Summary
Embryologiske manipulationer såsom udryddelse og transplantation af celler er vigtige værktøjer til at studere tidlig udvikling. Denne protokol beskriver en enkel og effektiv transplantation enhed til at udføre disse manipulationer i zebrafisk embryoner.
Abstract
Klassiske embryologiske manipulationer, såsom fjernelse af celler og transplantation af celler i eller mellem embryoner, er kraftfulde teknikker til at studere komplekse udviklingsprocesser. Zebrafisk embryoner er ideelle til disse manipulationer, da de er let tilgængelige, relativt store i størrelse og gennemsigtige. Men tidligere udviklede enheder til cellefjernelse og transplantation er besværlige at bruge eller dyre at købe. I modsætning hertil er den transplantationsenhed, der præsenteres her, økonomisk, nem at samle og nem at bruge. I denne protokol introducerer vi først håndteringen af transplantationsenheden samt dens samling fra kommercielt og bredt tilgængelige dele. Vi præsenterer derefter tre applikationer til dets anvendelse: generering af ektopiske kloner til at studere signalspredning fra lokaliserede kilder, udryddelse af celler til fremstilling af størrelsesreducerede embryoner og kimlinjetransplantation for at generere moder-zygotiske mutanter. Endelig viser vi, at værktøjet også kan bruges til embryologiske manipulationer hos andre arter som den japanske risfisk medaka.
Introduction
Fra de klassiske eksperimenter af Mangold og Spemann, der viste eksistensen af en organisator, der instruerer dannelsen af en embryonal akse1, er transplantation af celler mellem embryoner blevet en etableret teknik til undersøgelse af embryonal udvikling2,3,4,5,6,7,8,9,10 . En almindeligt anvendt opsætning til transplantation består af et mikrometerdrevstyret gastæt sprøjte, der er forbundet til en mikropipetteholder gennem fleksibel slange og et reservoir fyldt med mineralsk olie12,13. I denne opsætning flyttes sprøjtens stempel gennem en skrue. Trykket, der genereres på denne måde, overføres til mikropipetten og bruges til at trække celler ud fra et embryo og deponere dem i et andet. Denne hydraulisk drevne enhed består dog af mange dele og er besværlig at samle fra bunden. Lignende enheder kan også købes som et komplet arbejdssæt, der normalt sælges som manuelle mikroinjektorer, og disse kommercielle versioner koster typisk mere end 1500 US $. I både den hjemmelavede og den kommercielle version adskilles mikropipetten til embryomanipulation fra den trykproducerende enhed (den gastætte sprøjte) gennem oliefyldte slanger. Manipulationen af mikropipetten og stemplets bevægelse skal derfor betjenes separat med forskellige hænder, hvilket reducerer gennemløbet og nytten. Desuden er enhederne besværlige at forberede sig på transplantation, da slangen skal omhyggeligt fyldes med olie og samtidig undgå dannelsen af bobler. Her beskriver vi en alternativ pneumatisk betjent enhed til cellefjernelse og transplantation, der er billig, nem at samle og nem at bruge.
Den her præsenterede anordning består af en 25 μL gastæt sprøjte udstyret med en mikropipetteholder og koster mindre end 80 USD i alt. Enheden kan nemt samles ved at indsætte mikropipetteholderen i sprøjten via Luer-låsemontering (figur 1A). Enheden er derefter direkte monteret på en mikromanipulator, så brugeren kan styre både sin position og suge med en enkelt hånd direkte på mikromanipulatoren. Dette efterlader bekvemt den anden hånd fri til at stabilisere og flytte transplantationsskålen, der indeholder donor- og værtsfostre. Enheden fungerer ved direkte sugning med luft og behøver ikke at blive fyldt med mineralsk olie. På grund af de attraktive kræfter mellem vandet og glasnålens vægge oversættes en stor bevægelse i sprøjtens stempel til en mindre bevægelse i vandstanden i nålen, så længe vandstanden er i den tilspidsede ende af glasnålen. Dette giver mulighed for præcis kontrol over antallet af indsugningsceller og placeringen af deres indsættelse.
For at demonstrere nytten af denne enhed præsenterer vi tre applikationer i zebrafisk (Danio rerio) embryoner. For det første viser vi, hvordan man genererer lokaliserede kilder til udskillede signalmolekyler, som kan bruges til at studere gradientdannelse2,4,6. Her injiceres donorembryoner med mRNA, der kodning et fluorescerende mærket signalmolekyle. De fluorescensmærkede donorceller transplanteres derefter til værtsfostre af vildtypen, hvor dannelsen af en signalgradient kan afbildes og analyseres. For det andet beskriver vi, hvordan enheden kan bruges til at fjerne celler ved extirpation for at generere størrelsesreducerede embryoner5,13. Endelig viser vi, hvordan man robust producerer moder-zygotiske mutanter ved at transplantere celler, der bærer en urcellereporter i værtsfostre, hvor kimlinjen var blevet ablated6,10. I fremtiden kan den transplantationsanordning, der er beskrevet her, let tilpasses andre embryologiske manipulationer, der kræver fjernelse eller transplantation af celler.
Protocol
1. Samling og brug af transplantationsanordningen
- Montering af transplantationsanordningen.
- Tilslut Luerspidsen 25 μL gastæt sprøjte og en mikropipetteholder med Luer-låsemontering for at samle transplantationsanordningen (figur 1A).
BEMÆRK: Befugtning af Luer-spidsen med en tynd vandfilm kan bidrage til at forbedre forbindelsen ved at holde delene sammen via vand vedhæftning og samhørighed. - Sæt enheden direkte på en manuel mikromanipulator (Figur 1B). Enheden kan styres med den dominerende hånd alene, frigøre den anden side til yderligere opgaver.
- Tilslut Luerspidsen 25 μL gastæt sprøjte og en mikropipetteholder med Luer-låsemontering for at samle transplantationsanordningen (figur 1A).
- Forberedelse af transplantationsnålen.
- Fremstil en transplantationsnål ved at trække en glaskapillær pipette (uden glødetråd) med en mikropipettetrækker.
- Bryd spidsen af nålen så glat som muligt, da skarpe kanter øger chancen for at ridse æggeblommen under transplantation, hvilket er dødeligt for embryoet.
BEMÆRK: Spidsen kan nemt brydes med et barberblad med lige kanter under et stereomikroskop. Men ved hjælp af en mikroforge gør det muligt at generere en præcis åbning af den ønskede størrelse. For ektopisk kildegenerering er en ydre diameter på ca. 50-60 μm passende. Ved udskridning og kimlinjetransplantation skal nålens ydre diameter måle ca. 80-90 μm for at øge antallet af transplanterede celler. - Sæt den brugsklare nål i transplantationsanordningen (figur 1A).
- Ved hjælp af transplantationsenheden.
- Placer mikromanipulatoren sammen med transplantationsanordningen ved siden af et stereomikroskop (figur 1B).
- Stemplet fjernes, og transplantationsnålen sænkes i transplantationsskålen fyldt med Ringers opløsning (se trin 2.2.1) i en vinkel på 45°, indtil nålespidsen er nedsænket (figur 1B). Vand vil haste op nålen på grund af kapillær handling.
- Sæt stemplet ca halvvejs for at skylle Ringers opløsninger ud, så der kun er en lille mængde vand i den tynde, tilspidsede del af nålen (Figur 1C).
BEMÆRK: Dette er den neutrale position, og vandstanden skal være stabil der i et stykke tid (>20 min). Hvis vandstanden er ustabil, lækker luften. Luer-låsen tilsluttes, eller udskift sprøjten igen. - Når du bruger en transplantation nål for første gang, pels sin indersiden ved at udarbejde æggeblomme fra et ofret embryo og derefter udvise æggeblomme materiale helt. Belægningen vil bidrage til at reducere klæben af celler til glasset under efterfølgende procedurer.
- Placer forsigtigt donorembrynet ved hjælp af nålen, og anbring derefter nålen, der åbner ortogonalt på embryoets overflade (figur 1D).
BEMÆRK: Positionen vil være anderledes for forskellige analyser. For ektopisk signalmolekylekildegenerering og celleudtryk vil dette være toppen af dyrestangen (figur 1E); for kimlinjetransplantation vil dette være margenen (Figur 1D,F). - Træk langsomt og forsigtigt stemplet op for at trække cellerne ind i nålen.
BEMÆRK: Hvis cellerne tages for hurtigt op, kan de blive beskadiget. Hvis det gøres korrekt, skal cellerne komme ud som en cylindrisk kolonne. Undgå at tage æggeblomme i nålen, da den transplanterede æggeblomme er giftig for værtsfostret. - Stop sugningen ved forsigtigt at skubbe stemplet lidt ned, når det ønskede antal celler er trukket ind. Fjern nålen fra embryoet ved at rykke nålen til siden i en kort og hurtig bevægelse. Efterlad nogle Ringers opløsning på hver side af cellekolonnen, og begræns cellerne til den tilspidsede ende af nålen (Figur 1C, D).
BEMÆRK: Væsken foran cellekolonnen hjælper med at tvinge cellerne i værtsembryoner fra hinanden, når cellekolonnen deponeres. - Ryd eventuelle resterende æggeblomme eller cellerester ved langsomt at flytte stemplet op og ned - mens nålen forbliver nedsænket - for at vaske cellerne med Ringers opløsning. Hvis det gøres korrekt, vil de ubeskadigede celler forblive klæbet sammen i en kolonne, mens snavs vaskes væk.
BEMÆRK: Der skal udvises stor forsigtighed under dette trin, da vandstanden vil stige forbi nålens tilspidsede ende. Dette vil forårsage en pludselig tilstrømning af vand, som kan bruges til at vaske cellerne. Men når vandstanden har passeret den tilspidsede ende, vil den fine kontrol med stemplet blive reduceret, og stemplet skal flyttes langsommere og forsigtigt. - Flyt transplantationsskålen med den ikke-dominerende hånd for at placere nålen ortogonal til overfladen (enten dyrepæl eller margen) af værtsfostret (figur 1D-F).
- Forsigtigt anvende let tryk, og derefter give en hurtig, skarp bevægelse til at gennembore den omsluttende lag af værten embryo. Pas på ikke at ridse æggeblommen med nålen.
BEMÆRK: Ved at lægge et lille tryk på embryoet ved forsigtigt at klemme det mod brøndens vægge øges embryoets overfladespænding og letter dermed piercingen af det omsluttende lag. - Når nålen er inde, skal du forsigtigt skubbe stemplet for at ekstrudere cellekolonnen ind i embryoet, mens nålen langsomt trækkes tilbage på samme tid (figur 1D-F).
- Rengøring af transplantationsnålen.
- Skyl nålen ved at flytte stemplet op og ned, mens nålen er nedsænket i deioniseret vand.
BEMÆRK: Hvis nålen forbliver snavset, skal du skylle den med 10 M natriumhydroxidopløsning, før den skylles igen med vand. - Opbevar nålen i en passende kasse til videre brug.
- Skyl nålen ved at flytte stemplet op og ned, mens nålen er nedsænket i deioniseret vand.
2. Generering af ektopiske kilder til udskillede signalmolekyler i zebrafiskembryoner
- Forberedelse af værts- og donorfostre.
- Saml frisklagte embryoner ved parring zebrafisk.
- Dechorionat 1-cellet stadium zebrafisk embryoner ved at inkubere op til 100 embryoner i 0,5 mg/mL pronaseopløsning i ca. 15 min i et lille glas Petriskål (en detaljeret beskrivelse af denne procedure er blevet offentliggjort af Rogers, K. W. et al.14).
BEMÆRK: Alternativt kan embryonerne også dechorioneres på det høje stadium lige før transplantationen (trin 2.2), men dette kræver, at de injicerede donorfostre og ikkein injicerede værtsfostre afchorioneres separat. - Dyk embryonerne ned i embryomedium i et 200 mL bægerglas.
BEMÆRK: Dechorionerede blastula- og gastrulastadoblaner er meget sarte. Deres udsatte æggeblomme vil klæbe til plastoverflader og brud ved kontakt med luft. Derfor skal de forblive helt nedsænket i embryo medium, overføres med et glasrør, og vedligeholdes i enten agarose-belagt (1% i embryo medium) plast retter eller glas Petri retter. - Tøm forsigtigt det meste af embryomediet og fyld langsomt bægerglasset med frisk embryo medium. Den milde agitation forårsaget på denne måde vil lette fjernelsen af de svækkede chorions. Gentag dette trin 2-3 gange.
- Overfør de dechorionerede embryoner ved hjælp af et glas Pasteur pipette til en agarosebelagt injektionsskål.
BEMÆRK: Flammende spidsen af glasset Pasteur pipette ved at udsætte det for en Bunsen brænder flamme kan smelte og glatte ud kanten, bidrage til at forhindre skader på embryoner. - Indsprøjt mRNA, derkodning af det fluorescerende mærkede protein i en delmængde embryoner (Rogers, K.W. et al.14) har offentliggjort en detaljeret beskrivelse af denne procedure. Indsprøjt mRNA'et i cellen, ikke æggeblommen, for næsten homogent udtryk. Injicerede embryoner vil tjene som donorer, mens ikke-injicerede embryoner vil tjene som værter.
BEMÆRK: Mængden og typen af injiceret mRNA vil afhænge af det signalmolekyle, der studeres, og varierer normalt fra 20 til 200 pg2,4,5,6 (men kan være så højt som 1000 pg i visse tilfælde4). - Overfør de injicerede embryoner til en agarosebelagt seks-brønd skål fyldt med embryo medium. Inkuberes ved 28 °C, indtil embryonerne når det tidlige sfærestadium.
- Transplantere celler til at generere ektopiske kilder.
- Fyld en transplantationsskål (med individuelle trekantede kileformede brønde, se Materialebord) med Ringers opløsning (116 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 1 mM CaCl2, 5 mM HEPES; Opbevar HEPES bufferen ved 4 °C).
BEMÆRK: Calcium i Ringers opløsning fremmer celle vedhæftning og hjælper embryoet med at hele fra transplantationsproceduren. - Overfør embryonerne til transplantationsskålen.
- Placer værts- og donorembryoner i skiftende søjler, i hvert tilfælde med dyrestangen orienteret mod transplantationsnålen.
- Transplantationen udføres som beskrevet i punkt 1.3. Til ektopisk kildetransplantation skal du tage kildeceller fra toppen af dyrestangen og deponere dem på samme sted i værtsfostret (figur 1E).
BEMÆRK: Det er vigtigt for ektopisk kildegenerering at vaske cellerne med Ringers opløsning som beskrevet i trin 1.3.8 for at sikre, at allerede udskilte signalmolekyler ikke overføres til værten. Transplanter ikke for mange celler for at sikre, at kilden ikke spredes. En kolonne på ca. 80 μm i diameter og 100 μm i længden er passende til mange anvendelser. - Lad værtsfosteret blive i Ringers opløsning i 30 min til 1 time for at komme sig.
- Undersøg, om cellerne blev transplanteret med succes ved hjælp af et fluorescensstereomikroskop (figur 2).
- Efter bjærgning overføres embryonerne til en agarosebelagt seks-brønds plade fyldt med embryomedium og inkuberer dem ved 28 °C.
- Fyld en transplantationsskål (med individuelle trekantede kileformede brønde, se Materialebord) med Ringers opløsning (116 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 1 mM CaCl2, 5 mM HEPES; Opbevar HEPES bufferen ved 4 °C).
3. Generering af størrelsesreducerede embryoner ved celleudskridelse
- Forberedelse af embryoner til udryddelse.
- Saml frisklagte embryoner fra zebrafisk af den ønskede genotype.
- Inkuberes embryonerne ved 28 °C, indtil de når det høje stadium.
- Dechorionat embryonerne som beskrevet i trin 2.1.2-2.1.5, når embryonerne når det høje stadium.
BEMÆRK: I dette eksempel udføres celleudskridelse på sfærestadiet. Derfor afchorioneres embryoner ca. 30 min til 1 time tidligere.
- Valgfrit: Mærkning af æggeblomme syncytial lag (YSL).
BEMÆRK: Hvis det ønskes, injicere fluorescerende dextrans i YSL før udryddelse af celler. Denne teknik gør det muligt at afgøre, om YSL forbliver intakt efter cellefjernelse, hvilket er vigtigt for normal embryogenese15. Alternativt kan in vitro syntetiserede mRNAs eller proteiner også injiceres i YSL.- Brug en Pasteur pipette til at overføre de dechorionerede embryoner til en agarosebelagt injektionsskål fyldt med embryovand.
- Orient embryonerne sideværts, med blastoderm margen peger mod injektion nål (Figur 3A).
- Indsprøjt 0,5 nL på 1,5 μg/μL 10 kDa Alexa568-Dextran i YSL, der sigter mod en region mellem blastodermcellerne og æggeblommen i en dybde på omkring en tredjedel af embryoets diameter. Indsprøjt alle embryoner inden for en række.
BEMÆRK: Da injektionsnålen ikke behøver at gennembore chorionen, er en lille (~ 4 μm) og skarp åbning fordelagtig. - Roter embryonerne med 180°, så den modsatte side af blastodermmargenen peger mod injektionsnålen (figur 3A).
- YSL indsprøjtes yderligere 0,5 nL på 1,5 μg/μL 10 kDa Alexa568-Dextran i YSL som beskrevet i trin 3.2.3, hvilket giver et samlet injektionsvolumen på 1 nL pr. embryo.
BEMÆRK: Injektion fra to sider giver mulighed for en mere jævn fordeling af fluorescerende dextran inden for YSL. - Undersøg resultatet af injektionen under et fluorescens stereomikroskop. Hvis det gøres korrekt, vil fluorescerende signal være begrænset til YSL (Figur 3B) og ikke være synlig i det intercellulære rum af blastoderm.
- Frigøre celler
- Fyld en transplantationsskål med Ringers opløsning (se trin 2.2.1).
- Overfør embryonerne til transplantationsskålen.
- Orient embryonerne med dyrestangen mod transplantationsnålen (figur 3C).
- Fjern forsigtigt celler fra dyrepolområdet som beskrevet i trin 1.3.5-1.3.7, hvorved blastodermen reduceres til den ønskede størrelse.
- Kassér de fjernede celler ved at udstøde dem fra transplantationsnålen.
- Når proceduren er afsluttet, skal embryonerne forblive i Ringers opløsning i 30 min til 1 time for at komme sig.
- VALGFRIT: Undersøg YSL's integritet under et fluorescensstereomikroskop (figur 3D).
- Embryonerne overføres til en agarosebelagt plade fyldt med embryomedium og inkuberes ved 28 °C.
4. Oprettelse af moder-zygotiske mutanter ved kimlinjetransplantation
- Forberedelse af værts- og donorfostre.
- Saml frisklagte embryoner fra både mutant og vilde zebrafisk. Embryoner fra zebrafisk med en mutant baggrund vil tjene som donorer, mens embryoner fra zebrafisk med en vild baggrund vil tjene som værter.
BEMÆRK: Germline transplantation kræver et stort antal start embryoner (~ 50 for donorer, ~ 500 for værter) for at sikre et stort antal succesfulde kimlinjetransplantationer, der overlever ind i voksenalderen. - Overfør embryonerne til en agarosebelagt injektionsskål med embryomedium ved hjælp af en Pasteur-pipette.
BEMÆRK: Injektioner udføres før dechorionation for at øge gennemløbet. Nåle til injektion gennem chorion skal være stump og har en større åbning (~ 10 μm) for at forhindre tilstopning. - Indsprøjt donorfostrene med 1 nL på 100 ng/μL mRNA-kodning af GFP med et nos1 3'UTR. Indsprøjt mRNA'en i æggeblommen for at øge gennemløbet.
BEMÆRK: Nos1 3'UTR vil stabilisere mRNA i urkimcellerne, hvilket får kimcellerne til at være stærkt fluorescerende, når de afbildes 1 dag efter befrugtningen10. - Værtsfostrene injiceres med 1 nL på 0,33 mM (3 μg/μL) blindgyde (dnd) morpholino. Indsprøjt morpholinoen i æggeblommen for at øge gennemløbet.
BEMÆRK: Dnd morpholino blokerer primordial kimcelledannelse, som sikrer, at værtsfostrets kimlinje udelukkende befolket med celler fra donoren efter transplantation10. - Overfør de injicerede embryoner til plast petriskåle med embryo medium. Inkuber ved 28 °C, indtil embryonerne når det høje stadium.
- Dechorionat embryonerne som beskrevet i trin 2.1.2-2.1.5, når embryonerne når det høje stadium.
- Saml frisklagte embryoner fra både mutant og vilde zebrafisk. Embryoner fra zebrafisk med en mutant baggrund vil tjene som donorer, mens embryoner fra zebrafisk med en vild baggrund vil tjene som værter.
- Transplantation af kimceller
- Fyld en transplantationsskål med Ringers opløsning (se trin 2.2.1).
- Overfør dechorionerede sfære- til kuppel-fase embryoner i transplantation parabol.
- Placer værtsfostre og donorembryoner i skiftende kolonner for at transplantere cellerne fra et donorembryster til seks forskellige værtsfostre. Dette øger chancen for, at kimceller fra et givet værtsfoster med succes vil blive transplanteret.
- Bryd embryonerne med margenen mod transplantationsnålen, og udfør transplantationen som beskrevet i punkt 1.3. For kimlinjetransplantationer (figur 1D,F) skal kildecellerne tages fra margenen (hvor urkimcellerne er placeret) og deponere dem på samme sted i værtsfostret.
BEMÆRK: Hvis du transplanterer en stor søjle (ca. 80 μm i diameter og 600 μm i længden) øges risikoen for at opnå en vellykket kimlinjetransplantation. - Lad embryoet blive i Ringers opløsning i 30 min til 1 time for at komme sig, når transplantationen er afsluttet.
BEMÆRK: Hvis ikke alle donorembryoner forventes at være homozygote mutanter - f.eks. hvis de skyldes en heterozygot incross - skal de genotypeeres efter transplantation for at bestemme genotypen af værtens transplanterede fremtidige kimlinje. I dette tilfælde skal du sikre, at værts- og donorfostrenes positioner ikke blandes under håndteringen. - Brug et fluorescens stereomikroskop til at undersøge, om cellerne blev transplanteret med succes (Figur 4A,B).
- Overfør embryonerne til en 24-brønd agarosebelagt plade. Grupper alle de værtsfostre, der modtog celler fra den samme donor, i samme brønd og mærk dem i overensstemmelse hermed. Inkuber dem indtil næste dag ved 28 °C.
- Hvis det er nødvendigt, overføres donorembryoner til mærkede PCR-strimler til genotyping.
- Screening for vellykkede kimlinjetransplantationer
- Screen værtsfostrene til vellykkede kimlinetransplantationer under et fluorescensstereomikroskop ca. 30 timer efter befrugtning (hpf). Kimcellerne findes ved rillen over æggeblommeforlængelsen (Figur 4C).
BEMÆRK: Typiske eksperimenter med enheden og strategi præsenteret her vil have en succesrate på ~ 60% -80% for at opnå mindst en vært embryo transporterer transplanterede kimceller pr donor embryo. En tidligere rapport beskrev en ~ 10% effektivitet10. - Hvis det er relevant, kassere embryoner, der har modtaget celler fra donor embryoner med en forkert genotype. Dyrk larver med succesfuldt transplanterede kimceller til voksenalderen i henhold til standardholdsbetingelser og efter institutionelle retningslinjer.
- Screen værtsfostrene til vellykkede kimlinetransplantationer under et fluorescensstereomikroskop ca. 30 timer efter befrugtning (hpf). Kimcellerne findes ved rillen over æggeblommeforlængelsen (Figur 4C).
Representative Results
Succes og svigt i brugen af transplantationsanordningen til de tre ovennævnte applikationer kan let vurderes ved visuel inspektion under et stereomikroskop. I vellykkede transplantationer skal embryoet se normalt og lignende ud i form og æggeblommeklarhed til utransplantede embryoner uden store tårer i blastodermen. Hvis embryoet er synligt beskadiget (figur 4B), vil det ikke udvikle sig normalt. Ideelt set bør transplanterede celler, der udtrykker en fluorescerende markør, fremstå som en kontinuerlig kolonne, når de ses under et fluorescensstereomikroskop (figur 2A, figur 4A). Hvis kolonnen er fragmenteret, indikerer dette, at cellerne blev forstummet af suget ind i transplantationsnålen, eller at aflejringen af cellerne blev udført for kraftigt. Dette kan forhindres ved at flytte stemplet langsommere og forsigtigt.
Selv om transplantationsanordningen hovedsagelig er blevet anvendt på zebrafiskembryoner i blastulastadier5,6, fungerer transplantation og celleudsvævning lige så godt for dechorionerede blastula-stadium embryoner af de japanske risfisk medaka (Oryzias latipes) (figur 2B). Bortset fra embryodekorionation, som er blevet beskrevet af Porazinski, S. R. et al.17, kan de samme procedurer som beskrevet ovenfor følges.
I det specifikke tilfælde af transplantation af kimceller vil en god transplantation resultere i et embryo med en lang vandret kolonne af celler direkte over æggeblommemargenen (figur 4A). Om kimcellerne blev transplanteret med succes, kan dog først vurderes den følgende dag (figur 4C-F) på grund af baggrundsudtryk af GFP i blastulastadier (Figur 1F). Urkimcellerne vil fremstå som små fluorescerende kugler i rillen direkte over æggeblommeforlængelsen (Figur 4C-E). Tilstedeværelsen af disse celler på det korrekte sted indikerer vellykket kimlinjetransplantation. Celler med en anden form er ikke kimceller (f.eks. er aflange celler typisk muskelceller, Figur 4F). Også, hvis ur kimceller findes uden for rillen, betyder det, at de ikke har migreret korrekt, og de vil ikke være i stand til at bidrage til embryoets kimlinje. Endelig bør den generelle morfologi af transplanterede embryoner ligne utransplantede embryoner (figur 4D); halen må ikke deformeres, og hovedet må ikke krympes eller mangle øjne (figur 4E). Disse defekter skyldes generelt for høje morpholinokoncentrationer eller embryoskader under transplantationen. Germline transplantation eksperimenter som beskrevet her vil typisk resultere i 1-2 ud af 6 værts embryoner med held transplanteret kimceller for 60%-80% af donor embryoner, afhængigt af erfaringerne fra eksperimentatoren. Således skal celler fra 40-50 homozygode donorfostre transplanteres i 200-300 værtsfostre for at opdrage ca. 30 personer med mutante kimceller.
Figur 1: Samling og brug af transplantationsanordningen. (A) Transplantationsanordningen samles ved at forbinde en gastæt sprøjte med en mikropipetteholder gennem Luer-låsemontering. Glasnålen til transplantation indsættes derefter i mikropipetteholderen. B) Fotografi af den samlede transplantationsanordning monteret på en mikromanipulator (bemærk, at baggrund og etiketter er fjernet fra billedet). (C) Ved brug af transplantationsanordningen er det vigtigt at sikre, at vandstanden i transplantationsnålen forbliver i den tilspidsede ende. (D) Anordningen anvendes under et stereomikroskop til at trække celler tilbage og indsætte celler fra og i teleostfostre, der anbringes i individuelle brønde i en transplantationsskål. (E) Til fremstilling af ektopiske kilder udtages celler fra et donorembrysts (i-ii) dyrepæl og overføres til dyrets pol på et værtsfoster (iii-vi). (F) Ved transplantation af kimceller udtages et større antal celler fra margenen af et donorembryo (i-ii), hvor kimcellerne er placeret. Cellerne overføres derefter til margenen af værtsfostre (iii-vi). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Generering af kloner ved celletransplantation. (A) Eksempel på en dobbelt klon genereret ved sekventiel transplantation af fluorescerende celler (grøn) fra en zebrafiskdonor til et zebrafiskværtsfoster. Enkelt og dobbelt kloner kan bruges til at studere, hvordan udskilles signalmolekyler danner spatiotemporal gradienter2,4,5,6. (B) Eksempel på en enkelt klon, der genereres ved transplantation af celler fra en transgen eGFP-udtrykkende medakadonor (Wimbledon)17, til en medakavært af vildtypen. Skalalinjer repræsenterer 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Generering af størrelsesreducerede embryoner ved celleudskridelse. (A) Før celler fjernes ved udskridning, kan YSL mærkes ved at injicere fluorescerende farvestoffer i to modsatte sider af YSL. (B) Eksempel på et foster efter YSL-injektion. (C) For at frembringe størrelsesreducerede embryoner fjernes celler fra dyrestangen ved udskridelse5. (D) Eksempel på et embryo efter celleudskridelse. Bemærk, at YSL forbliver intakt. Skalalinjer repræsenterer 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Kimlinjetransplantation. (A) Eksempel på en vellykket transplantation af donorceller (grøn) ind i værtens marginalzone. (B) Eksempel på en mislykket transplantation. Æggeblommen af værtsfostret blev alvorligt beskadiget, og embryoet vil ikke være i stand til at udvikle sig normalt. (C) Ved 30 hk vil der udelukkende blive fundet transplanterede kimceller i gonadal mesoderm i den forreste del af æggeblommeforlængelsen. (D) Eksempel på en vellykket transplantation, hvor flere GFP-mærkede donorbakceller har befolket værtens fremtidige gonad. (E) Eksempel på en mislykket transplantation. Selvom kimceller har nået gonadal mesoderm, er værtsfostret alvorligt deformeret og vil ikke udvikle sig normalt. (F) Eksempel på en mislykket transplantation. Fluorescerende kimceller, der ikke kunne migrere til den korrekte placering, vil ikke genbefolke gonaderne. Skalastænger repræsenterer 100 μm. Billeder i D-F blev taget ved en samlet forstørrelse på ca. 50x. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Succesen med et transplantationseksperiment afhænger i høj grad af eksperimentatorens finmotoriske færdigheder. For at kunne udføre procedurerne er det nødvendigt med praksis. Det instrument, der præsenteres her, er imidlertid relativt let at lære og bruge sammenlignet med andre på markedet, og generelt er der kun brug for nogle få dages praksis.
Succesen af transplantationsproceduren kan forbedres ved at tage flere forholdsregler. Et skridt er at sikre, at mikromanipulatoren er af god kvalitet og i stand til at fungere problemfrit. Tilføjelse af en okulær med højere forstørrelse til stereomikroskopet kan bidrage til præcist at placere nålen i forhold til embryoet. Brug af velavlende zebrafisk eller medaka til at erhverve sunde embryoner og passe på ikke at beskadige embryonerne under håndtering (især under og efter dechorioneringstrinnet) vil også øge succesraten.
Problemer med forsinket toksicitet kan være vanskeligere at foretage fejlfinding. Hvis et foster dør efter et par timer - men ikke umiddelbart efter transplantationen - kan æggeblommen være blevet beskadiget af nålen (f.eks. ved at komme ind i embryoet for dybt), eller måske blev cellerne skubbet for kraftigt ud. Forsinket toksicitet og embryonal død kan også skyldes æggeblomme eller celleaffald injiceret sammen med donorcellerne; en anden årsag kan forringes HEPES buffer i Ringers løsning. Disse problemer kan overvindes ved at vaske cellerne (se trin 1.3.8) eller ved blot at bruge et nyt parti buffer. Desuden kan deforme værtsfostre i kimlinjetransplantationsforsøg skyldes for høje morfolinokoncentrationer. Det er afgørende at bruge nok morpholino til fuldt ud at ablate værtens vilde kønslinje og derved forhindre disse celler i at bidrage til afkommet - men samtidig skal for høje morpholinokoncentrationer undgås. Konsekvente morpholino-mængder på tværs af alle injicerede værtsfostre (et par hundrede i et typisk eksperiment) er derfor nøglen til succes for kimlinjetransplantationer. Dette kan hjælpes ved at supplere morpholino injektion mix med en let synlig sporstofstof14, som kan spores under en fluorescens stereomikroskop for at sikre, at alle embryoner får den samme injektion volumen.
De procedurer, der er beskrevet i denne protokol, involverer udelukkende manipulationer af celler i blastula-stadium zebrafisk eller medaka embryoner, men i fremtiden vil det sandsynligvis være muligt at tilpasse enheden til forskellige stadier og arter ved at ændre diameteren og formen af transplantationsnålen.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Dette projekt blev støttet af Max Planck Society og modtog støtte fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under EU's Horisont 2020-forsknings- og innovationsprogram (tilskudsaftale nr. 637840 (QUANTPATTERN) og tilskudsaftale nr. 863952 (ACE-OF-SPACE)).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mm glass capillary, ends cut without filament | To make the transplantation needle | ||
| 1.0 mm glass capillary, ends cut with filament | To make injection needles | ||
| 200 mL glass beaker | For embryo dechorionation | ||
| 24-well plastic plate | To be coated with agarose in order to incubate embryos | ||
| 5 cm diameter glass Petri dish | For embryo dechorionation | ||
| 6-well plastic plate | To be coated with agarose in order to incubate embryos | ||
| Agarose | To coat plastic dishes | ||
| dnd1 morpholino | Gene Tools | Sequence: GCTGGGCATCCATGTCTCCGAC CAT |
|
| Embryo medium | 250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
| Fluorescence stereomicroscope with GFP/RFP filters and light source | To assess YSL injections and germ-line transplantations | ||
| Glass micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | To make the transplantation needle |
| Glass pasteur pipette | Kimble Chase (via Fisher) | 63A53WT | For pipetting embryos; the tips can be flamed to smoothen out the edge |
| Incubator at 28 °C | For incubating zebrafish embryos | ||
| Luer tip 25 μL Hamilton syringe, 1700 series | Hamilton | Ref: 80201 | Part of the transplantation device |
| Manual micromanipulator with 3 axes of movement | Narishige | M-152 | For controlling the transplantation device |
| Manual pipetting pump | Bio-Tek | Cat. # 641 | For use with the glass pipettes to transfer embryos |
| Metal dissecting probe | For moving and rotating zebrafish embryos | ||
| Microforge | Narishige | MF2 | To make the transplantation needle |
| Microinjection apparatus | For injection of mRNA and morpholino into embryos | ||
| Microinjection molds, triangular grooves | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare microinjection plates with agarose |
| Microinjection-molds, single wells | Adaptive Science Tools | PT-1 | To prepare transplantation plates with agarose |
| Micropipette holder with Luer fitting for a 1.0 mm glass capillary | World Precision Instruments | MPH6S10 | Part of the transplantation device |
| mMessage mMachine Sp6 transcription kit |
Life Technologies | AM1340M | To generate capped mRNA for injection into embryos |
| Plasmid with GFP-nos1 3'UTR | Plasmid that can be transcriped to produce mRNA encoding GFP with the 3'UTR of nos1 | ||
| Plastic petri dish 100 mm | To be coated with agarose in order to make injection and transplantation dishes | ||
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | For embryo dechorionation: Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos |
| Ringer’s solution | For 1 L: Add 6.78 g of NaCl, 0.22 g of KCl, 0.26 g of CaCl2 and 1.19 g of HEPES; then fill to 1 L; adjust pH to 7.2; sterilize by filtration | ||
| Stereomicroscope | For injection and transplantation |
References
- Spemann, H., Mangold, H. Induction of embryonic primordia by implantation of organizers from a different species. Archives for Microscopic Anatomy and Developmental Mechanics. 100 (3-4), 599-638 (1924).
- Müller, P., et al. Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system. Science. 336 (6082), 721-724 (2012).
- Donovan, P., et al. Paracrine Activin-A signaling promotes melanoma growth and metastasis through immune evasion. Journal of Investigative Dermatology. 137 (12), 2578-2587 (2017).
- Pomreinke, A. P., et al. Dynamics of BMP signaling and distribution during zebrafish dorsal-ventral patterning. eLife. 6, 25861 (2017).
- Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signaling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
- Soh, G. H., Pomreinke, A. P., Müller, P. Integration of Nodal and BMP signaling by mutual signaling effector antagonism. Cell Reports. 31 (1), 107487 (2020).
- Mahalwar, P., Walderich, B., Singh, A. P., Nüsslein-Volhard, C. Local reorganization of xanthophores fine-tunes and colors the striped pattern of zebrafish. Science. 345 (6202), 1362-1364 (2014).
- Frohnhöfer, H. G., Krauss, J., Maischein, H. M., Nüsslein-Volhard, C. Iridophores and their interactions with other chromatophores are required for stripe formation in zebrafish. Development. 140 (14), 2997-3007 (2013).
- Chen, Y., Schier, A. F. The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen. Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).
- Ciruna, B., et al. Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germline replacement. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (23), 14919-14924 (2002).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edn. , University of Oregon Press. (2000).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (29), e1394 (2009).
- Capek, D., Müller, P. Positional information and tissue scaling during development and regeneration. Development. 146 (24), 177709 (2019).
- Rogers, K. W., Bläßle, A., Schier, A. F., Müller, P. Measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (FDAP). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52266 (2015).
- Carvalho, L., Heisenberg, C. P. The yolk syncytial layer in early zebrafish development. Trends in Cell Biology. 20 (10), 586-592 (2010).
- Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Dechorionation of medaka embryos and cell transplantation for the generation of chimeras. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2055 (2010).
- Centanin, L., Hoeckendorf, B., Wittbrodt, J. Fate restriction and multipotency in retinal stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 553-562 (2011).
