Summary
Embryologische manipulaties zoals uitroeiing en transplantatie van cellen zijn belangrijke hulpmiddelen om vroege ontwikkeling te bestuderen. Dit protocol beschrijft een eenvoudig en effectief transplantatieapparaat om deze manipulaties uit te voeren in zebravisembryo's.
Abstract
Klassieke embryologische manipulaties, zoals het verwijderen van cellen en het transplanteren van cellen in of tussen embryo's, zijn krachtige technieken om complexe ontwikkelingsprocessen te bestuderen. Zebravisembryo's zijn bij uitstek geschikt voor deze manipulaties omdat ze gemakkelijk toegankelijk, relatief groot en transparant zijn. Eerder ontwikkelde apparaten voor celverwijdering en -transplantatie zijn echter omslachtig in gebruik of duur in aanschaf. Daarentegen is het hier gepresenteerde transplantatieapparaat economisch, eenvoudig te monteren en eenvoudig te gebruiken. In dit protocol introduceren we eerst de behandeling van het transplantatieapparaat en de assemblage ervan uit commercieel en algemeen beschikbare onderdelen. Vervolgens presenteren we drie toepassingen voor het gebruik ervan: generatie van ectopische klonen om signaalverspreiding uit gelokaliseerde bronnen te bestuderen, extirpatie van cellen om embryo's met verkleinde grootte te produceren en kiembaantransplantatie om maternale-zygote mutanten te genereren. Tot slot laten we zien dat de tool ook gebruikt kan worden voor embryologische manipulaties bij andere soorten zoals de Japanse rijstvis medaka.
Introduction
Uit de klassieke experimenten van Mangold en Spemann die het bestaan aantoonden van een organisator die de vorming van een embryonale as instrueerde1, is transplantatie van cellen tussen embryo's een gevestigde techniek geworden voor het bestuderen van de embryonale ontwikkeling2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Een veelgebruikte opstelling voor transplantatie bestaat uit een micrometer drive-controlled gasdichte spuit die via flexibele slangen is aangesloten op een micropipettehouder en een reservoir gevuld met minerale olie12,13. In deze opstelling wordt de zuiger van de spuit door een schroef bewogen. De druk die op deze manier wordt gegenereerd, wordt overgebracht naar de micropipette en gebruikt om cellen uit het ene embryo te trekken en in een ander af te zetten. Dit hydraulisch bediende apparaat bestaat echter uit vele onderdelen en is om helemaal opnieuw te monteren. Vergelijkbare apparaten kunnen ook worden gekocht als een complete werkset, meestal verkocht als handmatige micro-injectoren, en deze commerciële versies kosten meestal meer dan 1500 US $. In zowel de zelfgemaakte als de commerciële versie wordt de micropipette voor embryomanipulatie gescheiden van het drukgenererende apparaat (de gasdichte spuit) door middel van met olie gevulde slangen. De manipulatie van de micropipette en de beweging van de zuiger moeten daarom afzonderlijk met verschillende handen worden bediend, waardoor de doorvoer en het nut worden verminderd. Bovendien zijn de apparaten omslachtig om zich voor te bereiden op transplantatie, omdat de slang zorgvuldig met olie moet worden gevuld terwijl de vorming van bubbels wordt vermeden. Hier beschrijven we een alternatief pneumatisch bediend apparaat voor celverwijdering en transplantatie dat goedkoop, eenvoudig te monteren en eenvoudig te gebruiken is.
Het hier gepresenteerde apparaat bestaat uit een gasdichte spuit van 25 μL met een micropipettehouder en kost in totaal minder dan 80 US $. Het apparaat kan eenvoudig worden gemonteerd door de micropipettehouder via luervergrendeling in de spuit te steken (figuur 1A). Het apparaat wordt vervolgens direct op een micromanipulator gemonteerd, waardoor de gebruiker zowel de positie als de zuigkracht met één hand rechtstreeks op de micromanipulator kan regelen. Dit laat de andere hand gemakkelijk vrij om de transplantatieschaal met donor- en gastheerembryo's te stabiliseren en te verplaatsen. Het apparaat werkt door directe zuiging met lucht en hoeft niet te worden gevuld met minerale olie. Vanwege de aantrekkingskracht tussen het water en de wanden van de glazen naald, wordt een grote beweging in de zuiger van de spuit vertaald in een kleinere beweging in het waterniveau in de naald, zolang het waterniveau zich in het taps toelopende uiteinde van de glazen naald bevindt. Dit maakt nauwkeurige controle mogelijk over het aantal geaspireerde cellen en de locatie van hun inbrenging.
Om het nut van dit apparaat aan te tonen, presenteren we drie toepassingen in zebravis (Danio rerio) embryo's. Eerst laten we zien hoe we gelokaliseerde bronnen van uitgescheiden signaalmoleculen kunnen genereren, die kunnen worden gebruikt om gradiëntvorming te bestuderen2,4,6. Hier worden donorembryo's geïnjecteerd met mRNA dat codeert voor een fluorescerend gelabeld signaalmolecuul. De fluorescentie-gelabelde donorcellen worden vervolgens getransplanteerd naar wild-type gastheerembryo's waar de vorming van een signaalgradiënt in beeld kan worden gebracht en geanalyseerd. Ten tweede beschrijven we hoe het apparaat kan worden gebruikt om cellen te verwijderen door uitroeiing om verkleinde embryo's te genereren5,13. Ten slotte laten we zien hoe maternale-zygote mutanten robuust kunnen worden geproduceerd door cellen met een primordiale kiemcelreporter te transplanteren in gastheerembryo's waarin de kiembaan was opgeblazen6,10. In de toekomst kan het hier beschreven transplantatieapparaat eenvoudig worden aangepast aan andere embryologische manipulaties die de verwijdering of transplantatie van cellen vereisen.
Protocol
1. Montage en gebruik van het transplantatieapparaat
- Het in elkaar zetten van het transplantatieapparaat.
- Sluit de Luer tip 25 μL gasdichte spuit en een micropipettehouder met Luer-vergrendeling aan om het transplantatieapparaat te monteren (figuur 1A).
OPMERKING: Het bevochtigen van de Luer-tip met een dunne film water kan helpen om de verbinding te verbeteren door de delen bij elkaar te houden via waterhechting en cohesie. - Monteer het apparaat rechtstreeks op een handmatige micromanipulator (figuur 1B). Het apparaat kan alleen met de dominante hand worden bediend, waardoor de andere hand vrijkomt voor extra taken.
- Sluit de Luer tip 25 μL gasdichte spuit en een micropipettehouder met Luer-vergrendeling aan om het transplantatieapparaat te monteren (figuur 1A).
- Het voorbereiden van de transplantatienaald.
- Maak een transplantatienaald door een glazen capillaire pipet (zonder filament) te trekken met een micropipettetrekker.
- Breek de punt van de naald zo soepel mogelijk, omdat scherpe randen de kans vergroten om de dooier te krabben tijdens het transplanteren, wat dodelijk is voor het embryo.
OPMERKING: De punt kan gemakkelijk worden gebroken met een scheermesje met rechte rand onder een stereomicroscoop. Het gebruik van een microforge maakt het echter mogelijk om een nauwkeurige opening van de gewenste grootte te genereren. Voor het genereren van ectopische bronnen is een buitendiameter van ongeveer 50-60 μm geschikt. Voor extirpaties en kiembaantransplantatie moet de buitendiameter van de naald ongeveer 80-90 μm meten om het aantal getransplanteerde cellen te vergroten. - Steek de gebruiksklare naald in het transplantatieapparaat (figuur 1A).
- Met behulp van het transplantatieapparaat.
- Plaats de micromanipulator met het transplantatieapparaat naast een stereomicroscoop (figuur 1B).
- Verwijder de zuiger en laat de transplantatienaald in de met Ringer-oplossing gevulde transplantatieschaal (zie stap 2.2.1) in een hoek van 45° zakken totdat de punt van de naald is ondergedompeld (figuur 1B). Water zal door capillaire werking de naald opspuiten.
- Plaats de zuiger ongeveer halverwege om de oplossingen van de Ringer weg te spoelen, waardoor er slechts een klein volume water overblijft in het dunne, taps toelopende deel van de naald (figuur 1C).
OPMERKING: Dit is de neutrale positie en het waterniveau moet daar een tijdje stabiel zijn (>20 min). Als het waterniveau onstabiel is, lekt de lucht; sluit de Luer-vergrendeling opnieuw aan of vervang de spuit. - Wanneer u voor de eerste keer een transplantatienaald gebruikt, bedekt u de binnenkant door dooier op te trekken uit een geofferd embryo en vervolgens het dooiermateriaal volledig te verdrijven. De coating zal helpen om de hechting van cellen aan het glas tijdens volgende procedures te verminderen.
- Plaats het donorsembryo voorzichtig met behulp van de naald en plaats vervolgens de naaldopening orthogonaal op het oppervlak van het embryo (figuur 1D).
OPMERKING: De positie zal verschillend zijn voor verschillende assays. Voor het genereren van ectopische signaalmoleculen en celuitroeiingen is dit de bovenkant van de dierpool (figuur 1E); voor kiembaantransplantatie is dit de marge (figuur 1D,F). - Trek langzaam en voorzichtig de zuiger omhoog om de cellen in de naald te trekken.
OPMERKING: Als de cellen te snel worden opgenomen, kunnen ze worden beschadigd. Als het goed wordt gedaan, moeten de cellen eruit komen als een cilindrische kolom. Vermijd het opnemen van dooier in de naald, omdat de getransplanteerde dooier giftig is voor het gastheerembryo. - Stop de zuigkracht door de zuiger voorzichtig iets naar beneden te duwen zodra het gewenste aantal cellen is binnengetrokken. Verwijder de naald uit het embryo door de naald in een korte en snelle beweging naar de zijkant te rukken. Laat wat Ringer-oplossing aan weerszijden van de celkolom staan en beperk de cellen tot het taps toelopende uiteinde van de naald (figuur 1C,D).
OPMERKING: De vloeistof voor de celkolom zal helpen om de cellen van de gastheerembryo's uit elkaar te drijven bij het afzetten van de celkolom. - Verwijder eventuele resterende dooier of celresten door de zuiger langzaam op en neer te bewegen - terwijl de naald ondergedompeld blijft - om de cellen te wassen met de oplossing van Ringer. Als het goed wordt gedaan, blijven de onbeschadigde cellen aan elkaar vastzitten in een kolom terwijl het vuil wordt weggespoeld.
OPMERKING: Tijdens deze stap moet grote voorzichtigheid worden betracht, omdat het waterniveau voorbij het taps toelopende uiteinde van de naald zal stijgen. Dit zal een plotselinge instroom van water veroorzaken, dat kan worden gebruikt om de cellen te wassen. Zodra het waterniveau echter het taps toelopende uiteinde is gepasseerd, wordt de fijne controle met de zuiger verminderd en moet de zuiger langzamer en voorzichtiger worden verplaatst. - Beweeg de transplantatieschaal met de niet-dominante hand om de naald orthogonaal op het oppervlak (dierlijke pool of marge) van het gastheerembryo te plaatsen (figuur 1D-F).
- Oefen voorzichtig lichte druk uit en geef vervolgens een snelle, scherpe beweging om de omhullende laag van het gastheerembryo te doorboren. Zorg ervoor dat u de dooier niet met de naald bekrast.
OPMERKING: Het uitoefenen van lichte druk op het embryo door het voorzichtig tegen de wanden van de put te knijpen, verhoogt de oppervlaktespanning van het embryo en vergemakkelijkt zo het doorboren van de omhullende laag. - Zodra de naald binnen is, drukt u voorzichtig op de zuiger om de kolom cellen in het embryo te extruderen terwijl u de naald tegelijkertijd langzaam terugtrekt (figuur 1D-F).
- Reiniging van de transplantatienaald.
- Spoel de naald door de zuiger op en neer te bewegen terwijl de naald wordt ondergedompeld in gedeïoniseerd water.
OPMERKING: Als de naald vuil blijft, spoel deze dan af met 10 M natriumhydroxideoplossing voordat u deze opnieuw met water spoelt. - Bewaar de naald in een geschikte doos voor verder gebruik.
- Spoel de naald door de zuiger op en neer te bewegen terwijl de naald wordt ondergedompeld in gedeïoniseerd water.
2. Het genereren van ectopische bronnen van uitgescheiden signaalmoleculen in zebravisembryo's
- Het voorbereiden van de gastheer- en donorembryo's.
- Verzamel vers gelegde embryo's door zebravissen te paren.
- Dechorioneer 1-cel stadium zebravisembryo's door tot 100 embryo's te incuberen in 0,5 mg / ml pronase-oplossing gedurende ongeveer 15 minuten in een kleine glazen petrischaal (een gedetailleerde beschrijving van deze procedure is gepubliceerd door Rogers, K. W. et al.14).
OPMERKING: Als alternatief kunnen de embryo's ook worden gedechorioneerd in het hoge stadium vlak voor de transplantatie (stap 2.2), maar dit vereist dat de geïnjecteerde donorembryo's en niet-geïnjecteerde gastheerembryo's afzonderlijk worden gedechorioneerd. - Dompel de embryo's onder in embryomedium in een bekerglas van 200 ml.
OPMERKING: Dechorionated blastula en gastrula stadium embryo's zijn zeer delicaat. Hun blootgestelde dooier hecht zich aan plastic oppervlakken en scheurt bij contact met lucht. Daarom moeten ze volledig ondergedompeld blijven in embryo-medium, overgebracht met een glazen pipet en onderhouden in ofwel agarose-gecoate (1% in embryo medium) plastic schalen of glazen petrischalen. - Leeg voorzichtig het grootste deel van het embryomedium en vul het bekerglas langzaam met vers embryomedium. De milde agitatie die op deze manier wordt veroorzaakt, zal de verwijdering van de verzwakte chorionen vergemakkelijken. Herhaal deze stap 2-3 keer.
- Breng de gedrogeerde embryo's met behulp van een glazen Pasteur-pipet over in een met agarose beklede injectieschaal.
OPMERKING: Het ontsteken van de punt van de glazen Pasteur-pipet door deze bloot te stellen aan een Bunsen-brandervlam kan smelten en de rand gladstrijken, waardoor schade aan de embryo's wordt voorkomen. - Injecteer het mRNA dat codeert voor het fluorescerend gelabelde eiwit in een subset van embryo's (een gedetailleerde beschrijving van deze procedure is gepubliceerd door Rogers, K. W. et al.14). Injecteer het mRNA in de cel, niet in de dooier, voor bijna homogene expressie. Geïnjecteerde embryo's zullen dienen als donoren, terwijl niet-geïnjecteerde embryo's als gastheren zullen dienen.
OPMERKING: De hoeveelheid en het type geïnjecteerd mRNA is afhankelijk van het signaalmolecuul dat wordt bestudeerd en varieert meestal van 20 tot 200 pg2,4,5,6 (maar kan in bepaalde gevallen oplopen tot 1000 pg4). - Breng de geïnjecteerde embryo's over in een agarose-gecoate zes-well schotel gevuld met embryomedium. Incubeer bij 28 °C totdat de embryo's het vroege bolstadium bereiken.
- Het transplanteren van cellen om ectopische bronnen te genereren.
- Vul een transplantatieschaal (met individuele driehoekige wigvormige putten, zie Materialentabel) met Ringer's oplossing (116 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 1 mM CaCl2, 5 mM HEPES; bewaar de HEPES-buffer bij 4 °C).
OPMERKING: Het calcium in de oplossing van Ringer bevordert de hechting van de cel en helpt het embryo te genezen van de transplantatieprocedure. - Breng de embryo's terug in de transplantatieschaal.
- Plaats de gastheer- en donorembryo's in afwisselende kolommen, in elk geval met de dierenpool gericht op de transplantatienaald.
- Voer de transplantatie uit zoals beschreven in rubriek 1.3. Neem voor ectopische brontransplantatie broncellen van de bovenkant van de dierpool en deponeer ze op dezelfde locatie in het gastheerembryo (figuur 1E).
OPMERKING: Het wassen van de cellen met ringer's oplossing zoals beschreven in stap 1.3.8 is belangrijk voor het genereren van ectopische bronnen om ervoor te zorgen dat reeds uitgescheiden signaalmoleculen niet naar de gastheer worden overgebracht. Transplanteer niet te veel cellen om ervoor te zorgen dat de bron niet wordt verspreid. Een kolom met een diameter van ongeveer 80 μm en een lengte van 100 μm is geschikt voor vele toepassingen. - Laat het gastheerembryo 30 minuten tot 1 uur in de oplossing van Ringer blijven om te herstellen.
- Onderzoek of cellen met succes zijn getransplanteerd met behulp van een fluorescentieseeromicroscoop (figuur 2).
- Breng na herstel de embryo's terug naar een met agarose bedekte zesputtenplaat gevuld met embryomedium en incubeer ze bij 28 °C.
- Vul een transplantatieschaal (met individuele driehoekige wigvormige putten, zie Materialentabel) met Ringer's oplossing (116 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 1 mM CaCl2, 5 mM HEPES; bewaar de HEPES-buffer bij 4 °C).
3. Het genereren van verkleinde embryo's door celuitroeiing
- Embryo's voorbereiden voor uitroeiing.
- Verzamel vers gelegde embryo's van zebravissen van het gewenste genotype.
- Incubeer de embryo's bij 28 °C totdat ze het hoge stadium bereiken.
- Dechorioneer de embryo's zoals beschreven in stappen 2.1.2-2.1.5 wanneer de embryo's het hoge stadium bereiken.
OPMERKING: In dit voorbeeld wordt celuitroeiing uitgevoerd in het bolstadium. Dienovereenkomstig worden embryo's ongeveer 30 minuten tot 1 uur eerder gedechorioneerd.
- Optioneel: Labeling van de dooiersyncytiele laag (YSL).
OPMERKING: Injecteer indien gewenst fluorescerende dextrans in de YSL voordat u cellen uitroeit. Deze techniek maakt het mogelijk om te bepalen of de YSL intact blijft na celverwijdering, wat belangrijk is voor normale embryogenese15. Als alternatief kunnen in vitro gesynthetiseerde mRNA's of eiwitten ook in de YSL worden geïnjecteerd.- Gebruik een Pasteur pipet om de gedechorioneerde embryo's over te brengen naar een met agarose bedekte injectieschaal gevuld met embryowater.
- Oriënteer de embryo's zijdelings, waarbij de blastodermmarge naar de injectienaald wijst (figuur 3A).
- Injecteer 0,5 nL van 1,5 μg/μL 10 kDa Alexa568-Dextran in de YSL, gericht op een gebied tussen de blastodermcellen en de dooier op een diepte van ongeveer een derde van de diameter van het embryo. Injecteer alle embryo's binnen één rij.
OPMERKING: Omdat de injectienaald niet door het chorion hoeft te prikken, is een kleine (~ 4 μm) en scherpe opening voordelig. - Draai de embryo's 180° zodat de andere kant van de blastodermmarge naar de injectienaald wijst (figuur 3A).
- Injecteer nog eens 0,5 nL van 1,5 μg/μL 10 kDa Alexa568-Dextran in de YSL zoals beschreven in stap 3.2.3, wat een totaal injectievolume van 1 nL per embryo oplevert.
OPMERKING: Injecteren van twee kanten zorgt voor een meer gelijkmatige verdeling van fluorescerend dextran binnen de YSL. - Onderzoek het resultaat van de injectie onder een fluorescentieseomicroscoop. Indien correct uitgevoerd, zal het fluorescerende signaal beperkt zijn tot de YSL (figuur 3B) en niet zichtbaar zijn in de intercellulaire ruimte van het blastoderm.
- Cellen uitroeien
- Vul een transplantatieschaal met de oplossing van Ringer (zie stap 2.2.1).
- Breng de embryo's terug naar de transplantatieschaal.
- Richt de embryo's met de dierpool naar de transplantatienaald (figuur 3C).
- Verwijder voorzichtig cellen uit het dierpoolgebied zoals beschreven in stappen 1.3.5-1.3.7, waardoor het blastoderm tot de gewenste grootte wordt teruggebracht.
- Gooi de verwijderde cellen weg door ze uit de transplantatienaald te verdrijven.
- Zodra de procedure is voltooid, laat u de embryo's 30 minuten tot 1 uur in de oplossing van Ringer blijven om te herstellen.
- OPTIONEEL: Onderzoek de integriteit van de YSL onder een fluorescentieseeromicroscoop (figuur 3D).
- Breng de embryo's terug op een met agarose beklede plaat gevuld met embryomedium en incubeer ze bij 28 °C.
4. Het creëren van maternale-zygote mutanten door kiembaantransplantatie
- Voorbereiding van gastheer- en donorembryo's.
- Verzamel vers gelegde embryo's van zowel gemuteerde als wilde zebravissen. Embryo's van zebravissen met een gemuteerde achtergrond zullen dienen als donoren, terwijl embryo's van zebravissen met een wild-type achtergrond zullen dienen als gastheren.
OPMERKING: Kiembaantransplantatie vereist een groot aantal beginnende embryo's (~ 50 voor donoren, ~ 500 voor gastheren) om een groot aantal succesvolle kiembaantransplantaties te garanderen die overleven tot in de volwassenheid. - Breng de embryo's over in een met agarose beklede injectieschaal met embryomedium met behulp van een Pasteur-pipet.
OPMERKING: Injecties worden gedaan vóór de dechorionatie om de doorvoer te verhogen. Naalden voor injectie door het chorion moeten stomp zijn en een grotere opening hebben (~ 10 μm) om verstopping te voorkomen. - Injecteer de donorembryo's met 1 nL van 100 ng/μL mRNA dat codeert voor GFP met een nos1 3'UTR. Injecteer het mRNA in de dooier om de doorvoer te verhogen.
OPMERKING: De nos1 3'UTR stabiliseert het mRNA in de primordiale geslachtscellen, waardoor de geslachtscellen sterk fluorescerend zijn wanneer ze 1 dag na de bevruchting worden afgebeeld10. - Injecteer de gastheerembryo's met 1 nL van 0,33 mM (3 μg/μL) doodlopende (dnd) morfolino. Injecteer de morfolino in de dooier om de doorvoer te verhogen.
OPMERKING: De dnd morpholino blokkeert primordiale kiemcelvorming, wat ervoor zorgt dat de kiembaan van het gastheerembryo na transplantatie uitsluitend wordt bevolkt met cellen van de donor10. - Breng de geïnjecteerde embryo's over in plastic petrischalen met embryomedium. Incubeer bij 28 °C totdat de embryo's het hoge stadium bereiken.
- Dechorioneer de embryo's zoals beschreven in stappen 2.1.2-2.1.5 wanneer de embryo's het hoge stadium bereiken.
- Verzamel vers gelegde embryo's van zowel gemuteerde als wilde zebravissen. Embryo's van zebravissen met een gemuteerde achtergrond zullen dienen als donoren, terwijl embryo's van zebravissen met een wild-type achtergrond zullen dienen als gastheren.
- Transplantatie van geslachtscellen
- Vul een transplantatieschaal met de oplossing van Ringer (zie stap 2.2.1).
- Breng de gedórioneerde bol- naar koepelstadium embryo's over in de transplantatieschaal.
- Plaats de gastheerembryo's en donorembryo's in afwisselende kolommen om de cellen van één donorembryo naar zes verschillende gastheerembryo's te transplanteren. Dit vergroot de kans dat geslachtscellen van een bepaald gastheerembryo succesvol worden getransplanteerd.
- Richt de embryo's met de marge naar de transplantatienaald en voer de transplantatie uit zoals beschreven in rubriek 1.3. Neem voor kiembaantransplantaties (figuur 1D,F) de broncellen uit de marge (waar de primordiale geslachtscellen zich bevinden) en deponeer ze op dezelfde locatie in het gastheerembryo.
OPMERKING: Het transplanteren van een grote kolom (ongeveer 80 μm in diameter en 600 μm lang) zal de kans op het verkrijgen van een succesvolle kiembaantransplantatie vergroten. - Laat het embryo 30 minuten tot 1 uur in de oplossing van Ringer blijven om te herstellen zodra de transplantatie is voltooid.
OPMERKING: Als niet van alle donorembryo's wordt verwacht dat ze homozygote mutanten zijn - bijvoorbeeld als ze het gevolg zijn van een heterozygote incross - moeten ze na transplantatie worden gegenotypeerd om het genotype van de getransplanteerde toekomstige kiembaan van de gastheer te bepalen. Zorg er in dit geval voor dat de posities van de gastheer- en donorembryo's niet door elkaar worden gehaald tijdens de behandeling. - Gebruik een fluorescentieseomicroscoop om te onderzoeken of de cellen met succes zijn getransplanteerd (figuur 4A,B).
- Breng de embryo's over in een 24-well agarose-gecoate plaat. Groepeer alle gastheerembryo's die cellen van dezelfde donor hebben ontvangen in dezelfde put en label ze dienovereenkomstig. Incubeer ze tot de volgende dag bij 28 °C.
- Breng indien nodig de donorembryo's over in gelabelde PCR-strips voor genotypering.
- Screening op succesvolle kiembaantransplantaties
- Screen de gastheerembryo's op succesvolle kiembaantransplantaties onder een fluorescentieseeromicroscoop ongeveer 30 uur na de bevruchting (hpf). De geslachtscellen bevinden zich in de groef boven de dooierverlenging (figuur 4C).
OPMERKING: Typische experimenten met het apparaat en de strategie die hier worden gepresenteerd, hebben een slagingspercentage van ~ 60% -80% om ten minste één gastheerembryo te verkrijgen dat getransplanteerde geslachtscellen per donorembryo draagt. Een eerder rapport beschreef een efficiëntie van ~10%10. - Gooi indien van toepassing embryo's weg die cellen hebben ontvangen van donorembryo's met een onjuist genotype. Kweek larven met succesvol getransplanteerde geslachtscellen naar volwassenheid volgens standaard houderijomstandigheden en volgens institutionele richtlijnen.
- Screen de gastheerembryo's op succesvolle kiembaantransplantaties onder een fluorescentieseeromicroscoop ongeveer 30 uur na de bevruchting (hpf). De geslachtscellen bevinden zich in de groef boven de dooierverlenging (figuur 4C).
Representative Results
Succes en falen in het gebruik van het transplantatieapparaat voor de drie hierboven beschreven toepassingen kunnen gemakkelijk worden beoordeeld door visuele inspectie onder een stereomicroscoop. Bij succesvolle transplantaties moet het embryo er normaal uitzien en qua vorm en dooierhelderheid lijken op onverharde embryo's, zonder grote scheuren in het blastoderm. Als het embryo zichtbaar beschadigd is (figuur 4B), zal het zich niet normaal ontwikkelen. Idealiter zouden getransplanteerde cellen die een fluorescerende marker tot expressie brengen als een continue kolom moeten verschijnen wanneer ze onder een fluorescentieseeromicroscoop worden bekeken (figuur 2A, figuur 4A). Als de kolom gefragmenteerd is, geeft dit aan dat de cellen zijn geschoren door de zuiging in de transplantatienaald of dat de afzetting van de cellen te krachtig is gedaan. Dit kan worden voorkomen door de zuiger langzamer en voorzichtiger te bewegen.
Hoewel het transplantatieapparaat voornamelijk is gebruikt op zebravisembryo's in blastulastadia5,6, werken transplantatie en celextirpatie net zo goed voor dechorionated blastula-stadium embryo's van de Japanse rijstvis medaka (Oryzias latipes) (figuur 2B). Afgezien van embryo-dechorionatie, die is beschreven door Porazinski, S. R. et al.17, kunnen dezelfde procedures als hierboven beschreven worden gevolgd.
In het specifieke geval van kiembaantransplantatie zal een goede transplantatie resulteren in een embryo met een lange horizontale kolom cellen direct boven de dooiermarge (figuur 4A). Of geslachtscellen met succes zijn getransplanteerd, kan echter pas de volgende dag worden beoordeeld (figuur 4C-F) vanwege achtergrondexpressie van GFP in blastulastadia (figuur 1F). De primordiale geslachtscellen verschijnen als kleine fluorescerende bolletjes in de groef direct boven de dooierverlenging (figuur 4C-E). De aanwezigheid van deze cellen op de juiste locatie duidt op een succesvolle kiembaantransplantatie. Cellen met een andere vorm zijn geen geslachtscellen (langwerpige cellen zijn bijvoorbeeld meestal spiercellen, figuur 4F). Ook als primordiale geslachtscellen buiten de groef worden gevonden, betekent dit dat ze niet goed hebben gemigreerd en dat ze niet kunnen bijdragen aan de kiembaan van het embryo. Ten slotte moet de algemene morfologie van getransplanteerde embryo's vergelijkbaar lijken met onverharde embryo's (figuur 4D); de staart mag niet worden vervormd en de kop mag niet gekrompen of ontbrekende ogen zijn (figuur 4E). Deze defecten zijn over het algemeen het gevolg van te hoge morfolinoconcentraties of van embryoschade tijdens de transplantatie. Kiembaantransplantatie-experimenten zoals hier beschreven, zullen meestal resulteren in 1-2 van de 6 gastheerembryo's met succesvol getransplanteerde geslachtscellen voor 60% -80% van de donorembryo's, afhankelijk van de ervaring van de experimentator. Zo moeten cellen van 40-50 homozygote donorembryo's worden getransplanteerd in 200-300 gastheerembryo's om ongeveer 30 personen met gemuteerde geslachtscellen groot te brengen.
Figuur 1: Montage en gebruik van het transplantatieapparaat. (A) Het transplantatieapparaat wordt geassembleerd door een gasdichte spuit aan te sluiten op een micropipettehouder via luervergrendeling. De glazen naald voor transplantatie wordt vervolgens in de micropipettehouder ingebracht. (B) Foto van het geassembleerde transplantatieapparaat gemonteerd op een micromanipulator (houd er rekening mee dat achtergrond en labels van de foto zijn verwijderd). (C) Bij gebruik van het transplantatieapparaat is het belangrijk ervoor te zorgen dat het waterniveau in de transplantatienaald aan het taps toelopende uiteinde blijft. D) Het apparaat wordt onder een stereomicroscoop gebruikt om cellen op te zuigen en in te brengen uit en in teleostembryo's die in afzonderlijke putten van een transplantatieschaal zijn geplaatst. (E) Voor het genereren van ectopische bronnen worden cellen uit de dierlijke pool van een donorsembryo (i-ii) gehaald en overgebracht naar de dierlijke pool van een gastheerembryo (iii-vi). F) Voor kiembaantransplantatie wordt een groter aantal cellen uit de marge van een donorsembryo (i-ii) genomen, waar de geslachtscellen zich bevinden. De cellen worden vervolgens overgebracht in de marge van gastheerembryo's (iii-vi). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Genereren van klonen door celtransplantatie. (A) Voorbeeld van een dubbele kloon gegenereerd door sequentiële transplantatie van fluorescerende cellen (groen) van een zebravisdonor in een embryo van een zebravisgastheer. Enkele en dubbele klonen kunnen worden gebruikt om te bestuderen hoe uitgescheiden signaalmoleculen spatiotemporale gradiënten vormen2,4,5,6. (B) Voorbeeld van een enkele kloon die wordt gegenereerd door het transplanteren van cellen van een transgene eGFP-tot expressie brengende medaka-donor (Wimbledon)17 in een wildtype medaka-gastheer. Schaalbalken vertegenwoordigen 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Het genereren van verkleinde embryo's door celuitroeiing. (A) Voordat cellen door extirpatie worden verwijderd, kan de YSL worden geëtiketteerd door fluorescerende kleurstoffen in twee tegengestelde zijden van de YSL te injecteren. (B) Voorbeeld van een embryo na YSL-injectie. (C) Om verkleinde embryo's te genereren, worden cellen uit de dierlijke pool verwijderd door uitroeiing5. (D) Voorbeeld van een embryo na celextirpatie. Merk op dat de YSL intact blijft. Schaalbalken vertegenwoordigen 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Kiembaantransplantatie. (A) Voorbeeld van een succesvolle transplantatie van donorcellen (groen) in de marginale zone van de gastheer. (B) Voorbeeld van een mislukte transplantatie. De dooier van het gastheerembryo is ernstig beschadigd en het embryo zal zich niet normaal kunnen ontwikkelen. (C) Bij 30 hpf worden succesvol getransplanteerde geslachtscellen uitsluitend aangetroffen in het gonadale mesoderm in het voorste gebied van de dooierverlenging. (D) Voorbeeld van een succesvolle transplantatie waarbij verschillende GFP-gelabelde donorkiemcellen de toekomstige geslachtsklier van de gastheer hebben bevolkt. (E) Voorbeeld van een mislukte transplantatie. Hoewel geslachtscellen het gonadale mesoderm hebben bereikt, is het gastheerembryo ernstig misvormd en zal het zich niet normaal ontwikkelen. (F) Voorbeeld van een mislukte transplantatie. Fluorescerende geslachtscellen die niet naar de juiste locatie zijn gemigreerd, zullen de geslachtsklieren niet opnieuw bevolken. Schaalbalken vertegenwoordigen 100 μm. De foto's in D-F zijn gemaakt met een totale vergroting van ongeveer 50x. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Het succes van een transplantatie-experiment hangt sterk af van de fijne motoriek van de experimentator. Om de procedures met succes uit te voeren, is oefening vereist. Het hier gepresenteerde instrument is echter relatief eenvoudig te leren en te gebruiken in vergelijking met andere op de markt, en over het algemeen zijn slechts een paar dagen oefenen nodig.
Het succes van de transplantatieprocedure kan worden vergroot door verschillende voorzorgsmaatregelen te nemen. Een stap is om ervoor te zorgen dat de micromanipulator van goede kwaliteit is en in staat is om soepel te werken. Het toevoegen van een oculair met een hogere vergroting aan de stereomicroscoop kan helpen om de naald precies ten opzichte van het embryo te positioneren. Het gebruik van goed fokkende zebravissen of medaka om gezonde embryo's te verkrijgen en ervoor te zorgen dat de embryo's niet worden beschadigd tijdens het hanteren (vooral tijdens en na de dechorionatiestap) zal ook het slagingspercentage verhogen.
Problemen met vertraagde toxiciteit kunnen moeilijker op te lossen zijn. Als een embryo na een paar uur sterft - maar niet onmiddellijk na transplantatie - kan de dooier door de naald zijn beschadigd (bijvoorbeeld door het embryo te diep binnen te dringen), of misschien zijn de cellen te krachtig uitgeworpen. Vertraagde toxiciteit en embryonale dood kunnen ook het gevolg zijn van dooier of celresten die samen met de donorcellen worden geïnjecteerd; een andere oorzaak kan een verslechterende HEPES-buffer in de Ringer-oplossing zijn. Deze problemen kunnen worden opgelost door de cellen te wassen (zie stap 1.3.8) of door simpelweg een nieuwe partij buffer te gebruiken. Bovendien kunnen misvormde gastheerembryo's in kiembaantransplantatie-experimenten het gevolg zijn van te hoge morfolinoconcentraties. Het is van cruciaal belang om voldoende morfolino te gebruiken om de wilde kiembaan van de gastheer volledig te aborteren, waardoor wordt voorkomen dat deze cellen bijdragen aan het nageslacht - maar tegelijkertijd moeten te hoge morfolinoconcentraties worden vermeden. Consistente morfolinohoeveelheden over alle geïnjecteerde gastheerembryo's (een paar honderd in een typisch experiment) zijn daarom de sleutel tot het succes van kiembaantransplantaties. Dit kan worden geholpen door de morfolino-injectiemix aan te vullen met een gemakkelijk zichtbare tracerkleurstof14, die kan worden gevolgd onder een fluorescentieseomicroscoop om ervoor te zorgen dat alle embryo's hetzelfde injectievolume krijgen.
De procedures die in dit protocol worden beschreven, omvatten uitsluitend manipulaties van cellen in blastula-stadium zebravis of medaka-embryo's, maar in de toekomst zal het waarschijnlijk mogelijk zijn om het apparaat aan te passen aan verschillende stadia en soorten door de diameter en vorm van de transplantatienaald te veranderen.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Dit project werd ondersteund door de Max Planck Society en ontving financiering van de European Research Council (ERC) in het kader van het Horizon 2020 onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie (subsidieovereenkomst nr. 637840 (QUANTPATTERN) en subsidieovereenkomst nr. 863952 (ACE-OF-SPACE)).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mm glass capillary, ends cut without filament | To make the transplantation needle | ||
| 1.0 mm glass capillary, ends cut with filament | To make injection needles | ||
| 200 mL glass beaker | For embryo dechorionation | ||
| 24-well plastic plate | To be coated with agarose in order to incubate embryos | ||
| 5 cm diameter glass Petri dish | For embryo dechorionation | ||
| 6-well plastic plate | To be coated with agarose in order to incubate embryos | ||
| Agarose | To coat plastic dishes | ||
| dnd1 morpholino | Gene Tools | Sequence: GCTGGGCATCCATGTCTCCGAC CAT |
|
| Embryo medium | 250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
| Fluorescence stereomicroscope with GFP/RFP filters and light source | To assess YSL injections and germ-line transplantations | ||
| Glass micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | To make the transplantation needle |
| Glass pasteur pipette | Kimble Chase (via Fisher) | 63A53WT | For pipetting embryos; the tips can be flamed to smoothen out the edge |
| Incubator at 28 °C | For incubating zebrafish embryos | ||
| Luer tip 25 μL Hamilton syringe, 1700 series | Hamilton | Ref: 80201 | Part of the transplantation device |
| Manual micromanipulator with 3 axes of movement | Narishige | M-152 | For controlling the transplantation device |
| Manual pipetting pump | Bio-Tek | Cat. # 641 | For use with the glass pipettes to transfer embryos |
| Metal dissecting probe | For moving and rotating zebrafish embryos | ||
| Microforge | Narishige | MF2 | To make the transplantation needle |
| Microinjection apparatus | For injection of mRNA and morpholino into embryos | ||
| Microinjection molds, triangular grooves | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare microinjection plates with agarose |
| Microinjection-molds, single wells | Adaptive Science Tools | PT-1 | To prepare transplantation plates with agarose |
| Micropipette holder with Luer fitting for a 1.0 mm glass capillary | World Precision Instruments | MPH6S10 | Part of the transplantation device |
| mMessage mMachine Sp6 transcription kit |
Life Technologies | AM1340M | To generate capped mRNA for injection into embryos |
| Plasmid with GFP-nos1 3'UTR | Plasmid that can be transcriped to produce mRNA encoding GFP with the 3'UTR of nos1 | ||
| Plastic petri dish 100 mm | To be coated with agarose in order to make injection and transplantation dishes | ||
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | For embryo dechorionation: Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos |
| Ringer’s solution | For 1 L: Add 6.78 g of NaCl, 0.22 g of KCl, 0.26 g of CaCl2 and 1.19 g of HEPES; then fill to 1 L; adjust pH to 7.2; sterilize by filtration | ||
| Stereomicroscope | For injection and transplantation |
References
- Spemann, H., Mangold, H. Induction of embryonic primordia by implantation of organizers from a different species. Archives for Microscopic Anatomy and Developmental Mechanics. 100 (3-4), 599-638 (1924).
- Müller, P., et al. Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system. Science. 336 (6082), 721-724 (2012).
- Donovan, P., et al. Paracrine Activin-A signaling promotes melanoma growth and metastasis through immune evasion. Journal of Investigative Dermatology. 137 (12), 2578-2587 (2017).
- Pomreinke, A. P., et al. Dynamics of BMP signaling and distribution during zebrafish dorsal-ventral patterning. eLife. 6, 25861 (2017).
- Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signaling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
- Soh, G. H., Pomreinke, A. P., Müller, P. Integration of Nodal and BMP signaling by mutual signaling effector antagonism. Cell Reports. 31 (1), 107487 (2020).
- Mahalwar, P., Walderich, B., Singh, A. P., Nüsslein-Volhard, C. Local reorganization of xanthophores fine-tunes and colors the striped pattern of zebrafish. Science. 345 (6202), 1362-1364 (2014).
- Frohnhöfer, H. G., Krauss, J., Maischein, H. M., Nüsslein-Volhard, C. Iridophores and their interactions with other chromatophores are required for stripe formation in zebrafish. Development. 140 (14), 2997-3007 (2013).
- Chen, Y., Schier, A. F. The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen. Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).
- Ciruna, B., et al. Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germline replacement. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (23), 14919-14924 (2002).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edn. , University of Oregon Press. (2000).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (29), e1394 (2009).
- Capek, D., Müller, P. Positional information and tissue scaling during development and regeneration. Development. 146 (24), 177709 (2019).
- Rogers, K. W., Bläßle, A., Schier, A. F., Müller, P. Measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (FDAP). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52266 (2015).
- Carvalho, L., Heisenberg, C. P. The yolk syncytial layer in early zebrafish development. Trends in Cell Biology. 20 (10), 586-592 (2010).
- Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Dechorionation of medaka embryos and cell transplantation for the generation of chimeras. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2055 (2010).
- Centanin, L., Hoeckendorf, B., Wittbrodt, J. Fate restriction and multipotency in retinal stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 553-562 (2011).
