Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Automatisert, høy gjennomstrømningsdeteksjon av bakteriell overholdelse av vertsceller

Published: September 17, 2021 doi: 10.3791/62764
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center, 2College of Veterinary Medicine, Texas A&M University

ERRATUM NOTICE

Summary

Påvisning av vertsbakterielle patogeninteraksjoner basert på fenotypisk tilslutning ved bruk av fluorescensmerking med høy gjennomstrømning sammen med automatiserte statistiske analysemetoder muliggjør rask evaluering av potensielle bakterielle interaksjoner med vertsceller.

Abstract

Identifisering av nye bakterielle patogener er avgjørende for menneskers helse og sikkerhet. Bakteriell overholdelse av vertsceller er et viktig skritt i bakterielle infeksjoner og utgjør et kjennetegn på potensiell trussel. Derfor kan det å undersøke overholdelse av bakterier til vertsceller brukes som en komponent i bakteriell trusselvurdering. En standardmetode for å liste opp bakteriell overholdelse av vertsceller er å co-inkubere bakterier med vertsceller, høste de tilhørende bakteriene, plate de høstede cellene på faste medier, og deretter telle de resulterende kolonidannende enhetene (CFU). Alternativt kan bakteriell overholdelse av vertsceller evalueres ved hjelp av immunfluorescensmikroskopibaserte tilnærminger. Konvensjonelle strategier for implementering av disse tilnærmingene er imidlertid tidkrevende og ineffektive. Her beskrives en nylig utviklet automatisert fluorescensmikroskopibasert avbildningsmetode. Når metoden kombineres med bildebehandling med høy gjennomstrømning og statistisk analyse, muliggjør den rask kvantifisering av bakterier som holder seg til vertsceller. To bakteriearter, Gram-negative Pseudomonas aeruginosa og Gram-positive Listeria monocytogenes og tilsvarende negative kontroller, ble testet for å demonstrere protokollen. Resultatene viser at denne tilnærmingen raskt og nøyaktig nummererer tilhengerbakterier og reduserer eksperimentelle arbeidsbelastninger og tidslinjer betydelig.

Introduction

Bakteriell vedheft er en prosess der bakterier festes til andre celler eller overflater. Vellykket etablering av infeksjon ved bakterielle patogener krever vedheft for å være vert for celler, kolonisering av vev, og i noen tilfeller invasjon av vertsceller1,2,3. Nye smittsomme sykdommer utgjør store folkehelsetrusler, som det fremgår av den nylige COVID-19-pandemien4,5,6. Det er viktig at nye eller nye patogener ikke lett kan ses ved hjelp av genombaserte tilnærminger, spesielt i tilfeller der patogenet er konstruert for å unngå deteksjon eller ikke inneholder genomiske signaturer som identifiserer det som patogent. Derfor kan identifisering av potensielle patogener ved hjelp av metoder som direkte vurderer kjennetegn på patogenisitet, som bakteriell overholdelse av vertsceller, spille en kritisk rolle i patogenidentifikasjon.

Bakteriell overholdelse av vertsceller har blitt brukt til å evaluere mekanismer for bakteriell patogenese i flere tiår1,7. Mikroskopisk avbildning8,9 og opplisting av bakteriell kolonidannende enhet (CFU)10,11,12,13 ved etterinfeksjonsbelegg er to velutviklede laboratoriemetoder for testing av mikrobiell tilslutning og/eller infeksjon av vertsceller14. Tatt i betraktning mikrometerskalastørrelsen på bakterieceller, krever opplistingen av de tilhørende bakteriecellene generelt bruk av avanserte mikroskopiteknikker med høy forstørrelse, samt høyoppløselige bildebehandlingsmetoder, inkludert elektronmikroskopi, ekspansjonsmikroskopi (ExM)15,16og tredimensjonal avbildning17 . Alternativt kan opplistingen av bakterier bundet til eller internalisert i vertsceller utføres ved å plating fortynningsserien av høstede bakterier på fast agar og telle de resulterende CFUs10,12,13. Denne metoden er arbeidskrevende og inneholder mange manuelle trinn, som introduserer vanskeligheter med å etablere en standardisert eller automatisert prosedyre som kreves for høygjennomstrømningsanalyser18,19. Derfor vil utviklingen av nye metoder for evaluering av vertscellevedlegg adressere gjeldende begrensninger i feltet.

En slik metode er beskrevet her som bruker automatisert mikroskopi med høy gjennomstrømning, kombinert med høy gjennomstrømningsbildebehandling og statistisk analyse. For å demonstrere tilnærmingen ble eksperimenter med flere bakterielle patogener utført, inkludert Pseudomonas aeruginosa, et opportunistisk Gram-negativ bakteriell patogen av mennesker, dyr og planter14,20, som ofte antas å kolonisere luftveiene til pasienter med nedsatt vertsforsvarsfunksjoner. Denne tilnærmingen optimaliserte den mikroskopiske bildebehandlingsprosessen beskrevet i tidligere studier14,20. Avbildningsdeteksjonen ble forenklet av fluorescensmerkede vertsceller og bakterier for raskt å spore nærheten til dem, noe som dramatisk reduserte mikroskopiarbeidsbelastningen for å få høyoppløselige bilder for å skille bakterier. I tillegg erstattet den automatiserte statistiske analysen av bilder i telling av vertsceller og bakterier hånd-på-eksperimentet av bakteriell CFU-plating for å estimere forholdet mellom tilhenger bakterietall per vertscelle. For å bekrefte kompatibiliteten til denne metoden har flere bakteriestammer og vertscelletyper også blitt testet, som Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus og Klebsiella pneumoniae, samt humane navlestrengs endothelialceller (HUVECs), og resultatene støtter mangfoldet og effektiviteten av metoden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. A549 cellekultur

  1. Vedlikehold A549-cellelinjen i F-12K medium supplert med 10% foster bovint serum (FBS) og inkuber ved 37 °C, 5 % CO2.
  2. Endre mediet hver 3-4 dager og passasje ved 85% -95% samløp.
  3. Skyll kort cellene med 1 x fosfatbufret saltvann (PBS, pH 7,4, med mindre annet er angitt) og behandle med 1 ml 0,25% Trypsin-0,53 mM etylendiamintetraacetisk syre (EDTA) oppløsning (nedsenket cellelaget) i ca. 2 min ved 37 °C.
  4. Tilsett ytterligere 6 ml komplett vekstmedium (F-12K medium + 10% FBS) for å stoppe proteaseaktiviteten. Deretter tallerken cellene i en steril polystyren T-75 vev kultur kolbe ved et subkultivasjonsforhold på 1:3-1:8. Det endelige volumet av kultur er 12 ml.
  5. Frø ca. 1 x 104 A549-celler (cellekonsentrasjon: ~1 x 105 celler/ml) på hver brønn på en 96-brønnsplate om dagen før tilslutningsanalysene.

2. Bakterievekst og farging

  1. Utfør alt bakteriearbeid i et Biosafety Cabinet, Biosafety Level 2-laboratorium.
  2. Inokuler alle bakteriekulturer, inkludert P. aeruginosa (PAO1), Escherichia. coli, L. monocytogenes og B. subtilis, etc., fra den frosne glyserolbestanden og vokse dem i Tryptic Soy Broth (TSB, 3 ml) i en rystende inkubator ved 37 °C over natten opprettholdt ved 250 o/min.
  3. Neste dag, bruk en 1:100 fortynning av nattkulturen for å inokulere en subkultur og dyrke dem i TSB (1 ml) i 3 timer til eksponentiell fase, mål OD ved 600 nm (OD600) for å bekrefte. Kontroller at OD600 er i området 0,4-0,6.
  4. Før du utfører bakterievertens tilslutningsanalyse, inkuberer plateseriefortynning av bakteriell suspensjon på TSB-agarplater, dem over natten ved 37 °C, og etablerer deretter bakterielle CFUer fra antall kolonier. For P. aeruginosatilsvarer en OD600 på 1,0 2 x 108 levedyktige bakterieceller / ml, og for L. monocytogenes tilsvareren OD600 av 1,0 9 x 108 levedyktige bakterieceller / ml.
  5. Høst bakteriekulturene i eksponentiell fase ved sentrifugering ved 13.000 x g i 2 min ved romtemperatur (RT), og vask dem deretter en gang ved hjelp av 1x PBS (1 ml). Resuspend bakteriell pellets i 1 ml 1x PBS og bestemme konsentrasjonene ved å måle OD600 av bakterielle suspensjoner. For eksempel representerer P. aeruginosa med OD600 av 0,5 en konsentrasjon på 1 x 108 bakterieceller / ml.
  6. Flekk bakteriell suspensjon ved hjelp av enten et grønt eller et rødt fluorescerende fargestoff ved RT i 30 minutter med mild rotasjon i mørket. For dette, tilsett 2 μL av det 500 ganger konsentrerte bestandsfargestoffet i 1 ml bakteriell suspensjon for å fortynne fargestoffet 1 ganger. For å vaske av fargestoffet, sentrifuger de fargede bakteriene på 13.000 x g i 2 min og resuspend pellet i 1 ml 1x PBS i tre ganger.
    MERK: Hvis fluorescens- (GFP-, RFP-, mCherry-, etc.) merkede bakterier brukes i forsøket, hopp over dette bakterielle fargingstrinnet. GFP-merket P. aeruginosa og rød fluorescerende farget L. monocytogenes ble brukt i denne protokollen.
  7. Samle de fargede bakteriecellene eller GFP-merkede bakterier ved sentrifugering ved 13.000 x g i 2 min. Resuspend i fersk F-12K medium (1 ml) og måle OD600 av hver kultur. Etterfølgende fortynne kulturene til de ønskede konsentrasjonene basert på mangfoldet av infeksjon (MOI) og vertscellekonsentrasjon. Det endelige volumet som brukes i dette eksperimentet er 500 μL.
    MERK: Hvis for eksempel vertscellekonsentrasjonen som telles ved hjelp av Trypan Blue-farging er 1 x 105 celler/ml, vil ønsket konsentrasjon av bakterieceller ved en MOI på 100 være 1 x 107 celler/ml. Konsentrasjonen av P. aeruginosa ved 0,5 OD600 er 1 x 108/ml. For å oppnå ønsket konsentrasjon, fortynn P. aeruginosa-kulturen 10 ganger, tilsett 50 μL resuspendert kultur til 450 μL fersk F-12K medium.

3. Bakteriell tilslutning og vertscellefarging

  1. Først vasker du frøet A549 cellemonolayers tre ganger med varm 1x PBS. For hver vask, tilsett 100 μL 1x PBS til hver brønn, forsiktig pipette opp og ned tre ganger, kast 1x PBS eller vent i 10 s etter tilsetning og støvsug deretter for å fjerne 1x PBS. For å bestemme kinetikken til bakteriell assosiasjon, overlegg cellene med 100 μL av ønskede konsentrasjoner av bakteriell suspensjon med forskjellige MOIer (0, 1, 10 og 100). Spinn ned bakteriene ved 200 x g i 10 min og inkuber de infiserte A549-cellene ved 37 °C, 5 % CO2 i ytterligere 1 time.
    MERK: I dette eksperimentet hadde hver tilstand et teknisk triplikat.
  2. Fjern de ubundne bakteriene ved å vaske monolayers fem ganger med varm 1x PBS som beskrevet ovenfor. Tilsett 100 μL 4% formaldehyd (i 1x PBS) i hver brønn av 96-brønnsplatene for å fikse cellene. La platene sitte på is i 15 min og vask deretter av fikseringsløsningen ved hjelp av 1x PBS tre ganger.
  3. For å flekke kjernen, tilsett 50 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) og inkuber den i 10 minutter ved RT. Etter inkubasjon, vask brønnene tre ganger ved hjelp av 1x PBS. Dekk de infiserte A549-cellene med 100 μL 1x PBS for å unngå tørking. Behandle for neste trinn eller oppbevar platen ved 4 °C i opptil 2 dager i mørket.

4. Automatisert fluorescensavbildning, prosessering og analyse

  1. For å opprettholde dataintegriteten velger du tilfeldig og manuelt fem steder i hver brønn for å ta bildene med 20x forstørrelse. Ta fluorescerende bilder av henholdsvis A549-celler og bakterier under DAPI- og GFP-kanaler. Bruk PE-Cy5 kanal for bakteriene farget av det røde fluorescerende fargestoffet.
  2. Hvis du vil ha en bedre oppløsning, kan du behandle alle bildene for sammenslåing og dekonvolusjon i bakgrunnen. Angi parametrene som 68 μm diameter på rullekulen for utjevning og automatisk mål punktspredningsfunksjonen (PSF) for bildedekonvolusjon basert på målet.
  3. For å telle alle kvalifiserte celler og bakterier, mål fluorescensintensiteten til vertscellene og bakteriene og angi den svakeste fluorescensintensiteten til vertsceller og bakterier som terskler for celleantall. Tell alle bakterier proksimal til en vertscelle innen 15 μm avstand som tilhengerbakteriene som diameteren på A549-cellen er 10,59-14,93 μm21.
    MERK: En standardinnstilling i bildesystemet teller selektivt vertscellene med diametre fra 5-100 μm og bakterier fra 0,2-5 μm i størrelse (bredde og lengde).
  4. Basert på de ovennevnte manuelle bildebehandlingsresultatene, bruk parametrene for bildeutjevning, dekonvolusjon, objektstørrelser, avstand og fluorescensintensiteter på resten av de automatiserte bildene. Etter den automatiserte analysen bør du vurdere kritiske avlesninger, for eksempel totalt antall vertsceller, cellestørrelser og former, totalt bakterietall og gjennomsnittlig bakterietall per vertscelle, som var den viktigste indikatoren, for å bestemme bakteriell tilslutning.
  5. Dataeksport og statistisk analyse
    1. Eksporter de analyserte resultatene fra alle bilder til et regneark (f.eks. Det automatiserte systemet genererer to sett med resultater: 1) gjennomsnittlig tilhenger bakteriell telling fra hvert bilde; 2) de informative dataene til hver enkelt vertscelle, for eksempel tilhengerbakteriell telling på en enkelt celle, vertsstørrelse og gjennomsnittlig fluorescensintensitet av vertscelle og bakterier, fra det tilsvarende bildet.
    2. Beregn gjennomsnittstallet og standardavviket for etterfølgende bakterietall fra alle bilder for å representere bakteriell tilslutningsnivå sammenlignet med negative kontroller. I denne metoden fungerte E. coli og B. subtilis som negative kontroller i testing av henholdsvis Gram-negativ og Gram-positiv bakteriell tilslutning. Utfør toveis ANOVAer for å teste for betydelig variasjon mellom datapunkter på tvers av behandling for tre uavhengige eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å utvikle fluorescensavbildningsbasert bakteriell tilslutningsanalyse ble P. aeruginosa-stammen PAO1 og dens negative overholdelsesmotpart E. coli brukt til å teste protokolleffektiviteten, da overholdelsen av disse bakteriene til A549-celler hadde blitt rapportert14,20,22. For det første ble GFP-merket P. aeruginosa (PAO1) og GFP-merket E. coli co-inkubert med en menneskelig udødelig epitelcellelinje A549 ved henholdsvis ulike MOIer. Resultatene viste at PAO1 fulgte A549-celler på en doseavhengig måte (Figur 1A,B); I mellomtiden ble nær nulltilslutning av E. coli også verifisert (Figur 1A,B). Det ble tatt og analysert 50 bilder ved hver MOI. Toveis ANOVAer ble utført for å teste de betydelige variasjonene fra tre uavhengige eksperimenter.

Figure 1
Figur 1: Gram-negativ bakteriell P. aeruginosa festet seg til A549-celler innen 1 t med inkubasjon. (A) Mikroskopiske bilder for en oversikt over bakteriell tilslutning der bildene ble tatt ved hjelp av 20x forstørrelse. PAO1 og den negative tilslutningskontrollen E. coli fulgte A549-celler ved den angitte multiplisiteten av infeksjoner (MOIer). Bakterier var GFP-fluorescens merket. A549 cellekjerner ble farget av DAPI. Skalastangen er 50 μm. (B) Kvantifisering av tilhengere av bakterietall per A549-celle. For hver testet bakteriestamme (PAO1 og E. coli) i hver MOI ble totalt 50 bilder brukt på analysen ved hver tilstand. Data er gjennomsnittlig ± standardavvik (SD) fra en representant for tre uavhengige eksperimenter. Den toveis statistiske analysen av ANOVA ble utført. * p < 0,05, *** p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Lignende resultater ble også observert når Gram-positive bakterier, L. monocytogens23,24 og dens negative kontroll B. subtilis, ble brukt ( Figur2A,B). Overholdelsen av A549-celler var signifikant i L. monocytogenes enn B. subtilis (Figur 2A,B).

Figure 2
Figur 2: Gram-positiv bakteriell L. monocytogenes festet seg til A549-celler innen 1 t med inkubasjon. (A) Mikroskopiske bilder for en oversikt over L. monocytogenes, samt den negative kontrollen B. subtilis overholdelse av A549 celler ved forskjellige MOIer. Bakterier ble farget med rød-fluorescerende fargestoff. A549 cellekjerner ble farget med DAPI. Skalastangen er 50 μm. (B) Kvantifisering av tilhenger bakteriell telling per A549-celle. For hver testet bakteriestamme (L. monocytogenes og B. subtilis) i hver MOI ble totalt 50 bilder brukt på analysen ved hver tilstand. Data er gjennomsnittlig ± SD fra en representant for tre uavhengige eksperimenter. Den toveis statistiske analysen av ANOVA ble utført. ** p < 0,01, *** p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Et representativt bilde av vertstilknyttet P. aeruginosa-segmentering og tellinger er vist i figur 3 (Gule masker: utvalgte bakterier, rød kontur: enkeltbakteriell telling). Innstillingene for både verts- og bakteriemål er beskrevet i Protokoll-delen.

Figure 3
Figur 3: Eksempelbilder av bakteriesegmentering og telling i den automatiserte analyseprosessen. (A) Mikroskopiske bilder av P. aeruginosa festet seg til A549 ved en MOI på 100 uten bakteriell segmentering og telling. (B) Det samme bildet etter statistisk analyse av bakteriell segmentering og telling. Gule masker: utvalgte bakterier, rød kontur: enkelt bakteriell telling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Resultatene av de automatiserte analysene, inkludert vertscellestørrelser og -områder, bakterie- og vertscelleantall, samt gjennomsnittlig bakterietall per vertscelle, som representerer status som vertscellehelse, bakterietilslutningsnivå og bakteriell cytotoksisitet, er oppført i tabell 1 og tabell 2. Tabell 1 representerer de tillevende bakterietallene på et gjennomsnittlig mobilnivå fra forskjellige bilder, mens tabell 2 representerer tilhengere av bakterielle tellinger analysert på ett bilde på ett enkelt A549-mobilnivå. Disse representative bildene ble tatt fra A549-celler infisert av PAO1 ved en MOI på 100. De analyserte resultatene av det første bildet i figur 3 ble oppført som Bilde 1 i tabell 1 og tabell 2.

Tabell 1: Statistiske analyseresultater av 9 representative bilder på cellenivå. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

I hvert bilde representerer antall vertssummer og bakterielle sumpunkter det totale antallet vertskjerner og totale bakterietall som gjenkjennes av systemet basert på parametrene beskrevet ovenfor. I tillegg representerer den automatiserte beregningen av bakteriell flekkforhold gjennomsnittlig bakterietall per vertscelle, avledet fra bakteriesumflekker / antall vertssummer. Videre kan ytterligere avlesninger også inkluderes; For eksempel illustrerer de bakterietilkholdne vertstallene det universelle eller spesifikke fenomenet hostbakterier. Når de bakterietilknende vertstallene er mye mindre enn vertssummen teller, er det gjennomsnittlige bakterietallet per vert relativt høyt, noe som representerer at en slik tilslutningsfenotype har en betydelig heterogenitet.

Tabell 2: Enkel cellulær statistisk analyse av et representativt bilde. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Entall celleanalyse gir flere detaljer om vertscelle og bakterielle mål i hvert bilde, noe som er mer nyttig når du samler andre bakterielle egenskaper og bruker dem på den automatiserte beregningsanalysen for å utvikle et kraftigere verktøy for å evaluere den potensielle bakterielle patogenisiteten, som en maskinlæringsmodell som studeres. I denne protokollen representerer vertsstørrelse og -område diameterene og områdene til hver fargede vertskjerner, og vertsfluorescensintensiteten representerer den gjennomsnittlige intensiteten til de fargede kjernene. Bakteriell spottelling og areal representerer de tilhengerbakterielle målene til hver vertscelle og deres totale områder. Bakteriell fluorescensintensitet representerer den gjennomsnittlige intensiteten til alle tilhengerbakterier.

Det er ikke overraskende at noen virulente bakterier ikke holdt seg til A549, mens noen bakterier med høye nivåer av bakteriell overholdelse ikke nødvendigvis korrelerer med patogenitet. En annen vertscelletype, HUVECs, ble også testet for å maksimere bruken av denne metoden. Resultatene viste effektiv deteksjon og de forskjellige tilslutningsfenotypene av bakterier (Figur 4). Ulike vertsceller kan øke beregningen av potensielle bakterielle patogener; for eksempel ble patogen Serratia rubidaea og Streptococcus agalactiae fulgt HUVEC, men ikke til A549-celler (figur 4). Videre var den cytotoksiske Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) ikke-tilhenger av enten A549 eller HUVEC (figur 4). Derfor er det viktig å sikre at metoden er egnet for flere vertscelletyper for å svare på spesifisiteten til vertsbakterieinteraksjoner. Både A549- og HUVEC-cellene ble co-inkubert med bakterier ved en MOI på 100 ved 37 °C i 1 time.

Figure 4
Figur 4: Spesifisitet av bakteriell tilslutning for å være vert for A549- og HUVEC-celler. Bakteriestammene, inkludert S. rubidaea, S. agalactiae, cytotoksisk Enterohemorrhagic E. coli (EHEC), PAO1, P. aeruginosa ΔpilA (PAO-NP), E. coli, S. aureus og S. aureus ΔsaeR, ble testet på både A549- og HUVEC-celler ved en MOI på 100 i 1 t co-inkubasjon ved 37 °C, 5 % CO2. Bakterier ble farget med rød-fluorescerende fargestoff. Tilhengere av bakterietall ble kvantifisert fra 45 bilder/bakteriestamme i tre uavhengige eksperimenter. Data er gjennomsnittlig ± SD fra en representant for tre uavhengige eksperimenter. * p < 0,05, *** p < 0,001, **** p<0,0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen beskriver en automatisert tilnærming for opplisting av bakteriell vedlegg til vertsceller. Den beskrevne tilnærmingen har flere attraktive fordeler i forhold til konvensjonelle metoder. For det første muliggjør denne tilnærmingen nøyaktig kvantifisering av antall mikrobielle patogenceller som er festet til individuelle vertsceller. Viktigst, denne kvantifiseringen kan utføres uten behov for arbeidskrevende bakteriell høsting, serielle fortynninger, plating på faste medier og bestemmelse av CFUer10,11,12. Som sådan reduserer den beskrevne teknikken den totale arbeidsmengden som kreves for å kvantifisere bakteriell overholdelse. Det bør verdsettes at fordelene ved den foreslåtte tilnærmingen forsterkes når man søker å oppdage fenotyper i store screeningforsøk, inkludert identifisering av bakterielle eller vertsgener i henholdsvis mutant- eller CRISPR-biblioteker som regulerer denne prosessen. For det andre gir den direkte evalueringen av interaksjoner mellom vertsceller og bakterieceller ved hjelp av fluorescensmikroskopi informasjon for å belyse mekanismer for bakteriell patogenitet, inkludert endringer i en vert eller bakteriell celleoverlevelse, morfologi eller dynamikk. Til slutt gir den automatiserte statistiske analysen som utføres på bilder samlet inn i analysen ikke bare en generell kvantifisering av den gjennomsnittlige bakterielle tilknytningen til vertsceller, men muliggjør også evaluering av dynamiske, encellede, vertspatogeninteraksjoner.

Til tross for disse fordelene har de beskrevne metodene noen viktige begrensninger. For det første er fluorescensfarging av bakterier nødvendig for å liste opp deres overholdelse av vertsceller. Dermed må det fluorescerende fargestoffet selektivt flekke bakterier enn vertscellemotpartene. I tillegg må fargestoffet ikke endre vedleggsfenotypen til bakteriene som bærer den. Derfor må optimalisering av bakteriell fluorescensfarging (f.eks. konsentrasjon, fargingsvarighet) bestemmes i forkant av å utføre de beskrevne tilslutningsstudiene. I denne protokollen påvirker fluorescerende farging av bakteriestammer, inkludert P. aeruginosa, L. monocytogenes, E. coli og B. subtilis i 30 min ikke deres overholdelse av vertsceller. For det andre, på grunn av spesifisiteten til forskjellige vertsbakterieinteraksjoner, kan en enkelt vertscelletype ikke være tilstrekkelig til å evaluere bakteriell vedlegg til vertsceller. Derfor kan flere vertscelletyper være nødvendig for å få en fullstendig forståelse av i hvilken grad en gitt mikrobe kan følge vertscelleoverflater. For det tredje var bakteriesegmentering ikke fullt ut effektiv når bakterier driver aggregering under koinkubasjonen, for eksempel S. aureus, eller når bakterier dannet klumper ved en høyere MOI (>100), for eksempel P. aeruginosa. I dette tilfellet bør en høyere forstørrelse brukes til å fange bildene, eller flere bilder bør brukes i analysen for å redusere effekten av bakteriell aggregasjon.

Humane lungeepitelceller (A549) og HUVEC ble brukt i studiene for å demonstrere plastisiteten i tilnærmingen med hensyn til vertscelletype, og begge viste høye nivåer av følsomhet for bakteriell overholdelse. Bruken av to vertscelletyper viste også at den beskrevne metoden kunne brukes mye for å karakterisere tilhenger av vertsbakterieinteraksjoner raskt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfattere har ingen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Vi er takknemlige til Dr. Kaite Zlotkowski fra Biotek Inc. for deres tekniske støtte. Dette arbeidet ble støttet av Forsvarsdepartementet under kontraktsnummer W911NF1920013 til PdF, Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) og Department of Interior under Contract No. 140D6319C0029 til PdF. Innholdet i informasjonen gjenspeiler ikke nødvendigvis regjeringens posisjon eller politikk, og ingen offisiell tilslutning bør utledes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x PBS VWR 45001-130
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher 62248 Host cell staining dye
96 well plate Corning 3882 Half area well, flat clear bottom
A549 cells ATCC  CCL 185 Mammalian cell line
BactoView Live Red Biotium 40101 Bacteria staning dye
Centrifuge Eppendorf 5810R
CFSE cell division tracker BioLegend 423801
Cytation 5  BioTek Cytation 5  Cell imaging multi-mode reader
E. coli Laboratory stock 
EGM bulletKit Lonza CC-3124 HUVEC cell culture medium
EHEC NIST collections
F-12k medium ATCC  302004 A549 cell culture medium
Fetal bovine serum Corning 35-016-CV
HUVEC Laboratory stock 
L. monocytogenes NIST collections
OD600 DiluPhotometer IMPLEN
P. aeruginosa Dr. Lori Burrows laboratory stock
P. aeruginosa ΔpilA Dr. Lori Burrows laboratory stock
S. agalactiae NIST collections
S. aureus BEI NR-46543
S. aureus ΔsaeR BEI NR-48164
S. rubidaea NIST collections
Typical soy broth Growcells MBPE-4040

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Bacterial adhesion and entry into host cells. Cell. 124, 715-727 (2006).
  2. Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Médecine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).
  3. Josse, J., Laurent, F., Diot, A. Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms. Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).
  4. Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Craxì, A. SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver. Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).
  5. Ortiz-Prado, E., et al. Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094 (2020).
  6. Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19. Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).
  7. Woo, V., et al. Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression. Frontiers in Immunology. 10, 928 (2019).
  8. Pandey, A., et al. Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection. Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).
  9. Ding, S., et al. Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes. iScience. 24 (3), 102192 (2021).
  10. Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110 (2008).
  11. Qin, Q. M., et al. Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans. PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078 (2011).
  12. Qin, Q. M., et al. A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240 (2020).
  13. Pandey, A., et al. Activation of host IRE1α-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103 (2018).
  14. Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells. Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).
  15. Götz, R., et al. Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy. Nature Communications. 11, 6173 (2020).
  16. Lim, Y., et al. Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy. PLOS Biology. 17 (10), 3000268 (2019).
  17. Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60350 (2019).
  18. Hoffmann, S., et al. High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43 (2018).
  19. Hazan, R., Que, Y. -A., Maura, D., Rahme, L. G. A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates. BMC Microbiology. 12 (1), 259 (2012).
  20. Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).
  21. Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).
  22. Farinha, M. A., et al. Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice. Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).
  23. Réglier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes. Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).
  24. Ortega, F. E., et al. Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells. Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 175

Erratum

Formal Correction: Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells
Posted by JoVE Editors on 02/08/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

to:

Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

Automatisert, høy gjennomstrømningsdeteksjon av bakteriell overholdelse av vertsceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, J., Qin, Q. M., Van Schaik,… More

Yang, J., Qin, Q. M., Van Schaik, E., Samuel, J. E., de Figueiredo, P. Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells. J. Vis. Exp. (175), e62764, doi:10.3791/62764 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter