Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Automatiserad, hög genomströmningsdetektering av bakteriell efterlevnad av värdceller

Published: September 17, 2021 doi: 10.3791/62764
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center, 2College of Veterinary Medicine, Texas A&M University

ERRATUM NOTICE

Summary

Detektion av värd-bakteriell patogen interaktioner baserat på fenotypisk vidhäftning med hjälp av hög genomströmning fluorescens märkning märkning imaging tillsammans med automatiserade statistiska analys metoder möjliggör snabb utvärdering av potentiella bakteriella interaktioner med värdceller.

Abstract

Identifiering av framväxande bakteriella patogener är avgörande för människors hälsa och säkerhet. Bakteriell följsamhet till värdceller är ett viktigt steg i bakteriella infektioner och utgör ett kännetecken för potentiellt hot. Därför kan undersökning av vidhäftningen av bakterier till värdceller användas som en komponent i bakteriell hotbedömning. En standardmetod för att räkna upp bakteriell vidhäftning till värdceller är att samtidigt inkubera bakterier med värdceller, skörda de vidhäftande bakterierna, plätera de skördade cellerna på fasta medier och sedan räkna de resulterande kolonibildande enheterna (CFU). Alternativt kan bakteriell vidhäftning till värdceller utvärderas med hjälp av immunofluorescensmikroskopibaserade metoder. Konventionella strategier för att genomföra dessa metoder är dock tidskrävande och ineffektiva. Här beskrivs en nyligen utvecklad automatiserad fluorescensmikroskopibaserad avbildningsmetod. I kombination med bildbehandling med hög genomströmning och statistisk analys möjliggör metoden snabb kvantifiering av bakterier som håller sig till värdceller. Två bakteriearter, gramnegativa Pseudomonas aeruginosa och grampositiva Listeria monocytogenes och motsvarande negativa kontroller, testades för att påvisa protokollet. Resultaten visar att detta tillvägagångssätt snabbt och exakt räknar upp vidhäftande bakterier och avsevärt minskar experimentella arbetsbelastningar och tidslinjer.

Introduction

Bakteriell vidhäftning är en process där bakterier fäster vid andra celler eller ytor. Framgångsrik etablering av infektion av bakteriella patogener kräver vidhäftning för att vara värdceller, kolonisering av vävnader och i vissa fall invasion av värdceller1,2,3. Nya infektionssjukdomar utgör stora hot mot folkhälsan, vilket framgår av den senaste covid-19-pandemin4,5,6. Viktigt är att nya eller framväxande patogener inte lätt kan urskiljas med hjälp av genomiska metoder, särskilt i fall där patogenen har konstruerats för att undvika upptäckt eller inte innehåller genomiska signaturer som identifierar den som patogen. Därför kan identifiering av potentiella patogener med metoder som direkt bedömer kännetecken för patogenicitet, som bakteriell vidhäftning till värdceller, spela en avgörande roll i patogenidentifiering.

Bakteriell vidhäftning till värdceller har använts för att utvärdera mekanismer för bakteriell patogenes i årtionden1,7. Mikroskopisk avbildning8,9 och uppräkning av bakteriell kolonibildande enhet (CFU)10,11,12,13 genom plätering efter infektion är två välutvecklade laboratoriemetoder för testning av mikrobiell vidhäftning och/eller infektion i värdceller14. Med tanke på bakteriecellernas mikrometerskala kräver uppräkningen av de vidhäftande bakteriecellerna i allmänhet användning av avancerade mikroskopitekniker med hög förstoring, liksom högupplösta avbildningsmetoder, inklusive elektronmikroskopi, expansionsmikroskopi (ExM)15,16och tredimensionell avbildning17 . Alternativt kan uppräkning av bakterier som är bundna till eller internaliserade i värdceller utföras genom att plätera utspädningsserien av skördade bakterier på fast agar och räkna de resulterande CFUs10,12,13. Denna metod är mödosam och innehåller många manuella steg, vilket introducerar svårigheter att upprätta en standardiserad eller automatiserad procedur som krävs för analyser med hög genomströmning18,19. Därför skulle utvecklingen av nya metoder för utvärdering av värdcellbilaga ta itu med aktuella begränsningar i fältet.

En sådan metod beskrivs här som använder automatiserad hög genomströmningsmikroskopi, kombinerat med bildbehandling med högt genomströmning och statistisk analys. För att demonstrera tillvägagångssättet utfördes experiment med flera bakteriella patogener, inklusive Pseudomonas aeruginosa, en opportunistisk gramnegativ bakteriell patogen hos människor, djur och växter14,20, som ofta finns för att kolonisera andningsorganen hos patienter med nedsatt värdförsvarsfunktioner. Detta tillvägagångssätt optimerade den mikroskopiska avbildningsprocessen som beskrivs i tidigare studier14,20. Bildframställningsdetekteringen förenklades av fluorescensmärkta värdceller och bakterier för att snabbt spåra närheten till dem, vilket dramatiskt minskade mikroskopibelastningen för att få högupplösta bilder för att särskilja bakterier. Dessutom ersatte den automatiserade statistiska analysen av bilder vid räkning av värdceller och bakterier det hand-on experimentet med bakteriell CFU-plätering för att uppskatta förhållandet mellan vidhäftande bakterieantal per värdcell. För att bekräfta kompatibiliteten hos denna metod har flera bakteriestammar och värdcelltyper också testats, som Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus och Klebsiella pneumoniae, liksom mänskliga navelvensendotelceller (HUVECs), och resultaten stöder metodens mångfald och effektivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. A549 cellkultur

  1. Behåll A549-cellinjen i F-12K medium kompletterat med 10% fetalt bovin serum (FBS) och inkubera vid 37 °C, 5% CO2.
  2. Byt medium var 3-4 dagar och passage vid 85%-95% confluency.
  3. Skölj kort cellerna med 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7.4, om inget annat anges) och behandla med 1 ml trypsin-0,53 mM etylendiamintetraacetic acid (EDTA) lösning (nedsänkning av cellskiktet) i ca 2 min vid 37 °C.
  4. Lägg till ytterligare 6 ml komplett tillväxtmedium (F-12K medium + 10% FBS) för att stoppa proteasaktiviteten. Plätera sedan cellerna i en steril polystyren T-75 vävnadsodlingskolv med ett subkultureringsförhållande på 1:3-1:8. Den slutliga volymen av kultur är 12 mL.
  5. Frö cirka 1 x 104 A549 celler (cellkoncentration: ~ 1 x 105 celler / ml) på varje brunn på en 96-brunnsplatta en dag före vidhäftningsanalyserna.

2. Bakteriell tillväxt och färgning

  1. Utför allt bakteriellt arbete i ett biosäkerhetsskåp, Biosafety Level 2-laboratorium.
  2. Inokulera alla bakteriekulturer, inklusive P. aeruginosa (PAO1), Escherichia. coli, L. monocytogenes och B. subtilis, etc., från det frusna glycerolbeståndet och odla dem i tryptisk sojabuljong (TSB, 3 ml) i en skakinkubator vid 37 °C över natten bibehållen vid 250 varv/min.
  3. Nästa dag, använd en 1:100 utspädning av nattkulturen för att inokulera en subkultur och odla dem i TSB (1 mL) i 3 timmar till den exponentiella fasen, mät OD vid 600 nm (OD600) för att bekräfta. Se till att OD600 ligger i intervallet 0,4-0,6.
  4. Innan du utför bakterievärdens vidhäftningsanalys, pläterar seriella utspädningar av bakteriell suspension på TSB-agarplattor, inkuberar dem över natten vid 37 °C och etablerar sedan bakteriella CFUs från antalet kolonier. För P. aeruginosamotsvarar en OD600 av 1,0 2 x 108 livskraftiga bakterieceller/ml, och för L. monocytogenesmotsvarar en OD600 av 1,0 9 x 108 livskraftiga bakterieceller/ml.
  5. Skörda bakteriekulturerna i exponentiell fas genom centrifugering vid 13 000 x g i 2 min vid rumstemperatur (RT) och tvätta dem sedan en gång med 1x PBS (1 mL). Återanvänd bakteriepelletsen i 1 ml 1x PBS och bestäm koncentrationerna genom att mäta OD600 av bakteriella suspensioner. Till exempel representerar P. aeruginosa med OD600 av 0,5 en koncentration av 1 x 108 bakterieceller/ml.
  6. Färga bakteriesuspensionen med antingen ett grönt eller ett rött fluorescerande färgämne på RT i 30 minuter med mild rotation i mörkret. Tillsätt för detta 2 μL av det 500-faldiga koncentrerade buljongfärgningsfärgämnet i 1 ml bakteriesuspension för att späda färgämnet 1-faldigt. För att tvätta av färgämnet, centrifugera de färgade bakterierna vid 13 000 x g i 2 min och återanvänd pelleten i 1 ml 1x PBS i tre gånger.
    OBS: Om fluorescens- (GFP-, RFP-, mCherry-, etc.) taggade bakterier används i experimentet, hoppa sedan över detta bakteriella färgningssteg. GFP- taggade P. aeruginosa och röda fluorescerande färgämne-färgade L. monocytogenes användes i detta protokoll.
  7. Samla de färgade bakteriecellerna eller GFP-märkta bakterierna genom centrifugering vid 13 000 x g i 2 minuter. Resuspend i färskT F-12K medium (1 mL) och mät OD600 för varje kultur. Späd upp kulturerna till önskade koncentrationer baserat på multiplikiteten av infektion (MOI) och värdcellkoncentration. Den slutliga volymen som används i detta experiment är 500 μL.
    OBS: Om värdcellkoncentrationen som räknas med Trypan Blue-färgning till exempel är 1 x 105 celler/ml, kommer den önskade koncentrationen av bakterieceller vid en MOI på 100 att vara 1 x 107 celler/ml. Koncentration av P. aeruginosa vid 0,5 OD600 är 1 x 108/mL. För att uppnå önskad koncentration, späd P. aeruginosa-kulturen 10-faldigt, tillsätt 50 μL återsuspenderad odling till 450 μL färskt F-12K-medium.

3. Bakteriell vidhäftning och värdcellfärgning

  1. Tvätta först de sådda A549-cellsmonolayers tre gånger med varm 1x PBS. För varje tvätt, tillsätt 100 μL 1x PBS till varje brunn, rör försiktigt upp och ner tre gånger, kassera 1x PBS eller vänta i 10 s efter tillsats och dammsug sedan för att ta bort 1x PBS. För att bestämma kinetiken hos bakteriell association, överlagra cellerna med 100 μL önskade koncentrationer av bakteriell suspension med olika MOI (0, 1, 10 och 100). Snurra ner bakterierna vid 200 x g i 10 min och inkubera de infekterade A549-cellerna vid 37 °C, 5% CO2 i ytterligare 1 h.
    OBS: I detta experiment hade varje tillstånd en teknisk tredubbel.
  2. Ta bort de obundna bakterierna genom att tvätta monoskikten fem gånger med varm 1x PBS enligt beskrivningen ovan. Tillsätt 100 μL 4% formaldehyd (i 1x PBS) i varje brunn av 96-brunnsplattorna för att fixa cellerna. Låt plattorna sitta på is i 15 minuter och tvätta sedan av fixeringslösningen med 1x PBS tre gånger.
  3. För att färga atomkärnorna, tillsätt 50 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) och inkubera den i 10 min vid RT. Tvätta brunnarna tre gånger efter inkubation med 1x PBS. Täck de infekterade A549-cellerna med 100 μL 1x PBS för att undvika torkning. Bearbeta för nästa steg eller förvara plattan vid 4 °C i upp till 2 dagar i mörker.

4. Automatiserad fluorescensavbildning, bearbetning och analys

  1. För att upprätthålla dataintegriteten väljer du slumpmässigt och manuellt fem platser för varje brunn för att fånga bilderna vid 20x förstoring. Fånga fluorescerande bilder av A549-celler och bakterier under DAPI respektive GFP-kanaler. Använd PE-Cy5-kanalen för de bakterier som färgas av det röda fluorescerande färgämnet.
  2. För att få en bättre upplösning bearbetar du alla bilder för bakgrunds förenkling och dekonvolution. Ställ in parametrarna som 68 μm diameter på den rullande kulan för utjämning och automatiskt mäta punktspridningsfunktionen (PSF) för bilddekonvolution baserat på målet.
  3. För att räkna alla kvalificerade celler och bakterier, mät fluorescensintensiteten hos värdcellerna och bakterierna och ställ in den svagaste fluorescensintensiteten hos värdceller och bakterier som tröskelvärden för cellantal. Räkna alla bakterier som proximat till en värdcell inom 15 μm avstånd som de vidhäftande bakterierna som diametern på A549 cell är 10,59-14,93 μm21.
    OBS: En standardinställning i bildsystemet räknar selektivt värdcellerna med diametrar från 5-100 μm och bakterier från 0,2-5 μm i storlek (bredd och längd).
  4. Baserat på ovanstående manuella bildbehandlingsresultat tillämpar du parametrarna för bildutjämning, dekonvolution, objektstorlekar, avstånd och fluorescensintensiteter på resten av de automatiserade bilderna. Efter den automatiserade analysen bör du överväga kritiska avläsningar, till exempel totala antal värdceller, cellstorlekar och former, totalt bakterieantal och det genomsnittliga antalet bakterier per värdcell, vilket var den viktigaste indikatorn, för att bestämma bakteriell vidhäftning.
  5. Dataexport och statistisk analys
    1. Exportera de analyserade resultaten från alla bilder till ett kalkylblad (t.ex. xlsx-format). Det automatiserade systemet genererar två uppsättningar resultat: 1) det genomsnittliga vidhäftande bakterieantalet från varje bild; 2) informativa data för varje enskild värdcell, såsom vidhäftande bakterieantal på en enda cell, värdstorlek och den genomsnittliga fluorescensintensiteten hos värdcell och bakterier, från motsvarande bild.
    2. Beräkna medelvärdet och standardavvikelsen för vidhäftande bakterieantal från alla bilder för att representera bakteriens vidhäftningsnivå jämfört med negativa kontroller. I denna metod fungerade E. coli och B. subtilis som negativa kontroller vid testning gramnegativ respektive grampositiv bakteriell vidhäftning. Utför tvåvägs ANOVAs för att testa för betydande variation mellan datapunkter mellan behandling för tre oberoende experiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att utveckla den fluorescensavbildningsbaserade bakterieupplevnadsanalysen användes P. aeruginosa stam PAO1 och dess negativa vidhäftningsmotsvarighet E. coli för att testa protokollets effektivitet, eftersom vidhäftningen av dessa bakterier till A549-celler hade rapporterats14,20,22. För det första var GFP- märkt P. aeruginosa (PAO1) och GFP-märkta E. coli co-incubated med en human odödlig epitelial cellinje A549 vid olika MOIs, respektive. Resultaten visade att PAO1 höll sig till A549-celler på ett dosberoende sätt (figur 1A,B); Under tiden kontrollerades även E. colis nära upphävande(figur 1A,B). Det fanns 50 bilder tagna och analyserade vid varje MOI. Tvåvägs ANOVAs utfördes för att testa de betydande variationerna från tre oberoende experiment.

Figure 1
Figur 1: Gramnegativ bakteriell P. aeruginosa vidhäftade A549-celler inom 1 h från saminkubation. (A) Mikroskopiska bilder för en översikt över bakteriell vidhäftning där bilderna togs med 20x förstoring. PAO1 och den negativa vidhäftning kontroll E. coli följde A549 celler vid den angivna multiplicity av infektioner (MOIs). Bakterier var GFP-fluorescens taggade. A549 cellkärnor var färgade av DAPI. Skalstången är 50 μm. (B) Kvantifiering av vidhäftande bakterieantal per A549-cell. För varje testad bakteriestam (PAO1 och E. coli)i varje MOI applicerades totalt 50 bilder på analysen vid varje tillstånd. Data är medelvärde ± standardavvikelse (SD) från en representant för tre oberoende experiment. Tvåvägs ANOVA statistiska analys utfördes. * p < 0,05, *** p < 0,001. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Liknande resultat observerades också när grampositiva bakterier, L. monocytogens23,24 och dess negativa kontroll B. subtilis, användes ( figur2A,B). Vidhäftningen till A549 celler var betydande i L. monocytogenes än B. subtilis (figur 2A,B).

Figure 2
Figur 2: Grampositiva bakteriella L. monocytogenes som följs vid A549-celler inom 1 h från saminkubation. ( A) Mikroskopiska bilder för en översikt över L. monocytogenes, liksom den negativa kontrollen B. subtilis adherence till A549 celler vid olika MOIs. Bakterier färgades med hjälp av ett röd-fluorescerande färgämne. A549 cell atomkärnor var färgade med DAPI. Skalstången är 50 μm. (B) Kvantifiering av vidhäftande bakterieantal per A549-cell. För varje testad bakteriestam (L. monocytogenes och B. subtilis) i varje MOI applicerades totalt 50 bilder på analysen vid varje tillstånd. Data är medelvärde ± SD från en representant för tre oberoende experiment. Tvåvägs ANOVA statistiska analys utfördes. ** p < 0,01, *** p < 0,001. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

En representativ bild av värd-anhängare P. aeruginosa segmentering och antal visas i figur 3 (Gula masker: utvalda bakterier, röd kontur: enda bakteriell räkning). Inställningarna för både värd- och bakteriemål beskrivs i avsnittet Protokoll.

Figure 3
Bild 3: Exempelbilder av bakteriell segmentering och räkning i den automatiserade analysprocessen. (A) Mikroskopiska bilder av P. aeruginosa vid en MOI på 100 utan bakteriell segmentering och räkning. B) Samma bild efter den statistiska analysen av bakteriell segmentering och räkning. Gula masker: utvalda bakterier, röd kontur: enda bakterieantal. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Resultaten av de automatiserade analyserna, inklusive värdcellsstorlekar och områden, antalet bakterie- och värdceller, liksom de genomsnittliga bakterieantalen per värdcell, som representerar statusen för värdcellshälsa, bakterieefterlevnadsnivå och bakteriell cytotoxicitet, listas i tabell 1 och tabell 2. Tabell 1 representerar de vidhäftande bakterieantalen på en genomsnittlig cellnivå från olika bilder, medan tabell 2 representerar vidhäftande bakterieantal analyserade på en bild på en enda A549-cellnivå. Dessa representativa bilder togs från A549 celler infekterade av PAO1 vid en MOI på 100. De analyserade resultaten av den första bilden i figur 3 listades som bild 1 i tabell 1 och tabell 2.

Tabell 1: Statistiska analysresultat av 9 representativa bilder på cellnivå. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

I varje bild representerar värdens summaantal och bakteriella summafläckar de totala antalet värdkärnor och totala bakterieantal som känns igen av systemet baserat på de parametrar som beskrivs ovan. Dessutom representerar den automatiska beräkningen av bakteriefläckförhållandet det genomsnittliga bakterieantalet per värdcell, härlett från bakteriesummorna/värdsummorna. Dessutom kan ytterligare avläsningar också inkluderas; Till exempel illustrerar de bakterieföljande värdantalen det universella eller specifika fenomenet med värdbakteriers vidhäftning. När antalet bakterieföljande värden är mycket mindre än värdsummorna är däremot det genomsnittliga bakterieantalet per värd relativt högt, vilket representerar att sådan vidhäftning fenotyp har en betydande heterogenitet.

Tabell 2: En enda cellulär statistisk analys av en representativ bild. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Singular cellanalys ger mer information om värdcells- och bakteriemål i varje bild, vilket är mer användbart när man samlar in andra bakteriefunktioner och tillämpar dem på den automatiserade beräkningsanalysen för att utveckla ett kraftfullare verktyg för att utvärdera den potentiella bakteriella patogeniciteten, som en maskininlärningsmodell som studeras. I detta protokoll representerar värdstorleken och området diametern och områdena för varje betsad värdkärnor, och värdfluorescensintensiteten representerar den genomsnittliga intensiteten hos de färgade kärnorna. Bakteriellt spotantal och område representerar de vidhäftande bakteriella målen för varje värdcell och deras totala områden. Bakteriell fluorescensintensitet representerar den genomsnittliga intensiteten hos alla vidhäftande bakterier.

Det är inte förvånande att vissa virulenta bakterier inte höll sig till A549 medan vissa bakterier med höga nivåer av bakteriell vidhäftning inte nödvändigtvis korrelerar med patogenicitet. En annan värdcellstyp, HUVECs, testades också för att maximera tillämpningen av den här metoden. Resultaten visade effektiv detektion och de olika vidhäftande fenotyperna av bakterier (figur 4). Olika värdceller kan öka uppskattningen av potentiella bakteriella patogener; Patogena Serratia rubidaea och Streptococcus agalactiae var till exempel anhängare till HUVEC men inte till A549 celler (figur 4). Dessutom var den cytotoxiska Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) inte vidhäftande till antingen A549 eller HUVEC (figur 4). Därför är det viktigt att se till att metoden är lämplig för flera värdcellstyper för att svara på specificiteten hos värd-bakterieinteraktioner. Både A549 och HUVEC celler var co-inkuberade med bakterier vid en MOI på 100 vid 37 °C för 1 h.

Figure 4
Figur 4: Specificitet av bakteriell följsamhet till värd A549- och HUVEC-celler. Bakteriestammarna, inklusive S. rubidaea, S. agalactiae, cytotoxiska Enterohemorrhagic E. coli (EHEC), PAO1, P. aeruginosa ΔpilA (PAO-NP), E. coli, S. aureus och S. aureus ΔsaeR, testades på både A549 och HUVEC-celler vid en MOI på 100 för 1h. Bakterier färgades med ett röd-fluorescerande färgämne. Vidhäftande bakteriella räkningar kvantifierades från 45 bilder/bakteriell stam i tre oberoende experiment. Data är medelvärde ± SD från en representant för tre oberoende experiment. * p < 0,05, *** p < 0,001, **** s<0,0001. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollet beskriver en automatiserad metod för att räkna upp bakteriell bilaga till värdceller. Det beskrivna tillvägagångssättet har flera attraktiva fördelar jämfört med konventionella metoder. För det första möjliggör detta tillvägagångssätt exakt kvantifiering av antalet mikrobiella patogenceller som är kopplade till enskilda värdceller. Viktigt är att denna kvantifiering kan utföras utan behov av mödosam bakteriell skörd, seriella utspädningar, plätering på fasta medier och bestämning av CFUs10,11,12. Som sådan minskar den beskrivna tekniken den totala arbetsbelastningen som krävs för att kvantifiera bakteriell vidhäftning. Det bör uppskattas att fördelarna med det föreslagna tillvägagångssättet förstärks när man försöker upptäcka vidhäftande fenotyper i storskaliga screeningexperiment, inklusive identifiering av bakteriella eller värdgener i mutanta respektive CRISPR-bibliotek, som reglerar denna process. För det andra ger den direkta utvärderingen av interaktioner mellan värd- och bakterieceller med fluorescensmikroskopi information för klargörande mekanismer för bakteriell patogenicitet, inklusive förändringar i en värd- eller bakteriecellsöverlevnad, morfologi eller dynamik. Slutligen ger den automatiserade statistiska analysen som utförs på bilder som samlats in i analysen inte bara en övergripande kvantifiering av den genomsnittliga bakterieassociationen med värdceller utan möjliggör också utvärdering av dynamiska, encelliga, värdpatogena interaktioner.

Trots dessa fördelar har de beskrivna metoderna några viktiga begränsningar. För det första krävs fluorescensfärgning av bakterier för att räkna upp deras anslutning till värdceller. Således måste det fluorescerande färgämnet selektivt färga bakterier än deras värdcellsmotsvarigheter. Dessutom får färgningsfärgen inte ändra fästfenotypen hos bakterierna som bär den. Därför måste optimeringen av bakteriell fluorescensfärgning (t.ex. koncentration, färgningstid) bestämmas innan de beskrivna följsamhetsstudierna utförs. I detta protokoll påverkar fluorescerande färgning av bakteriestammar inklusive P. aeruginosa, L. monocytogenes, E. coli och B. subtilis i 30 min inte deras anslutning till värdceller. För det andra, på grund av specificiteten hos olika värd-bakterieinteraktioner, kanske en enda värdcellstyp inte är tillräcklig för att utvärdera bakteriell anknytning till värdceller. Därför kan flera värdcellstyper krävas för att få en fullständig förståelse för i vilken grad en viss mikrob kan fästa sig vid värdcellens ytor. För det tredje var bakteriell segmentering inte helt effektiv när bakterier driver aggregering under saminkubation, t.ex. S. aureus, eller när bakterier bildade klumpar vid en högre MOI (>100), t.ex. P. aeruginosa. I detta fall bör en högre förstoring tillämpas för att fånga bilderna, eller fler bilder bör användas i analysen för att minska effekten av bakteriell aggregering.

Mänskliga lung epitelial celler (A549) och HUVECs användes i studierna för att visa plasticitet av tillvägagångssättet med avseende på värd cell typ, och båda visade höga nivåer av mottaglighet för bakteriell vidhäftning. Användningen av två värdcellstyper visade också att den beskrivna metoden kunde tillämpas i stor utsträckning för att karakterisera vidhäftande värd-bakterieinteraktioner snabbt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alla författare har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Vi är tacksamma mot Dr. Kaite Zlotkowski på Biotek Inc. för deras tekniska support. Detta arbete stöddes av försvarsdepartementet under kontraktsnummer W911NF1920013 till PdF, Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) och inrikesdepartementet under kontrakt nr 140D6319C0029 till PdF. Innehållet i informationen återspeglar inte nödvändigtvis regeringens ståndpunkt eller politik, och inget officiellt godkännande bör härledas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x PBS VWR 45001-130
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher 62248 Host cell staining dye
96 well plate Corning 3882 Half area well, flat clear bottom
A549 cells ATCC  CCL 185 Mammalian cell line
BactoView Live Red Biotium 40101 Bacteria staning dye
Centrifuge Eppendorf 5810R
CFSE cell division tracker BioLegend 423801
Cytation 5  BioTek Cytation 5  Cell imaging multi-mode reader
E. coli Laboratory stock 
EGM bulletKit Lonza CC-3124 HUVEC cell culture medium
EHEC NIST collections
F-12k medium ATCC  302004 A549 cell culture medium
Fetal bovine serum Corning 35-016-CV
HUVEC Laboratory stock 
L. monocytogenes NIST collections
OD600 DiluPhotometer IMPLEN
P. aeruginosa Dr. Lori Burrows laboratory stock
P. aeruginosa ΔpilA Dr. Lori Burrows laboratory stock
S. agalactiae NIST collections
S. aureus BEI NR-46543
S. aureus ΔsaeR BEI NR-48164
S. rubidaea NIST collections
Typical soy broth Growcells MBPE-4040

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Bacterial adhesion and entry into host cells. Cell. 124, 715-727 (2006).
  2. Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Médecine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).
  3. Josse, J., Laurent, F., Diot, A. Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms. Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).
  4. Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Craxì, A. SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver. Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).
  5. Ortiz-Prado, E., et al. Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094 (2020).
  6. Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19. Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).
  7. Woo, V., et al. Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression. Frontiers in Immunology. 10, 928 (2019).
  8. Pandey, A., et al. Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection. Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).
  9. Ding, S., et al. Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes. iScience. 24 (3), 102192 (2021).
  10. Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110 (2008).
  11. Qin, Q. M., et al. Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans. PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078 (2011).
  12. Qin, Q. M., et al. A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240 (2020).
  13. Pandey, A., et al. Activation of host IRE1α-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103 (2018).
  14. Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells. Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).
  15. Götz, R., et al. Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy. Nature Communications. 11, 6173 (2020).
  16. Lim, Y., et al. Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy. PLOS Biology. 17 (10), 3000268 (2019).
  17. Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60350 (2019).
  18. Hoffmann, S., et al. High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43 (2018).
  19. Hazan, R., Que, Y. -A., Maura, D., Rahme, L. G. A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates. BMC Microbiology. 12 (1), 259 (2012).
  20. Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).
  21. Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).
  22. Farinha, M. A., et al. Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice. Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).
  23. Réglier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes. Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).
  24. Ortega, F. E., et al. Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells. Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).

Tags

Immunologi och infektion nummer 175

Erratum

Formal Correction: Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells
Posted by JoVE Editors on 02/08/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

to:

Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

Automatiserad, hög genomströmningsdetektering av bakteriell efterlevnad av värdceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, J., Qin, Q. M., Van Schaik,… More

Yang, J., Qin, Q. M., Van Schaik, E., Samuel, J. E., de Figueiredo, P. Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells. J. Vis. Exp. (175), e62764, doi:10.3791/62764 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter