Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

זיהוי אוטומטי בעל תפוקה גבוהה של דבקות חיידקית בתאים מארחים

Published: September 17, 2021 doi: 10.3791/62764
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center, 2College of Veterinary Medicine, Texas A&M University

ERRATUM NOTICE

Summary

זיהוי של אינטראקציות פתוגן מארח-חיידקי המבוסס על דבקות פנוטיפית באמצעות הדמיית תיוג פלואורסצנטית בעלת תפוקה גבוהה יחד עם שיטות ניתוח סטטיסטיות אוטומטיות מאפשר הערכה מהירה של אינטראקציות חיידקיות פוטנציאליות עם תאים מארחים.

Abstract

זיהוי של פתוגנים חיידקיים מתעוררים הוא קריטי לבריאות וביטחון האדם. דבקות חיידקית בתאים מארחים היא צעד חיוני בזיהומים חיידקיים ומהווה סימן היכר של איום פוטנציאלי. לכן, בחינת דבקותם של חיידקים לתאים מארחים יכולה לשמש כמרכיב של הערכת איום חיידקי. שיטה סטנדרטית לספירת דבקות חיידקית לתאים מארחים היא להדגיר יחד חיידקים עם תאים מארחים, לקצור את החיידקים החסידים, צלחת התאים שנקטפו על מדיה מוצקה, ולאחר מכן לספור את המושבה שנוצרת יחידות יוצרות (CFU). לחלופין, דבקות חיידקית בתאים מארחים ניתן להעריך באמצעות גישות מבוססות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית. עם זאת, אסטרטגיות קונבנציונליות ליישום גישות אלה גוזלות זמן ולא יעילות. כאן, פותחה לאחרונה שיטת הדמיה אוטומטית המבוססת על מיקרוסקופיה. בשילוב עם עיבוד תמונה בעל תפוקה גבוהה וניתוח סטטיסטי, השיטה מאפשרת כימות מהיר של חיידקים הנצמדים לתאים מארחים. שני מינים חיידקיים, פסאודומונס ארוגינוזה גרם-חיובי מונוציטוגנים ופקדים שליליים תואמים, נבדקו כדי להדגים את הפרוטוקול. התוצאות מראות כי גישה זו מהווה נדבך במהירות ובדייקנות ומצטרפת באופן משמעותי את עומסי העבודה וצירי הזמן הניסיוניים.

Introduction

הידבקות חיידקית היא תהליך לפיו חיידקים מתחברים לתאים או למשטחים אחרים. הקמה מוצלחת של זיהום על ידי פתוגנים חיידקיים דורשת הידבקות לתאים מארחים, קולוניזציה של רקמות, ובמקרים מסוימים, פלישה לתאים מארחים1,2,3. מחלות זיהומיות מתפתחות מהוות איומים גדולים על בריאות הציבור, כפי שמעידת מגפת COVID-19 האחרונה4,5,6. חשוב לציין, פתוגנים חדשים או מתעוררים לא ניתן להבחין בקלות באמצעות גישות מבוססות גנומיות, במיוחד במקרים שבהם הפתוגן תוכנן להתחמק מזיהוי או אינו מכיל חתימות גנומיות המזהות אותו פתוגניים. לכן, זיהוי של פתוגנים פוטנציאליים באמצעות שיטות המעריכות ישירות סימני היכר של פתוגניות, כמו דבקות חיידקית בתאים מארחים, יכול לשחק תפקיד קריטי בזיהוי פתוגן.

דבקות חיידקית לתאים מארחים שימשה להערכת מנגנונים של פתוגנזה חיידקית במשךעשרות שנים 1,7. הדמיה מיקרוסקופית8,9 והספירה של יחידת יצירת מושבה חיידקית (CFU)10,11,12,13 על ידי ציפוי לאחר זיהום הן שתי שיטות מעבדה מפותחות לבדיקת דבקות מיקרוביאלית ו / או זיהום של תאים מארחים14. בהתחשב בגודל קנה המידה של תאי החיידקים, חלוקת תאי החיידקים החסידים דורשת בדרך כלל שימוש בטכניקות מיקרוסקופיות מתקדמות בהגדלה גבוהה, כמו גם בגישות הדמיה ברזולוציה גבוהה, כולל מיקרוסקופיה אלקטרונית, מיקרוסקופיה הרחבה (ExM)15,16והדמיה תלת ממדית17 . לחלופין, ספירת חיידקים הקשורים או מופנמים בתוך תאים מארחים יכולה להתבצע על ידי ציפוי סדרת הדילול של חיידקים שנקטפו על אגר מוצק וספירת CFUs10,12,13. שיטה זו היא מייגע וכוללת צעדים ידניים רבים, אשר מציג קשיים בקביעת הליך סטנדרטי או אוטומטי הנדרש לניתוחים בעלי תפוקה גבוהה18,19. לכן, פיתוח שיטות חדשות להערכת קובץ מצורף לתא מארח יטפל במגבלות הנוכחיות בשדה.

שיטה אחת כזו מתוארת כאן המשתמשת במיקרוסקופיה אוטומטית של תפוקה גבוהה, בשילוב עם עיבוד תמונה בתפוקה גבוהה וניתוח סטטיסטי. כדי להדגים את הגישה, בוצעו ניסויים עם מספר פתוגנים חיידקיים, כולל פסאודומונס ארוגינוזה, פתוגן חיידקי גרם שלילי אופורטוניסטי של בני אדם, בעלי חיים וצמחים14,20, אשר נמצא לעתים קרובות ליישב את דרכי הנשימה של חולים עם תפקודי הגנה מארח לקוי. גישה זו מיטבה את תהליך ההדמיה המיקרוסקופית המתוארת במחקרים קודמים14,20. זיהוי ההדמיה היה פשוט יותר על ידי תאים מארחים ובקטריה המסומנים על ידי פלואורסצנטיות כדי לעקוב במהירות אחר הקרבה שלהם, מה שהפחית באופן דרמטי את עומס העבודה של המיקרוסקופיה כדי לקבל תמונות ברזולוציה גבוהה עבור חיידקים ייחודיים. בנוסף, הניתוח הסטטיסטי האוטומטי של תמונות בספירת תאים מארחים וחיידקים החליף את הניסוי הידני של ציפוי CFU חיידקי כדי להעריך את היחס בין ספירת חיידקים חסידים לתא מארח. כדי לאשר את התאימות של שיטה זו, זנים חיידקיים מרובים וסוגי תאים מארחים נבדקו גם, כמו ליסטריה מונוציטוגנים, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, ו Klebsiella דלקת ריאות, כמו גם תאי אנדותל וריד הטבור האנושי (HUVECs), והתוצאות תומכות במגוון וביעילות של השיטה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תרבית תאים A549

  1. לשמור על קו התא A549 ב F-12K בינוני בתוספת עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) ודגרה ב 37 °C (5°F), 5% CO2.
  2. לשנות את המדיום כל 3-4 ימים ועבר ב 85%-95% השפעה.
  3. בקצרה, לשטוף את התאים עם 1 x תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS, pH 7.4, אלא אם צוין אחרת) ולטפל עם 1 מיליליטר של 0.25% טריפסין-0.53 mM חומצה אתילנדימינטראטראצטית (EDTA) פתרון (שקוע שכבת התא) במשך כ 2 דקות ב 37 °C .C.
  4. הוסף 6 מ"ל נוספים של מדיום צמיחה מלא (F-12K בינוני + 10% FBS) כדי לעצור את פעילות הפרוטאז. לאחר מכן, צלחת התאים בפוליסטירן סטרילי T-75 רקמה תרבית בקבוקון ביחס תת-קטיביציה של 1:3-1:8. הכרך הסופי של התרבות הוא 12 מ"ל.
  5. זרע כ 1 x 104 תאי A549 (ריכוז תאים: ~ 1 x 105 תאים / מ"ל) על כל באר של צלחת 96 באר יום לפני דבקות.

2. צמיחה והכתמה חיידקית

  1. בצע את כל עבודת החיידקים בקבינט בטיחות ביולוגית, מעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2.
  2. לחסן את כל תרביות החיידקים, כולל P. aeruginosa (PAO1), Escherichia. coli, L. monocytogenes, ו- B. subtilis, וכו ', ממלאי הגליצריל הקפוא ולגדל אותם במרק סויה טריפטי (TSB, 3 מ"ל) באינקובטור רועד ב 37 °C בלילה נשמר ב 250 סל"ד.
  3. למחרת, להשתמש 1:100 דילול של תרבות הלילה כדי לחסן תת תרבות ולהגדיל אותם TSB (1 מ"ל) עבור 3 שעות לשלב המעריכי, למדוד את OD ב 600 ננומטר (OD600)כדי לאשר. ודא כי OD600 הוא בטווח של 0.4-0.6.
  4. לפני ביצוע בדיקת דבקות מארח חיידקים, צלחת דילול סדרתי של השעיית חיידקים על לוחות TSB-אגר, לדגור אותם לילה ב 37 °C (50 °F), ולאחר מכן להקים את CFUs חיידקי ממספר המושבות. עבור P. aeruginosa, OD600 של 1.0 מתאים 2 x 108 תאים חיידקיים קיימא / מ"ל, ועל L. monocytogenes, OD600 של 1.0 מתאים 9 x 108 תאים חיידקיים קיימא / מ"ל.
  5. לקצור את תרביות החיידקים בשלב מעריכי על ידי צנטריפוגה ב 13,000 x גרם במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר (RT), ולאחר מכן לשטוף אותם פעם אחת באמצעות 1x PBS (1 מ"ל). Resuspend כדורי חיידקים ב 1 מ"ל של 1x PBS ולקבוע את הריכוזים על ידי מדידת OD600 של השעיות חיידקים. לדוגמה, P. aeruginosa עם OD600 של 0.5 מייצג ריכוז של 1 x 108 תאים חיידקיים / מ"ל.
  6. מכתימים את ההשעיה החיידקית באמצעות צבע פלואורסצנטי ירוק או אדום ב- RT למשך 30 דקות עם סיבוב עדין בחושך. בשביל זה, להוסיף 2 μL של 500-קיפול מרוכז מלאי כתמים צבע לתוך 1 מ"ל של השעיה חיידקית כדי לדלל את הצבע פי 1. כדי לשטוף את צבע הכתמים, צנטריפוגה החיידקים מוכתמים ב 13,000 x גרם במשך 2 דקות ו resuspend הכדור ב 1 מ"ל של 1x PBS במשך שלוש פעמים.
    הערה: אם פלואורסצנטיות - (GFP-, RFP-, mCherry-, וכו ') חיידקים מתויגים משמשים בניסוי, אז לדלג על שלב זה כתם חיידקי. GFP- מתויג P. aeruginosa ו צביעה פלואורסצנטית אדומה מוכתמת L. מונוציטוגנים שימשו בפרוטוקול זה.
  7. לאסוף את תאי החיידקים המוכתמים או חיידקים מתויג GFP על ידי צנטריפוגה ב 13,000 x גרם במשך 2 דקות. יש תחודשו ב-F-12K בינוני טרי (1 מ"ל) ותמדדו את ה-OD600 של כל תרבות. לאחר מכן לדלל את התרבויות לריכוזים הרצויים בהתבסס על ריבוי הזיהום (MOI) וריכוז התא המארח. הכרך הסופי המשמש בניסוי זה הוא 500 μL.
    הערה: לדוגמה, אם ריכוז התא המארח שנספר באמצעות מכתים כחול טריפאן הוא 1 x 105 תאים / מ"ל, הריכוז הרצוי של תאים חיידקיים ב- MOI של 100 יהיה 1 x 107 תאים / מ"ל. ריכוז P. aeruginosa ב 0.5 OD600 הוא 1 x 108/mL. כדי להשיג את הריכוז הרצוי, לדלל את P. aeruginosa תרבות פי 10, להוסיף 50 μL של תרבות resuspended כדי 450 μL של בינוני F-12K טרי.

3. דבקות חיידקית והכתמת תאים מארחים

  1. ראשית, לשטוף את המונו-שכבתים של תאי A549 זרע שלוש פעמים עם PBS חם 1x. עבור כל שטיפה, להוסיף 100 μL של 1x PBS לכל באר, בעדינות pipette למעלה ולמטה שלוש פעמים, להיפטר 1x PBS או לחכות 10 s לאחר תוספת ולאחר מכן ואקום כדי להסיר 1x PBS. כדי לקבוע את הקינטיקה של אסוציאציה חיידקית, לכסות את התאים עם 100 μL של ריכוזים הרצויים של השעיה חיידקית עם MOIs שונים (0, 1, 10, ו 100). ספין את החיידקים ב 200 x g במשך 10 דקות ודגורת תאי A549 נגועים ב 37 °C (5 °F), 5% CO2 עבור שעה אחת נוספת.
    הערה: בניסוי זה, לכל תנאי היה טריפליקט טכני.
  2. הסר את החיידקים הלא מאוגדים על ידי שטיפת המונו-שכבתיות חמש פעמים עם PBS חם 1x כמתואר לעיל. הוסף 100 μL של 4% פורמלדהיד (ב 1x PBS) לתוך כל באר של לוחות 96-well כדי לתקן את התאים. תן את הצלחות לשבת על קרח במשך 15 דקות ולאחר מכן לשטוף את פתרון הקיבעון באמצעות 1x PBS שלוש פעמים.
  3. כדי להכתים את הגרעינים, להוסיף 50 ננוגרם / מ"ל של 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) ודגרה זה במשך 10 דקות ב RT. לאחר הדגירה, לשטוף את הבארות שלוש פעמים באמצעות 1x PBS. לכסות את תאי A549 נגועים עם 100 μL של 1x PBS כדי למנוע ייבוש. מעבד לשלב הבא או לאחסן את הצלחת ב 4 °C (5 °F) עד 2 ימים בחושך.

4. הדמיה, עיבוד וניתוח פלואורסצנטיות אוטומטיים

  1. כדי לשמור על שלמות הנתונים, בחר באופן אקראי ובאופן ידני חמישה מיקומים של כל באר כדי ללכוד את התמונות בהגדלה של פי 20. ללכוד את התמונות הפלואורסצנטיות של תאי A549 וחיידקים תחת ערוצי DAPI ו- GFP, בהתאמה. השתמש בערוץ PE-Cy5 עבור החיידקים מוכתמים על ידי צבע פלואורסצנטי אדום.
  2. כדי לקבל רזולוציה טובה יותר, לעבד את כל התמונות עבור שיטוח רקע ופירוק. הגדר את הפרמטרים כקוטר 68 מיקרומטר של הכדור המתגלגל להחלקת ומדידת אוטומטית של פונקציית התפשטות הנקודות (PSF) של דה-וולבולציה של תמונה בהתבסס על המטרה.
  3. כדי לספור את כל התאים והחיידקים המוסמכים, למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות של התאים המארחים והחיידקים ולהגדיר את עוצמת הפלואורסצנטיות החלשה ביותר של תאים וחיידקים מארחים כסף לספירת התאים. לספור את כל החיידקים קרוב לתא מארח בתוך 15 מיקרומטר מרחק כמו חיידקים דבק כמו הקוטר של תא A549 הוא 10.59-14.93 מיקרומטר21.
    הערה: הגדרת ברירת מחדל במערכת ההדמיה סופרת באופן סלקטיבי את התאים המארחים עם קטרים הנעים בין 5-100 מיקרומטר וחיידקים הנעים בין 0.2-5 מיקרומטר בגודל (רוחב ואורך).
  4. בהתבסס על תוצאות עיבוד התמונה הידניות שהוזכרו לעיל, החל את הפרמטרים של החלקת תמונה, דה-אבון-וולטינג, גדלי אובייקטים, מרחק ועוצמות פלואורסצנטיות לשאר התמונות האוטומטיות. לאחר הניתוח האוטומטי, שקול קריאות קריטיות, כגון ספירת תאים מארחים כוללת, גדלי תאים וצורות, ספירת חיידקים כוללת, וספירת החיידקים הממוצעת לכל תא מארח, שהיה האינדיקטור החשוב ביותר, כדי לקבוע דבקות חיידקית.
  5. ייצוא נתונים וניתוח סטטיסטי
    1. יצא את התוצאות שנותחו מכל התמונות לגיליון אלקטרוני (למשל, תבנית 'xlsx'). המערכת האוטומטית מייצרת שתי קבוצות של תוצאות: 1) ספירת החיידקים החסידית הממוצעת מכל תמונה; 2) הנתונים האינפורמטיביים של כל תא מארח יחיד, כגון ספירת חיידקים חסידים על תא בודד, גודל המארח ועוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של התא המארח והחיידקים, מהתמונה המתאימה.
    2. חשב את המספר הממוצע ואת סטיית התקן של ספירת חיידקים חסידים מכל התמונות כדי לייצג את רמת הדבקות החיידקית בהשוואה לבקרות שליליות. בשיטה זו, E. coli ו- B. subtilis שימשו בקרות שליליות בבדיקת דבקות חיידקית גראם שלילית וסבתא חיובית, בהתאמה. בצע ANOVAs דו-כיווני כדי לבדוק שונות משמעותית בין נקודות נתונים על פני טיפול עבור שלושה ניסויים עצמאיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לפתח את בדיקת דבקות חיידקית מבוססת הדמיית פלואורסצנטיות, זן P. aeruginosa PAO1 ומקבילו לדבקות שלילית E. coli שימשו לבדיקת יעילות הפרוטוקול, כמו הדבקות של חיידקים אלה לתאי A549 דווח14,20,22. ראשית, GFP - שכותרתו P. aeruginosa (PAO1) ו- GFP שכותרתו E. coli היו דגירה משותפת עם קו תא אפיתל מונצח אנושי A549 ב MOIs שונים, בהתאמה. התוצאות הראו כי PAO1 דבק בתאי A549 בצורה תלוית מינון (איור 1A,B); בינתיים אומתה גם הדבקות כמעט אפסית של אי-קולי (איור 1א,ב'). היו 50 תמונות שנתפסו ונותחו בכל MOI. ANOVAs דו-כיווני בוצעו כדי לבדוק את הווריאציות המשמעותיות משלושה ניסויים עצמאיים.

Figure 1
איור 1: חיידקי גרם-שלילי P. aeruginosa דבק בתאי A549 בתוך שעה אחת של דגירה משותפת. (A)תמונות מיקרוסקופיות לסקירה כללית של דבקות חיידקית שבהן צולמו התמונות באמצעות הגדלה של פי 20. PAO1 ובקרת הדבקות השלילית E. coli דבקו בתאי A549 בריבוי המצוין של זיהומים (MOIs). חיידקים היו GFP-פלואורסצנטיות מתויגת. גרעיני תאי A549 הוכתמו על ידי DAPI. סרגל קנה המידה הוא 50 מיקרומטר. (B)כימות של ספירת חיידקים חסידים לכל תא A549. עבור כל זן חיידקי שנבדק (PAO1 ו- E. coli) בכל MOI, בסך הכל 50 תמונות הוחלו על הניתוח בכל תנאי. הנתונים הם ממוצעים ± סטיית תקן (SD) מנציג אחד של שלושה ניסויים עצמאיים. הניתוח הסטטיסטי הדו-כיווני של ANOVA בוצע. * p < 0.05, *** p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות דומות נצפו גם כאשר חיידקים גרם חיובי, L. monocytogens23,24 ואת השליטה השלילית שלה B. subtilis, שימשו ( איור2A,B). הדבקות בתאי A549 הייתה משמעותית ב- L. monocytogenes מאשר B. subtilis (איור 2A,B).

Figure 2
איור 2: חיידקי L. monocytogenes חיידקיים חיוביים לדבוק תאי A549 בתוך 1 שעה של דגירה משותפת. (A)תמונות מיקרוסקופיות עבור סקירה כללית של L. monocytogenes, כמו גם את השליטה השלילית B. subtilis דבקות בתאי A549 ב- MOIs שונים. חיידקים הוכתמו באמצעות צבע פלואורסצנטי אדום. גרעיני תאי A549 היו מוכתמים ב- DAPI. סרגל קנה המידה הוא 50 מיקרומטר. (B)כימות של ספירת חיידקים חסיד לכל תא A549. עבור כל זן חיידקי שנבדק (L. monocytogenes ו- B. subtilis) בכל MOI, בסך הכל 50 תמונות הוחלו על הניתוח בכל מצב. נתונים הם ממוצעים ± SD מנציג של שלושה ניסויים עצמאיים. הניתוח הסטטיסטי הדו-כיווני של ANOVA בוצע. ** p < 0.01, *** p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

תמונה מייצגת של פילוח P. aeruginosa חסיד מארח מוצגת באיור 3 (מסכות צהובות: חיידקים נבחרים, קו מתאר אדום: ספירת חיידקים בודדים). ההגדרות עבור מטרות מחשב מארח וחיידקים מתוארות בסעיף פרוטוקול.

Figure 3
איור 3: תמונות לדוגמה של פילוח חיידקים וספירה בתהליך הניתוח האוטומטי. (A) תמונות מיקרוסקופיות של P. aeruginosa דבק A549 ב MOI של 100 ללא פילוח חיידקי וספירה. (B) אותה תמונה לאחר הניתוח הסטטיסטי של פילוח חיידקים וספירה. מסכות צהובות: חיידקים נבחרים, קו מתאר אדום: ספירת חיידקים בודדים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

התוצאות של הניתוחים האוטומטיים, כולל גדלים ואזורים של תאים מארחים, ספירת תאים חיידקיים וארחים, כמו גם ספירת החיידקים הממוצעת לכל תא מארח, המייצגים את מצב בריאות התא המארח, רמת דבקות החיידקים, וציטוקסיות חיידקית, מפורטות בטבלה 1 ובטבלה 2. טבלה 1 מייצגת את ספירת החיידקים החסידים ברמה התאית הממוצעת מתמונות שונות, בעוד שטבלה 2 מייצגת ספירות חיידקים חסידיות המנותחות בתמונה אחת ברמה התאית A549 אחת. תמונות מייצגות אלה צולמו מתאי A549 נגועים על ידי PAO1 ב MOI של 100. התוצאות המנותחות של התמונה הראשונית באיור 3 נרשמו כתמונה 1 בטבלה 1 ובטבלה 2.

טבלה 1: תוצאות ניתוח סטטיסטי של 9 תמונות מייצגות ברמה התאית. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

בכל תמונה, ספירת סכומי המארח וכתמי סכום חיידקים מייצגים את סך הספירה של גרעינים מארחים וספירות חיידקים כוללות שזוהו על ידי המערכת בהתבסס על הפרמטרים שתוארו לעיל, בהתאמה. בנוסף, החישוב האוטומטי של יחס כתמי חיידקים מייצג את ספירת החיידקים הממוצעת לכל תא מארח, הנגזר מסכום החיידקים כתמים / ספירת סכומי המארח. יתר על כן, ניתן לכלול גם קריאות נוספות; לדוגמה, ספירת הפונדקאים של החיידקים ממחישים את התופעה האוניברסלית או הספציפית של דבקות חיידקים מארחים. כאשר ספירת הפונדקאים של החיידקים נמוכה בהרבה מספירת הסכום של המארח, לעומת זאת, ספירת החיידקים הממוצעת לפונדקאי גבוהה יחסית, מה שמייצג כי פנוטיפ דבקות כזה יש הטרוגניות משמעותית.

טבלה 2: ניתוח סטטיסטי תאי יחיד של תמונה מייצגת. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

ניתוח תאים יחידים מספק פרטים נוספים על תאי מארח ויעדים חיידקיים בכל תמונה, וזה שימושי יותר בעת איסוף תכונות חיידקיות אחרות והחלתם על הניתוח החישובי האוטומטי כדי לפתח כלי חזק יותר בהערכת הפתוגניות החיידקית הפוטנציאלית, כמו מודל למידת מכונה הנחקר. בפרוטוקול זה, גודל המארח והאזור מייצגים את הקטרים והאזורים של כל גרעיני מארח מוכתמים, ועוצמת הפלואורסצנטיות המארחת מייצגת את העוצמה הממוצעת של הגרעינים המוכתמים. ספירת נקודות חיידקים ואזור מייצגים את מטרות החיידקים החסידים לכל תא מארח ולאזורים הכוללים שלהם. עוצמת הפלואורסצנטיות החיידקית מייצגת את העוצמה הממוצעת של כל החיידקים החסידים.

אין זה מפתיע כי כמה חיידקים ארסיים לא לדבוק A549 בעוד כמה חיידקים עם רמות גבוהות של דבקות חיידקית לא בהכרח לתאם עם פתוגניות. סוג תא מארח אחר, HUVECs, נבדק גם כדי למקסם את היישום של שיטה זו. התוצאות הראו את הזיהוי היעיל ואת הפנוטיפים השונים של חיידקים (איור 4). תאים מארחים שונים יכולים להגביר את ההערכה של פתוגנים חיידקיים פוטנציאליים; לדוגמה, סראטיה רובידאיה וסטרפטוקוקוס אגלקטיה חסידים ב-HUVEC אך לא בתאי A549(איור 4). יתר על כן, ה- Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) לא היה דבק ב- A549 או HUVEC(איור 4). לכן, זה קריטי כדי להבטיח כי השיטה מתאימה סוגים מרובים של תאים מארחים להגיב הספציפיות של אינטראקציות מארח-חיידקים. הן תאי A549 והן תאי HUVEC דוגרו במשותף עם חיידקים ב MOI של 100 ב 37 °C (57 °F) עבור 1 שעה.

Figure 4
איור 4: ייחודיות של דבקות חיידקית לארח תאי A549 ו- HUVEC. זני החיידקים, כולל S. rubidaea, S. agalactiae, ציטוטוקסית אנטרוהמורהאגית E. coli (EHEC), PAO1 ,P. aeruginosa ΔpilA (PAO-NP),E. coli, S. aureus ו- S. aureus ΔsaeR, נבדקו הן בתאי A549 והן ב- HUVEC ב- MOI של 100 עבור שעה אחת של דגירה משותפת ב -37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. חיידקים היו מוכתמים בצבע פלואורסצנטי אדום. ספירת חיידקים חסידים היו מכמתים מ 45 תמונות / זן חיידקי בשלושה ניסויים עצמאיים. הנתונים הם ממוצעים ± SD מנציג אחד של שלושה ניסויים עצמאיים. * p < 0.05, *** p < 0.001, **** p<0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול מתאר גישה אוטומטית לספירת התקשרות חיידקית לתאים מארחים. לגישה המתוארת יש כמה יתרונות אטרקטיביים על פני שיטות קונבנציונליות. ראשית, גישה זו מאפשרת כימות מדויק של מספר תאי הפתוגן המיקרוביאליים המחוברים לתאים מארחים בודדים. חשוב לציין, כימות זה יכול להתבצע ללא צורך בקציר חיידקים מייגע, דילול סדרתי, ציפוי על מדיה מוצקה, וקביעה של CFUs10,11,12. ככזה, הטכניקה המתוארת מפחיתה את עומס העבודה הכולל הנדרש כדי לכמת דבקות חיידקית. יש להעריך כי היתרונות של הגישה המוצעת מוגברים כאשר מבקשים לזהות פנוטיפים דבקות בניסויי סינון בקנה מידה גדול, כולל זיהוי של גנים חיידקיים או מארחים בספריות מוטציה או CRISPR, בהתאמה, המסדירים תהליך זה. שנית, הערכה ישירה של אינטראקציות בין תאים מארחים לתאים חיידקיים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מספקת מידע לבירור מנגנונים של פתוגניות חיידקית, כולל שינויים בהישרדות תאים מארחים או חיידקיים, מורפולוגיה או דינמיקה. לבסוף, הניתוח הסטטיסטי האוטומטי המבוצע על תמונות שנאספו בניתוח לא רק מספק כימות כולל של הקשר החיידקי הממוצע לתאים מארחים, אלא גם מאפשר הערכה של אינטראקציות דינמיות, חד-תאיות, מארח-פתוגן.

למרות יתרונות אלה, לשיטות המתוארות יש כמה מגבלות חשובות. ראשית, מכתים פלואורסצנטיות של חיידקים נדרשים כדי למנות את דבקותם בתאים המארחים. לכן, צבע הכתמים הפלואורסצנטי צריך להכתים חיידקים באופן סלקטיבי מאשר עמיתיהם לתא המארח. בנוסף, צבע הכתמים לא יכול לשנות את פנוטיפ מצורף של החיידקים הנושאים אותו. לכן, יש לקבוע מראש את אופטימיזציה של כתמי פלואורסצנטיות חיידקית (למשל, ריכוז, משך הכתמים) לקראת ביצוע מחקרי הדבקות המתוארים. בפרוטוקול זה, כתמים פלואורסצנטיים של זני חיידקים כולל P. aeruginosa, L. monocytogenes, E. coli, ו- B. subtilis במשך 30 דקות אינו משפיע על דבקותם בתאים מארחים. שנית, בשל הספציפיות של אינטראקציות שונות בין חיידקי מארח, ייתכן שסוג תא מארח יחיד לא יספיק כדי להעריך התקשרות חיידקית לתאים מארחים. לכן, סוגים מרובים של תאים מארחים עשויים להידרש כדי לקבל הבנה מלאה של המידה שבה חיידק נתון יכול לדבוק במשטחי תאים מארחים. שלישית, פילוח חיידקים לא היה יעיל לחלוטין כאשר חיידקים להניע צבירה במהלך הדגירה המשותפת, למשל, S. aureus, או כאשר חיידקים יצרו גושים ב MOI גבוה יותר (>100), למשל, P. aeruginosa. במקרה זה, הגדלה גבוהה יותר יש להחיל כדי ללכוד את התמונות, או תמונות נוספות יש להשתמש בניתוח כדי להפחית את ההשפעה של צבירת חיידקים.

תאי אפיתל ריאות אנושיים (A549) ו- HUVECs הועסקו במחקרים כדי להדגים את הפלסטיות של הגישה ביחס לסוג התא המארח, ושניהם הציגו רמות גבוהות של רגישות לדבקות חיידקית. השימוש בשני סוגי תאים מארחים גם הראה כי השיטה המתוארת יכולה להיות מיושמת באופן נרחב כדי לאפיין אינטראקציות מארח-חיידק חסיד במהירות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לכל המחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר קייט זלוטוקובסקי מ-Biotek Inc. על תמיכתם הטכנית. עבודה זו נתמכה על ידי משרד ההגנה תחת חוזה מספר W911NF1920013 ל- PdF, הסוכנות לפרויקטי מחקר מתקדמים של ההגנה (DARPA) ומשרד הפנים תחת חוזה מס '140D6319C0029 ל- PdF. תוכן המידע אינו משקף בהכרח את עמדת הממשלה או את מדיניותה, ואין להסיק כל אישור רשמי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x PBS VWR 45001-130
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher 62248 Host cell staining dye
96 well plate Corning 3882 Half area well, flat clear bottom
A549 cells ATCC  CCL 185 Mammalian cell line
BactoView Live Red Biotium 40101 Bacteria staning dye
Centrifuge Eppendorf 5810R
CFSE cell division tracker BioLegend 423801
Cytation 5  BioTek Cytation 5  Cell imaging multi-mode reader
E. coli Laboratory stock 
EGM bulletKit Lonza CC-3124 HUVEC cell culture medium
EHEC NIST collections
F-12k medium ATCC  302004 A549 cell culture medium
Fetal bovine serum Corning 35-016-CV
HUVEC Laboratory stock 
L. monocytogenes NIST collections
OD600 DiluPhotometer IMPLEN
P. aeruginosa Dr. Lori Burrows laboratory stock
P. aeruginosa ΔpilA Dr. Lori Burrows laboratory stock
S. agalactiae NIST collections
S. aureus BEI NR-46543
S. aureus ΔsaeR BEI NR-48164
S. rubidaea NIST collections
Typical soy broth Growcells MBPE-4040

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Bacterial adhesion and entry into host cells. Cell. 124, 715-727 (2006).
  2. Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Médecine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).
  3. Josse, J., Laurent, F., Diot, A. Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms. Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).
  4. Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Craxì, A. SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver. Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).
  5. Ortiz-Prado, E., et al. Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094 (2020).
  6. Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19. Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).
  7. Woo, V., et al. Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression. Frontiers in Immunology. 10, 928 (2019).
  8. Pandey, A., et al. Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection. Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).
  9. Ding, S., et al. Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes. iScience. 24 (3), 102192 (2021).
  10. Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110 (2008).
  11. Qin, Q. M., et al. Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans. PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078 (2011).
  12. Qin, Q. M., et al. A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240 (2020).
  13. Pandey, A., et al. Activation of host IRE1α-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103 (2018).
  14. Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells. Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).
  15. Götz, R., et al. Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy. Nature Communications. 11, 6173 (2020).
  16. Lim, Y., et al. Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy. PLOS Biology. 17 (10), 3000268 (2019).
  17. Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60350 (2019).
  18. Hoffmann, S., et al. High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43 (2018).
  19. Hazan, R., Que, Y. -A., Maura, D., Rahme, L. G. A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates. BMC Microbiology. 12 (1), 259 (2012).
  20. Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).
  21. Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).
  22. Farinha, M. A., et al. Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice. Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).
  23. Réglier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes. Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).
  24. Ortega, F. E., et al. Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells. Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 175

Erratum

Formal Correction: Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells
Posted by JoVE Editors on 02/08/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

to:

Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

זיהוי אוטומטי בעל תפוקה גבוהה של דבקות חיידקית בתאים מארחים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, J., Qin, Q. M., Van Schaik,… More

Yang, J., Qin, Q. M., Van Schaik, E., Samuel, J. E., de Figueiredo, P. Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells. J. Vis. Exp. (175), e62764, doi:10.3791/62764 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter