Summary
भ्रूणीय जोड़तोड़ जैसे कि कोशिकाओं का निष्कासन और प्रत्यारोपण प्रारंभिक विकास का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं। यह प्रोटोकॉल ज़ेब्राफ़िश भ्रूण में इन जोड़तोड़ को करने के लिए एक सरल और प्रभावी प्रत्यारोपण उपकरण का वर्णन करता है।
Abstract
शास्त्रीय भ्रूणीय जोड़तोड़, जैसे कोशिकाओं को हटाना और भ्रूण के भीतर या उसके बीच कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करना, जटिल विकास प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए शक्तिशाली तकनीकें हैं। ज़ेब्राफ़िश भ्रूण आदर्श रूप से इन जोड़तोड़ के लिए उपयुक्त हैं क्योंकि वे आसानी से सुलभ, आकार में अपेक्षाकृत बड़े और पारदर्शी हैं। हालांकि, सेल हटाने और प्रत्यारोपण के लिए पहले से विकसित उपकरण उपयोग करने के लिए बोझिल हैं या खरीदने के लिए महंगे हैं। इसके विपरीत, यहां प्रस्तुत प्रत्यारोपण उपकरण किफायती, इकट्ठा करने में आसान और उपयोग करने में आसान है। इस प्रोटोकॉल में, हम पहले प्रत्यारोपण डिवाइस के साथ-साथ व्यावसायिक और व्यापक रूप से उपलब्ध भागों से इसकी असेंबली को संभालने का परिचय देते हैं। फिर हम इसके उपयोग के लिए तीन अनुप्रयोगों को प्रस्तुत करते हैं: स्थानीयकृत स्रोतों से सिग्नल फैलाव का अध्ययन करने के लिए अस्थानिक क्लोन की पीढ़ी, आकार-कम भ्रूण का उत्पादन करने के लिए कोशिकाओं का निष्कासन, और मातृ-युग्मनज उत्परिवर्ती उत्पन्न करने के लिए जर्मलाइन प्रत्यारोपण। अंत में, हम दिखाते हैं कि उपकरण का उपयोग अन्य प्रजातियों जैसे कि जापानी चावल मछली मेडका में भ्रूण संबंधी जोड़तोड़ के लिए भी किया जा सकता है।
Introduction
Mangold और Spemann के शास्त्रीय प्रयोगों से, जो एक भ्रूण अक्ष 1 के गठन का निर्देश देने वाले एक आयोजक के अस्तित्व का प्रदर्शन करते हैं, भ्रूण के बीच कोशिकाओं का प्रत्यारोपण भ्रूण के विकास का अध्ययन करने के लिए एक स्थापित तकनीक बन गया है2,3,4,5,6,7,8,9,10 . प्रत्यारोपण के लिए आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले सेटअप में एक माइक्रोमीटर ड्राइव-नियंत्रित गैस-तंग सिरिंज होती है जो लचीली टयूबिंग के माध्यम से एक माइक्रोपिपेट धारक से जुड़ी होती है और खनिज तेल 12,13 से भरा एक जलाशय होता है। इस सेटअप में, सिरिंज के प्लंजर को एक पेंच के माध्यम से ले जाया जाता है। इस तरीके से उत्पन्न दबाव को माइक्रोपिपेट में स्थानांतरित कर दिया जाता है और एक भ्रूण से कोशिकाओं को बाहर निकालने और उन्हें दूसरे में जमा करने के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, इस हाइड्रोलिक रूप से संचालित डिवाइस में कई भाग होते हैं और खरोंच से इकट्ठा करने के लिए श्रमसाध्य है। इसी तरह के उपकरणों को एक पूर्ण कार्य सेट के रूप में भी खरीदा जा सकता है, आमतौर पर मैनुअल माइक्रोइंजेक्टर्स के रूप में बेचा जाता है, और इन वाणिज्यिक संस्करणों की लागत आमतौर पर 1500 यूएस $ से अधिक होती है। घर के बने और वाणिज्यिक संस्करण दोनों में, भ्रूण हेरफेर के लिए माइक्रोपिपेट को तेल से भरे टयूबिंग के माध्यम से दबाव पैदा करने वाले डिवाइस (गैस-तंग सिरिंज) से अलग किया जाता है। माइक्रोपिपेट के हेरफेर और प्लंजर के आंदोलन, इसलिए, अलग-अलग हाथों से अलग-अलग संचालित किया जाना चाहिए, जिससे थ्रूपुट और उपयोगिता कम हो जाती है। इसके अलावा, उपकरणप्रतिरोपण के लिए तैयार करने के लिए बोझिल हैं क्योंकि ट्यूबिंग को बुलबुले के गठन से बचने के दौरान तेल से सावधानीपूर्वक भरने की आवश्यकता होती है। यहां, हम सेल हटाने और प्रत्यारोपण के लिए एक वैकल्पिक वायवीय रूप से संचालित डिवाइस का वर्णन करते हैं जो सस्ती, इकट्ठा करने में आसान और उपयोग करने में आसान है।
यहां प्रस्तुत डिवाइस में एक माइक्रोपिपेट धारक के साथ फिट 25 μL गैस-तंग सिरिंज शामिल है और इसकी लागत कुल मिलाकर 80 अमेरिकी डॉलर से कम है। डिवाइस आसानी से Luer ताला फिटिंग (चित्रा 1A) के माध्यम से सिरिंज में माइक्रोपिपेट धारक डालने के द्वारा इकट्ठा किया जाता है। डिवाइस को तब सीधे एक माइक्रोमैनिपुलेटर पर लगाया जाता है, जिससे उपयोगकर्ता को अपनी स्थिति और सक्शन दोनों को सीधे माइक्रोमैनिपुलेटर पर एक ही हाथ से नियंत्रित करने की अनुमति मिलती है। यह आसानी से दूसरे हाथ को स्थिर करने और दाता और मेजबान भ्रूण युक्त प्रत्यारोपण पकवान को स्थानांतरित करने के लिए स्वतंत्र छोड़ देता है। डिवाइस हवा के साथ प्रत्यक्ष सक्शन द्वारा काम करता है और खनिज तेल से भरने की आवश्यकता नहीं है। पानी और कांच की सुई की दीवारों के बीच आकर्षक बलों के कारण, सिरिंज के प्लंजर में एक बड़े आंदोलन को सुई के भीतर पानी के स्तर में एक छोटे से आंदोलन में अनुवादित किया जाता है, जब तक कि पानी का स्तर कांच की सुई के पतले अंत में होता है। यह एस्पिरेटेड कोशिकाओं की संख्या और उनके सम्मिलन के स्थान पर सटीक नियंत्रण की अनुमति देता है।
इस डिवाइस की उपयोगिता का प्रदर्शन करने के लिए, हम ज़ेबराफ़िश (डैनियो रीरियो) भ्रूण में तीन अनुप्रयोगों को प्रस्तुत करते हैं। सबसे पहले, हम दिखाते हैं कि स्रावित सिग्नलिंग अणुओं के स्थानीयकृत स्रोतों को कैसे उत्पन्न किया जाए, जिसका उपयोग ग्रेडिएंट गठन 2,4,6 का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। यहां, दाता भ्रूण को एमआरएनए एन्कोडिंग के साथ इंजेक्ट किया जाता है जो फ्लोरोसेंटली लेबल वाले सिग्नलिंग अणु को एन्कोडिंग करता है। प्रतिदीप्ति-लेबल वाले दाता कोशिकाओं को तब जंगली-प्रकार के मेजबान भ्रूण में प्रत्यारोपित किया जाता है जहां सिग्नल ग्रेडिएंट के गठन को चित्रित और विश्लेषण किया जा सकता है। दूसरा, हम वर्णन करते हैं कि डिवाइस का उपयोग आकार-कम भ्रूण 5,13 उत्पन्न करने के लिए एक्सटिर्पेशन द्वारा कोशिकाओं को हटाने के लिए कैसे किया जा सकता है। अंत में, हम दिखाते हैं कि मेजबान भ्रूण में एक आदिम रोगाणु सेल रिपोर्टर ले जाने वाली कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करके मातृ-युग्मनज उत्परिवर्ती का मजबूत उत्पादन कैसे किया जाए, जिसमें रोगाणु रेखा को 6,10 से अधिक किया गया था। भविष्य में, यहां वर्णित प्रत्यारोपण उपकरण को आसानी से अन्य भ्रूणीय जोड़तोड़ के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जिसके लिए कोशिकाओं को हटाने या प्रत्यारोपण की आवश्यकता होती है।
Protocol
1. इकट्ठा करने और प्रत्यारोपण डिवाइस का उपयोग कर
- प्रत्यारोपण डिवाइस को इकट्ठा करना.
- Luer टिप 25 μL गैस तंग सिरिंज और Luer ताला फिटिंग के साथ एक माइक्रोपिपेट धारक से कनेक्ट करने के लिए प्रत्यारोपण डिवाइस (चित्रा 1A) को इकट्ठा करने के लिए.
नोट: पानी की एक पतली फिल्म के साथ Luer टिप गीला पानी आसंजन और सामंजस्य के माध्यम से भागों को एक साथ पकड़कर कनेक्शन को बढ़ाने में मदद कर सकते हैं। - डिवाइस को सीधे एक मैनुअल माइक्रोमैनिपुलेटर (चित्रा 1 बी) पर माउंट करें। डिवाइस को अकेले प्रमुख हाथ से नियंत्रित किया जा सकता है, अतिरिक्त कार्यों के लिए दूसरे हाथ को मुक्त किया जा सकता है।
- Luer टिप 25 μL गैस तंग सिरिंज और Luer ताला फिटिंग के साथ एक माइक्रोपिपेट धारक से कनेक्ट करने के लिए प्रत्यारोपण डिवाइस (चित्रा 1A) को इकट्ठा करने के लिए.
- प्रत्यारोपण सुई तैयार करना।
- एक माइक्रोपिपेट खींचने के साथ एक ग्लास केशिका पिपेट (फिलामेंट के बिना) खींचकर एक प्रत्यारोपण सुई का उत्पादन करें।
- सुई की नोक को जितना संभव हो सके आसानी से तोड़ दें, क्योंकि तेज किनारों से प्रत्यारोपण करते समय जर्दी को खरोंचने की संभावना बढ़ जाती है, जो भ्रूण के लिए घातक है।
नोट: टिप को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत सीधे किनारे वाले रेजर ब्लेड के साथ आसानी से तोड़ा जा सकता है। हालांकि, एक माइक्रोफोर्ज का उपयोग करना वांछित आकार का एक सटीक उद्घाटन उत्पन्न करने की अनुमति देता है। अस्थानिक स्रोत पीढ़ी के लिए, लगभग 50-60 μm का एक बाहरी व्यास उपयुक्त है। extirpations और जर्मलाइन प्रत्यारोपण के लिए, सुई के बाहरी व्यास को प्रत्यारोपित कोशिकाओं की संख्या बढ़ाने के लिए लगभग 80-90 μm को मापना चाहिए। - प्रतिरोपण डिवाइस में उपयोग के लिए तैयार सुई डालें (चित्रा 1A)।
- प्रत्यारोपण डिवाइस का उपयोग करना।
- एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप (चित्रा 1 बी) के बगल में प्रत्यारोपण डिवाइस के साथ माइक्रोमैनिपुलेटर रखें।
- प्लंजर को हटा दें और ट्रांसप्लांटेशन सुई को रिंगर के समाधान से भरे प्रत्यारोपण पकवान में कम करें (चरण 2.2.1 देखें) 45 ° कोण पर जब तक कि सुई की नोक विसर्जित न हो जाए (चित्रा 1 बी)। केशिका कार्रवाई के कारण पानी सुई पर चढ़ जाएगा।
- रिंगर के समाधानों को बाहर निकालने के लिए प्लंजर को लगभग आधे रास्ते में डालें, सुई के पतले, पतले हिस्से में पानी की केवल एक छोटी मात्रा छोड़ दें (चित्रा 1 सी)।
नोट: यह तटस्थ स्थिति है, और पानी का स्तर थोड़ी देर के लिए स्थिर होना चाहिए (>20 मिनट)। यदि पानी का स्तर अस्थिर है, तो हवा लीक हो रही है; Luer ताला फिटिंग reconnect या सिरिंज को बदलें. - पहली बार प्रत्यारोपण सुई का उपयोग करते समय, एक बलिदान किए गए भ्रूण से जर्दी खींचकर और फिर जर्दी सामग्री को पूरी तरह से निष्कासित करके इसके अंदर कोट करें। कोटिंग बाद की प्रक्रियाओं के दौरान कांच के लिए कोशिकाओं के पालन को कम करने में मदद करेगी।
- सुई की मदद से दाता भ्रूण को धीरे से रखें और फिर सुई को भ्रूण की सतह पर ऑर्थोगोनल खोलने की स्थिति दें (चित्रा 1 डी)।
नोट: स्थिति विभिन्न assays के लिए अलग हो जाएगा. एक्टोपिक सिग्नलिंग अणु स्रोत पीढ़ी और सेल extirpations के लिए, यह पशु ध्रुव (चित्रा 1E) के शीर्ष पर होगा; जर्मलाइन प्रत्यारोपण के लिए, यह मार्जिन होगा (चित्रा 1 डी, एफ)। - धीरे-धीरे और सावधानी से सुई में कोशिकाओं को आकर्षित करने के लिए प्लंजर को खींचें।
नोट:: यदि कक्षों को बहुत तेज़ी से लिया जाता है, तो वे क्षतिग्रस्त हो सकते हैं. यदि सही ढंग से किया जाता है, तो कोशिकाओं को बेलनाकार स्तंभ के रूप में बाहर आना चाहिए। सुई में जर्दी लेने से बचें, क्योंकि प्रत्यारोपित जर्दी मेजबान भ्रूण के लिए विषाक्त है। - कोशिकाओं की वांछित संख्या में खींचे जाने के बाद प्लंजर को धीरे से थोड़ा नीचे धकेलकर चूषण को रोकें। एक छोटी और तेज गति में सुई को साइड में मरोड़कर भ्रूण से सुई को हटा दें। सेल कॉलम के दोनों ओर कुछ रिंगर के समाधान को छोड़ दें, और कोशिकाओं को सुई के पतले अंत तक सीमित करें (चित्रा 1 सी, डी)।
नोट:: सेल स्तंभ के सामने तरल सेल स्तंभ जमा करते समय मेजबान भ्रूण की कोशिकाओं को अलग करने के लिए मजबूर करने में मदद करेगा। - प्लंजर को धीरे-धीरे ऊपर और नीचे ले जाकर किसी भी शेष जर्दी या सेल मलबे को साफ करें - जबकि सुई डूबी हुई रहती है - रिंगर के समाधान के साथ कोशिकाओं को धोने के लिए। यदि सही ढंग से किया जाता है, तो मलबे को धोए जाने के दौरान अक्षतिग्रस्त कोशिकाएं एक कॉलम में एक साथ चिपकी रहेंगी।
नोट: इस कदम के दौरान बहुत सावधानी बरतनी चाहिए क्योंकि पानी का स्तर सुई के पतले अंत से पहले बढ़ जाएगा। इससे अचानक पानी की आमद हो जाएगी, जिसका उपयोग कोशिकाओं को धोने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, एक बार जब पानी का स्तर पतला अंत से गुजर जाता है, तो प्लंजर के साथ ठीक नियंत्रण कम हो जाएगा, और प्लंजर को अधिक धीरे-धीरे और सावधानी से स्थानांतरित किया जाना चाहिए। - मेजबान भ्रूण (चित्रा 1 डी-एफ) की सतह (या तो पशु ध्रुव या मार्जिन) पर सुई ओर्थोगोनल की स्थिति के लिए गैर-प्रमुख हाथ के साथ प्रत्यारोपण पकवान को स्थानांतरित करें।
- धीरे से थोड़ा दबाव लागू करें, और फिर मेजबान भ्रूण की आवरण परत को छेदने के लिए एक तेज, तेज आंदोलन दें। ध्यान रखें कि सुई के साथ जर्दी को खरोंच न करें।
नोट: अच्छी तरह से दीवारों के खिलाफ ध्यान से निचोड़कर भ्रूण पर थोड़ा दबाव डालने से भ्रूण की सतह का तनाव बढ़ जाता है और इस प्रकार आवरण परत के भेदी की सुविधा होती है। - एक बार जब सुई अंदर होती है, तो धीरे-धीरे प्लंजर को भ्रूण में कोशिकाओं के कॉलम को बाहर निकालने के लिए धक्का दें, जबकि धीरे-धीरे एक ही समय में सुई को पीछे हटा दें (चित्रा 1 डी-एफ)।
- प्रत्यारोपण सुई की सफाई.
- प्लंजर को ऊपर और नीचे ले जाकर सुई को कुल्ला करें, जबकि सुई विआयनीकृत पानी में डूबी हुई है।
नोट: यदि सुई गंदी रहती है, तो इसे पानी के साथ फिर से धोने से पहले इसे 10 एम सोडियम हाइड्रॉक्साइड समाधान के साथ कुल्ला करें। - आगे के उपयोग के लिए सुई को एक उपयुक्त बॉक्स में संग्रहीत करें।
- प्लंजर को ऊपर और नीचे ले जाकर सुई को कुल्ला करें, जबकि सुई विआयनीकृत पानी में डूबी हुई है।
2. ज़ेब्राफ़िश भ्रूण में स्रावित सिग्नलिंग अणुओं के अस्थानिक स्रोतों का उत्पादन
- मेजबान और दाता भ्रूण तैयार करना।
- zebrafish संभोग द्वारा ताजा रखी भ्रूण ले लीजिए.
- एक छोटे से ग्लास पेट्री डिश में लगभग 15 मिनट के लिए प्रोनेस समाधान के 0.5 मिलीग्राम / एमएल में 100 भ्रूण तक इनक्यूबेट करके 1-सेल चरण ज़ेब्राफ़िश भ्रूण को अलग करना (इस प्रक्रिया का एक विस्तृत विवरण रोजर्स, के डब्ल्यू एट अल.14 द्वारा प्रकाशित किया गया है)।
नोट: वैकल्पिक रूप से, भ्रूण को प्रत्यारोपण (चरण 2.2) से ठीक पहले उच्च चरण में डिकोरियोनेटेड भी किया जा सकता है, लेकिन इसके लिए इंजेक्ट किए गए दाता भ्रूण और बिना इंजेक्शन वाले मेजबान भ्रूण को अलग से डिकोरियोनेटेड करने की आवश्यकता होती है। - भ्रूण को 200 मिली बीकर में भ्रूण माध्यम में डुबोएं।
नोट: Dechorionated ब्लास्टुला और gastrula चरण भ्रूण बहुत नाजुक हैं। उनकी उजागर जर्दी प्लास्टिक की सतहों का पालन करेगी और हवा के संपर्क में आने पर टूट जाएगी। इसलिए, उन्हें भ्रूण माध्यम में पूरी तरह से डूबे रहना चाहिए, एक ग्लास पिपेट के साथ स्थानांतरित किया जाना चाहिए, और या तो एगारोज़-लेपित (भ्रूण माध्यम में 1%) प्लास्टिक व्यंजनों या ग्लास पेट्री व्यंजनों में बनाए रखा जाना चाहिए। - अधिकांश भ्रूण माध्यम को सावधानीपूर्वक खाली करें और धीरे-धीरे बीकर को ताजा भ्रूण माध्यम से भरें। इस तरह से होने वाले हल्के आंदोलन से कमजोर चोरियों को हटाने में मदद मिलेगी। इस चरण को 2-3 बार दोहराएं।
- एक कांच पाश्चर पिपेट का उपयोग करके एक agarose-लेपित इंजेक्शन पकवान में dechorionated भ्रूण हस्तांतरण.
नोट: कांच पाश्चर पिपेट की नोक को एक बुनसेन बर्नर लौ के संपर्क में लाकर सूजन पिघल सकती है और किनारे को चिकना कर सकती है, जिससे भ्रूण को नुकसान को रोकने में मदद मिलती है। - भ्रूण के सबसेट में फ्लोरोसेंटली टैग किए गए प्रोटीन को एन्कोडिंग करने वाले एमआरएनए को इंजेक्ट करें (इस प्रक्रिया का एक विस्तृत विवरण रोजर्स, के डब्ल्यू एट अल.14 द्वारा प्रकाशित किया गया है)। निकट-सजातीय अभिव्यक्ति के लिए एमआरएनए को सेल में इंजेक्ट करें, न कि जर्दी। इंजेक्ट किए गए भ्रूण दाताओं के रूप में काम करेंगे, जबकि बिना इंजेक्शन वाले भ्रूण मेजबान के रूप में काम करेंगे।
नोट: इंजेक्ट किए गए एमआरएनए की मात्रा और प्रकार अध्ययन किए जा रहे सिग्नलिंग अणु पर निर्भर करेगा और आमतौर पर 20 से 200 पीजी 2, 4,5,6 तक होता है (लेकिन कुछ मामलों में 1000 पीजी के रूप में उच्च हो सकता है4)। - इंजेक्ट किए गए भ्रूण को भ्रूण माध्यम से भरे एक एगारोज़-लेपित छह-अच्छी तरह से पकवान में स्थानांतरित करें। 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक कि भ्रूण प्रारंभिक क्षेत्र चरण तक नहीं पहुंच जाता।
- अस्थानिक स्रोतों को उत्पन्न करने के लिए कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करना।
- रिंगर के समाधान (116 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM CaCl2, 5 mM HEPES) के साथ एक प्रत्यारोपण पकवान (व्यक्तिगत त्रिकोणीय कील के आकार के कुओं के साथ, सामग्री की तालिका देखें) भरें; HEPES बफर को 4 °C पर स्टोर करें।
नोट: रिंगर के समाधान में कैल्शियम सेल आसंजन को बढ़ावा देता है और भ्रूण को प्रत्यारोपण प्रक्रिया से चंगा करने में मदद करता है। - भ्रूण को प्रत्यारोपण पकवान में स्थानांतरित करें।
- प्रत्यावर्ती स्तंभों में मेजबान और दाता भ्रूण की स्थिति, प्रत्येक मामले में प्रत्यारोपण सुई की ओर उन्मुख पशु ध्रुव के साथ।
- धारा 1.3 में वर्णित के रूप में प्रत्यारोपण करें। एक्टोपिक स्रोत प्रत्यारोपण के लिए, पशु ध्रुव के शीर्ष से स्रोत कोशिकाओं को लें और उन्हें मेजबान भ्रूण (चित्रा 1 ई) में एक ही स्थान पर जमा करें।
नोट: चरण 1.3.8 में विस्तृत के रूप में रिंगर के समाधान के साथ कोशिकाओं को धोना अस्थानिक स्रोत पीढ़ी के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि पहले से ही स्रावित सिग्नलिंग अणुओं को होस्ट पर नहीं ले जाया जाता है। यह सुनिश्चित करने के लिए बहुत अधिक कोशिकाओं का प्रत्यारोपण न करें कि स्रोत बिखरा हुआ नहीं है। व्यास में लगभग 80 μm और लंबाई में 100 μm एक स्तंभ कई अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है। - मेजबान भ्रूण को ठीक होने के लिए 30 मिनट से 1 घंटे तक रिंगर के समाधान में रहने की अनुमति दें।
- जांचें कि क्या कोशिकाओं को प्रतिदीप्ति स्टीरियोमाइक्रोस्कोप (चित्रा 2) का उपयोग करके सफलतापूर्वक प्रत्यारोपित किया गया था।
- वसूली के बाद, भ्रूण को भ्रूण माध्यम से भरे एक एगारोज़-लेपित छह-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें और उन्हें 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- रिंगर के समाधान (116 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM CaCl2, 5 mM HEPES) के साथ एक प्रत्यारोपण पकवान (व्यक्तिगत त्रिकोणीय कील के आकार के कुओं के साथ, सामग्री की तालिका देखें) भरें; HEPES बफर को 4 °C पर स्टोर करें।
3. कोशिका extirpation द्वारा आकार कम भ्रूण उत्पन्न
- extirpation के लिए भ्रूण तैयार करना।
- वांछित जीनोटाइप के ज़ेब्राफ़िश से ताजा रखे गए भ्रूण ों को इकट्ठा करें।
- भ्रूण को 28 डिग्री सेल्सियस पर तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि वे उच्च चरण तक न पहुंच जाएं।
- जब भ्रूण उच्च अवस्था तक पहुँचजाता है तो चरण 2.1.2-2.1.5 में वर्णित भ्रूण को विघटित करें।
नोट:: इस उदाहरण में, कक्ष extirpation क्षेत्र चरण पर किया जाता है। तदनुसार, भ्रूण को लगभग 30 मिनट से 1 घंटे पहले डिकोरियोनेटेड किया जाता है।
- वैकल्पिक: जर्दी syncytial परत (YSL) लेबलिंग.
नोट:: यदि वांछित है, तो कोशिकाओं extirpating से पहले YSL में फ्लोरोसेंट dextrans इंजेक्ट करें। यह तकनीक यह निर्धारित करने की अनुमति देती है कि क्या वाईएसएल सेल हटाने के बाद बरकरार रहता है, जो सामान्य भ्रूणजनन 15 के लिए महत्वपूर्ण है। वैकल्पिक रूप से, इन विट्रो संश्लेषित एमआरएनए या प्रोटीन को वाईएसएल में भी इंजेक्ट किया जा सकता है।- भ्रूण के पानी से भरे एक agarose-लेपित इंजेक्शन पकवान के लिए dechorionated भ्रूण स्थानांतरित करने के लिए एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करें।
- भ्रूण को पार्श्व रूप से उन्मुख करें, ब्लास्टोडर्म मार्जिन इंजेक्शन सुई की ओर इशारा करते हुए (चित्रा 3 ए)।
- YSL में 1.5 μg / μL 10 kDA Alexa568-Dextran के 0.5 nL इंजेक्ट करें, भ्रूण के व्यास के लगभग एक तिहाई की गहराई पर ब्लास्टोडर्म कोशिकाओं और जर्दी के बीच एक क्षेत्र के लिए लक्ष्य। एक पंक्ति के भीतर सभी भ्रूण इंजेक्ट करें।
नोट: चूंकि इंजेक्शन सुई को कोरियन के माध्यम से छेदने की आवश्यकता नहीं है, इसलिए एक छोटा (~ 4 μm) और तेज उद्घाटन फायदेमंद है। - भ्रूण को 180° तक घुमाएं ताकि ब्लास्टोडर्म मार्जिन का विपरीत पक्ष इंजेक्शन सुई (चित्रा 3 ए) की ओर इशारा कर रहा हो।
- YSL में 1.5 μg / μL 10 kDA Alexa568-Dextran के एक और 0.5 nL को इंजेक्ट करें जैसा कि चरण 3.2.3 में वर्णित है, जिससे प्रति भ्रूण 1 nL की कुल इंजेक्शन मात्रा उत्पन्न होती है।
नोट: दो पक्षों से इंजेक्शन YSL के भीतर फ्लोरोसेंट dextran के एक और भी वितरण के लिए अनुमति देता है। - एक प्रतिदीप्ति स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत इंजेक्शन के परिणाम की जांच करें। यदि सही ढंग से किया जाता है, तो फ्लोरोसेंट सिग्नल को वाईएसएल (चित्रा 3 बी) तक सीमित कर दिया जाएगा और ब्लास्टोडर्म के अंतरकोशिकीय स्थान में दिखाई नहीं देगा।
- बाह्य कोशिकाएँ
- रिंगर के समाधान के साथ एक प्रत्यारोपण पकवान भरें (चरण 2.2.1 देखें)।
- भ्रूण को प्रत्यारोपण पकवान में स्थानांतरित करें।
- प्रत्यारोपण सुई (चित्रा 3 सी) की ओर पशु ध्रुव के साथ भ्रूण उन्मुख।
- चरण 1.3.5-1.3.7 में वर्णित पशु ध्रुव क्षेत्र से कोशिकाओं को सावधानीपूर्वक हटा दें, जिससे ब्लास्टोडर्म को वांछित आकार में कम किया जा सके।
- हटाए गए कोशिकाओं को प्रत्यारोपण सुई से निष्कासित करके छोड़ दें।
- एक बार प्रक्रिया पूरी हो जाने के बाद, भ्रूण को ठीक होने के लिए 30 मिनट से 1 घंटे तक रिंगर के समाधान में रहने की अनुमति दें।
- वैकल्पिक: एक प्रतिदीप्ति स्टीरियोमाइक्रोस्कोप (चित्रा 3 डी) के तहत YSL की अखंडता की जांच करें।
- भ्रूण को भ्रूण माध्यम से भरे एक एगारोज़-लेपित प्लेट में स्थानांतरित करें और उन्हें 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
4. जर्मलाइन प्रत्यारोपण द्वारा मातृ-युग्मनज उत्परिवर्ती बनाना
- मेजबान और दाता भ्रूण तैयार करना।
- उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार के ज़ेब्राफ़िश दोनों से ताजा रखे गए भ्रूण एकत्र करें। एक उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि के साथ ज़ेब्राफ़िश से भ्रूण दाताओं के रूप में काम करेंगे, जबकि जंगली प्रकार की पृष्ठभूमि वाले ज़ेब्राफ़िश से भ्रूण मेजबान के रूप में काम करेंगे।
नोट: जर्मलाइन प्रत्यारोपण के लिए शुरुआती भ्रूण की एक उच्च संख्या की आवश्यकता होती है (~ दाताओं के लिए 50, मेजबानों के लिए ~ 500) सफल जर्मलाइन प्रत्यारोपण की एक अच्छी संख्या सुनिश्चित करने के लिए जो वयस्कता में जीवित रहते हैं। - एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके भ्रूण माध्यम के साथ एक agarose-लेपित इंजेक्शन पकवान के लिए भ्रूण स्थानांतरण।
नोट: इंजेक्शन थ्रूपुट बढ़ाने के लिए dechorionation से पहले किया जाता है। कोरियोन के माध्यम से इंजेक्शन के लिए सुइयों को कुंद होने की आवश्यकता होती है और क्लॉगिंग को रोकने के लिए एक बड़ा उद्घाटन (~ 10 μm) होता है। - एक nos1 3'UTR के साथ GFP एन्कोडिंग 100 ng / μL mRNA के 1 nL के साथ दाता भ्रूण इंजेक्ट करें। थ्रूपुट को बढ़ाने के लिए जर्दी में एमआरएनए इंजेक्ट करें।
नोट: nos1 3'UTR आदिम रोगाणु कोशिकाओं में mRNA को स्थिर करेगा, जिससे रोगाणु कोशिकाएं दृढ़ता से फ्लोरोसेंट हो जाती हैं जब 1 दिन के बाद निषेचन 10 की छवि बनाई जाती है। - 0.33 mM (3 μg / μL) मृत अंत (dnd) morpholino के 1 nL के साथ मेजबान भ्रूण इंजेक्ट करें। थ्रूपुट को बढ़ाने के लिए जर्दी में मॉर्फोलिनो इंजेक्ट करें।
नोट: डीएनडी मॉर्फोलिनो आदिम रोगाणु कोशिका गठन को अवरुद्ध करता है, जो यह सुनिश्चित करता है कि मेजबान भ्रूण की जर्मलाइन विशेष रूप से प्रत्यारोपण के बाद दाता से कोशिकाओं के साथ आबाद होगी10। - भ्रूण माध्यम के साथ प्लास्टिक पेट्री व्यंजन के लिए इंजेक्ट किए गए भ्रूण को स्थानांतरित करें। 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक कि भ्रूण उच्च चरण तक नहीं पहुंच जाता।
- जब भ्रूण उच्च अवस्था तक पहुँचजाता है तो चरण 2.1.2-2.1.5 में वर्णित भ्रूण को विघटित करें।
- उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार के ज़ेब्राफ़िश दोनों से ताजा रखे गए भ्रूण एकत्र करें। एक उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि के साथ ज़ेब्राफ़िश से भ्रूण दाताओं के रूप में काम करेंगे, जबकि जंगली प्रकार की पृष्ठभूमि वाले ज़ेब्राफ़िश से भ्रूण मेजबान के रूप में काम करेंगे।
- रोगाणु कोशिकाओं का प्रतिरोपण
- रिंगर के समाधान के साथ एक प्रत्यारोपण पकवान भरें (चरण 2.2.1 देखें)।
- डिकोरियोनेटेड गोले को गुंबद-चरण के भ्रूण को प्रत्यारोपण पकवान में स्थानांतरित करें।
- एक दाता भ्रूण से छह अलग-अलग मेजबान भ्रूणों में कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करने के लिए वैकल्पिक स्तंभों में मेजबान भ्रूण और दाता भ्रूण की स्थिति। यह संभावना बढ़ जाती है कि किसी दिए गए मेजबान भ्रूण से रोगाणु कोशिकाओं को सफलतापूर्वक प्रत्यारोपित किया जाएगा।
- प्रत्यारोपण सुई की ओर मार्जिन के साथ भ्रूण को उन्मुख करें और धारा 1.3 में वर्णित के रूप में प्रत्यारोपण करें। जर्मलाइन प्रत्यारोपण (चित्रा 1 डी, एफ) के लिए, मार्जिन से स्रोत कोशिकाओं को लें (जहां आदिम रोगाणु कोशिकाएं स्थित हैं) और उन्हें मेजबान भ्रूण में एक ही स्थान पर जमा करें।
नोट: एक बड़े स्तंभ (व्यास में लगभग 80 μm और लंबाई में 600 μm) प्रत्यारोपण एक सफल जर्मलाइन प्रत्यारोपण प्राप्त करने की संभावना में वृद्धि होगी। - प्रत्यारोपण पूरा होने के बाद ठीक होने के लिए भ्रूण को 30 मिनट से 1 घंटे के लिए रिंगर के समाधान में रहने की अनुमति दें।
नोट: यदि सभी दाता भ्रूण को होमोजीगस म्यूटेंट होने की उम्मीद नहीं है - उदाहरण के लिए, यदि वे विषमयुग्मजी इनक्रॉस के परिणामस्वरूप होते हैं - तो उन्हें मेजबान के प्रत्यारोपित भविष्य के जर्मलाइन के जीनोटाइप को निर्धारित करने के लिए प्रत्यारोपण के बाद जीनोटाइप करने की आवश्यकता होती है। इस मामले में, सुनिश्चित करें कि मेजबान और दाता भ्रूण की स्थिति हैंडलिंग के दौरान मिश्रित नहीं होती है। - यह जांचने के लिए एक प्रतिदीप्ति स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करें कि कोशिकाओं को सफलतापूर्वक प्रत्यारोपित किया गया था या नहीं (चित्रा 4 ए, बी)।
- भ्रूण को 24-अच्छी तरह से agarose-लेपित प्लेट में स्थानांतरित करें। एक ही दाता से कोशिकाओं को प्राप्त करने वाले सभी मेजबान भ्रूणों को एक ही कुएं में समूहीकृत करें और तदनुसार उन्हें लेबल करें। उन्हें अगले दिन तक 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- यदि आवश्यक हो, तो दाता भ्रूण को जीनोटाइपिंग के लिए लेबल किए गए पीसीआर स्ट्रिप्स में स्थानांतरित करें।
- सफल जर्मलाइन प्रत्यारोपण के लिए स्क्रीनिंग
- एक प्रतिदीप्ति स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत सफल जर्मलाइन प्रत्यारोपण के लिए मेजबान भ्रूण को स्क्रीन लगभग 30 ज पोस्ट-निषेचन (एचपीएफ)। रोगाणु कोशिकाएं जर्दी विस्तार (चित्रा 4 सी) के ऊपर नाली में पाई जाती हैं।
नोट: यहां प्रस्तुत डिवाइस और रणनीति के साथ विशिष्ट प्रयोगों में प्रतिदाता भ्रूण प्रति प्रतिरोपित रोगाणु कोशिकाओं को ले जाने वाले कम से कम एक मेजबान भ्रूण प्राप्त करने के लिए ~ 60% -80% की सफलता दर होगी। एक पिछली रिपोर्ट में एक ~ 10% दक्षता 10 का वर्णन किया गया था। - यदि लागू हो, तो उन भ्रूणों को छोड़ दें जो एक गलत जीनोटाइप के साथ दाता भ्रूण से कोशिकाओं को प्राप्त करते हैं। मानक पशुपालन स्थितियों के अनुसार वयस्कता के लिए सफलतापूर्वक प्रत्यारोपित रोगाणु कोशिकाओं के साथ लार्वा उगाएं और संस्थागत दिशानिर्देशों का पालन करें।
- एक प्रतिदीप्ति स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत सफल जर्मलाइन प्रत्यारोपण के लिए मेजबान भ्रूण को स्क्रीन लगभग 30 ज पोस्ट-निषेचन (एचपीएफ)। रोगाणु कोशिकाएं जर्दी विस्तार (चित्रा 4 सी) के ऊपर नाली में पाई जाती हैं।
Representative Results
ऊपर वर्णित तीन अनुप्रयोगों के लिए प्रत्यारोपण उपकरण के उपयोग में सफलता और विफलता का आकलन स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत दृश्य निरीक्षण द्वारा आसानी से किया जा सकता है। सफल प्रत्यारोपण में, भ्रूण को ब्लास्टोडर्म में बड़े आँसू के बिना, बिना किसी प्रत्यारोपित भ्रूण के लिए आकार और जर्दी की स्पष्टता में सामान्य और समान दिखना चाहिए। यदि भ्रूण स्पष्ट रूप से क्षतिग्रस्त है (चित्रा 4 बी), तो यह सामान्य रूप से विकसित नहीं होगा। आदर्श रूप से, एक फ्लोरोसेंट मार्कर को व्यक्त करने वाली प्रत्यारोपित कोशिकाओं को एक निरंतर स्तंभ के रूप में दिखाई देना चाहिए जब एक प्रतिदीप्ति स्टीरियोमाइक्रोस्कोप (चित्रा 2 ए, चित्रा 4 ए) के तहत देखा जाता है। यदि स्तंभ खंडित है, तो यह इंगित करता है कि कोशिकाओं को प्रत्यारोपण सुई में सक्शन द्वारा कतरनी की गई थी या कोशिकाओं का जमाव बहुत सख्ती से किया गया था। इसे प्लंजर को अधिक धीरे-धीरे और धीरे-धीरे स्थानांतरित करके रोका जा सकता है।
यद्यपि प्रत्यारोपण उपकरण का उपयोग मुख्य रूप से ब्लास्टुला चरणों 5,6 पर ज़ेब्राफ़िश भ्रूण पर किया गया है, प्रत्यारोपण और सेल एक्सटिर्पेशन जापानी चावल मछली मेडका (ओरिज़ियास लैटिप्स) (चित्रा 2 बी) के डिकोरियोनेटेड ब्लास्टुला-चरण भ्रूण के लिए भी काम करते हैं। भ्रूण dechorionation के अलावा, जो Porazinski, S. R. et al.17 द्वारा वर्णित किया गया है, ऊपर वर्णित के रूप में एक ही प्रक्रियाओं का पालन किया जा सकता है।
जर्मलाइन प्रत्यारोपण के विशिष्ट मामले में, एक अच्छा प्रत्यारोपण सीधे जर्दी मार्जिन (चित्रा 4 ए) के ऊपर कोशिकाओं के एक लंबे क्षैतिज स्तंभ के साथ एक भ्रूण में परिणाम होगा। हालांकि, क्या रोगाणु कोशिकाओं को सफलतापूर्वक प्रत्यारोपित किया गया था, इसका आकलन केवल अगले दिन (चित्रा 4 सी-एफ) ब्लास्टुला चरणों (चित्रा 1 एफ) पर जीएफपी की पृष्ठभूमि अभिव्यक्ति के कारण किया जा सकता है। आदिम रोगाणु कोशिकाएं जर्दी विस्तार (चित्रा 4 सी-ई) के ऊपर सीधे नाली में छोटे फ्लोरोसेंट गोले के रूप में दिखाई देंगी। सही स्थान पर इन कोशिकाओं की उपस्थिति सफल जर्मलाइन प्रत्यारोपण को इंगित करती है। एक अलग आकार वाली कोशिकाएं रोगाणु कोशिकाएं नहीं हैं (उदाहरण के लिए, लम्बी कोशिकाएं आमतौर पर मांसपेशियों की कोशिकाएं होती हैं, चित्रा 4 एफ)। इसके अलावा, यदि आदिम रोगाणु कोशिकाएं नाली के बाहर पाई जाती हैं, तो इसका मतलब है कि वे ठीक से स्थानांतरित करने में विफल रहे हैं, और वे भ्रूण की जर्मलाइन में योगदान करने में सक्षम नहीं होंगे। अंत में, प्रत्यारोपित भ्रूण की सामान्य आकृति विज्ञान को अनट्रांसप्लांटेड भ्रूण (चित्रा 4 डी) के समान दिखाई देना चाहिए; पूंछ को विकृत नहीं किया जाना चाहिए, और सिर को सिकुड़ा हुआ या गायब आंखें नहीं होनी चाहिए (चित्रा 4 ई)। ये दोष आमतौर पर अत्यधिक उच्च मॉर्फोलिनो सांद्रता या प्रत्यारोपण के दौरान भ्रूण क्षति के परिणामस्वरूप होते हैं। जर्मलाइन प्रत्यारोपण प्रयोगों के रूप में यहाँ वर्णित आमतौर पर 6 मेजबान भ्रूण में से 1-2 में परिणाम होगा सफलतापूर्वक 60% -80% दाता भ्रूण के लिए रोगाणु कोशिकाओं के लिए प्रत्यारोपित रोगाणु कोशिकाओं के साथ, प्रयोगकर्ता के अनुभव पर निर्भर करता है। इस प्रकार, 40-50 होमोजीगस दाता भ्रूण से कोशिकाओं को उत्परिवर्ती रोगाणु कोशिकाओं के साथ लगभग 30 व्यक्तियों को बढ़ाने के लिए 200-300 मेजबान भ्रूण में प्रत्यारोपित करने की आवश्यकता होती है।
चित्र1: ट्रांसप्लांटेशन डिवाइस की असेंबली और उपयोग। (A) ट्रांसप्लांटेशन डिवाइस को ल्यूयर लॉक फिटिंग के माध्यम से माइक्रोपिपेट धारक के साथ गैस-तंग सिरिंज को जोड़कर इकट्ठा किया जाता है। प्रत्यारोपण के लिए कांच की सुई को फिर माइक्रोपिपेट धारक में डाला जाता है। (बी) एक माइक्रोमैनिपुलेटर पर घुड़सवार इकट्ठे प्रत्यारोपण उपकरण की तस्वीर (कृपया ध्यान दें कि पृष्ठभूमि और लेबल चित्र से हटा दिए गए हैं)। (सी) प्रत्यारोपण उपकरण का उपयोग करते समय, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि प्रत्यारोपण सुई में पानी का स्तर पतले अंत में बना रहे। (डी) डिवाइस का उपयोग एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत एक प्रत्यारोपण पकवान के व्यक्तिगत कुओं में रखे गए टेलीओस्ट भ्रूण से कोशिकाओं को वापस लेने और डालने के लिए किया जाता है। (ई) अस्थानिक स्रोतों की पीढ़ी के लिए, कोशिकाओं को दाता भ्रूण (i-ii) के पशु ध्रुव से लिया जाता है और एक मेजबान भ्रूण (iii-vi) के पशु ध्रुव में स्थानांतरित किया जाता है। (च) जर्मलाइन प्रत्यारोपण के लिए, एक दाता भ्रूण (i-ii) के मार्जिन से बड़ी संख्या में कोशिकाओं को लिया जाता है, जहां रोगाणु कोशिकाएं स्थित होती हैं। कोशिकाओं को तब मेजबान भ्रूण (iii-vi) के मार्जिन में स्थानांतरित कर दिया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: सेल प्रत्यारोपण द्वारा क्लोन उत्पन्न करना। (A) ज़ेब्राफ़िश दाता से ज़ेब्राफ़िश होस्ट भ्रूण में फ्लोरोसेंट कोशिकाओं (हरे) के अनुक्रमिक प्रत्यारोपण द्वारा उत्पन्न एक डबल क्लोन का उदाहरण। एकल और डबल क्लोन का उपयोग यह अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है कि कैसे स्रावित सिग्नलिंग अणु स्पैटिओटेम्पोरल ग्रेडिएंट 2,4,5,6 बनाते हैं। (बी) एक ट्रांसजेनिक ईजीएफपी-एक्सप्रेसिंग मेडका डोनर (विंबलडन) 17 से कोशिकाओं को जंगली-प्रकार के मेडका होस्ट में प्रत्यारोपित करके उत्पन्न एकल क्लोन का उदाहरण। स्केल बार 100 μm का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3: सेल एक्सटिर्पेशन द्वारा आकार-कम भ्रूण उत्पन्न करना। (ए) एक्सटिर्पेशन द्वारा कोशिकाओं को हटाने से पहले, वाईएसएल को वाईएसएल के दो विरोधी पक्षों में फ्लोरोसेंट रंजक इंजेक्ट करके लेबल किया जा सकता है। (बी) वाईएसएल इंजेक्शन के बाद एक भ्रूण का उदाहरण। (C) आकार-कम भ्रूण उत्पन्न करने के लिए, पशु ध्रुव से कोशिकाओं को extirpation5 द्वारा हटा दिया जाता है। (d) कोशिका निष्कासन के बाद एक भ्रूण का उदाहरण। ध्यान दें कि YSL बरकरार रहता है। स्केल बार 100 μm का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 4: जर्मलाइन प्रत्यारोपण( A) मेजबान के सीमांत क्षेत्र में दाता कोशिकाओं (हरे) के सफल प्रत्यारोपण का उदाहरण। (बी) एक असफल प्रत्यारोपण का उदाहरण। मेजबान भ्रूण की जर्दी गंभीर रूप से क्षतिग्रस्त हो गई थी, और भ्रूण सामान्य रूप से विकसित करने में सक्षम नहीं होगा। (सी) 30 एचपीएफ पर, सफलतापूर्वक प्रत्यारोपित रोगाणु कोशिकाएं पूरी तरह से जर्दी विस्तार के पूर्वकाल क्षेत्र में गोनाडल मेसोडर्म में पाई जाएंगी। (डी) एक सफल प्रत्यारोपण का उदाहरण जिसमें कई जीएफपी-लेबल वाले दाता रोगाणु कोशिकाओं ने मेजबान के भविष्य के गोनाड को पॉप्युलेट किया है। (ई) एक असफल प्रत्यारोपण का उदाहरण। यद्यपि रोगाणु कोशिकाएं गोनाडल मेसोडर्म तक पहुंच गई हैं, मेजबान भ्रूण गंभीर रूप से विकृत है और सामान्य रूप से विकसित नहीं होगा। (च) एक असफल प्रत्यारोपण का उदाहरण। फ्लोरोसेंट रोगाणु कोशिकाएं जो सही स्थान पर माइग्रेट करने में विफल रहीं, वे गोनाड्स को फिर से पॉप्युलेट नहीं करेंगी। स्केल बार 100 μm का प्रतिनिधित्व करते हैं। D-F में छवियों को लगभग 50x के कुल आवर्धन पर लिया गया था। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
एक प्रत्यारोपण प्रयोग की सफलता दृढ़ता से प्रयोगकर्ता के ठीक मोटर कौशल पर निर्भर करती है। प्रक्रियाओं को सफलतापूर्वक पूरा करने के लिए, अभ्यास की आवश्यकता होती है। हालांकि, यहां प्रस्तुत उपकरण बाजार पर दूसरों की तुलना में सीखने और उपयोग करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है, और, सामान्य तौर पर, केवल कुछ दिनों के अभ्यास की आवश्यकता होती है।
प्रत्यारोपण प्रक्रिया की सफलता को कई सावधानियां बरतकर बढ़ाया जा सकता है। एक कदम यह सुनिश्चित करना है कि माइक्रोमैनिपुलेटर अच्छी गुणवत्ता का है और चिकनी संचालन में सक्षम है। स्टीरियोमाइक्रोस्कोप में उच्च आवर्धन के साथ एक ओकुलर जोड़ने से भ्रूण के सापेक्ष सुई को ठीक से स्थिति में रखने में मदद मिल सकती है। स्वस्थ भ्रूण प्राप्त करने के लिए अच्छी तरह से प्रजनन जेब्राफ़िश या मेडका का उपयोग करना और हैंडलिंग के दौरान भ्रूण को नुकसान न पहुंचाने का ध्यान रखना (विशेष रूप से डिकोरियनेशन चरण के दौरान और बाद में) भी सफलता दर को बढ़ाएगा।
विलंबित विषाक्तता के साथ समस्याओं का निवारण करना अधिक कठिन हो सकता है। यदि कुछ घंटों के बाद एक भ्रूण मर जाता है - लेकिन प्रत्यारोपण के तुरंत बाद नहीं - जर्दी को सुई द्वारा क्षतिग्रस्त कर दिया गया हो सकता है (उदाहरण के लिए, भ्रूण में बहुत गहराई से प्रवेश करके), या शायद कोशिकाओं को बहुत बलपूर्वक बाहर निकाल दिया गया था। विलंबित विषाक्तता और भ्रूण की मृत्यु भी दाता कोशिकाओं के साथ इंजेक्ट की गई जर्दी या सेल मलबे के परिणामस्वरूप हो सकती है; एक और कारण रिंगर के समाधान में HEPES बफर बिगड़ सकता है। इन समस्याओं को कोशिकाओं को धोकर दूर किया जा सकता है (चरण 1.3.8 देखें) या बस क्रमशः बफर के एक नए बैच का उपयोग करके। इसके अलावा, जर्मलाइन प्रत्यारोपण प्रयोगों में विकृत मेजबान भ्रूण अत्यधिक उच्च मॉर्फोलिनो सांद्रता के परिणामस्वरूप हो सकता है। मेजबान के जंगली-प्रकार के जर्मलाइन को पूरी तरह से कम करने के लिए पर्याप्त मॉर्फोलिनो का उपयोग करना महत्वपूर्ण है, जिससे इन कोशिकाओं को संतानों में योगदान करने से रोका जा सकता है - लेकिन एक ही समय में, अत्यधिक उच्च मॉर्फोलिनो सांद्रता से बचने की आवश्यकता है। सभी इंजेक्ट किए गए मेजबान भ्रूण (एक विशिष्ट प्रयोग में कुछ सौ) में लगातार मॉर्फोलिनो मात्रा इसलिए जर्मलाइन प्रत्यारोपण की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। यह एक आसानी से दिखाई देने वाले अनुरेखक डाई 14 के साथ मॉर्फोलिनो इंजेक्शन मिश्रण को पूरक करके मदद की जा सकती है, जिसे यह सुनिश्चित करने के लिए एक प्रतिदीप्ति स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत ट्रैक किया जा सकता है कि सभी भ्रूण एक ही इंजेक्शन की मात्रा प्राप्त करते हैं।
इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रक्रियाओं में विशेष रूप से ब्लास्टुला-स्टेज ज़ेब्राफ़िश या मेडका भ्रूण में कोशिकाओं के जोड़तोड़ शामिल हैं, लेकिन भविष्य में, प्रत्यारोपण सुई के व्यास और आकार को बदलकर डिवाइस को विभिन्न चरणों और प्रजातियों के अनुकूल बनाना संभव होगा।
Disclosures
लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।
Acknowledgments
इस परियोजना को मैक्स प्लैंक सोसाइटी द्वारा समर्थित किया गया था और यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम (अनुदान समझौते संख्या 637840 (क्वांटपैटर्न) और अनुदान समझौते नंबर 863952 (एसीई-ओएफ-स्पेस)) के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) से धन प्राप्त हुआ था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mm glass capillary, ends cut without filament | To make the transplantation needle | ||
| 1.0 mm glass capillary, ends cut with filament | To make injection needles | ||
| 200 mL glass beaker | For embryo dechorionation | ||
| 24-well plastic plate | To be coated with agarose in order to incubate embryos | ||
| 5 cm diameter glass Petri dish | For embryo dechorionation | ||
| 6-well plastic plate | To be coated with agarose in order to incubate embryos | ||
| Agarose | To coat plastic dishes | ||
| dnd1 morpholino | Gene Tools | Sequence: GCTGGGCATCCATGTCTCCGAC CAT |
|
| Embryo medium | 250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
| Fluorescence stereomicroscope with GFP/RFP filters and light source | To assess YSL injections and germ-line transplantations | ||
| Glass micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | To make the transplantation needle |
| Glass pasteur pipette | Kimble Chase (via Fisher) | 63A53WT | For pipetting embryos; the tips can be flamed to smoothen out the edge |
| Incubator at 28 °C | For incubating zebrafish embryos | ||
| Luer tip 25 μL Hamilton syringe, 1700 series | Hamilton | Ref: 80201 | Part of the transplantation device |
| Manual micromanipulator with 3 axes of movement | Narishige | M-152 | For controlling the transplantation device |
| Manual pipetting pump | Bio-Tek | Cat. # 641 | For use with the glass pipettes to transfer embryos |
| Metal dissecting probe | For moving and rotating zebrafish embryos | ||
| Microforge | Narishige | MF2 | To make the transplantation needle |
| Microinjection apparatus | For injection of mRNA and morpholino into embryos | ||
| Microinjection molds, triangular grooves | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare microinjection plates with agarose |
| Microinjection-molds, single wells | Adaptive Science Tools | PT-1 | To prepare transplantation plates with agarose |
| Micropipette holder with Luer fitting for a 1.0 mm glass capillary | World Precision Instruments | MPH6S10 | Part of the transplantation device |
| mMessage mMachine Sp6 transcription kit |
Life Technologies | AM1340M | To generate capped mRNA for injection into embryos |
| Plasmid with GFP-nos1 3'UTR | Plasmid that can be transcriped to produce mRNA encoding GFP with the 3'UTR of nos1 | ||
| Plastic petri dish 100 mm | To be coated with agarose in order to make injection and transplantation dishes | ||
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | For embryo dechorionation: Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos |
| Ringer’s solution | For 1 L: Add 6.78 g of NaCl, 0.22 g of KCl, 0.26 g of CaCl2 and 1.19 g of HEPES; then fill to 1 L; adjust pH to 7.2; sterilize by filtration | ||
| Stereomicroscope | For injection and transplantation |
References
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