Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Konak Hücrelere Bakteriyel Yapışmanın Otomatik, Yüksek Verimli Tespiti

Published: September 17, 2021 doi: 10.3791/62764
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center, 2College of Veterinary Medicine, Texas A&M University

ERRATUM NOTICE

Summary

Otomatik istatistiksel analiz yöntemleri ile birlikte yüksek verimli floresan etiketleme görüntüleme kullanılarak fenotipik yapışma esas alınarak konak-bakteriyel patojen etkileşimlerinin tespiti, konak hücrelerle potansiyel bakteriyel etkileşimlerin hızlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.

Abstract

Ortaya çıkan bakteriyel patojenlerin tanımlanması insan sağlığı ve güvenliği için kritik öneme sahiptir. Konak hücrelere bakteriyel yapışmak bakteriyel enfeksiyonlarda önemli bir adımdır ve potansiyel tehdidin ayırt edici bir özelliğidir. Bu nedenle, bakterilerin konak hücrelere yapışmasını incelemek bakteri tehdidi değerlendirmesinin bir bileşeni olarak kullanılabilir. Konak hücrelere bakteri yapışmasını numaralandırmak için standart bir yöntem, bakterileri konak hücrelerle birlikte kuluçkaya yatırmak, yapışık bakterileri hasat etmek, hasat edilen hücreleri katı ortamda kaplamak ve ardından elde edilen koloni oluşturan birimleri (CFU) saymaktır. Alternatif olarak, konak hücrelere bakteriyel yapışma immünoforezans mikroskopi tabanlı yaklaşımlar kullanılarak değerlendirilebilir. Bununla birlikte, bu yaklaşımları uygulamak için geleneksel stratejiler zaman alıcı ve verimsizdir. Burada yakın zamanda geliştirilen otomatik floresan mikroskopi tabanlı görüntüleme yöntemi açıklanmıştır. Yüksek verimli görüntü işleme ve istatistiksel analiz ile birleştirildiğinde, yöntem konak hücrelere yapışan bakterilerin hızlı bir şekilde ölçülmesini sağlar. Protokolü göstermek için gram negatif Pseudomonas aeruginosa ve Gram-pozitif Listeria monocytogenes ve buna karşılık gelen negatif kontroller olmak üzere iki bakteri türü test edildi. Sonuçlar, bu yaklaşımın yapışan bakterileri hızlı ve doğru bir şekilde numaralandırmasını ve deneysel iş yüklerini ve zaman çizelgelerini önemli ölçüde azalttığını göstermektedir.

Introduction

Bakteriyel yapışma, bakterilerin diğer hücrelere veya yüzeylere bağlandığı bir işlemdir. Bakteriyel patojenler tarafından enfeksiyonun başarılı bir şekilde kurulması, konak hücrelere yapışıklık, dokuların kolonizasyonu ve bazı durumlarda konak hücrelerin istilası1,2,3gerektirir. Ortaya çıkan bulaşıcı hastalıklar, son COVID-19 pandemisi4,5,6tarafından kanıtlanan büyük halk sağlığı tehditleri oluşturmaktadır. Daha da önemlisi, yeni veya gelişmekte olan patojenler genomik tabanlı yaklaşımlar kullanılarak kolayca ayırt edilemeyebilir, özellikle patojenin tespit edilmekten kaçınmak için tasarlandığı veya patojenik olarak tanımlayan genomik imzalar içermediği durumlarda. Bu nedenle, konak hücrelere bakteriyel yapışım gibi patojenliğin ayırt edici özelliklerini doğrudan değerlendiren yöntemler kullanılarak potansiyel patojenlerin tanımlanması patojen tanımlamasında kritik bir rol oynayabilir.

Konak hücrelere bakteriyel yapışma, onlarca yıldır bakteriyel patogenez mekanizmalarını değerlendirmek için kullanılmıştır1,7. Mikroskobik görüntüleme8,9 ve bakteriyel koloni oluşturan ünitenin (CFU) 10 ,11,12,13 enfeksiyon sonrası kaplama ile numaralandırılması, konak hücrelerin mikrobiyal yapışma ve/veya enfeksiyonunu test etmek için iyi geliştirilmiş iki laboratuvar yöntemidir14. Bakteri hücrelerinin mikrometre ölçek büyüklüğü göz önüne alındığında, yapışık bakteri hücrelerinin numaralandırılması genellikle gelişmiş yüksek büyütme mikroskopi tekniklerinin yanı sıra elektron mikroskopisi, genleşme mikroskopisi (ExM)15,16ve üç boyutlu görüntüleme dahil olmak üzere yüksek çözünürlüklü görüntüleme yaklaşımlarının kullanılmasını gerektirir17 . Alternatif olarak, konak hücrelere bağlı veya içselleştirilmiş bakterilerin numaralandırması, hasat edilen bakterilerin seyreltme serisini katı agar üzerine kaplayarak ve sonuçta elde edilen CFO'lar10 , 12,13sayarak gerçekleştirilebilir. Bu yöntem zahmetlidir ve yüksek verimli analizler için gerekli standartlaştırılmış veya otomatik bir prosedür oluşturmada zorluklar getiren birçok manuel adım içerir18,19. Bu nedenle, konak hücre ekini değerlendirmek için yeni yöntemlerin geliştirilmesi alandaki geçerli sınırlamaları giderir.

Burada, yüksek verimli görüntü işleme ve istatistiksel analiz ile birlikte otomatik yüksek verimli mikroskopi kullanan bu tür bir yöntem açıklanmıştır. Yaklaşımı göstermek için, pseudomonas aeruginosada dahil olmak üzere çeşitli bakteriyel patojenlerle deneyler yapıldı, insanların, hayvanların ve bitkilerin fırsatçı bir Gram-negatif bakteriyel patojeni14,20, sık sık konak savunma fonksiyonları bozulmuş hastaların solunum yollarını kolonileştirdiği tespit edildi. Bu yaklaşım, önceki çalışmalarda açıklanan mikroskobik görüntüleme sürecini optimize etti14,20. Görüntüleme algılaması, floresan etiketli konak hücreler ve bakteriler tarafından, bunların yakınlığını hızla izlemek için basitleştirildi ve bu da bakterileri ayırt etmek için yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmek için mikroskopi iş yükünü önemli ölçüde azalttı. Buna ek olarak, konak hücre ve bakterilerin sayımındaki görüntülerin otomatik istatistiksel analizi, konak hücre başına yapışık bakteri sayısının oranını tahmin etmek için bakteriyel CFU kaplamanın elden deneyinin yerini almıştır. Bu yöntemin uyumluluğunu doğrulamak için Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus ve Klebsiella pneumoniae gibi birden fazla bakteri türü ve konak hücre tipinin yanı sıra insan göbek ve damar endotel hücreleri (HUVEC) de test edilmiştir ve sonuçlar yöntemin çeşitliliğini ve etkinliğini desteklememektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. A549 hücre kültürü

  1. %10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş F-12K ortamında A549 hücre hattını koruyun ve 37 °C, %5 CO2'dekuluçkaya yatırın.
  2. Ortamı her 3-4 günde bir değiştirin ve % 85-% 95 izdiahta geçiş.
  3. Kısaca, hücreleri 1 x fosfat tamponlu salin (AKSI belirtilmedikçe pS, pH 7.4) ile durulayın ve 1 ml%0.25 Trypsin-0.53 mM etileniaminetetraasetik asit (EDTA) çözeltisi (hücre tabakasını batırarak) ile yaklaşık 2 dakika boyunca 37 °C'de tedavi edin.
  4. Proteaz aktivitesini durdurmak için ek 6 mL tam büyüme ortamı (F-12K orta + % 10 FBS) ekleyin. Daha sonra, steril bir polistiren T-75 doku kültürü şişeskindeki hücreleri 1:3-1:8 alt kültür oranında plakala. Kültürün son hacmi 12 mL'dir.
  5. Yapışma testlerinden bir gün önce 96 kuyu plakasının her kuyusuna yaklaşık 1 x 104 A549 hücresi (hücre konsantrasyonu: ~1 x 10 5 hücre/mL) tohumlayın.

2. Bakteriyel büyüme ve lekeleme

  1. Tüm bakteriyel çalışmaları biyogüvenlik kabini, Biyogüvenlik Seviye 2 laboratuvarında gerçekleştirin.
  2. P. aeruginosa (PAO1), Escherichia. coli, L. monocytogenes ve B. subtilis, vb. dahil olmak üzere tüm bakteri kültürlerini donmuş gliserol stoğundan aşılayın ve 37 °C'de bir gecede 250 r'de tutulan sarsıcı bir inkübatörde Tryptic Soy Broth'ta (TSB, 3 mL) yetiştirin.
  3. Ertesi gün, bir alt kültürü aşılamak için geceleme kültürünün 1:100 seyreltilmesini kullanın ve üstel faza 3 saat boyunca TSB'de (1 mL) yetiştirin, onaylamak için OD'yi 600 nm (OD600)olarak ölçün. OD600'ün 0,4-0,6 aralığında olduğundan eminolun.
  4. Bakteri-konak yapışma tahlilini gerçekleştirmeden önce, bakteriyel süspansiyonun plaka seri seyreltmeleri TSB-agar plakalarına, 37 ° C'de bir gecede kuluçkaya yatırın ve daha sonra bakteri cfo'larını koloni sayısından kurun. P. aeruginosaiçin,1.0'ın OD 600'ü 2 x 108 uygulanabilir bakteri hücrelerine /mL'ye ve L. monocytogenesiçin 1.0'ın600'ü 9 x 10 8 uygulanabilir bakteri hücrelerine /mL'ye karşılık gelir.
  5. Bakteri kültürlerini oda sıcaklığında (RT) 2 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüjleme ile üstel fazda hasat edin, ardından 1x PBS (1 mL) kullanarak bir kez yıkayın. Bakteri peletlerini 1 mL 1x PBS'de yeniden dirildi ve OD600 bakteri süspansiyonlarını ölçerek konsantrasyonları belirledi. Örneğin,0,5'in OD 600'üne sahip P. aeruginosa, 1 x 108 bakteri hücresi /mL konsantrasyonu temsil eder.
  6. Karanlıkta yumuşak dönüş ile 30 dakika boyunca RT'de yeşil veya kırmızı floresan boya kullanarak bakteri süspansiyonu lekelenin. Bunun için, boyayı 1 kat seyreltmek için 1 mL bakteriyel süspansiyona 500 kat konsantre stok boyama boyasının 2 μL'sini ekleyin. Boyama boyasını yıkamak için, lekeli bakterileri 2 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüj edin ve peleti 1 mL 1x PBS'de üç kez yeniden ıslatın.
    NOT: Deneyde floresan - (GFP-, RFP-, mCherry- vb.) etiketli bakteriler kullanılıyorsa, bu bakteriyel boyama adımını atlayın. Bu protokolde GFP etiketli P. aeruginosa ve kırmızı floresan boya lekeli L. monocytogenes kullanılmıştır.
  7. Lekeli bakteri hücrelerini veya GFP etiketli bakterileri 2 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüjleme ile toplayın. Taze F-12K ortamında (1 mL) yeniden dürt ve her kültürünOD 600'lerini ölçün. Daha sonra, enfeksiyonun çokluğuna (MOI) ve konak hücre konsantrasyonuna bağlı olarak kültürleri istenen konsantrasyonlara seyreltin. Bu deneyde kullanılan son hacim 500 μL'dir.
    NOT: Örneğin, Trypan Blue boyama kullanılarak sayılan konak hücre konsantrasyonu 1 x 105 hücre/mL ise, 100 MOI'de istenen bakteri hücresi konsantrasyonu 1 x 107 hücre/mL olacaktır. 0.5 OD 600'de P. aeruginosa konsantrasyonu1 x 10 8 /mL'dir. İstenilen konsantrasyonu elde etmek için, P. aeruginosa kültürünü 10 kat seyreltin, 450 μL taze F-12K ortama 50 μL resüspended kültür ekleyin.

3. Bakteriyel yapışma ve konak hücre boyama

  1. İlk olarak, tohumlu A549 hücre monolayerlerini ılık 1x PBS ile üç kez yıkayın. Her yıkama için, her kuyuya 100 μL 1x PBS ekleyin, üç kez hafifçe pipet yukarı ve aşağı, 1x PBS atın veya eklemeden sonra 10 s bekleyin ve ardından 1x PBS'yi çıkarmak için vakumlayın. Bakteri ilişkisinin kinetiğini belirlemek için, hücreleri farklı MTI'lerle (0, 1, 10 ve 100) istenen 100 μL bakteri süspansiyon konsantrasyonuna sahip kapla. Bakterileri 200 x g'da 10 dakika döndürün ve enfekte olmuş A549 hücrelerini 37 °C'de kuluçkaya yatırın, 1 saat daha% 5 CO2.
    NOT: Bu deneyde, her durumun teknik bir üçeye özeli vardı.
  2. Yukarıda açıklandığı gibi sıcak 1x PBS ile monolayerleri beş kez yıkayarak ilişkisiz bakterileri temizleyin. Hücreleri sabitlemek için 96 kuyu plakalarının her kuyusuna 100 μL% 4 formaldehit (1x PBS olarak) ekleyin. Plakaları 15 dakika boyunca buzun üzerine oturtun ve ardından 1x PBS kullanarak sabitleme çözeltisini üç kez yıkayın.
  3. Çekirdeği lekelemek için, 4′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) 50 ng / mL ekleyin ve RT'de 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, kuyuları 1x PBS kullanarak üç kez yıkayın. Kurumasını önlemek için enfekte olmuş A549 hücrelerini 100 μL 1x PBS ile örtün. Bir sonraki adım için işlem yapın veya plakayı karanlıkta 2 güne kadar 4 °C'de saklayın.

4. Otomatik floresan görüntüleme, işleme ve analiz

  1. Veri bütünlüğünü korumak için, görüntüleri 20x büyütmede yakalamak için her kuyunun beş konumunu rastgele ve manuel olarak seçin. Sırasıyla DAPI ve GFP kanalları altında A549 hücrelerinin ve bakterilerinin floresan görüntülerini yakalayın. Kırmızı floresan boya ile lekelenmiş bakteriler için PE-Cy5 kanalını kullanın.
  2. Daha iyi bir çözünürlüğe sahip olmak için, arka plan düzleştirme ve dekonvolüzyon için tüm görüntüleri işleyin. Görüntü dekonvolüyonunun nokta yayılma işlevini (PSF) hedefe göre yumuşatmak ve otomatik olarak ölçmek için parametreleri yuvarlanan topun 68 μm çapı olarak ayarlayın.
  3. Tüm nitelikli hücreleri ve bakterileri saymak için konak hücrelerin ve bakterilerin floresan yoğunluğunu ölçün ve konak hücre ve bakterilerin en zayıf floresan yoğunluğunu hücre sayısı eşikleri olarak ayarlayın. A549 hücresinin çapı 10,59-14,93 μm21olduğu için yapışan bakteri olarak 15 μm mesafedeki bir konak hücreye yakın tüm bakterileri sayın.
    NOT: Görüntüleme sistemindeki varsayılan bir ayar, çapları 5-100 μm arasında değişen konak hücreleri ve boyut (genişlik ve uzunluk) olarak 0,2-5 μm arasında değişen bakterileri seçici olarak sayar.
  4. Yukarıda belirtilen manuel görüntü işleme sonuçlarına bağlı olarak, otomatik görüntülerin geri kalanına görüntü yumuşatma, dekonvolüsyon, nesne boyutları, mesafe ve floresan yoğunluklarının parametrelerini uygulayın. Otomatik analizden sonra, bakteriyel yapışmayı belirlemek için toplam konak hücre sayıları, hücre boyutları ve şekilleri, toplam bakteri sayısı ve en önemli gösterge olan konak hücre başına ortalama bakteri sayısı gibi kritik okumaları göz önünde bulundurun.
  5. Veri ihracatı ve istatistiksel analiz
    1. Analiz edilen sonuçları tüm görüntülerden bir elektronik tabloya (ör. 'xlsx' biçimi) dışa aktarın. Otomatik sistem iki sonuç kümesi oluşturur: 1) her görüntüden ortalama yapışan bakteri sayısı; 2) tek bir hücreye yapışan bakteri sayısı, konak boyutu ve konak hücre ve bakterilerin ortalama floresan yoğunluğu gibi her bir konak hücrenin bilgilendirici verileri, ilgili görüntüden.
    2. Negatif kontrollere kıyasla bakteriyel yapışma seviyesini temsil etmek için tüm görüntülerden yapışık bakteri sayısının ortalama sayısını ve standart sapmasını hesaplayın. Bu yöntemde E. coli ve B. subtilis sırasıyla Gram-negatif ve Gram-pozitif bakteriyel yapışma testlerinde negatif kontrol görevi gördü. Üç bağımsız deney için tedavi genelinde veri noktaları arasında önemli bir varyasyon sınamak için iki yönlü ANOVA'lar gerçekleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Floresan görüntüleme bazlı bakteriyel yapışma testini geliştirmek için, P. aeruginosa suşu PAO1 ve negatif yapışma muadili E. coli, protokol etkinliğini test etmek için kullanıldı, çünkü bu bakterilerin A549 hücrelerine yapışma14,20,22bildirilmiştir. İlk olarak, GFP etiketli P. aeruginosa (PAO1) ve GFP etiketli E. coli, sırasıyla çeşitli MOI'lerde insan ölümsüzleştirilmiş epitel hücre hattı A549 ile birlikte inkübe edildi. Sonuçlar PAO1'in A549 hücrelerine doza bağımlı bir şekilde yapıştığı göstermiştir (Şekil 1A,B); bu arada, E. coli'nin neredeyse boş yapıştırlık da doğrulandı (Şekil 1A,B). Her MOI'de 50 görüntü yakalandı ve analiz edildi. üç bağımsız deneyden elde edilen önemli varyasyonları test etmek için iki yönlü ANOVA'lar gerçekleştirildi.

Figure 1
Şekil 1: Gram negatif bakteriyel P. aeruginosa, 1 saat içinde A549 hücrelerine yapışmış. (A) Görüntülerin 20x büyütme kullanılarak çekildiği bakteriyel yapışmalara genel bir bakış için mikroskobik görüntüler. PAO1 ve negatif yapışma kontrolü E. coli, belirtilen enfeksiyon çokluğunda (MTI' ler) A549 hücrelerine yapıştı. Bakteriler GFP-floresan etiketliydi. A549 hücre çekirdekleri DAPI tarafından lekelendi. Ölçek çubuğu 50 μm'dir. (B) A549 hücresi başına yapışan bakteri sayısının nicelemesi. Her MOI'de test edilen her bakteri suşu (PAO1 ve E. coli)için, her koşulda analize toplam 50 görüntü uygulandı. Veriler, üç bağımsız deneyin bir temsilcisinden standart sapma (SD) ± ortalamadır. İki yönlü ANOVA istatistiksel analizi yapıldı. * s < 0.05, *** p < 0.001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Gram-pozitif bakteriler, L. monocytogens23,24ve negatif kontrolü B. subtilis kullanıldığında da benzer sonuçlar gözlenmiştir (Şekil 2A, B). A549 hücrelerine bağlılık L. monocytogenes'te B. subtilis 'e göre anlamlıydı (Şekil 2A,B).

Figure 2
Şekil 2: Gram-pozitif bakteriyel L. monocytogenes, 1 saat içinde A549 hücrelerine yapışarak ko-inkübasyona neden oldu. (A) L. monocytogenes'egenel bir bakış için mikroskobik görüntüler ve negatif kontrol B. subtilis farklı MBI'lerdeki A549 hücrelerine yapışır. Bakteriler kırmızı floresan boya kullanılarak boyandı. A549 hücre çekirdekleri DAPI ile boyandı. Ölçek çubuğu 50 μm'dir. (B) A549 hücresi başına yapışan bakteri sayısının nicelemesi. Her MOI'de test edilen her bakteri suşu(L. monocytogenes ve B. subtilis)için her koşulda analize toplam 50 görüntü uygulanmıştır. Veriler, üç bağımsız deneyin temsilcisinden SD ± ortalamadır. İki yönlü ANOVA istatistiksel analizi yapıldı. ** s < 0.01, *** p < 0.001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Konağa bağlı P. aeruginosa segmentasyonunun ve sayımlarının temsili bir görüntüsü Şekil 3'te gösterilmiştir (Sarı maskeler: seçilen bakteriler, kırmızı anahat: tek bakteri sayısı). Hem ana bilgisayar hem de bakteri hedeflerinin ayarları Protokol bölümünde açıklanmıştır.

Figure 3
Şekil 3: Otomatik analiz sürecinde bakteri segmentasyonu ve sayımının örnek görüntüleri. (A) P. aeruginosa'nın mikroskobik görüntüleri, bakteri segmentasyonu ve sayımı olmadan 100 moi'de A549'a yapışmıştır. (B) Bakteriyel segmentasyon ve sayım istatistiksel analizinden sonra aynı görüntü. Sarı maskeler: seçilen bakteriler, kırmızı anahat: tek bakteri sayısı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Konak hücre boyutları ve alanları, bakteriyel ve konak hücre sayıları, konak hücre başına ortalama bakteri sayısı, konak hücre sağlığının durumunu, bakteri bağlılığı seviyesini ve bakteriyel sitotoksisiteyi temsil eden otomatik analizlerin sonuçları Tablo 1 ve Tablo 2'delistelenmiştir. Tablo 1, farklı görüntülerden ortalama hücresel düzeydeki yapışan bakteri sayısını temsil ederken, Tablo 2 tek bir A549 hücresel düzeyde bir görüntüde analiz edilen yapışan bakteri sayısını temsil eder. Bu temsili görüntüler, PAO1 tarafından enfekte edilen A549 hücrelerinden 100 MOI'de çekildi. Şekil 3'teki ilk görüntünün analiz edilen sonuçları Tablo 1 ve Tablo 2'deResim 1 olarak listelenmiştir.

Tablo 1: Hücresel düzeyde 9 temsili görüntü istatistiksel analiz sonuçları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Her görüntüde, konak toplam sayısı ve bakteri toplam noktaları, sırasıyla yukarıda açıklanan parametrelere dayanarak sistem tarafından tanınan konak çekirdeklerinin ve toplam bakteri sayısının toplam sayılarını temsil eder. Ek olarak, bakteri lekeleri oranının otomatik olarak hesaplanması, bakteri toplamı lekeleri / konak toplam sayımından elde edilen konak hücre başına ortalama bakteri sayısını temsil eder. Ayrıca, ek okumalar da dahil edilebilir; örneğin, bakteriye bağlı konak sayısı, konak-bakteri yapışması evrensel veya spesifik olgusunu göstermektedir. Bakteriye bağlı konak sayısı konak toplam sayılarından çok daha az olduğunda, buna karşılık, konak başına ortalama bakteri sayısı nispeten yüksektir, bu da bu tür bir yapışma fenotipinin önemli bir heterojenliğe sahip olduğunu temsil eder.

Tablo 2: Temsili bir görüntünün tek hücresel istatistiksel analizi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tekil hücre analizi, diğer bakteriyel özellikleri toplarken ve üzerinde çalışılan bir Makine Öğrenimi modeli gibi potansiyel bakteri patojenitesini değerlendirmede daha güçlü bir araç geliştirmek için otomatik hesaplama analizine uygularken daha yararlı olan her görüntüdeki konak hücre ve bakteri hedefleri hakkında daha fazla ayrıntı sağlar. Bu protokolde, konak boyutu ve alanı her lekeli konak çekirdeğinin çaplarını ve alanlarını temsil eder ve konak floresan yoğunluğu lekeli çekirdeğin ortalama yoğunluğunu temsil eder. Bakteriyel nokta sayısı ve alanı, her konak hücreye ve bunların toplam alanlarına yapışan bakteri hedeflerini temsil eder. Bakteriyel floresan yoğunluğu, tüm yapışan bakterilerin ortalama yoğunluğunu temsil eder.

Bazı virülan bakterilerin A549'a yapışmaması şaşırtıcı değildir, ancak yüksek bakteriyel yapışma seviyelerine sahip bazı bakteriler mutlaka patojeniklikle ilişkili değildir. Bu yöntemin uygulanmasını en üst düzeye çıkarmak için farklı bir konak hücre türü olan HUVEC'ler de sınanmıştır. Sonuçlar bakterilerin etkili saptanma ve farklı yapışma fenotiplerini göstermiştir (Şekil 4). Farklı konak hücreler potansiyel bakteriyel patojenlerin tahminini artırabilir; örneğin, patojenik Serratia rubidaea ve Streptococcus agalactiae HUVEC'e bağlıydı, ancak A549 hücrelerine bağlı değildi (Şekil 4). Ayrıca, sitotoksik Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) A549 veya HUVEC'e bağlı değildi (Şekil 4). Bu nedenle, yöntemin konak-bakteri etkileşimlerinin özgüllüğüne yanıt vermek için birden fazla konak hücre tipi için uygun olduğundan emin olmak önemlidir. Hem A549 hem de HUVEC hücreleri 1 saat boyunca 37 °C'de 100 MOI'de bakterilerle birlikte inkübe edildi.

Figure 4
Şekil 4: Konak A549 ve HUVEC hücrelerine bakteriyel yapışma özgüllüğü. S. rubidaea, S. agalactiae, sitotoksik Enterohemorrhagic E dahil olmak üzere bakteri suşları. coli (EHEC), PAO1, P. aeruginosa ΔpilA (PAO-NP), E. coli, S. aureus ve S. aureus ΔsaeR, 37 °C'de 1 saat birlikte inkübasyon için 100 MOI, %5 CO2ile hem A549 hem de HUVEC hücreleri üzerinde test edildi. Bakteriler kırmızı floresan boya ile boyanmış. Üç bağımsız deneyde 45 görüntü/bakteri türü ile yandaş bakteri sayısı ölçülmektedir. Veriler, üç bağımsız deneyin bir temsilcisinden SD ± ortalamadır. * s < 0.05, *** p < 0.001, **** s<0.0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokol, konak hücrelere bakteriyel bağlanmayı numaralandırmak için otomatik bir yaklaşım açıklar. Açıklanan yaklaşımın geleneksel yöntemlere göre birkaç çekici avantajı vardır. İlk olarak, bu yaklaşım, tek tek konak hücrelere bağlı mikrobiyal patojen hücrelerinin sayısının kesin olarak ölçülmesini sağlar. Daha da önemlisi, bu niceleme zahmetli bakteriyel hasat, seri seyreltmeler, katı ortamlarda kaplama ve CFO10, 11,12tayini gerekmeden gerçekleştirilebilir. Bu nedenle, açıklanan teknik bakteriyel yapıştığı ölçmek için gereken genel iş yükünü azaltır. Bu süreci düzenleyen mutant veya CRISPR kütüphanelerinde sırasıyla bakteriyel veya konak genlerinin tanımlanması da dahil olmak üzere büyük ölçekli tarama deneylerinde yapışma fenotiplerini tespit etmeye çalışırken önerilen yaklaşımın avantajlarının arttırıldığu takdir edilmelidir. İkinci olarak, floresan mikroskopi kullanılarak konak ve bakteri hücreleri arasındaki etkileşimlerin doğrudan değerlendirilmesi, konak veya bakteri hücresi sağkalımında, morfolojisinde veya dinamiklerinde değişiklikler de dahil olmak üzere bakteriyel patojenite mekanizmalarını emmek için bilgi sağlar. Son olarak, analizde toplanan görüntüler üzerinde yapılan otomatik istatistiksel analiz, sadece konak hücrelerle ortalama bakteri ilişkisinin genel bir nicelliğini sağlamakta, aynı zamanda dinamik, tek hücreli, konak-patojen etkileşimlerinin değerlendirilmesini de sağlamaktadır.

Bu avantajlara rağmen, açıklanan yöntemlerin bazı önemli sınırlamaları vardır. İlk olarak, bakterilerin floresan lekelenmeleri konak hücrelere yapışmalarını numaralandırmak için gereklidir. Bu nedenle, floresan boyama boyası, bakterileri konak hücre meslektaşlarından seçici olarak lekelemektedir. Ek olarak, boyama boyası onu taşıyan bakterilerin bağlanma fenotipini değiştirmemelidir. Bu nedenle, bakteriyel floresan boyamanın optimizasyonu (örneğin konsantrasyon, lekelenme süresi) açıklanan yapışma çalışmalarının yapılmasından önce belirlenmelidir. Bu protokolde, P. aeruginosa, L. monocytogenes, E. coli ve B. subtilis dahil olmak üzere bakteri türlerinin 30 dakika boyunca floresan boyanması konak hücrelere yapışmalarını etkilemez. İkincisi, farklı konak-bakteri etkileşimlerinin özgüllüğü nedeniyle, konak hücrelere bakteriyel bağlanmayı değerlendirmek için tek bir konak hücre tipi yeterli olmayabilir. Bu nedenle, belirli bir mikrobun konak hücre yüzeylerine yapışabilme derecesini tam olarak anlamak için birden çok ana bilgisayar hücre türü gerekebilir. Üçüncü olarak, bakteri segmentasyonu, bakterilerin ko-inkübasyon sırasında toplanmasına neden olduğunda, örneğin S. aureusveya bakteriler daha yüksek bir MOI'de (>100) kümeler oluşturduğunda, örneğin P. aeruginosatam olarak verimli değildi. Bu durumda, görüntüleri yakalamak için daha yüksek bir büyütme uygulanmalıdır veya analizde bakteri toplama etkisini azaltmak için daha fazla görüntü kullanılmalıdır.

Konak hücre tipine göre yaklaşımın plastisitesini göstermek için yapılan çalışmalarda insan akciğer epitel hücreleri (A549) ve HUVEC'ler kullanıldı ve her ikisi de bakteriyel yapışmaya karşı yüksek düzeyde duyarlılık gösterdi. İki konak hücre tipinin kullanımı, açıklanan yöntemin, bağlı konak-bakteri etkileşimlerini hızla karakterize etmek için yaygın olarak uygulanabileceğini göstermiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Tüm yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Acknowledgments

Biotek A.Ş.'den Dr. Kaite Zlotkowski'ye teknik destekleri için minnettarız. Bu çalışma Savunma Bakanlığı tarafından W911NF1920013 sözleşme numarası altında PDF, Savunma İleri Araştırma Projeleri Ajansı (DARPA) ve İçişleri Bakanlığı tarafından PDF'ye 140D6319C0029 sözleşme numarası altında desteklenmiştir. Bilgilerin içeriği mutlaka Hükümetin konumunu veya politikasını yansıtmaz ve resmi bir onay çıkarılmamalıdır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x PBS VWR 45001-130
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher 62248 Host cell staining dye
96 well plate Corning 3882 Half area well, flat clear bottom
A549 cells ATCC  CCL 185 Mammalian cell line
BactoView Live Red Biotium 40101 Bacteria staning dye
Centrifuge Eppendorf 5810R
CFSE cell division tracker BioLegend 423801
Cytation 5  BioTek Cytation 5  Cell imaging multi-mode reader
E. coli Laboratory stock 
EGM bulletKit Lonza CC-3124 HUVEC cell culture medium
EHEC NIST collections
F-12k medium ATCC  302004 A549 cell culture medium
Fetal bovine serum Corning 35-016-CV
HUVEC Laboratory stock 
L. monocytogenes NIST collections
OD600 DiluPhotometer IMPLEN
P. aeruginosa Dr. Lori Burrows laboratory stock
P. aeruginosa ΔpilA Dr. Lori Burrows laboratory stock
S. agalactiae NIST collections
S. aureus BEI NR-46543
S. aureus ΔsaeR BEI NR-48164
S. rubidaea NIST collections
Typical soy broth Growcells MBPE-4040

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Bacterial adhesion and entry into host cells. Cell. 124, 715-727 (2006).
  2. Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Médecine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).
  3. Josse, J., Laurent, F., Diot, A. Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms. Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).
  4. Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Craxì, A. SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver. Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).
  5. Ortiz-Prado, E., et al. Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094 (2020).
  6. Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19. Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).
  7. Woo, V., et al. Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression. Frontiers in Immunology. 10, 928 (2019).
  8. Pandey, A., et al. Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection. Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).
  9. Ding, S., et al. Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes. iScience. 24 (3), 102192 (2021).
  10. Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110 (2008).
  11. Qin, Q. M., et al. Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans. PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078 (2011).
  12. Qin, Q. M., et al. A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240 (2020).
  13. Pandey, A., et al. Activation of host IRE1α-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103 (2018).
  14. Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells. Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).
  15. Götz, R., et al. Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy. Nature Communications. 11, 6173 (2020).
  16. Lim, Y., et al. Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy. PLOS Biology. 17 (10), 3000268 (2019).
  17. Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60350 (2019).
  18. Hoffmann, S., et al. High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43 (2018).
  19. Hazan, R., Que, Y. -A., Maura, D., Rahme, L. G. A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates. BMC Microbiology. 12 (1), 259 (2012).
  20. Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).
  21. Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).
  22. Farinha, M. A., et al. Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice. Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).
  23. Réglier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes. Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).
  24. Ortega, F. E., et al. Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells. Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 175

Erratum

Formal Correction: Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells
Posted by JoVE Editors on 02/08/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

to:

Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

Konak Hücrelere Bakteriyel Yapışmanın Otomatik, Yüksek Verimli Tespiti
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, J., Qin, Q. M., Van Schaik,… More

Yang, J., Qin, Q. M., Van Schaik, E., Samuel, J. E., de Figueiredo, P. Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells. J. Vis. Exp. (175), e62764, doi:10.3791/62764 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter