Summary
Her presenterer vi en protokoll for kirurgisk implantasjon av et permanent svulmende optisk vindu for murine thorax, som muliggjør høyoppløselig, intravital avbildning av lungen. Vinduets utholdenhet gjør det godt egnet til studiet av dynamiske cellulære prosesser i lungen, spesielt de som sakte utvikler seg, for eksempel metastatisk progresjon av spredte tumorceller.
Abstract
Metastase, som står for ~ 90% av kreftrelatert dødelighet, innebærer systemisk spredning av kreftceller fra primære svulster til sekundære steder som bein, hjerne og lunge. Selv om det er grundig studert, forblir de mekanistiske detaljene i denne prosessen dårlig forstått. Mens vanlige avbildningsmodaliteter, inkludert beregnet tomografi (CT), positronutslippstomografi (PET) og magnetisk resonansavbildning (MR), tilbyr varierende grad av brutto visualisering, mangler hver den tidsmessige og romlige oppløsningen som er nødvendig for å oppdage dynamikken i individuelle tumorceller. For å løse dette har mange teknikker blitt beskrevet for intravital avbildning av vanlige metastatiske nettsteder. Av disse stedene har lungen vist seg spesielt utfordrende å få tilgang til for intravital avbildning på grunn av sin delikatesse og kritiske rolle i å opprettholde livet. Selv om flere tilnærminger tidligere er beskrevet for encellet intravital avbildning av den intakte lungen, innebærer alle svært invasive og terminale prosedyrer, noe som begrenser maksimal mulig bildebehandlingsvarighet til 6-12 timer. Beskrevet her er en forbedret teknikk for permanent implantasjon av et minimalt invasivt thorax optisk vindu for høyoppløselig bildebehandling av lungen (WHRIL). Kombinert med en tilpasset tilnærming til mikrokartografi, forenkler det innovative optiske vinduet seriell intravital avbildning av den intakte lungen ved encellet oppløsning på tvers av flere bildebehandlingsøkter og spenner over flere uker. Gitt den enestående varigheten av tiden som bildedata kan samles inn over, kan WHRIL lette den akselererte oppdagelsen av de dynamiske mekanismene som ligger til grunn for metastatisk progresjon og mange ekstra biologiske prosesser i lungen.
Introduction
Metastas er ansvarlig for ~ 90% av dødsfallene, og er hovedårsaken til kreftrelatertdødelighet 1. Blant de viktigste stedene for klinisk observert metastase (bein, lever, lunge, hjerne)2, lungen har vist seg spesielt utfordrende for in vivo avbildning via intravital mikroskopi. Dette er fordi lungen er et delikat organ i evig bevegelse. Lungenes kontinuerlige bevegelse, ytterligere forsterket av intrathoracic hjertebevegelse, representerer en betydelig barriere for nøyaktig avbildning. Derfor, på grunn av sin relative utilgjengelighet for modaliteter for høyoppløselig intravital optisk avbildning, har kreftvekst i lungen ofte blitt ansett som en okkult prosess3.
I den kliniske settingen muliggjør bildeteknologier som beregnet tomografi (CT), positronutslippstomografi (PET) og magnetisk resonansavbildning (MR) visualisering dypt inne i intakte vitale organer som lungen4. Men mens disse modalitetene gir gode synspunkter på bruttoorganet (ofte til og med avslører patologi før utbruddet av kliniske symptomer), er de av utilstrekkelig oppløsning for å oppdage individuelle spredte tumorceller når de går videre gjennom de tidlige stadiene av metastase. Følgelig, når de nevnte modalitetene gir noen indikasjon på metastase til lungen, er metastatiske foci allerede godt etablert og sprer seg. Siden tumormikromiljøet spiller en sentral rolle i kreftprogresjon og metastasedannelse5,6, er det stor interesse for å undersøke de tidligste trinnene i metastatisk såing in vivo. Denne interessen er ytterligere drevet av den økte forståelsen av at kreftceller sprer seg selv før den primære svulsten oppdages7,8 og det økende beviset på at de overlever som enkeltceller og i sovende tilstand i år til tiår før de vokser ut i makrometastase9.
Tidligere har avbildning av lungen ved encellet oppløsning nødvendigvis involvert ex vivo eller explantpreparater10,11,12,13, noe som begrenser analyser til enkelttidspunkter. Selv om disse preparatene gir nyttig informasjon, gir de ingen innsikt i dynamikken i tumorceller i organet knyttet til et intakt sirkulasjonssystem.
Nylige teknologiske fremskritt innen avbildning har gjort det mulig med intravital visualisering av den intakte lungen ved encellet oppløsning over perioder på opptil 12 timer14,15,16. Dette ble oppnådd i en murinmodell ved hjelp av en protokoll som involverte mekanisk ventilasjon, reseksjon av ribbeina og vakuumassistert lunge-immobilisering. Til tross for å tilby de første enkeltcelleoppløsningsbildene av den fysiologisk intakte lungen, er teknikken imidlertid svært invasiv og terminal, og utelukker dermed ytterligere bildebehandlingsøkter utover indeksprosedyren. Denne begrensningen forhindrer derfor anvendelsen av studiet av metastatiske trinn som tar lengre tid enn 12 timer, for eksempel dormancy og re-initiering av vekst14,15,16. Videre må mønstre av cellulær oppførsel observert ved hjelp av denne bildemetoden tolkes forsiktig, gitt at vakuuminduserte trykkforskjeller sannsynligvis vil forårsake avledninger i blodstrømmen.
For å overvinne disse begrensningene ble et minimalt invasivt vindu for høyoppløselig bildebehandling av lungen (WHRIL) nylig utviklet, noe som letter seriell bildebehandling over en lengre periode på dager til uker, uten behov for mekanisk ventilasjon17. Teknikken innebærer opprettelsen av en "gjennomsiktig ribcage" med et forseglet thoraxhule for bevaring av normal lungefunksjon. Prosedyren tolereres godt, slik at musen kan gjenopprette uten meningsfull endring i baseline aktivitet og funksjon. For pålitelig lokalisering av nøyaktig samme lungeregion ved hver respektive bildeøkt, ble en teknikk kjent som mikrokartografi brukt på dette vinduet18. Gjennom dette vinduet var det mulig å fange bilder av celler når de kommer til lungens vaskulære seng, krysse endotelet, gjennomgå celledeling og vokse til mikrometastaser.
Her presenterer studien en detaljert beskrivelse av en forbedret kirurgisk protokoll for implantasjon av WHRIL, noe som forenkler operasjonen samtidig som den øker reproduserbarheten og kvaliteten. Mens denne protokollen ble utformet for å muliggjøre undersøkelse av de dynamiske prosessene som ligger til grunn for metastase, kan teknikken alternativt brukes på undersøkelser av mange prosesser i lungebiologi og patologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer beskrevet i denne protokollen er utført i samsvar med retningslinjer og forskrifter for bruk av virveldyrdyr, inkludert forhåndsgodkjenning fra Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Passivisering av vinduer
- Skyll de optiske vindusrammene (Tilleggs figur 2) med en 1 % (w/v) oppløsning av enzymatisk aktivt vaskemiddel.
- Inne i en glassburk, senk de optiske vindusrammene i 5% (w / v) natriumhydroksidoppløsning i 30 min ved 70 °C.
- Fjern og vask vindusrammene med deionisert vann.
- Inne i en ny glassburk, senk de optiske vindusrammene i 7% (w / v) sitronsyreoppløsning i 10 min ved 55 °C.
- Igjen, fjern og vask vindusrammene med deionisert vann.
- Gjenta trinn 1.2; Fjern deretter vindusrammer med deionisert vann.
2. Forberedelse for kirurgi
- Utfør operasjonen i en hette eller laminært strømningsskap. For å unngå forurensning av det operative feltet, sørg for forskjellige, separerte områder for henholdsvis forberedelse, kirurgi og gjenoppretting.
- I forkant av operasjonen steriliserer du alle kirurgiske instrumenter i en autoklav. Hvis etterfølgende prosedyrer er planlagt, steriliser instrumentene på nytt ved hjelp av en varm perlesterilisator. For denne kirurgiske prosedyren brukes en kun tips-teknikk.
- Strøm på den oppvarmede kirurgiske perlen og perlesterilisatoren.
- Bedøv musen med 5% isofluran i anestesikammeret.
- For å fjerne hår, sjenerøst bruke depilatorisk krem på øvre venstre bryst snittsted. Etter ikke mer enn 20 s, tørk bort hår og depilatorisk krem ved hjelp av fuktet vevspapir. Gjenta etter behov for å fjerne alt hår fra operasjonsstedet.
- Bruk 2-0 silke sutur, bind en knute ved foten av et 22 G kateter, og la 2-tommers lange haler (se figur 1A).
3. Lunge vindu kirurgi
- Vask hendene med antiseptisk såpe.
- Før hver ny operasjon, ikke nye sterile hansker.
- For å forhindre hornhinnen tørking og skade på musens øyne, bruk oftalmisk salve på begge øynene.
- Fortynn 10 μL (0,1 mg/kg) buprenorfin i 90 μL steril PBS, og injiser deretter subkutant for å sikre preoperativ analgesi.
- Intuber musen med silke sutur-bundet 22 G kateter15. Bruk en inflasjonspære, bekreft vellykket intubasjon ved å merke bilateral bryststigning ved pærepress.
- Fest intubasjonskateteret ved å binde 2-0 silke suturen rundt musens snute (se figur 1B).
- Plasser musen på det oppvarmede kirurgiske stativet og plasser den i høyre lateral decubitus for å eksponere venstre thorax.
- Koble ventilatoren til intubasjonskateteret.
- Sørg for kontrollert, stabil ventilasjon på ventilatoren og senk deretter isofluoren til 3%. Ved prosedyrens begynnelse og periodisk gjennom hele prosedyrens varighet, vurder anestesiens tilstrekkelighet ved å utføre en tåklemmetest.
- Bruk papirbånd, kranialt og kaudalt sikre henholdsvis fremer- og bakre lemmer til det oppvarmede kirurgiske stadiet. Plasser et annet stykke tape langs lengden på musens rygg for å maksimere eksponeringen for det kirurgiske feltet (se figur 1C).
- Åpne alle kirurgiske instrumenter under panseret for bevaring av sterilitet.
- Steriliser operasjonsstedet ved en sjenerøs påføring av antiseptisk middel til musens hud.
- Bruk tang, løft huden og lag et sirkulært snitt på ~10 mm, ~7 mm til venstre for brystbenet og ~7 mm som er bedre enn subkostalmargen (figur 1D).
- Identifiser nøye eventuelle større fartøy. Hvis oppdeling av fartøy er nødvendig, cauterize i begge ender med elektrokautery pennen for å opprettholde hemostase.
- Slukk bløtvevet som overbelaster ribbeina.
- Løft den sjetteeller sjunde ribben med tang. Ved hjelp av et enkelt blad av den stumpe mikro-dissekeringssaksen, den avrundede siden mot lungen, pierce forsiktig intercostalmuskelen mellom 6og 7th ribber for å komme inn i det intrathoracic rommet (Figur 1E).
- Delikat utslipp trykkluftbeholder ved feilen for å kollapse lungen og skille den fra brystveggen. Avfyr trykkluften i korte eksplosjoner for å forhindre iatrogene lungeskader.
- Plasser biopsistansen over skjæreverktøyet (Tilleggsfigur 1) og manøvrer skjæreverktøyets base forsiktig gjennom interkostal snittet (Figur 1F).
- Orienter bunnen av skjæreverktøyet slik at det er parallelt med brystveggen. Stans et 5 mm sirkulært hull gjennom ribbeinburet (figur 1G).
MERK: Sørg for at det eksponerte lungevevet er rosa, uten tegn på skade. - Bruk 5-0 silke sutur, lage en veske-streng sting ~ 1 mm fra hullet, omkrets, sammenfletting med ribbenene (Figur 1H).
- Plasser vindusrammen slik at kantene på den sirkulære feilen justeres innenfor vinduets spor (se figur 1I).
- Lås det implanterte vinduet godt ved å binde ned silkesugingen på 5-0.
- Legg 100 μL cyanoacrylatgellim i 1 ml sprøyten.
- Tørk lungen ved å påføre en jevn, skånsom strøm av trykkluft i ca. 10-20 s (figur 1J).
- Bruk tang til å gripe vindusrammen ved ytterkanten, løft forsiktig for å sikre separasjon av lungen fra undergrunnen av vindusrammen.
- Dispenser et tynt lag cyanoacrylatlim langs undergrunnen til den optiske vindusrammen (Figur 1K).
- Øk det positive sluttutløpstrykket (PEEP) på ventilatoren for å blåse opp lungen.
- Hold i 10-20 s, bruk forsiktig, men fast trykk for å feste den optiske vindusrammen på lungevevet (Figur 1L).
- Dispenser en 5 mm dråpe av det gjenværende cyanoacrylatgellimet på en rektangulær dekslelip.
- Plukk opp 5 mm dekslene ved hjelp av vakuum pickups. Dypp undergrunnen på dekslene i limet, og skrap deretter av overflødig lim tre ganger mot siden av den rektangulære dekslen, slik at bare et veldig tynt lag forblir (Figur 1M).
- Plasser dekslene forsiktig for å passe inne i utsparingen i midten av den optiske vindusrammen og holdes over lungevevet i en vinkel. Klem kort ventilatoren for å generere positivt trykk, hyperinflating av lungen. Bruk en roterende bevegelse, orienter dekslene parallelt med lungevevet for å skape direkte appposisjon mellom lungens overflate og undergrunnen av dekslene. Oppretthold skånsomt trykk, slik at cyanoacrylatlimet kan stille inn (~25 s).
- Bruk tangene til å skille dekslene fra vakuumopptakene (Figur 1N).
- Ved hjelp av 5-0 silke sutur, igjen lage en veske-streng sting, denne gangen <1 mm omkrets fra cut-edge av huden snitt. Legg overflødig hud under ytterkanten av vindusrammen før du binder den tett sammen med låseknut.
- For å sikre en lufttett forsegling mellom dekslene og vindusrammen, dispenserer du en liten mengde flytende cyanokokrylat ved metallglassgrensesnittet (se figur 1O).
- Fest en steril kanyle til en 1 ml insulinsprøyte. Sett nålen under xiphoid-prosessen, som beveger seg mot venstre skulder, inn i thoracic hulrommet gjennom membranen. Trekk forsiktig tilbake sprøyten for å fjerne eventuell gjenværende luft fra brysthulen (se figur 1P).
- Fjern båndet fra musen.
- Slå av isofluran.
- Fortsett ventilasjonen med 100 % oksygen til musen ser ut til å være klar til å vekkes.
- Klipp forsiktig 2-0 silke suturen rundt musens snute og extubate musen.
- Overfør musen til et rent bur og overvåk til den er fullstendig gjenopprettet. Euthanize musen hvis tegn på pustevansker er til stede.
- Gi postoperativ analgesi ved subkutant injeksjon 10 μL (0,1 mg/kg) buprenorfin fortynnet i 90 μL steril fosfatbufret oppløsning (PBS).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Trinnene i den kirurgiske prosedyren som er beskrevet i denne protokollen, er oppsummert og illustrert i figur 1. Kort, før operasjonen, blir mus bedøvet og håret over venstre thorax fjernes. Mus er intubert og mekanisk ventilert for å muliggjøre overlevelse ved brudd på thoraxhulen. Bløtvev som overbelaster ribbenene utskilles, og en liten sirkulær defekt opprettes, som spenner over 6og 7th ribber. Den optiske vindusrammen settes inn i defekten og bunnsiden (utenfor den klare blenderåpningen) festes til lungevevet. Vindusrammen festes deretter med en kombinasjon av suturer og lim, forsegle thoraxhulen og tillate gjenopptakelse av normal pust etter ekstubasjon. Når den er implantert, vil lungen holde seg til det optiske vinduet (som er innlemmet som en del av brystveggen), med intrathoracic trykkgradienter bevart. Dette tillater komfortabel overlevelse av musen, noe som muliggjør daglig bildebehandling opp til protokollkvoten (2 uker). Intravital avbildning kan deretter utføres gjennom vinduet, som tidligere beskrevet for andre vinduer15,19,20.
For visualisering av ulike celletyper, biologiske strukturer eller cellulære funksjonelle tilstander, kan prosedyren som presenteres her utføres på et bredt spekter av mus som enten har blitt genetisk manipulert for å uttrykke fluorescerende proteiner21 eller injiseres med fargestoffer22. Vinduets permanente natur gjør det kompatibelt med teknikker for ny tildeling av synsfelt, for eksempel photoconversion23,24 eller mikrokartografi17,18. Mikrokartografi er en trianguleringsteknikk basert på bruk av beregnede transformasjoner av koordinater av faste fiduciale merker mellom bildebehandlingsøkter for å forutsi og omlokere en interesseregion. I vinduet som er opprettet som beskrevet ovenfor, er disse fiducial merkene lette riper etset inn i vindusrammen (Tilleggsfigur 2) som lett kan identifiseres under mikroskopet. Dette gjør det mulig å finne det samme synsfeltet flere ganger, selv i ellers umerket vev. Figur 2 viser resultatet av disse teknikkene i en mus der lungevaskulaturen har blitt merket ved injeksjon av en farget merket høymolekylær dextran (tetrametylrhodamin 155 kD dextran) og den samme mikrovaskulaturen relokalisert over 3 dager.
Denne dextran ble funnet å være ekstremt nyttig i evaluering av forbigående vaskulære åpninger som er indusert i perioder med tumorcelle intravasasjon25,26,27. Faktisk har det vist seg at i primære brystsvulster er denne høye molekylvekten dextran ellers effektivt beslaglagt til vaskulaturen og lekker ikke inn i interstitium25. Dette er i motsetning til dextrans av lavere molekylvekt (som 10 kD eller 70 kD), som har vist seg å lekke fra neoangiogene kar passivt28,29. I mellomtiden har den sunne lungevaskulaturen blitt observert å være mer motstandsdyktig mot lekkasje, med dextrans >10 kD som bare rømmer til interstitiumet ved fornærmelse mot orgelet, for eksempel ved eksponering for eksosomer30 eller virus31. Det finnes også en rekke kontrastmidler for å måle andre parametere i lungen (f.eks. kjernefysiske markører, levende/døde indikatorer, oksidative stressreportere, blodstrømshastighetssporere) i tillegg til vaskulær permeabilitet. En utmerket ressurs katalogisering dem finnes i protokollen av Ueki et al.22.
WHRIL er en teknikk som er veldig godt egnet til å undersøke dynamikken i blodstrømmen i lungen. Dette kan gjøres på flere måter. For det første, når det er avbildet ved hjelp av relativt langsomme bildefrekvenser (~ 1-10 bilder per sekund, fps) blodstrømshastigheter kan bestemmes av skyggene som umerkede erytrocytter gjør når de strømmer i større kar. Ved lave fps danner disse skyggene linjer hvis vinkel i forhold til fartøyet kan brukes til å beregne erytrocyttstrømningshastigheter32 (Figur 2, gule linjer). For det andre kan skygger også spores på mikroskoper med lave fps ved å justere karene med mikroskopets hurtigskanningsakse og anskaffe kymografer ved hjelp av hurtiglinjeskanning33,34,35. Til slutt, når du ser på høye bildefrekvenser (>10 fps) på et mikroskop som er i stand til å integrere signalet over tid (f.eks. en spinnende diskkonfokal utstyrt med en ladekoblet enhet (CCD) detektor), kan individuelle partikler spores direkte16,17. I dette tilfellet vises stasjonære objekter som lyse prikker, og flytende gjenstander sporer ut spor gjennom med sirkulasjonen. Cellehastigheter kan kvantifiseres ved å måle lengden på sporene og dele på rammeanskaffelsestiden. Et eksempel på dette er gitt i figur 3 og supplemental Movie 1, hvor 2 μm fluorescerende mikrosfærer har blitt intravaskulært injisert i musen før avbildning.
Med muligheten til gjentatte ganger og konsekvent å gå tilbake til samme synsfelt, er visualisering av prosesser som utvikler seg over flere dager nå mulig. Som en demonstrasjon av denne applikasjonen ble WHRIL brukt til å visualisere den metastatiske progresjonen av brystkreftceller i lungene17,21: det vil spore over tid skjebnen til individuelle tumorceller som kommer til lungevaskulaturen. Dette konseptet er avbildet i figur 4A, hvor en enkelt spredt tumorcelle visualiseres kort tid etter overnatting i et segment av lungemikrovaskulatur. Å gå tilbake til samme sted på etterfølgende dager avslører tumorcellens skjebne (f.eks. resirkulering, ekstravasasjon, etc.). Anvendt på undersøkelsen av de kulminerende trinnene for metastatisk progresjon i lungen, var det mulig å visuelt krønike dynamiske prosesser, inkludert tumorcelleankomst (Figur 4B), ekstravasasjon (Figur 4C), og spredning for å danne makrometastase (Figur 4D).
Figur 1: Oppsummering av kirurgi for implantasjon av vinduet for høyoppløselig bildebehandling av lungen (WHRIL). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Mikrokartografi gjør det mulig å omfordele faste posisjoner i det optiske vinduet. Multifoton intravital avbildning av en enkelt region av lungen under den optisk gjennomsiktige dekslen viser mikrovaskulatur flyttet over 3 påfølgende dager ved hjelp av mikrokartografi. Gule piler indikerer et klart definerbart grenpunkt fra et enkelt fartøy identifisert hver påfølgende dag. Gule linjer uthever skygger som umerkede erytrocytter gjør når de strømmer i større fartøy. Vinkelen på disse linjene i forhold til fartøyet kan brukes til å beregne erytrocyttstrømningshastigheter. Rød = tdTomato merket endotelceller og 155 kDa Tetramethylrhodamine dextran merket blodserum, Grønn = GFP merket tumorceller, Blå = andre harmoniske generasjon. Skalastang = 15 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Visualisering av blodmengde. Blodstrømningshastigheter kan visualiseres ved å injisere 2 μm diameter fluorescerende mikrosfærer retro-orbitalt og forestille seg passasjen gjennom blodkarene. Når det er avbildet på et mikroskop som er i stand til å integrere signalet over tid (f.eks. en spinnende disk konfokal utstyrt med en CCD-detektor), vises stasjonære mikrosfærer som lyse prikker (piler), og flytende sfærer sporer ut spor gjennom med sirkulasjonen (alternative linjer). Skalalinje = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. WHRIL kan fange hvert trinn av den metastatiske kaskaden i lungen ved å direkte visualisere skjebnen til spredte tumorceller. (A) Sporing av skjebnen til spredte tumorceller (grønn) er oppnåelig med seriell avbildning, over flere dager, gjennom WHRIL. På dag 1 observeres en tumorcelle å ha kommet til og lagt seg i lungevaskulaturen. På dag 2 og dag 3 er cellen ikke lenger til stede i lungevaskulaturen, etter enten å ha resirkulert eller dødd. Skala bar = 15 μm. (B-D) Visualisering av hvert av stadiene av tumorcellemetastase i lungen. (B) En intravaskulær spredt tumorcelle (grønn) som sitter fast i lungevaskulaturen etter ankomst. (C) Spredd tumorcelle (grønn) etter ekstravasating i lungeparenchyma. (D) Tumorceller som har spredt seg og vokst til mikrometastaser. Rød = tdTomato merket endotelceller og 155 kDa Tetramethylrhodamine dextran merket blodserum, Grønn = GFP merket tumorceller, Blå = andre harmoniske generasjon. Skalalinje = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Ekstra film 1: Video som tilsvarer figur 3 som viser lungevaskulaturen med sirkulerende 2 μm mikrosfærer. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Supplerende figur 1: Mekaniske designtegninger for stainless-steel skjæreverktøy som brukes til å lede 5 mm biopsi punch. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 2: Mekaniske designtegninger for vindusrammen i rustfritt stål. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 3: Mekaniske designtegninger for vindusholderverktøyet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På steder med fjern metastasering som lungen gir høyoppløselig optisk bildebehandling innsikt i den forseggjorte dynamikken i tumorcellemetastase. Ved å muliggjøre in vivo-visualisering av enkeltkreftceller og deres interaksjoner med vertsvevet, har høyoppløselig intravital avbildning vist seg å være medvirkende til å forstå mekanismene som ligger til grunn for metastase.
Beskrevet her er en forbedret kirurgisk protokoll for permanent thoraximplantasjon av et optisk vindu designet for å muliggjøre seriell avbildning av murin lungen via høyoppløselig multifotonmikroskopi. Vinduet som er opprettet ved hjelp av denne protokollen er godt tolerert, og gitt sin evne til å reseal thoracic hulrommet, er i stand til å opprettholde de intrathoracic trykk gradienter som er nødvendige for spontan ventilasjon (i motsetning til noe annet tidligere beskrevet vindu for avbildning av murin lunge14,15,16,36,37 ). Dette tillater musen å våkne fra anestesi, puste uavhengig og komfortabelt overleve med gjennomsiktig ribcage i en lengre periode som strekker seg over flere uker.
Ved hjelp av dette vinduet var det mulig å visualisere, med encellet oppløsning, alle trinnene i metastase, inkludert ankomst, ekstravasasjon og vekst i mikrometastaser.
Selv om protokollen krever noen tekniske ferdigheter, med praksis og nøye oppmerksomhet til flere viktige trinn, kan prosedyren utføres med høy suksessrate. For det første, når du fjerner hår før operasjonen, er det viktig å beskytte musens hud ved å fjerne depilatorisk krem med et fuktet vev etter ikke mer enn 20 s kontakt. Under operasjonen bør det utvises ekstrem forsiktighet for å unngå å kutte fartøy. Overdreven blødning, oftest oppstått på grunn av oppdeling av enten brakial eller interne pattedyr arterier under fjerning av pattedyret fett pad, kan skjule visualisering i kirurgisk felt eller føre til døden gjennom exsanguination. Nylig beskrevet i denne protokollen er bruken av et biopsistans og skjæreverktøy (Supplemental Figure 1), som betydelig fremskynder og forenkler opprettelsen av den sirkulære feilen gjennom ribbeburet, og et vindusholderverktøy som gjør implantasjon enklere. Implementeringen av disse fremskrittene forbedrer prosedyrens suksessrate betydelig og reduserer det nødvendige nivået av tidligere kirurgisk ferdighet. Individuelle laboratorier kan bruke tegningene i tilleggstallene til å produsere disse verktøyene med enten interne eller kommersielle maskinverksteder. Et internettsøk etter "budsteder for maskinverksteder" vil gi flere online applikasjoner som vil bidra til å finne lokale kommersielle maskinbutikker.
Til slutt er det avgjørende å sikre at lungevevet forblir tørt før limpåføring. Den vanligste fallgruven som resulterer i mislykket dekslerlip vedlegg er unnlatelse av å sikre fullstendig fjerning av fuktighet fra lungeoverflaten før appposisjon med rammen eller dekkglasset. Videre, for å sikre kvalitetsbilder, bør et ekstremt tynt lag lim (<10 μm) påføres. Overflødig lim skal skrapes av før plassering av dekkglasset.
Hovedbegrensningen av IVI gjennom WHRIL er den relativt begrensede dybden av penetrasjon oppnåelig. Derfor er patologi som forekommer dypt inne i lungen utilgjengelig. Til tross for denne begrensningen kan teknikken fortsatt gi en overflod av klinisk relevant informasjon, spesielt i onkologiske undersøkelser, gitt den beskrevne proclivity for perifert lokaliserte lungemetastaser38,39,40,41. Til syvende og sist gir denne avbildningsmetoden en betydelig fordel i forhold til standard ex vivo-analyser og andre metoder for in vivo-avbildning, som enten kobler vev fra vitale fysiologiske prosesser10,11,12,13eller begrenser langsgående analyse til en maksimal varighet på 12 timer14,15,16,37,42, henholdsvis.
For gjentatt avbildning i denne tidsperioden må flere utfordringer fortsatt overvinnes. For det første er det viktig å opprettholde helsen til huden rundt det implanterte vinduet, for mens det sårede vevet ikke er utsatt, kan huden rundt fortsatt bli betent eller smittet. Rutinemessig påføring av en antibiotikasalve vil bidra til å forhindre dette. For det andre, med tiden, kan ekssudat fra den kuttede huden samles under vindusrammen og forhindre plassering av festeplaten som brukes til å immobilisere musen i mikroskopstadiet. Å plassere et vått vev over WHRIL i 10-15 min vil myke opp dette ekssudatet og tillate plassering av vindusrammen. For det tredje er en av kroppens mekanismer for å skille ut overflødig vann og opprettholde homeostase via utånding av damp. Dermed vil for mye væskeinntak (hovedsakelig som følge av injeksjon av kontrastmidler eller tumorcellesuspensjoner) føre til at lungeoverflaten skiller ut dette overskytende vannet og vil resultere i at lungevevet løsner fra WHRIL. Dette kan unngås ved å begrense injeksjonsvolumet til maksimalt 50 μL om gangen. Til slutt, selv med det beste av omsorg, kan lungevev av og til løsne fra WHRIL på grunn av at musen inntar et stort volum vann eller på grunn av at musen overstyrer seg selv. Når dette skjer, oppstår løsrivelse av lungevevet fra WHRIL vanligvis sakte, fra ytterkanten. Dermed kan det være umulig å følge noen synsfelt som ligger på den første dagen av bildet for hele vinduets varighet. Det ble funnet at de beste bilderesultatene vil bli oppnådd i løpet av de første dagene, og at bruk av mosaikkteknikker som den tidligere publiserte Large-Volume High-Resolution Intravital Imaging21 kan minimere virkningen av denne begrensningen.
Gitt at WHRIL er integrert i musens brystvegg, er drift under avbildning generelt ikke et betydelig problem, så lenge det betales forsiktighet for å sikre at vedlegget mellom vinduet og mikroskopet er fast. Likevel kan en liten mengde drift observeres i løpet av tiden umiddelbart etter plassering av musen i mikroskopstadiet. Dette kan komme fra avslapning av musens kropp eller fra termisk utvidelse av mikroskopkomponentene (sceneplate, XY-stadium, objektiv linse) på grunn av miljøkammeret. Denne driften kan unngås ved å tildele ~ 30 min for likevekt før du starter avbildningsprosedyren. Denne perioden tillater musens fysiologi å stabilisere seg under anestesi og lar alle komponenter komme til termisk likevekt. Enhver liten mengde restdrift kan lett håndteres av beregningsalgoritmer som StackReg43 eller HyperStackReg44.
Til slutt er denne protokollen en forbedring i forhold til den tidligere skriftlige versjonen av to grunner. For det første tillater det visuelle formatet en bedre konseptualisering av den kirurgiske protokollen. Dette er spesielt nyttig for de avgjørende trinnene der 1) lungen tørkes ved å påføre en jevn mild strøm av trykkluft (trinn 3.24, Figur 1J), 2) dekslene er festet til vindusrammens sentrale boring på en måte som forhindrer innfelling av bobler (trinn 3.31) og 3) tilsettes en liten mengde flytende cyanoakrylat ved metallglassgrensesnittet for å sikre en lufttett forsegling mellom dekselglasset og vindusrammen (trinn 3.34, figur 1O).
Til slutt, med ankomsten av WHRIL, gitt sin manglende evne til subcellulær visualisering av det samme lungevevet over en lengre periode, er etterforskere nylig bemyndiget til å ta opp mange ubesvarte spørsmål. Spesielt muliggjør protokollen som er skissert her, grunnleggende utforskning av de dynamiske prosessene som ligger til grunn for mange patologier, inkludert utviklingen av kreftmetastase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne avslører ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av følgende tilskudd: CA216248, CA013330, Montefiores Ruth L. Kirschstein T32 Training Grant CA200561, METAvivor Early Career Award, Gruss-Lipper Biophotonics Center og det integrerte bildebehandlingsprogrammet, og Jane A. og Myles P. Dempsey. Vi vil takke Analytical Imaging Facility (AIF) ved Einstein College of Medicine for bildestøtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | N/A | concentrated, anionic detergent with protease enzyme for manual and ultrasonic cleaning |
| 2 µm fluorescent microspheres | Invitrogen | F8827 | |
| 5 mm coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | |
| 5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 5% Isoflurane | Henry Schein, Inc | 29405 | |
| 5-0 braided silk with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| 8 mm stainless steel window frame | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 2 |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| 5 mm disposable biopsy punch | Integra | 33-35-SH | |
| Blunt micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5980 | |
| Brass window tool holder | N/A | N/A | Custom-made, Supplemental Figure 3 |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | |
| Cautery pen | Braintree Scientific | GEM 5917 | |
| Chlorhexidine gluconate | Becton, Dickinson and Company | 260100 | ChloraPrep Single swabstick 1.75 mL |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Henkel Adhesives | LOC1363589 | |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | |
| Bead sterilizer | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Germinator 500 |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Insulin syringes | Becton Dickinson | 329424 | |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc. | 40002957 | |
| Neomycin/polymyxin B/bacitracin | Johnson & Johnson | 501373005 | Antibiotic ointmen |
| Ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| Paper tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Rectangular Cover Glass | Corning | 2980-225 | |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| Stainless steel cutting tool | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 1 |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral antibiotic | Hi-Tech Pharmacal Co. | 50383-823-16 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Vacuum pickup system metal probe | Ted Pella, Inc. | 528-112 |
References
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Lee, Y. T. Breast carcinoma: pattern of metastasis at autopsy. Journal of Surgical Oncology. 23 (3), 175-180 (1983).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital imaging techniques for biomedical and clinical research. Cytometry Part A. 95 (5), 448-457 (2019).
- DeClerck, Y. A., Pienta, K. J., Woodhouse, E. C., Singer, D. S., Mohla, S. The tumor microenvironment at a turning point knowledge gained over the last decade, and challenges and opportunities ahead: A white paper from the NCI TME network. Cancer Research. 77 (5), 1051-1059 (2017).
- Borriello, L., et al. The role of the tumor microenvironment in tumor cell intravasation and dissemination. European Journal of Cell Biology. 99 (6), 151098 (2020).
- Hosseini, H., et al. Early dissemination seeds metastasis in breast cancer. Nature. 540 (7634), 552-558 (2016).
- Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540, 589-612 (2016).
- Risson, E., Nobre, A. R., Maguer-Satta, V., Aguirre-Ghiso, J. A. The current paradigm and challenges ahead for the dormancy of disseminated tumor cells. Nature Cancer. 1 (7), 672-680 (2020).
- Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4 (8), 6562 (2009).
- Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
- Miyao, N., et al. Various adhesion molecules impair microvascular leukocyte kinetics in ventilator-induced lung injury. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 290 (6), 1059-1068 (2006).
- Bernal, P. J., et al. Nitric-oxide-mediated zinc release contributes to hypoxic regulation of pulmonary vascular tone. Circulation Research. 102 (12), 1575-1583 (2008).
- Entenberg, D., et al. In vivo subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. IntraVital. 4 (3), 1-11 (2015).
- Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Dunphy, M. P., Entenberg, D., Toledo-Crow, R., Larson, S. M. In vivo microcartography and subcellular imaging of tumor angiogenesis: a novel platform for translational angiogenesis research. Microvascular Research. 78 (1), 51-56 (2009).
- Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54042 (2016).
- Seynhaeve, A. L. B., Ten Hagen, T. L. M. Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55115 (2018).
- Entenbery, D., et al. Time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
- Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nature Protocols. 15 (3), 1041-1065 (2020).
- Ritsma, L., Ponsioen, B., van Rheenen, J. Intravital imaging of cell signaling in mice. IntraVital. 1 (1), 2-10 (2012).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Harney, A. S., et al. Real-time imaging reveals local, transient vascular permeability, and tumor cell intravasation stimulated by TIE2hi macrophage-derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
- Karagiannis, G. S., et al. Assessing tumor microenvironment of metastasis doorway-mediated vascular permeability associated with cancer cell dissemination using intravital imaging and fixed tissue analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59633 (2019).
- Karagiannis, G. S., et al. Neoadjuvant chemotherapy induces breast cancer metastasis through a TMEM-mediated mechanism. Science Translational Medicine. 9 (397), (2017).
- Dreher, M. R., et al. Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers. Journal of the National Cancer Institute. 98 (5), 335-344 (2006).
- Rizzo, V., Kim, D., Duran, W. N., DeFouw, D. O. Ontogeny of microvascular permeability to macromolecules in the chick chorioallantoic membrane during normal angiogenesis. Microvascular Research. 49 (1), 49-63 (1995).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Ueki, H., et al. In vivo imaging of the pathophysiological changes and neutrophil dynamics in influenza virus-infected mouse lungs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 6622-6629 (2018).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of retinal blood flow using fluorescently labeled red blood cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital microscopy imaging of the liver following leishmania infection: An assessment of hepatic hemodynamics. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (101), e52303 (2015).
- Chaigneau, E., Roche, M., Charpak, S. Unbiased analysis method for measurement of red blood cell size and velocity with laser scanning microscopy. Frontiers in Neuroscience. 13, 644 (2019).
- Kim, T. N., et al. Line-scanning particle image velocimetry: an optical approach for quantifying a wide range of blood flow speeds in live animals. PLoS One. 7 (6), 38590 (2012).
- Presson, R. G., et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. American Journal of Pathology. 179 (1), 75-82 (2011).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
- Travis, W. D.
- Scholten, E. T., Kreel, L. Distribution of lung metastases in the axial plane. A combined radiological-pathological study. Radiologica Clinica (Basel). 46 (4), 248-265 (1977).
- Braman, S. S., Whitcomb, M. E.
- Herold, C. J., Bankier, A. A., Fleischmann, D.
- Kimura, H., et al. Real-time imaging of single cancer-cell dynamics of lung metastasis. Journal of Cellular Biochemistry. 109 (1), 58-64 (2010).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).
- Sharma, V. P.
