션 전반에 걸쳐 체온을 모니터링하십시오.
- 가열된 패드를 켜고 마우스를 면밀히 모니터링하여 체온이 37°C를 초과하지 않도록 합니다.
- 소프트웨어를 사용하여 마우스의 호흡 속도를 모니터링하십시오. 최적의 속도는 ~ 1 호흡 / 초입니다. 필요에 따라 마취를 조정하십시오.
- 각 이미징 세션 전에 잔여 렌즈 침지 매체 및 이물질로부터 창문을 청소하여 70% 에탄올(v/v)에 담근 면봉으로 부드럽게 닦으십시오.
- 침수 렌즈를 사용할 때는 거품을 피하면서 창문에 초음파 젤을 바르십시오.
참고: 증류수도 사용할 수 있지만 이미징 중에 다시 적용해야 할 수도 있습니다. - 이미징에 대한 최적의 깊이를 찾으려면 먼저 그리드를 찾아 초점을 맞춥니다.
- 그리드의 바닥을 0으로 설정하여 대략적인 조직 이미징 깊이를 결정합니다. 이 정보는 후속 이미징 세션에서 대응하는 z 평면을 찾는 데 필요하다.
- 여러 이미징 세션에서 동일한 위치를 식별하려면 그리드의 사각형을 참조점으로 활용합니다. 이미징 동안, 격자의 방향과 이미지화된 각 시야의 격자 내의 위치를 주목한다(예를 들어, 상단으로부터 2번째 행, 왼쪽으로부터 4번째 사각형).
- 연속적인 이미징 세션 중에 그리드를 사용하여 특정 그리드 영역으로 다시 이동하여 필드를 이미징합니다.
- 각 이미징 세션이 끝나면 70% 에탄올(v/v)에 담근 면봉으로 창을 부드럽게 닦아 잔류 렌즈 침지 매체와 이물질을 제거합니다.
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Representative Results
이미징 창을 통한 생체 내 이미징은 몇 시간에서 몇 주에 걸쳐 단일 세포 분해능에서 광범위한 세포 및 분자 사건을 관찰, 추적 및 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 이미징 윈도우에 이상적인 특징은 다음을 포함한다: a) 마우스의 웰빙 및 조직의 생리학에 대한 제한된 영향; b) 내구성; c) 삽입의 단순성; d) 동일한 영역의 반복 이미징을위한 명확한 랜드 마크. 그 결과 다용도의 불활성 실리콘 윈도우가 탄생하여 쉽게 제작되고 삽입되며, 여러 이미징 세션의 범위에 걸쳐 동일한 시야각을 찾을 수 있는 그리드를 장착할 수 있습니다.
창은 저렴하고 유연하며 명확한 재료 인 PDMS로 만들어졌습니다. Windows는 대부분의 실험실에서 구입할 수있는 소모품으로 주조 할 수 있습니다. 이러한 목적을 위해, 상업적으로 입수가능한 24개의 웰 플레이트의 뚜껑에 이미 에칭된 원형 몰드(직경 22mm)가 잘 작동합니다. 단위 면적당 사용되는 폴리머의 양을 변화시킴으로써, 윈도우의 두께를 조절할 수 있다. 이미징 해상도에 대한 윈도우의 두께의 효과를 문서화하기 위해, 40 nm 형광 미소 구체의 포인트 확산 기능 (PSF) 분석을 수행하여 다양한 두께의 PDMS 창을 통한 이미징을 생체 내 이미징 윈도우 (0.17 mm 두께)에 일반적으로 사용되는 유리 커버 슬립과 비교했습니다. 생체내 영상화에 사용된 셋업을 복제하기 위해, PSF 이미징은 침지 매질로서 적용된 초음파 겔과 동일한 이광자 현미경 및 수침 렌즈를 사용하여 수행되었다.
측면 평면에서 PSF의 적합도를 통해 계산된 신호 강도의 절반 최대값(FWHM)에서의 전체 폭은 100mg의 PDMS로 주조된 PDMS 윈도우용 유리의 폭과 비슷했습니다(그림 5A,B). 유리 커버슬립에 비해 측면 분해능은 150-250mg의 PDMS로 주조된 창문의 경우 감소되었습니다(그림 5A,B). z축 이미지 평면에서 100-200mg의 폴리머로 주조된 PDMS 윈도우는 유리 커버슬립보다 성능이 뛰어납니다(그림 5C). 300mg의 PDMS로 주조된 윈도우에서 광학 선명도가 손실되어 측정이 신뢰할 수 없게 되었습니다(그림 5A–C). FWHM 값의 X/Y 비율은 두께의 유리와 PDMS간에 크게 다르지 않았지만, 200-250mg의 폴리머가 있는 윈도우의 비율은 초음파 겔을 침지 매질로 사용하는 1에서 현저하게 벗어났습니다 (그림 5D). 그러나, 물을 200mg의 윈도우 캐스트를 위한 침지 매질로서 사용할 때, 대칭으로부터의 편차는 훨씬 덜 두드러졌다. 이 두께에서, 중합체의 수차로 인한 편차는 따라서 미미할 가능성이 있다. 피크 형광 강도 값도 각 미소 구체에 대해 수집되었고, 가장 높은 신호가 유리를 통해 기록되었지만, 유리와 PDMS가 비교적으로 수행되었음을 보여주었다 (그림 5I). PDMS 창의 최적 두께는 특정 응용 분야 및 이미징 시스템에 따라 달라집니다. 대부분의 목적을 위해, 22mm 직경의 원형 윈도우를 위한 200mg의 폴리머 용액은 윈도우 견고성과 광학 선명도 사이의 최적의 절충안입니다. 실제로 200mg 미만의 창문은 유리와 유사한 FWHM 값으로 광학적으로 더 명확했지만 외과 적 이식 중에 때때로 찢어졌으며 200mg (> 100 마리의 마우스)을 사용하여 창 손상이 관찰되지 않았습니다.
재료 특성의 이러한 차이를 측정하기 위해 PDMS 창(200mg 및 150mg)을 재료 고장이 발생할 때까지 1N/s의 하중 제어 프로파일로 서보유압 재료 시험기에 적재했습니다(그림 5J). 힘 및 변위 값은 100Hz의 주파수에서 측정되었다. 그런 다음 힘-변위 데이터는 방정식을 사용하여 응력 변형률로 변환되었습니다.
σ = F / A (1)
Ɛ = Δ L / L0 (2)
여기서 σ는 응력(Pa), F는 힘(N), A는 윈도우의 단면적, Ɛ는 변형, ΔL은 변위,L0 은 윈도우의 두께이다. 재료의 인성은 응력-변형 곡선 하에서의 합산 면적을 계산함으로써 결정되었다. 재료의 인성은 가소성으로 변형되고 골절 전 과정에서 에너지를 흡수하는 능력을 말하며, 이는 이식 된 창문(13)의 핵심 특성입니다. 이미징 실험 중 관찰과 일치하여, 200mg의 PDMS를 사용한 윈도우 캐스트는 150mg(그림 5K)의 윈도우 캐스트보다 훨씬 더 큰 인성을 가지며, 따라서 파손되기 쉽다.
다음으로, 200 mg으로 주조된 바람직한 PDMS 윈도우 캐스트의 영 모듈러스(E)를 결정하고, 응력-변형 곡선의 선형 영역을 추출하고 Hooke의 법칙을 사용하여 기울기를 결정함으로써 표준 유리 커버슬립의 그것과 비교하였다:
σ = EƐ (3)
유리 창문의 영 모듈러스는 PDMS보다 훨씬 컸으며, 이는 유리가 PDMS보다 재료 강도가 훨씬 더 강하기 때문에 예상되었습니다 (그림 5L). 따라서, 유리는 더 큰 영 모듈러스에 기초한 더 강한 물질이지만, 200mg PDMS 창문의 더 큰 인성은 두 번째 수술 절차 또는 안락사를 필요로 하고 파손될 위험 없이 더 오랜 기간 동안 적용될 수 있다는 것을 지지한다.
실리콘 창문의 가장 큰 장점은 다재다능함입니다. 중요한 것은 외과 적으로 창을 삽입하는 절차가 다른 해부학 적 위치에 쉽게 맞출 수 있다는 것입니다. 수술에 대한 적응은 외과 용 가위로 창문의 크기를 쉽게 조정할 수 있고 창문이 관심있는 조직 / 기관의 표면과 피부에 접착되어 봉합사에 대한 요구 사항을 완전히 제거한다는 사실에 의해 촉진됩니다. 이러한 방식으로 창문을 성공적으로 삽입하면 간, 췌장 및 유선이 달성되었습니다 (그림 6A-C). 특히, 간 영상을 위해 복부 또는 측면 창을 이식하기 위해 두 가지 프로토콜이 개발되었습니다. 그림 1은 복부 창을 삽입하는 단계를 보여줍니다. 이 절차는 다른 복부 장기에 적용 할 수 있으며 가장 큰 이미지 가능한 표면적을 산출합니다. 그러나, 큰 (>1cm2) 영상화 가능 영역이 요구되지 않는 한, 마우스의 우측 측면에 측면 윈도우를 삽입하는 것(도 2)은 예를 들어, 호흡 및 연동 운동으로 인해 모션 아티팩트를 감소시키는 것이 바람직하다. 또한, 측방영상창을 삽입하는 수술절차는 간전이의 발달을 실험적으로 모델링하기 위해 문맥 정맥에 암세포를 동시에 주입하는 것과 호환된다. 따라서 마우스는 동일한 동물에서 문맥 정맥 주사 및 복부 이미징 창 삽입이 필요할 때 두 개의 개별 절차 대신 단일 절차를 거칠 수 있습니다. 유사한 절차가 마우스의 왼쪽 측면에있는 췌장 위에 창을 이식하는 데 사용됩니다 (그림 3). 창은 또한 피하 조직, 즉 정상 유선뿐만 아니라 이미 확립 된 자발적 또는 정형 외과 적으로 이식 된 유방 종양에 삽입 될 수 있습니다 (그림 4). 대안적으로, 암세포는 바늘이 윈도우의 완전성을 손상시키지 않으면서 PDMS 필름을 천공할 수 있기 때문에 원발성 종양의 발달을 종방향으로 따르도록 창을 통해 유선에 주입될 수 있다.
낮은 무게와 유연성으로 인해 실리콘 창은 마우스의 이동성을 방해하지 않습니다 (영화 1). 따라서 실리콘 창은 취약성, 복잡한 봉합 및 동물 이동성에 미치는 영향과 같은 유리 창과 관련된 주요 장애물을 극복합니다. 대신, 실리콘 창과 관련된 주요 한계는 창 아래의 상피의 재성장입니다. 그러나 적절한 양의 피부를 제거하고 상처가 접착제로 완전히 밀봉되면 재 상피화가 제한되고 장기간에 걸쳐 이미징이 계속 될 수 있습니다 (최대 35 일이 테스트되었습니다, 그림 6D). 창을 삽입한 후, 마우스는 대략 한 달 동안 또는 외과적 접착제가 실패하거나 재상피화가 발생할 때까지 세로로 영상화될 수 있다. 짧은 일일 이미징 세션 (~ 60 분) 또는 덜 빈번하지만 더 긴 이미징 세션은 마취로 인한 부작용을 피하기 위해 선호됩니다. 창문을 가진 동물은 표준 절차를 사용하여 단일 광자 또는 다중 광자 공초점 현미경을 통해 모든 생명 내 이미징 플랫폼에서 이미징 할 수 있습니다 (예 : 14 참조). 각 이미징 세션 전후에 70 % 에탄올 (v / v)에 담근 면봉으로 창문을 닦아 얼룩과 이물질로부터 창문을 청소하는 것이 좋습니다.
시간이 지남에 따라 동일한 위치를 추적하기 위해 스테인레스 스틸 그리드를 창 내에 내장 할 수 있습니다. 그림 7A는 여기에 사용된 맞춤형 레이저 에칭 그리드의 사양을 보여줍니다. 투과 전자 현미경을 위한 상업용 격자도 이 용도에 적합하다. 그리드는 캐스팅 절차 동안 창 내에 내장되어 있으며 육안으로(그림 7B) 및 현미경의 안구(그림 7C)를 통해 이미징 영역 전체에 걸쳐 명확하게 볼 수 있습니다. 창은 장기 표면에 붙어 있기 때문에 그리드에 상대적인 이미징 필드의 위치가 안정적입니다. 이미징 동안, 격자의 방향과 이미지화되는 각 시야의 격자 내의 위치(예를 들어, 상단으로부터 2번째 행, 왼쪽으로부터 4번째 사각형)를 주목한다. 그런 다음 그리드를 사용하여 연속적인 이미징 세션 중에 특정 그리드 영역(따라서 이미징 필드)으로 다시 이동합니다.
그리드는 또한 조직이 예를 들어, 호흡 또는 연동 운동으로 인해 천천히 표류할 때 이미징 세션 동안 이미징 필드를 정렬하는데 유용하다. 견고한 림이 있는 대부분의 이미징 창은 이미징 중에 홀더에 연결할 수 있으므로 이미징 영역에 안정성을 추가할 수 있습니다. 가요성 창문은 직접적으로 안정화될 수 없기 때문에, 수술 테이프는 윈도우를 포함하는 신체 섹션을 안정화시키기 위해 사용되고, 이미징 영역은 정의된 간격(전형적으로 매 30분마다)에서 대응하는 격자 정사각형 또는 이전에 식별된 조직 랜드마크(예를 들어, 혈관 랜드마크)의 중심에 재정렬된다. 시야각의 미세한 이동을 위한 추가적인 드리프트 보정은 검출된 조직 패턴(보충 코드 1–2)을 기반으로 프레임을 재정렬하는 코드를 통해 획득 후 단계에서 디지털로 수행됩니다.
창문이 명백한 전신 부작용을 일으키지 않는다는 것을 검증하기 위해, 창 이식과 치료되지 않은 연령 일치 대조군을 겪은 동물의 체중을 모니터링했습니다. 수술과 관련된 초기 체중 감소 후, 창문이 삽입 된 대부분의 마우스는 시간이 지남에 따라 체중이 계속 증가하여 창 삽입이 잘 견딜 수 있음을 나타냅니다 (그림 8A-C). 간 및 유선창의 경우 수술 후 5 일 이내에 정상 체중이 회복됩니다. 수술 후 회복은 췌장 위에 창문을 이식 한 후 느려지며 마우스는 14 일 이내에 수술 전 체중으로 돌아갑니다. 이 관찰은 수술시 췌장 조작과 관련된 예상되는 효과와 일치합니다. 체중 감소가 인간 종말점에 대한 역치에 도달하지 않는 경우에도, 수술 전 체중을 회복하지 않는 마우스( 도 8B에서 *로 표시된 마우스에 의해 예시된 모든 마우스의 <5%)는 전형적으로 이미징 실험으로부터 검열된다. 또한, 창 삽입 후 다양한 시점에서 결정된 백혈구 수는 대조군에 비해 거의 모든 창 베어링 마우스에서 변경되지 않았으며 시간이 지남에 따라 상당히 변하지 않았으며(도 8D), 이는 창이 주요 전신 염증을 일으키지 않았음을 시사한다.
다음으로, 창 및 글루에 대한 국소 조직 반응의 정도를 평가하기 위해, 마우스를 조직학적 분석을 위해 창문을 외과적으로 삽입한 후 3, 14, 및 28(유선창) 또는 35일(간 및 췌장 창)에서 안락사시켰다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색된 간 절편의 평가는 대부분의 마우스에 대해 창문 아래에서 피상적(20-80 μm), 최소 내지 경미한 협막 과립 조직 형성을 나타냈다(3마리 중 2마리는 3일째에 평가되었고, 3마리 중 2마리는 14일째에 평가되었다). 이 병변은 초점(길이 1-3mm)이었으며 접착제 층의 너비에 대략 해당합니다(그림 8E). 35 일 후, 대부분의 마우스 (두 번의 개별 실험에서 평가 된 6 마리 중 4 마리)는 과립 조직을 나타내지 않았으며 일부 (6 마리 중 2 마리)는 중등도의 초점 협막 경화증과 desmoplasia (25-250 μm 깊이에서)를 보였습니다. 흥미롭게도, 아홉 마리의 마우스 코호트에서 임의의 시점에서 창 바로 아래의 췌장의 표면에서 유의한 병변이 관찰되지 않았다 (도 8G). 그러나 일부 마우스는 췌장의 위축 부위와 복부 지방의 염증 (지방염)을 보여 주며 조작으로 인한 손상과 일치합니다. 유선의 경우, 창 이식 후 3 일째에 3 마리의 마우스 중 3 마리가 땀샘 표면을 따라 보이는 치유 절개 또는 지방 조직의 염증 반응을 연상시키는 육아 조직을 가졌습니다. 14일째에, 평가된 3마리의 마우스 중 3마리는 과립화 조직을 가졌다. 이 병변은 다시 초점이 맞고 길이가 1-3mm였습니다 (그림 8I). 수술 후 28일 동안 안락사된 유선창이 있는 마우스는 명백한 조직학적 이상을 보이지 않았다.
이 분석은 창문이 테스트 된 장기 (간, 췌장, 유선)의 전반적인 생리적 구조를 손상시키지 않는다는 것을 암시합니다. 간과 유선의 표면에서 발견되는 반응성 조직은 접착제에 대한 반응 일 가능성이 높았으며 접착제와 접촉하는 즉시 조직으로 제한되었습니다. 정상 조직은 글루글루에 노출되지 않은 부위(도 8E,I)에서 반응성 조직에 인접하여(< 100 μm) 쉽게 발견될 수 있으며, 따라서 조직 염증은 건강한 조직 영역의 영상화를 방해하지 않는다. 더욱이, 조직 반응은 대부분의 마우스(9마리의 마우스 중 8마리, 모든 조직 위치에 걸쳐)가 후기 시점(28일 또는 35일)에 유의한 병변을 나타내지 않았기 때문에 가역적일 가능성이 높지만, 조직 반응이 해결된다는 직접적인 확인은 개별 마우스에서 종방향 측정 없이는 달성하기 어려울 것이다.
CD45, CD68 및 골수퍼옥시다제(MPO)에 대한 다중 면역조직화학 염색도 백혈구, 단핵구/대식세포 및 호중구의 침윤을 각각 특성화하기 위해 수행되었다. 육아 조직 및 지방염과 관련된 면역 세포 침윤의 증가는 유선과 간에서는 나타났지만 췌장에서는 나타나지 않았다 (도 8F, H, J). 참고로, 이러한 변화는 면역 세포 침윤이 마지막 시점 (유선창의 경우 28 일, 간 및 췌장 창구의 경우 35 일)에서 처리되지 않은 대조군의 것과 비교할 수 있기 때문에 일시적 일 가능성이 큽니다.
간은 창 삽입 및 이미징이 이미징을 사용하여 상당한 국소 면역 침윤을 유발했는지 여부를 더 특성화하기 위해 부위로 선택되었습니다. 이를 위해, 골수성 세포 (주로 대식세포)가 녹색 형광 단백질로 표지 된 c-fms-EGFP (MacGreen) 마우스15를 사용했다. 간 창은 3개의 c-fms-EGFP 마우스에 이식되었고, 동일한 시야를 찾기 위해 그리드를 사용하여 수술 후 1일, 3, 5일에 이들을 영상화하였다. 영상화 영역에 존재하는 대식세포의 수는 윈도우 삽입 후 시간에 따라 상당히 변하지 않았다(도 8K).
다음에, 창은 세포 수준 (즉, 이동, 증식, 세포-세포 접촉) 및 조직 수준 (즉, 췌장에서의 종양 성장, 유선에서의 면역 침윤, 및 간 전이)에서 다양한 생물학적 과정의 세트를 영상화함으로써 기능적으로 시험되었다. 췌장은 이미징을위한 쉽게 접근 할 수있는 장소가 아닙니다. 이 장기에서 암 세포 역학을 포착하기 위해 창을 어떻게 활용할 수 있는지 입증하기 위해, 창은 KPC-BL/6-1199 세포의 동위원소 주사와 동시에 6개의 C57BL/6J 마우스의 췌장 위에 삽입되었으며, 일반적으로 사용되는 KPC(Kras LSL- G12D/+;p 53 LSL-R172H; Pdx1-Cre) 췌장암의 유전자 조작 마우스 모델. 공초점 현미경에 의해 시각화되기 위해, KPC-BL/6-1199 세포를 독시사이클린-유도성 강화 GFP (iGFP-1199 세포)를 발현하도록 조작하였다. 주사 후 엿새 후, 마우스를 독시사이클린 식이에 넣어 췌장암 세포에서 녹색 형광 단백질(GFP)의 발현을 촉발시켰다. 도 9는 주사 및 창 삽입 후 11 및 14일째에 iGFP-1199 세포를 정형외적으로 주사한 마우스로부터의 대표적인 이미지를 도시한다. 무비 2는 윈도우 삽입 후 11일째에 2-h 이미징 세션의 발췌문에서 iGFP-1199 종양 가장자리를 보여주며, 실리콘 윈도우를 사용하여 췌장에서 세포막 돌출의 동역학을 포착하는 능력을 예시한다.
실리콘 창은 또한 시간이 지남에 따라 동적 면역 세포 침윤을 포착하는 데 사용할 수 있습니다. 이를 설명하기 위해, 유선창은 수유중인 ACTB-ECFP (Tg (CAG-ECFP)CK6Nagy)로 멸균되었다. LysM-eGFP (Lyz2tm1.1Graf) 마우스는 이유식 직후. 이들 마우스에서, 모든 세포, 그러나 가장 높은 상피 세포는, 베타 액틴 프로모터에 의해 구동되는 시안 형광 단백질 (CFP)을 발현하고, 골수성 세포 - 주로 호중구뿐만 아니라 대식세포 -는 리소자임 M 프로모터에 의해 구동되는 eGFP에 의해 표지된다. 마우스는 창 삽입 후 2 일과 4 일째에, 유선이 침범하는 과정에서 유선조직이 임신 전 상태로 되돌아 가기 시작할 때 이미징되었습니다. ImageJ용 두 개의 매크로는 모션 아티팩트를 줄이고 시각화를 개선하기 위해 개발되었으며, 하나는 Z 평면을 4차원 인트라바이탈 비디오(보충 코드 1)에 정렬하고 다른 하나는 호흡 또는 기타 모션 아티팩트로 인한 흔들림을 줄입니다(보조 코드 2). 그림 10 및 Movie 3A-C는 2일과 4일에 같은 위치에 있는 리모델링 유선조직 내의 호중구 침윤을 보여주며, 창을 사용하여 서로 다른 날에 걸친 면역 세포 침윤 및 움직임을 모니터링하고 추적하는 방법을 보여줍니다. 유사한 실험이 c-fms-EGFP 마우스에서, c-fms 프로모터에 의해 구동되는 GFP를 발현하는 골수성 세포(주로 대식세포)와 함께 진행되었다(무비 4).
마지막으로,이 사용자 정의 가능한 창의 비교적 큰 표면적은 정맥 내 접종 후 간 전이의 형성과 같은 드문 사건을 관찰 할 수있게합니다. 이러한 현상을 입증하기 위해, 간창은 KPC-BL/6-1199 췌장암 세포를 구성적으로 발현하는 KPC-BL/6-1199 췌장암 세포와 함께 문맥 정맥 주사시에 C57BL/6J 마우스에 삽입하여 핵융합 단백질 histone2B-CFP(H2B-CFP)를 발현시켰다. 시간이 지남에 따라 단일 세포와 2-3 세포의 작은 클러스터가 미세 전이 (>100 세포)로 발전하면서 모니터링되었습니다. 도 10 은 주사 및 윈도우 삽입 후 1, 3, 7, 및 9일에 촬영된 대표적인 이미지를 보여주고, 단일 세포에서 미세전이로의 진행을 입증한다.
모든 이미지 및 영화는 다중 광자 현미경을 사용하여 수집되었다. 시간이 지남에 따라 Z 및 X 축을 따라 최대 강도 투영 및 동영상 정렬이 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 생성되었습니다. 정렬 된 이미지와 영화는 Imaris 소프트웨어를 사용하여 컴파일되었습니다.
그림 1 : 간 위에 복부 복부 이미징 창을 외과 적으로 삽입합니다 . (A) 만화는 수술과 관련된 구조의 해부학 적 위치를 보여줍니다. 흰색 점선 상자는 그림에서 볼 수있는 수술 필드를 윤곽을 그립니다. (B) 절개는 xiphoid 과정 아래 3mm에서 시작하여 피부의 1-1.5cm2 섹션이 미드 라인을 따라 제거되도록 계속 내려갑니다. (C) 복막의 약간 작은 부분이 해부된다. (D) 팔시폼 인대 (흰색 화살촉)가 절단되어 간을 아래로 밀어 내린다. 참고 : 멸균 식염수로 적신 면봉은 내부 장기를 부드럽게 조작하는 데 사용됩니다. (e) 주사기를 사용하여, 소량의 외과 접착제가 간 표면의 관심 영역 주위의 물방울에 도포된다. (F) 창문을 배치하고 접착제가 건조 될 때까지 (2 분) 간을 단단히 고정시킵니다. (G) 창의 가장자리는 복막과 피부 아래에 접혀 있습니다. (H) 창을 복막에 고정시키기 위해, 복막을 아래로 밀고 제자리에 붙이기 전에 음영 영역에 해당하는 창 표면에 접착제를 바르십시오. 피부는 마찬가지로 복막에 붙어 있습니다. 접착제의 테두리는 마침내 창 위의 상피의 성장을 막기 위해 빨간색 선을 따라 퇴적됩니다. (i) 수술 후 회복을 위해 준비된 마우스를 보여주는 표시가 없는 (H)에서와 동일한 이미지. 파선으로 윤곽이 그려진 영역은 (J, K)로 확대됩니다. (J) 접착제 방울의 자국은 간 표면(화살표 머리)에서 볼 수 있습니다 (K) 흰색 점선으로 윤곽이 그려진 창을 통해 보이는 간을 보여주는 J에서와 동일한 사진. 간 표면에있는 접착제 방울은 빨간색으로 윤곽선으로 표시됩니다. 이미지화할 영역은 흰색으로 윤곽선이 그려져 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 간장의 오른쪽 엽에 창문을 수술적으로 삽입한 경우. (A) 만화는 수술과 관련된 구조물의 해부학 적 위치를 보여줍니다. 검은 색 점선 상자는 그림에서 볼 수있는 수술 필드를 윤곽을 그립니다. (B) 마우스를 왼쪽 측면 욕창 위치에 놓고, 흉곽 아래 3mm부터 절개를하고, 피부의 약1cm2 부분을 제거합니다. (C) 복막의 약간 작은 부분이 해부된다. (D) 간은 축축한 면봉을 사용하여 흉곽 케이지 아래로 부드럽게 당겨진다. (e) 주사기를 사용하여, 소량의 외과 접착제가 간 표면의 물방울 (흰색 화살표 머리)에 도포된다. (F) 창문을 배치하고 접착제가 건조 될 때까지 (2 분) 간을 단단히 고정시킵니다. (G) 창의 가장자리는 복막과 피부 아래에 접혀 있습니다. (H) 창을 복막에 고정시키기 위해 복막을 아래로 밀고 제자리에 붙이기 전에 음영 영역에 해당하는 창 표면에 접착제를 바르십시오. 피부는 마찬가지로 복막에 붙어 있습니다. 접착제의 테두리는 또한 창 위의 상피의 성장을 방지하기 위해 빨간색 선을 따라 증착됩니다. (I) 높은 배율에서, 간 (흰색 점선으로 윤곽선)이 창문을 통해 보입니다. 이미징 영역은 창에 포함된 격자(흰색 화살표 머리)로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 췌 장 위에 창문을 수술적으로 삽입. (A) 만화는 수술과 관련된 구조물의 해부학 적 위치를 보여줍니다. 검은 색 점선 상자는 그림에서 볼 수있는 수술 필드를 윤곽을 그립니다. (b) 마우스는 우측 횡방향 욕창 위치에 놓인다. 비장은 면도 된 피부 (파선)를 통해 볼 수 있습니다 (C) 흉곽 아래 3mm부터 절개가 이루어지며 피부의 약1cm2 부분이 제거됩니다. (D) 복막의 약간 작은 부분이 해부된다. (E) 췌장 (흰색 화살표 머리)은 창문 위치에 축축한 면봉으로 부드럽게 위치합니다. (f) 주사기를 사용하여 소량의 외과 용 접착제가 비장뿐만 아니라 췌장 (이미징 될 영역으로부터 멀리 떨어져 있음)에 적용됩니다. (G) 창문은 접착제가 건조 될 때까지 (2 분) 췌장에 단단히 고정되어 있습니다. 창문의 가장자리는 복막과 피부 아래에 접혀 있습니다. (H) 창을 복막에 고정시키기 위해, 복막을 아래로 밀고 제자리에 붙이기 전에 음영 영역에 해당하는 창 표면에 접착제를 바르십시오. 피부는 마찬가지로 복막에 붙어 있습니다. 접착제의 테두리는 또한 창 위의 상피의 성장을 방지하기 위해 빨간색 선을 따라 증착됩니다. (I) 높은 배율에서 췌장 (흰색 점선으로 윤곽선)이 창을 통해 보입니다. 이미징 영역은 창에 포함된 격자(흰색 화살표 머리)로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 사타구니 유선에 창문을 외과 적으로 삽입합니다. (A) 만화는 수술과 관련된 구조물의 해부학 적 위치를 보여줍니다. 검은 색 점선 상자는 그림에서 볼 수있는 수술 필드를 윤곽을 그립니다. 수술은 4 번째 또는 5번째 유선에서 수행 할 수 있습니다. (b) 마우스는 멸균 수술 필드의 수핀 위치에 배치된다. 5번째 오른쪽 젖꼭지 (화살표 머리)는 절개를 수행하는 랜드 마크로 사용됩니다. (C) 절개를하고, 유선이 위에 놓인 피부에서 분리되고, 피부의 약 1cm2 부분이 제거됩니다. (d) 주사기를 사용하여, 소량의 외과 용 접착제가 유선의 표면 상의 관심 영역 주위의 물방울에 도포된다. (E) 창문은 접착제가 건조 될 때까지 (2 분) 단단히 고정되고 고정됩니다. (F) 창문의 가장자리는 포셉을 사용하여 피부 아래에 접혀 있습니다. (G) 창을 피부에 고정시키기 위해, 피부를 아래로 밀고 제자리에 붙이기 전에 음영 영역에 해당하는 창 표면에 접착제를 바르십시오. 접착제의 테두리는 또한 창 위의 상피의 성장을 방지하기 위해 빨간색 선을 따라 증착됩니다. (h) 4번째 우측 유선에서 작은 종양 위에 이식된 창의 예가 제공된다. 파선으로 윤곽이 그려진 영역은 (I)에서 더 높은 배율로 표시됩니다. (I) 유선의 표면에 접착제 방울이 빨간색으로 윤곽선으로 윤곽을 그립니다. 이미지화할 영역은 검은색으로 윤곽선으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 실리콘 이미징 창은 유리한 광학 및 재료 특성을 가지고 있습니다. (A–C) 포인트 확산 기능을 측정하고 PDMS 윈도우의 이미징 특성을 유리 커버슬립의 이미징 특성과 비교하기 위해, 40nm 황록색 형광 마이크로스피어를 다양한 두께의 PDMS 윈도우 또는 유리 커버슬립(#1.5 두께)을 통해 이미징하였다.16. 이미지는 생체내 영상화의 조건과 일치하도록 침지 매질로서 초음파 겔을 사용하여 수집되었다. 플롯은 (A) X축, (B) Y축 및 (C) Z축 (SD± 평균; n = 3/group, 두 개 이상의 개별 창을 사용하여 획득; Dunnett의 다중 비교 테스트와 모든 PDMS 창을 유리와 비교하는 단방향 ANOVA; 유의한 차이 만 표시됨). (D) X축과 Y축에서 계산된 FWHM 값 사이의 비율(A–B)는 X 축과 Y 축을 따라 포인트 소스 이미지의 대칭의 척도로서 도시되고, 따라서 광학적 수차의 척도로서 도시된다. (E–G) 미소 구체는 200mg의 PDMS로 주조 된 세 개의 개별 창을 통해 이미징되었습니다 (에 대한 생체 내 이미징에 사용 된 창과 유사). 그림 9, 그림 10, 그림 11 그리고 영화 2, 영화 3, 영화 4) 또는 세 개의 유리 커버 슬립 (# 1.5 두께)을 사용하여 포인트 확산 기능을 측정합니다. 생체내 영상화 예와는 달리, 이러한 계산을 위한 이미지들은 침지 매질로서 물을 사용하여 수집되었다. 플롯은 (E) X축, (F) Y축과 (G) Z축 (SD± 평균; n = 3/3개의 개별 윈도우를 사용하는 그룹; 만-휘트니 검사, 유의한 차이는 발견되지 않았다). (H) 플롯은 X- 축과 Y축에서 계산된 FWHM 값 사이의 비율을 보여줍니다(E–F). (나는) 플롯은 마이크로스피어당 피크 형광 강도를 나타낸다(평균 ± SD; n=3/군; 만-휘트니 검사, 유의한 차이는 발견되지 않았다). 모든 이미지는 960nm의 파장 및 3%의 레이저 파워에서 수집되었다. 100 μm z-스택을 0.6 μm의 스텝 크기로 각 미소 구체에 대해 수집하였다. 이미지 프레임은 1022 픽셀 x 1022 픽셀의 해상도로 69 μm x 69 μm로 설정되었다. 분석은 피지-MetroloJ 플러그인으로 수행되었다. (J) 재료 특성을 테스트하기 위해 PDMS 창을 장력으로 유지하고 기계 테스트 중에 탄성 반응을 보장하기 위해 슈퍼 접착제를 사용하여 두 개의 링 모양의 와셔 사이에 고정했습니다. 동일한 절차가 유리의 강성으로 인한 장력이없는 마이크로 커버 유리 슬립에 사용되었습니다. 반구(직경 6 mm)로 구성된 로딩 팁과 실린더 압출(직경 4 mm, 길이 20 mm)을 폴리락트산 필라멘트를 사용하여 3D 프린팅하였다. 창문은 재료 고장이 발생할 때까지 1 N / s의 부하 제어 프로파일하에 서보 유압 재료 시험기에로드되었습니다. 힘 및 변위 값은 100Hz의 주파수에서 측정되었다. 이미지는 창 중앙에 로딩 팁이 적용되도록 설정된 창 테스트를 보여줍니다. (K) 플롯은 MATLAB의 Trapz 함수를 사용하여 응력 변형률 곡선 하의 합산 면적을 계산하여 결정된 재료의 인성을 보여줍니다 (평균 ± SEM; n = 3 / 그룹마다 3 개의 개별 PDMS 창을 사용하여 유리 커버슬립, Tukey의 다중 비교 테스트가있는 단방향 ANOVA). (L) 플롯은 응력-변형률 곡선의 선형 부분으로부터 결정된 영 모듈러스를 보여준다(평균 ± SEM; n = 3/3개의 분리된 PDMS 창과 유리 커버슬립을 사용하는 그룹; 웰치의 보정을 이용한 t-테스트). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 실리콘 창은 높은 내약성과 수명을 보여줍니다 . (A) 창 수술 후 11일 후에 그리드가 없는 복부 복부 이미징 창이 있는 7주령 C57BL/6J 마우스 남성의 대표적인 이미지입니다. (b) 창수술 14일 후 격자가 포함된 췌장 영상 창을 가진 7주령 남성 C57BL/6J 마우스의 대표 이미지. (c) 창수술 후 12주령 C57BL/6J c-fms-EGFP 마우스의 대표적인 이미지로, >7일 후에 격자가 포함된 유선영상창을 갖는 마우스. (d) 7주령의 수컷 c-fms-EGFP 마우스에서 간 영상화 창(맨 윗줄)을 촬영하고 수술 후 0일째(수술 직후) 및 35일째에 영상화(맨 아래 줄)하였다. 적절한 양의 피부를 제거하고 접착제로 상처를 밀봉하면 피부가 다시 상피화되고 창문을 위아래로 밀어 넣지 못하여 장기를 장기간 이미징 할 수 있습니다. 배율 막대 = 30μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 창 내의 격자를 사용하면 동일한 시야각을 추적할 수 있습니다. (A) 레이저 컷 스테인레스 스틸 창문의 맞춤 생산을위한 자세한 사양. (B) 이미징 창 내에 내장 된 그리드는 간 너머로 볼 수 있으며 창 주위의 접착제 테두리가 명확하게 보입니다. (C) 두 광자 현미경의 안구를 통한 창의 전망. 간에서 혈관 (빨간색)과 녹색 신호는 백그라운드에서 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 창 삽입에 대한 체계적 및 로컬 응답. (A–C) 간에서 윈도우 삽입 후 28일의 기간 동안 7주령의 C57BL/6J 암컷 마우스에 대해 체중을 모니터링하였다 (A), 췌장 (B) 또는 유선(C). 처리되지 않은 연령 매칭 마우스와 비교하여 체중 변화율이 도시되어 있다. (*)는 정상 체중을 회복하지 못했고 따라서 이미징 실험에서 검열되었을 마우스를 나타냅니다. 동일한 대조군 마우스가 각 유형의 창과 더 쉽게 비교할 수 있도록 세 패널 모두에 표시됩니다. (D) 백혈구 (WBC) 카운트는 수술 후 3, 14 및 28 일 (유선창) 또는 35 일 (간 또는 췌장 창)에 모니터링됩니다. 마우스의 WBC 카운트에 대한 정상 범위는 파선으로 표시됩니다. (E,G,나는) 헤마톡실린 및 에오신 염색을 처리하지 않은 대조군(왼쪽)과 7주령의 C57BL/6J 마우스의 삽입 14일 후 이미징 윈도우(오른쪽)를 통해 조직 절편(E) 간, (G) 췌장, 또는 (나는) 유선. (E,나는) 표면 및 초점 과립 병변은 간과 유선의 표면 (화살표)을 따라 분리 된 장소에서 볼 수 있으며, 이는 접착제에 대한 반응을 암시합니다. *로 표시된 정상 조직은 과립화 병변에 인접한 영역에서 볼 수 있다. 간 창구를 가진 3 마리의 대조군과 3 마리의 마우스를 각 시점 (수술 후 3, 14 및 35 일째)에 평가하였고, 간창이있는 6 마리의 마우스가 수술 후 35 일째에 평가되었다는 점을 제외하고는. 3마리의 마우스 중 두 마리는 제3일 및 제14일에 육아조직을 나타내었다. 3마리의 마우스 중 1마리는 35일째에 육아조직을 나타내었다. 3개의 대조군 및 유선창이 있는 3마리의 마우스를 각 시점(수술 후 3일, 14일, 및 28일)에서 평가하였다. 3마리의 마우스 중 3마리는 제3일과 제14일에 유선의 지방조직에서 육아조직 또는 염증반응을 보였다. 3마리의 마우스 중 제로제로는 28일째에 과립화 병변 또는 염증 반응을 나타내었다. (G) 췌장에는 심각한 병변이 보이지 않습니다. 3개의 대조군 및 췌장 창문을 갖는 3마리의 마우스를 각 시점에서(수술 후 3일, 14일, 및 35일째) 평가하였다. 췌장 창문을 가진 마우스는 어느 시점에서도 육아 조직이 없었습니다. 스케일 바 = 500 μm (F,H,J) 멀티플렉스 면역조직화학 염색을 통해 이미징 윈도우를 삽입한 후 14일째 처리되지 않은 대조군 및 7주령의 C57BL/6J 마우스로부터의 조직 절편에 대해 수행하였다(F) 간, (H) 췌장 또는 (J) 유선. CD45, CD68 및 골수퍼옥시다제 (MPO)에 대한 항체를 사용하여 백혈구, 단핵구/대식세포 및 호중구를 각각 표지하였다. CD45 및 CD68 염색은 동일한 절편에서 수행되었고, MPO 염색은 동일한 조직의 직렬 절편에서 수행되었다. 항-CD45 항체를 HRP 컨쥬게이션된 이차 항체로 검출하고 먼저 영상화한 다음, 염색체 및 이차 항체를 벗겨내고 슬라이드를 항-CD68을 인식하는 이차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 정량화는 컬러 임계치에 의해 피지 소프트웨어로 수행되었다; 파라미터는 항체 및 조직에 걸쳐 조정되었다. 플롯은 시야각(FOV)당 셀 카운트로 정량화를 표시합니다(SEM± 평균; n = 3/그룹; Tukey의 다중 비교 테스트를 사용한 단방향 ANOVA; 유의한 차이만 표시됨). (K) 남성 C57BL/6J c-fms-EGFP 8-11 주령의 생쥐는 간장의 오른쪽 엽에 실리콘 이미징 창을 삽입했습니다. 형광 표지된 렉틴(100 μL)을 각 이미징 세션 직전에 정맥내 주사하였다. 이미지는 단일 마우스에서, 수술 후 1일, 3일, 5일에 동일한 격자 유전자좌에서, 격자 아래의 대략 200 μm에서 이다. 스케일 바 = 30 μm. 여기 파장 960 nm, 레이저 파워 10%를 사용하여 이미징합니다. 혈관은 빨간색으로 나타납니다. 대식세포는 녹색(흰색 화살표)으로 나타납니다. 세 마리의 이미지화 된 마우스의 대표. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 종양은 창 삽입 후 몇 주에 걸쳐 여러 시점에서 시각화할 수 있습니다. 췌장 창 삽입시에 1.5 x 104 iGFP-1199 췌장암 세포를 정형외적으로 주사한 7주령의 C57BL/6J 마우스 한 마리의 남성으로부터의 대표적인 이미지는, 창 삽입 후 11일 및 14일째에 이미지화하였다. 스케일 바 = 30 μm. 여기 파장 960 nm, 레이저 파워 10%를 사용하여 이미징합니다. 대표적으로 6마리의 영상화된 마우스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10: 정상 유선침윤 동안 면역 세포 침윤의 동적 변화. 이미징 윈도우에 내장된 금속 그리드를 사용하여, 동일한 위치가 유선의 침범 동안과 같은 정상 조직 리모델링 동안 이미징될 수 있다. 면역 세포 침윤과 같은 동적 변화를 모니터링하는 실리콘 창의 기능을 더 평가하기 위해, 12 주령 여성 C57BL / 6J x BALB / c ACTB-ECFP; LysM-eGFP 마우스를 복선에 삽입된 이미징 윈도우와 함께 유선침범 후 2일째 및 4일에 영상화하였다. 호중구는 녹색 (흰색 화살표)으로 나타납니다. 호중구 엘라스타제 활성은 영상화 시작 4시간 전에 호중구 엘라스타제 형광 프로브를 주입하여 가시화하였고, 적색(또는 호중구와 공동국소화할 때 황색)으로 나타난다. 상피 세포는 파란색으로 나타납니다. 스냅샷은 Z축(깊이 100-150mm)을 따라 5개의 이미지를 최대 강도로 투영하는 것입니다. 이미지는 동영상 3A 및 3B에서 가져온 것이며, 아래쪽 행 이미지에서는 CFP 신호만 표시되고 이미지는 빨간색 점선으로 표시되어 두 개의 서로 다른 시점에서 조직 내의 동일한 위치를 시각화합니다. 스케일 바 = 30 μm. 960nm 및 1080nm 여기 파장, 각각 10% 및 15%의 레이저 파워를 사용하여 이미징합니다. 네 마리의 이미지화 된 마우스의 대표. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 11: 암 전이의 형성은 시간이 지남에 따라 추적될 수 있다. 수컷 C57BL/6J 10주령 마우스에 1 x 105 KPC-BL/6-1199 췌장암 세포를 주입하여 핵 국소 히스톤 H2B 컨쥬게이션된 시안 형광 단백질(H2B-CFP)을 발현하는 췌장암 세포를 창 삽입시에 문맥 정맥을 통해 주입하였다. 간 영상화는 주사 후 24 h (Day 1) 및 지시 된대로 세 가지 이후 시점 (최대 9 일)에 측면 창을 통해 수행되었습니다. 주사 후 1일과 3일에 보이는 단일 암세포는 흰색 화살표로 표시됩니다. 콜라겐 섬유로부터의 두 번째 고조파 신호는 또한 시안 채널(노란색 화살표)에서 시각화되었다. 이미지는 각 다른 시점에서 동일한 마우스에서 가져온 것입니다. 깊이가 300μm에서 350μm 사이로 촬영된 단일 z-평면 이미지. 스케일 바 = 30 μm. 880nm의 여기 파장을 사용하여 이미지화. 8%의 레이저 파워. 세 마리의 이미지화 된 마우스의 대표. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
영화 1 : 실리콘 상상력g 창문은 생쥐에서 잘 견뎌냅니다. 영화는 창 삽입 후 14 일 동안 9 주령의 남성 C57BL / 6J 마우스를 보여줍니다. 마우스는 통증과 관련된 어떠한 표준 행동도 나타내지 않는다(예를 들어, 빈약한 손질, 닫힌 눈, 또는 혼수). 여섯 마리의 기록된 마우스를 대표하고, 성공적인 창 이식 후 관찰된 100마리 이상의 마우스와 일치한다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
영화 2: 정형외적으로 이식된 췌장암 세포의 세포하 영상. iGFP-1199 세포를 7주령의 수컷 C57BL/6J 마우스의 췌장에 정형외로 주사하고, 암세포를 주입하고 창 삽입 후 11일째에 영상화하였다. 동영상은 Z축을 따라 여섯 개의 이미지를 최대 강도 프로젝션하고 2시간 이미징 기간에서 추출한 것입니다. 타임스탬프(h:min:s:ms). 여섯 마리의 이미지화 된 마우스의 대표. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
영화 3: ACTB-ECFP에서의 면역 세포 침윤의 변화; LysM-eGFP 마우스는 침범시. 여성 C57BL / 6J x BALB / c ACTB-ECFP; 골수성 세포에서 GFP를 발현하는 LysM-eGFP 마우스 (주로 과립구에서뿐만 아니라 대식세포에서도), 모든 세포에서 ECFP (상피 세포에서 가장 높음)는 8 주령에 사육되었다. 분만 후, 새끼들은 마우스 당 여섯 마리의 새끼로 정상화되었다. 분만 후 10 일째에 새끼를 젖을 떼고 복부 유선 이미징 창을 삽입했습니다. 골수성 세포는 녹색으로 나타난다; 영상화 시작 4시간 전에 주입된 호중구 엘라스타제 680 FAST 프로브를 사용하여 표지된 호중구 엘라스타제 활성은 적색으로 나타난다(호중구와 함께 국소화하면 노란색으로 나타남); 상피 세포는 파란색으로 나타납니다. 동영상은 Z축(깊이 100–150μm)을 따라 5개의 이미지를 최대 강도로 투영합니다. (A) 유선침의 2일째에 영상화. 스케일 바 = 20 μm. 960nm 및 1080nm 여기 파장, 각각 10% 및 15%의 레이저 파워를 사용하여 이미징합니다. (B) 유선침의 4일째에 영상화. 스케일 바 = 20 μm. 무비는 무비 3A와 동일한 마우스 및 조직 영역으로부터의 것이다. (C) 무비 3B로부터의 관심 영역의 더 높은 배율은, 두 개의 호중구가 유선의 상피 세포와 서로 상호작용하는 것을 보여준다. 일시적인 막 돌출부의 형성은 호중구 이동 동안 전단에서 관찰 될 수있다. 타임스탬프(h:min:s:ms). 네 마리의 이미지화 된 마우스의 대표. 영화 3A를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 영화 3B를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 영화 3C를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
영화 4: 침범시 c-fms-EGFP 마우스에서의 면역 세포 침윤의 변화. GFP 표지된 대식세포를 가진 암컷 C57BL/6J c-fms-EGFP 마우스는 8주령에 사육되었다. 분만 후, 깔짚을 마우스 당 여섯 마리의 새끼로 조정했습니다. 분만 후 10 일째에 새끼를 젖을 떼고 복부 유선 이미징 창을 삽입했습니다. 개입 1 일째 (창문을 삽입 한 지 하루 후)에 획득 한이 영화는 개입하는 동안 눈에 띄는 대식세포 침투를 강조합니다. 대식세포는 녹색으로 나타나고, 콜라겐 섬유(두 번째 고조파 생성)는 파란색으로 나타나고, 혈관은 빨간색으로 나타납니다(Lectin-DyLight 594). 스케일 바 = 20 μm. 이미지는 Z축(깊이 100–150um)을 따라 5개의 이미지의 최대 강도 투영입니다. 960nm 및 800nm 여기 파장, 각각 10% 및 15%의 레이저 파워를 사용하여 이미징합니다. 타임스탬프(h:min:s:ms). 세 마리의 이미지화 된 마우스의 대표. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
Intravital 이미징 창은 시간이 지남에 따라 펼쳐지는 세포 분해능에서 생리 학적 및 병리학 적 과정을 직접 시각화하는 데 중요한 도구입니다. 마우스에 유연한 실리콘 이미징 창을 주조 및 삽입하기 위해 설명 된 새로운 절차는 현재 사용되는 이미징 창 (삼출, 파손 및 정상적인 이동성과의 간섭)의 가장 일반적인 문제 중 일부를 극복하고 마우스에 대한 추가 안전성을 제공하며이 기술의 접근성을 향상시킵니다.
가장 널리 사용되는 이미징 창은 유리 커버 슬립을 고정하는 금속 프레임으로 구성됩니다. 이러한 프로토 타입 창문의 사용에 대한 주요 장애물은 금속 링을 고정하는 것이 힘든 스티칭 절차를 필요로하므로 고급 외과 적 훈련을 받아야한다는 것입니다. 또한 프레임을 제조하는 데 비용이 많이 들고 특수 장비가 필요합니다. PDMS 창은 이러한 두 가지 문제를 모두 극복합니다. PDMS 창을 삽입하는 절차는 바느질을 제거하여 기술 학습에 대한 장벽을 크게 낮춥니다. 창문을 생산하는 재료도 저렴하며 쉽게 구입할 수 있습니다. 또한, 창의 모양과 수술 절차 모두 유선, 간, 췌장, 비장 및 장을 포함한 다양한 장기를 이미징하도록 조정할 수 있습니다.
현재의 생명 내 이미징 창은 일반적으로 며칠 동안 종방향 이미징을 허용하는 반면, 몇 가지 일반적인 문제는 장기간 이러한 창의 사용을 제한합니다. 유리 창문의 무게와 크기는 생쥐의 자유로운 움직임을 방해 할 수 있으며 삼출물은 창문에 축적 될 수 있습니다. 마우스는 또한 유리 커버 슬립을 손상시켜 상처와 감염을 일으킬 수 있습니다. 대조적으로, 여기에 설명 된 절차는 동물에 대한 고통을 최소화하면서 조직에 대한 동일한 수준의 접근성을 유지합니다. PDMS는 약물 전달 장치, 안면 재건 수술 및 유방 임플란트와 같은 인간의 생물 의학 응용 분야에 널리 사용되는 안전하고 생체 안정하며 합성 폴리머입니다. 창문에 대한 동물의 내성을 높이는 것 외에도 유리와는 달리 생물학적으로 불활성 인 물질의 사용은 국소 염증이 혼란스러운 효과가되는 면역 체계와 관련된 연구에 특히 중요합니다. 또한, 주요 개선은 쥐가 물고 당겨서 금속 프레임 유리 이미징 창문이 빠지게 할 수 있기 때문에 바늘을 제거하는 것입니다. 이 문제는 스티치가 그루브9에 숨겨지도록 설계된 최신 세대의 창에 의해 부분적으로 해결되었습니다. 그러나이 후자의 전략은 지갑 끈 봉합이 필요하며, 이는 복잡하고 오류가 발생하기 쉬운 절차로 종종 바늘을 너무 단단히 잡아 당겨 조직의 괴사와 통증을 유발합니다. 따라서 창을 제자리에 접착하는 능력은 실리콘 창 접근법의 주요 이점을 구성합니다. 또한, 창문은 무시할 수있는 무게의 유연하고 내구성있는 재료로 만들어져 유리 커버 슬립(17)을 잡기 위해 금속 대신 실리콘을 사용한 창문의 비교에서 이전에 평가 된 바와 같이 동물의 움직임에 미치는 영향을 줄입니다. 유리 커버 슬립을 완전히 제거함으로써 실리콘 창은 금속 프레임과 유리의 문제를 제거합니다. 또한, 창문의 유연성은 쉽게 삽입 될 수있게하고 단단한 표면을 장기에 접착함으로써 발생하는 응력을 감소시켜 관찰되는 조직에 대한 영구적 인 손상의 위험을 줄입니다. 또한, 창문을 삽입하고 제자리에 고정하는 것이 훨씬 쉽기 때문에 전반적인 절차에는 시간이 덜 걸리고 장기간의 마취로 인한 부작용이 제한됩니다. 간 위에 삽입하는 경우, 금속 프레임 창문의 경우 45 분에서 실리콘 창문의 경우 15 분까지 시술 시간의 차이가 특히 큽니다. 사실, 간 위에 금속 프레임을 삽입하려면 xiphoid 과정 (흉골 끝의 연골)의 해부가 필요하지만 잠재적으로 고통스럽고 지속적인 염증을 유발하지만,이 해부는 실리콘 창을 삽입하는 데 필요하지 않습니다. 마지막으로,이 작업에 제시된 이미징 창은 가능한 응용 프로그램과 관련하여 추가적인 이점을 제공합니다. 예를 들어, 유리 창문과 달리 실리콘 창문은 조직에 쉽게 접근 할 수 있으므로 암세포, 형광 염료 또는 약물을 창을 통해 직접 주입 할 수 있습니다.
유선(mammary gland)을 포함한 다양한 해부학적 위치에서의 삽입에 적합한 또 다른 PDMS 기반 실리콘 이미징 윈도우가 최근에 기술되었다(18). 이 창은 스티치나 접착제 없이도 창을 신속하게 이식 할 수있는 모양과 특수 모서리를 생성하도록 성형됩니다. 대조적으로, 여기에 제시된 실리콘 윈도우는 특별한 몰드를 필요로 하지 않으며, 중요하게는, 해부학적 위치 및 개별 마우스에 적응하기 위해 수술 절차 동안 형상으로 절단될 수 있다. 본원에 기술된 프로토콜이 접착제의 사용을 필요로 하지만, 이러한 추가적인 요건은 간과 비장을 포함하는 복부 장기의 이미징을 허용한다. 더욱이, 여기에 설명된 실리콘 윈도우는 기준 랜드마크를 제공하는 윈도우 내에 스테인리스-스틸 그리드의 임베딩을 허용한다. 이러한 랜드마크는 시간이 지남에 따라 동일한 정확한 위치를 추적할 수 있게 해주고, 전이성 병변의 발생과 같이 며칠에서 몇 주가 걸리는 과정을 연구하기 위해 여러 세션(종방향 이미징)에 걸쳐 동일한 부위의 반복적인 이미징을 용이하게 합니다.
요약하면, 유선이나 복부 장기의 종방향 IVM에 사용하기 위해 실리콘 이미징 창이 개발되었습니다. 창은 광학적으로 명확하고 내구성이 뛰어나며 저렴합니다. 창 삽입 절차의 단순성은 창 기반 생체 내 이미징 접근 방식을 구현하는 데 필요한 기술 기술을 감소시킵니다. 다양한 조직 부위에 대한 창의 적응성은 방대한 생물학적 연구에서 IVM의 구현을 허용합니다.
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Disclosures
M.E.는 Insmed, Inc.의 brensocatib 연구 자문위원회 위원입니다. Vividion Therapeutics, Inc.의 과학 자문위원회 위원; Protalix, Inc.의 컨설턴트; Agios Pharmaceuticals, Inc. D.A.T.는 Mestag Therapeutics의 공동 설립자이며 과학 자문위원회에 소속되어 있으며 Mestag Therapeutics, Leap Therapeutics, Surface Oncology 및 Cygnal Therapeutics의 지분을 보유하고 있습니다. 다른 저자들은 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
레이저 컷 스테인레스 스틸 그리드를 설계하고 최적화하는 데 도움을 주신 Rob Eifert에게 감사드립니다. 이 연구는 CSHL 암 센터 (P30-CA045508)와 국립 보건원 (NIH)의 M.E. 기금 (1R01CA2374135 및 5P01CA013106-49)에 의해 지원되었습니다. CSHL 및 노스웰 헬스; 톰슨 가족 재단; 미국 전역에서 수영; Simons Foundation에서 CSHL에 대한 보조금. M.S.는 국립 일반 의료 과학 연구소 의료 과학자 교육 프로그램 교육 상 (T32-GM008444)과 NIH의 국립 암 연구소 (National Cancer Institute)의 수상 번호 1F30CA253993-01의 지원을 받았습니다. L.M.은 James S. McDonnell Foundation Postdoctoral Fellowship의 지원을 받습니다. J.M.A.는 암 연구소 / 어빙턴 박사 후 펠로우십 (CRI 상 # 3435)을 수상했습니다. D.A.T.는 Lustgarten Foundation Dedicated Laboratory for Pancreatic Cancer Research 및 Thompson Family Foundation의 지원을 받습니다. 만화는 Biorender.com 로 만들어졌습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape | 3M | 70200770819 | |
| Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2 | Ethicon | N267H | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 22974 | |
| AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole) | Vector Laboratories | SK-4200 | |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Anesthesia system | Molecular Imaging Products Co. | ||
| Acqknowledge software and sensors | BIOPAC | ACK100W, ACK100M, TSD110 | |
| Betadine spray | LORIS | 109-08 | |
| c-fms-EGFP (MacGreen) mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) | Invitrogen | 14-0451-82 | |
| CD68 Antibody | Abcam | ab125212 | |
| Curity gauze sponges | Covidien | ||
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6885 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab97064 | |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab102182 | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Two-part, 10:1 mixing ratio |
| Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness | Electron Microscopy Sciences | 72296-08 | |
| Ender-3 Pro 3D printer | Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD | ||
| Far Infrared Heated blanket | Kent Scientific | RT-0520 | |
| Fc Receptor Blocker | Innovex Biosciences | NB309 | |
| Fiji imaging processing package | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515) | Invitrogen | F8795 | |
| Gating system: | BIOPAC Systems Inc. | The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems. | |
| Acqknowledge software | ACK100W, ACK100M | ||
| Diff. Amp. Module, C Series | DA100C | ||
| Dual Gating Sys small animal | DTU200 | ||
| MP160 for Windows - Analysis system | MP160WSW | ||
| MouseOx Plus 120V | MOX-120V;015000 | ||
| Pressure Pad | TSD110 | ||
| Gelfoam | Pfizer | 9031508 | Absorbable gelatin sponge |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Two pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length |
| Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody | R&D Systems | AF3667 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 s |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc | BD | 324912 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | 502017 | |
| Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594 | Vector Laboratories | DL-1177-1 | |
| LysM-eGFP mice | www.mmrrc.org | 012039-MU | |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 | Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5153 | 1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length |
| MTS MiniBionix II 808 | MTS Systems | Servohydraulic material testing machine | |
| Neutrophil Elastase 680 FAST probe | PerkinElmer | NEV11169 | |
| Nitrogen | General Welding Supply Corp. | ||
| Oxygen | General Welding Supply Corp. | ||
| Polylactic acid filament | Hatchbox | 1.75 mm diameter | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36970 | |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra | NDC17033-211-38 | |
| Reflex 7 wound clips | Roboz Surgical | RS-9255 | |
| Stainless steel grid | Fotofab | One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square. | |
| Surface Treated SterileTissue Culture Plates | Fisher Scientific | FB012929 | Lid used as curing surface for imaging windows |
| TriM Scope Multiphoton Microscope | LaVision BioTec | Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: T560LP T665LPXXR T495lxpr |
|
| Vetbond | 3M | 70200742529 | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48404-453 |
References
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