Summary
Embryologiske manipulasjoner som utryddelse og transplantasjon av celler er viktige verktøy for å studere tidlig utvikling. Denne protokollen beskriver en enkel og effektiv transplantasjonsenhet for å utføre disse manipulasjonene i sebrafiskembryoer.
Abstract
Klassiske embryologiske manipulasjoner, som å fjerne celler og transplantere celler i eller mellom embryoer, er kraftige teknikker for å studere komplekse utviklingsprosesser. Sebrafisk embryoer er ideelle for disse manipulasjonene siden de er lett tilgjengelige, relativt store i størrelse og gjennomsiktige. Tidligere utviklede enheter for cellefjerning og transplantasjon er imidlertid tungvint å bruke eller dyrt å kjøpe. Derimot er transplantasjonsenheten som presenteres her økonomisk, enkel å montere og enkel å bruke. I denne protokollen introduserer vi først håndteringen av transplantasjonsenheten samt monteringen fra kommersielt og allment tilgjengelige deler. Vi presenterer deretter tre applikasjoner for bruk: generering av ektopiske kloner for å studere signaldispergering fra lokaliserte kilder, utryddelse av celler for å produsere størrelsesreduserende embryoer og bakterietransplantasjon for å generere maternal-zygotiske mutanter. Til slutt viser vi at verktøyet også kan brukes til embryologiske manipulasjoner i andre arter som den japanske risfiskmedakaen.
Introduction
Fra de klassiske eksperimentene til Mangold og Spemann som demonstrerte eksistensen av en arrangør som instruerer dannelsen av en embryonal akse1, har transplantasjon av celler mellom embryoer blitt en etablert teknikk for å studere embryonal utvikling2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Et vanlig brukt oppsett for transplantasjon består av en mikrometerdrivkontrollert gasstett sprøyte koblet til en mikropipetteholder gjennom fleksibel rør og et reservoar fylt med mineralolje12,13. I dette oppsettet flyttes sprøytens stempel gjennom en skrue. Trykket som genereres på denne måten overføres til mikropipetten og brukes til å trekke celler ut fra ett embryo og deponere dem i et annet. Denne hydraulisk opererte enheten består imidlertid av mange deler og er arbeidskrevende å montere fra bunnen av. Lignende enheter kan også kjøpes som et komplett arbeidssett, vanligvis solgt som manuelle mikroinjektorer, og disse kommersielle versjonene koster vanligvis mer enn 1500 US $. I både hjemmelaget og kommersiell versjon skilles mikropipetten for embryomanipulering fra den trykkgenererende enheten (den gasstette sprøyten) gjennom oljefylte rør. Manipuleringen av mikropipetten og bevegelsen av stempelet må derfor betjenes separat med forskjellige hender, noe som reduserer gjennomstrømningen og verktøyet. Videre er enhetene tungvint for å forberede seg på transplantasjon siden slangen må fylles forsiktig med olje samtidig som man unngår dannelsen av bobler. Her beskriver vi en alternativ pneumatisk operert enhet for cellefjerning og transplantasjon som er billig, enkel å montere og enkel å bruke.
Enheten som presenteres her består av en 25 μL gasstett sprøyte utstyrt med en mikropipetteholder og koster mindre enn 80 US $ helt. Enheten monteres enkelt ved å sette mikropipetteholderen inn i sprøyten via Luer-låsebeslag (figur 1A). Enheten monteres deretter direkte på en mikromanipulator, slik at brukeren kan kontrollere både posisjonen og suget med en enkelt hånd direkte på mikromanipulatoren. Dette etterlater den andre hånden fri til å stabilisere og flytte transplantasjonsfatet som inneholder donor og vert embryoer. Enheten fungerer ved direkte sug med luft og trenger ikke å fylles med mineralolje. På grunn av de attraktive kreftene mellom vannet og glassnålens vegger, oversettes en stor bevegelse i sprøytens stempel til en mindre bevegelse i vannstanden i nålen, så lenge vannstanden er i den koniske enden av glassnålen. Dette gir nøyaktig kontroll over antall aspirerte celler og plasseringen av innsettingen.
For å demonstrere nytten av denne enheten, presenterer vi tre applikasjoner i sebrafisk (Danio rerio) embryoer. Først viser vi hvordan man genererer lokaliserte kilder til utskilte signalmolekyler, som kan brukes til å studere gradientdannelse2,4,6. Her injiseres donorembryoer med mRNA-koding av et fluorescerende merket signalmolekyl. De fluorescensmerkede donorcellene blir deretter transplantert til villtype vertsembryoer der dannelsen av en signalgradient kan avbildes og analyseres. For det andre beskriver vi hvordan enheten kan brukes til å fjerne celler ved utryddelse for å generere størrelsesreduserende embryoer5,13. Til slutt viser vi hvordan vi robust kan produsere maternal-zygotiske mutanter ved å transplantere celler som bærer en primordial bakteriecellereporter inn i vertsembryoer der bakterielinjen hadde blitt ablated6,10. I fremtiden kan transplantasjonsenheten beskrevet her lett tilpasses andre embryologiske manipulasjoner som krever fjerning eller transplantasjon av celler.
Protocol
1. Montering og bruk av transplantasjonsenheten
- Montering av transplantasjonsenheten.
- Koble luerspissen 25 μL gasstett sprøyte og en mikropipetteholder med Luer-låsearmatur for å montere transplantasjonsenheten (figur 1A).
MERK: Fukting av luerspissen med en tynn film med vann kan bidra til å forbedre forbindelsen ved å holde delene sammen via vannadhesjon og samhørighet. - Monter apparatet direkte på en manuell mikromanipulator (figur 1B). Enheten kan styres med den dominerende hånden alene, og frigjør den andre hånden for ytterligere oppgaver.
- Koble luerspissen 25 μL gasstett sprøyte og en mikropipetteholder med Luer-låsearmatur for å montere transplantasjonsenheten (figur 1A).
- Forbereder transplantasjonsnålen.
- Produser en transplantasjonsnål ved å trekke en glasskapillær pipette (uten filament) med en mikropipettetrekker.
- Bryt spissen av nålen så jevnt som mulig, da skarpe kanter øker sjansen for å skrape eggeplommen under transplantasjon, noe som er dødelig for embryoet.
MERK: Spissen kan enkelt brytes med et barberblad med rett kant under et stereomikroskop. Ved å bruke en mikroforge kan du imidlertid generere en presis åpning av ønsket størrelse. For ektopisk kildegenerering er en ytre diameter på ca. 50-60 μm hensiktsmessig. For ekstirpasjoner og bakterietransplantasjon bør nålens ytre diameter måle ca. 80-90 μm for å øke antall transplanterte celler. - Sett nålen som er klar til bruk, inn i transplantasjonsenheten (figur 1A).
- Bruke transplantasjonsenheten.
- Plasser mikromanipulatoren med transplantasjonsenheten ved siden av et stereomikroskop (figur 1B).
- Fjern stempelet og senk transplantasjonsnålen ned i transplantasjonsfatet fylt med Ringers oppløsning (se trinn 2.2.1) i en 45° vinkel til spissen av nålen er nedsenket (figur 1B). Vann vil rush opp nålen på grunn av kapillær virkning.
- Sett stempelet omtrent halvveis inn for å skylle ut Ringers løsninger, og la bare et lite volum vann ligge i den tynne, koniske delen av nålen (figur 1C).
MERK: Dette er den nøytrale posisjonen, og vannstanden skal være stabil der en stund (>20 min). Hvis vannstanden er ustabil, lekker luften; luerlåsbeslaget eller sett på sprøyten igjen. - Når du bruker en transplantasjonsnål for første gang, belegge innsiden ved å tegne opp eggeplomme fra et ofret embryo og deretter utvise eggeplommematerialet helt. Belegget vil bidra til å redusere overholdelsen av celler til glasset under etterfølgende prosedyrer.
- Plasser donorembryoet forsiktig ved hjelp av nålen og plasser deretter nåleåpningen ortogonal til embryoets overflate (figur 1D).
MERK: Stillingen vil være forskjellig for forskjellige analyser. For ektopisk signalmolekylkildegenerering og celleekstirpasjoner vil dette være toppen av dyrestangen (figur 1E); For bakterietransplantasjon vil dette være marginen (figur 1D,F). - Trekk stempelet langsomt og forsiktig opp for å trekke cellene inn i nålen.
MERK: Hvis cellene tas opp for raskt, kan de bli skadet. Hvis det gjøres riktig, bør cellene komme ut som en sylindrisk kolonne. Unngå å ta opp eggeplomme i nålen, da den transplanterte eggeplommen er giftig for vertsembryoet. - Stopp sugingen ved å skyve stempelet forsiktig litt ned når ønsket antall celler er trukket inn. Fjern nålen fra embryoet ved å rykke nålen til siden i en kort og rask bevegelse. La noen Ringers løsning ligge på hver side av cellekolonnen, og begrens cellene til den koniske enden av nålen (figur 1C,D).
MERK: Væsken foran cellekolonnen vil bidra til å tvinge fra hverandre cellene i vertsembryoene når du deponerer cellekolonnen. - Fjern eventuelle gjenværende eggeplommer eller cellerester ved å sakte flytte stempelet opp og ned - mens nålen forblir nedsenket - for å vaske cellene med Ringers løsning. Hvis det gjøres riktig, vil de uskadede cellene forbli festet sammen i en kolonne mens ruskene vaskes bort.
MERK: Det må utvises stor forsiktighet i dette trinnet, da vannstanden vil stige forbi den koniske enden av nålen. Dette vil føre til en plutselig tilstrømning av vann, som kan brukes til å vaske cellene. Men når vannstanden har passert den koniske enden, vil den fine kontrollen med stempelet bli redusert, og stempelet må flyttes saktere og forsiktig. - Flytt transplantasjonsfatet med den ikke-dominerende hånden for å plassere nålen ortogonal til overflaten (enten dyrestang eller margin) av vertsembryoet (figur 1D-F).
- Påfør forsiktig lite trykk, og gi deretter en rask, skarp bevegelse for å pierce det omsluttende laget av vertsembryoet. Pass på at du ikke riper eggeplommen med nålen.
MERK: Hvis du legger litt trykk på embryoet ved å klemme det forsiktig mot brønnens vegger, øker embryoets overflatespenning og letter dermed piercingen til det omsluttende laget. - Når nålen er inne, skyver du stempelet forsiktig for å ekstrudere cellekolonnen inn i embryoet samtidig som nålen trekkes tilbake samtidig (figur 1D-F).
- Rengjøring av transplantasjonsnålen.
- Skyll nålen ved å flytte stempelet opp og ned mens nålen er nedsenket i deionisert vann.
MERK: Hvis kanylen forblir skitten, skyll den med 10 M natriumhydroksidoppløsning før du skyller den igjen med vann. - Oppbevar kanylen i en passende eske for videre bruk.
- Skyll nålen ved å flytte stempelet opp og ned mens nålen er nedsenket i deionisert vann.
2. Generere ektopiske kilder til utskilte signalmolekyler i sebrafiskembryoer
- Forbereder vert og donor embryoer.
- Samle nylagde embryoer ved å parre sebrafisk.
- Dechorionate 1-celle stadium sebrafisk embryoer ved å inkubere opptil 100 embryoer i 0,5 mg / ml pronaseoppløsning i ca. 15 min i en liten glass Petri-tallerken (en detaljert beskrivelse av denne prosedyren er publisert av Rogers, K. W. et al.14).
MERK: Alternativt kan embryoene også dechorionated på det høye stadiet like før transplantasjon (trinn 2.2), men dette krever at injiserte donorembryoer og uinjiserte vertsembryoer blir dechorionated separat. - Senk embryoene i embryomediet ned i et 200 ml beger.
MERK: Dechorionated blastula og gastrula stadium embryoer er svært delikate. Deres eksponerte eggeplomme vil holde seg til plastoverflater og briste ved kontakt med luft. Derfor må de forbli helt nedsenket i embryomedium, overført med en glasspipet, og opprettholdes i enten agarosebelagte (1% i embryomedium) plastretter eller glass Petri-retter. - Tøm forsiktig ut det meste av embryomediet og fyll sakte begeret med friskt embryomedium. Den milde agitasjonen forårsaket på denne måten vil lette fjerningen av de svekkede korionene. Gjenta dette trinnet 2-3 ganger.
- Overfør de dechorionated embryoene ved hjelp av en pasteurpipette i et agarosebelagt injeksjonsfat.
MERK: Flammende tuppen av glasset Pasteur pipette ved å utsette den for en Bunsen brennerflamme kan smelte og glatte ut kanten, noe som bidrar til å forhindre skade på embryoene. - Injiser mRNA-kodingen av det fluorescerende merkede proteinet i en undergruppe av embryoer (en detaljert beskrivelse av denne prosedyren er publisert av Rogers, K. W. et al.14). Injiser mRNA i cellen, ikke eggeplommen, for nesten homogent uttrykk. Injiserte embryoer vil tjene som donorer, mens uinjiserte embryoer vil tjene som verter.
MERK: Mengden og typen injisert mRNA vil avhenge av signalmolekylet som studeres og varierer vanligvis fra 20 til 200 pg2,4,5,6 (men kan være så høyt som 1000 pg i visse tilfeller4). - Overfør de injiserte embryoene til en agarosebelagt seksbrønnsfat fylt med embryomedium. Inkuber ved 28 °C til embryoene når det tidlige sfærestadiet.
- Transplantere celler for å generere ektopiske kilder.
- Fyll en transplantasjonsfat (med individuelle trekantede kileformede brønner, se Materialtabell) med Ringers løsning (116 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 1 mM CaCl2, 5 mM HEPES; oppbevar HEPES-bufferen ved 4 °C).
MERK: Kalsiumet i Ringers løsning fremmer celleadhesjon og hjelper embryoet med å helbrede fra transplantasjonsprosedyren. - Overfør embryoene til transplantasjonsfatet.
- Plasser verten og donorembryoene i vekslende kolonner, i hvert tilfelle med dyrestangen orientert mot transplantasjonsnålen.
- Utfør transplantasjonen som beskrevet i pkt. 1.3. For ektopisk kildetransplantasjon, ta kildeceller fra toppen av dyrestangen og deponer dem på samme sted i vertsembryoet (figur 1E).
MERK: Vasking av cellene med Ringers løsning som beskrevet i trinn 1.3.8 er viktig for ektopisk kildegenerering for å sikre at allerede utskilte signalmolekyler ikke overføres til verten. Ikke transplanter for mange celler for å sikre at kilden ikke spres. En kolonne på ca. 80 μm i diameter og 100 μm i lengde passer for mange bruksområder. - La vertsembryoet forbli i Ringers løsning i 30 minutter til 1 time for å gjenopprette.
- Undersøk om cellene ble transplantert ved hjelp av et fluorescenssteremkroskop (figur 2).
- Etter utvinning, overfør embryoene til en agarose-belagt seksbrønnsplate fylt med embryomedium og inkuber dem ved 28 °C.
- Fyll en transplantasjonsfat (med individuelle trekantede kileformede brønner, se Materialtabell) med Ringers løsning (116 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 1 mM CaCl2, 5 mM HEPES; oppbevar HEPES-bufferen ved 4 °C).
3. Generere størrelsesreduserende embryoer ved celleutsettelse
- Forbereder embryoer for utryddelse.
- Samle nylagde embryoer fra sebrafisk av ønsket genotype.
- Inkuber embryoene ved 28 °C til de når det høye stadiet.
- Dechorionate embryoene som beskrevet i trinn 2.1.2-2.1.5 når embryoene når det høye stadiet.
MERK: I dette eksemplet utføres celleutskillelse på sfærestadiet. Følgelig blir embryoer dechorionated ca 30 min til 1 time tidligere.
- Valgfritt: Merking av eggeplommesynkroniseringslaget (YSL).
MERK: Injiser eventuelt fluorescerende dextrans i YSL før du ekstirperer celler. Denne teknikken gjør det mulig å avgjøre om YSL forblir intakt etter cellefjerning, noe som er viktig for normal embryogenese15. Alternativt kan in vitro syntetiserte mRNAer eller proteiner også injiseres i YSL.- Bruk en Pasteur pipette for å overføre de dechorionated embryoer til en agarose-belagt injeksjonsfat fylt med embryovann.
- Orienter embryoene sidelengs, med blastodermmarginen pekende mot injeksjonsnålen (figur 3A).
- Injiser 0,5 nL 1,5 μg/μL 10 kDa Alexa568-Dextran i YSL, med sikte på en region mellom blastodermcellene og eggeplommen på en dybde på omtrent en tredjedel av embryoets diameter. Injiser alle embryoer innen en rad.
MERK: Siden injeksjonsnålen ikke trenger å trenge gjennom koret, er en liten (~ 4 μm) og skarp åpning fordelaktig. - Roter embryoene med 180° slik at motsatt side av blastodermmarginen peker mot injeksjonsnålen (figur 3A).
- Injiser ytterligere 0,5 nL 1,5 μg/μL 10 kDa Alexa568-Dextran i YSL som beskrevet i trinn 3.2.3, noe som gir et totalt injeksjonsvolum på 1 nL per embryo.
MERK: Injisering fra to sider gir en jevnere fordeling av fluorescerende dekstran i YSL. - Undersøk resultatet av injeksjonen under et fluorescens stereomikroskop. Hvis det gjøres riktig, vil fluorescerende signalet være begrenset til YSL (figur 3B) og ikke være synlig i blastodermens intercellulære rom.
- Extirpating celler
- Fyll en transplantasjonsfat med Ringers løsning (se trinn 2.2.1).
- Overfør embryoene til transplantasjonsfatet.
- Orienter embryoene med dyrestangen mot transplantasjonsnålen (figur 3C).
- Fjern forsiktig celler fra dyrestangområdet som beskrevet i trinn 1.3.5-1.3.7, og dermed redusere blastodermen til ønsket størrelse.
- Kast de fjernede cellene ved å utvise dem fra transplantasjonsnålen.
- Når prosedyren er fullført, la embryoene holde seg i Ringers løsning i 30 min til 1 time for å gjenopprette.
- VALGFRITT: Undersøk integriteten til YSL under et fluorescenssteremkroskop (figur 3D).
- Overfør embryoene til en agarosebelagt plate fylt med embryomedium og inkuber dem ved 28 °C.
4. Opprette maternal-zygotiske mutanter ved bakterietransplantasjon
- Forbereder verts- og donorembryoer.
- Samle nylagde embryoer fra både mutant og vill type sebrafisk. Embryoer fra sebrafisk med mutant bakgrunn vil tjene som donorer, mens embryoer fra sebrafisk med vill bakgrunn vil tjene som verter.
MERK: Germlinetransplantasjon krever et høyt antall startende embryoer (~ 50 for givere, ~ 500 for verter) for å sikre et stort antall vellykkede bakterietransplantasjoner som overlever i voksen alder. - Overfør embryoene til en agarosebelagt injeksjonsfat med embryomedium ved hjelp av en Pasteur pipette.
MERK: Injeksjoner gjøres før dechorionation for å øke gjennomstrømningen. Nåler til injeksjon gjennom koret må være stumpe og ha en større åpning (~ 10 μm) for å forhindre tilstopping. - Injiser donorembryoene med 1 nL 100 ng/μL mRNA-koding av GFP med en nos1 3'UTR. Injiser mRNA i eggeplommen for å øke gjennomstrømningen.
MERK: Nos1 3'UTR vil stabilisere mRNA i primordiale bakterieceller, noe som fører til at bakteriecellene er sterkt fluorescerende når de avbildes 1 dag etter befruktning10. - Injiser vertsembryoene med 1 nL 0,33 mM (3 μg/μL) blindvei (dnd) morpholino. Injiser morpholinoen i eggeplommen for å øke gjennomstrømningen.
MERK: Dnd morpholino blokkerer primordial bakteriecelledannelse, noe som sikrer at vertsembryoens bakterie vil bli utelukkende befolket med celler fra donoren etter transplantasjon10. - Overfør de injiserte embryoene til plast Petri-retter med embryomedium. Inkuber ved 28 °C til embryoene når det høye stadiet.
- Dechorionate embryoene som beskrevet i trinn 2.1.2-2.1.5 når embryoene når det høye stadiet.
- Samle nylagde embryoer fra både mutant og vill type sebrafisk. Embryoer fra sebrafisk med mutant bakgrunn vil tjene som donorer, mens embryoer fra sebrafisk med vill bakgrunn vil tjene som verter.
- Transplantasjon av bakterieceller
- Fyll en transplantasjonsfat med Ringers løsning (se trinn 2.2.1).
- Overfør dechorionated sfæren - til kuppel-stadium embryoer inn i transplantasjonsfatet.
- Plasser vertsembryoene og donorembryoene i vekslende kolonner for å transplantere cellene fra ett donorembryo til seks forskjellige vertsembryoer. Dette øker sjansen for at bakterieceller fra et gitt vertsembryo vil bli transplantert.
- Orienter embryoene med margen mot transplantasjonsnålen og utfør transplantasjonen som beskrevet i avsnitt 1.3. For bakterietransplantasjoner (figur 1D,F), ta kildecellene fra marginen (hvor de opprinnelige bakteriecellene er plassert) og deponer dem på samme sted i vertsembryoet.
MERK: Transplantasjon av en stor kolonne (ca. 80 μm i diameter og 600 μm i lengde) vil øke sjansen for å oppnå en vellykket bakterietransplantasjon. - La embryoet forbli i Ringers løsning i 30 minutter til 1 time for å gjenopprette når transplantasjonen er fullført.
MERK: Hvis ikke alle donorembryoer forventes å være homozygote mutanter - for eksempel hvis de skyldes en heterozygot incross - må de genotypes etter transplantasjon for å bestemme genotypen til vertens transplanterte fremtidige bakterie. I dette tilfellet må du sørge for at posisjonene til verts- og donorembryoene ikke blandes opp under håndtering. - Bruk et fluorescenssteremkroskop for å undersøke om cellene ble transplantert (figur 4A, B).
- Overfør embryoene til en 24-brønns agarosebelagt plate. Grupper alle vertsembryoene som mottok celler fra samme donor i samme brønn og merk dem deretter. Inkuber dem til neste dag ved 28 °C.
- Overfør om nødvendig donorembryoene til merkede PCR-striper for genotyping.
- Screening for vellykkede bakterietransplantasjoner
- Screen vertsembryoene for vellykkede bakterietransplantasjoner under et fluorescens stereomikroskop ca. 30 timer etter befruktning (hpf). Bakteriecellene finnes i sporet over eggeplommeforlengelsen (figur 4C).
MERK: Typiske eksperimenter med enheten og strategien som presenteres her vil ha en suksessrate på ~ 60% -80% for å oppnå minst ett vertsembryo som bærer transplanterte bakterieceller per donorembryo. En tidligere rapport beskrev en effektivitet på ~ 10%10. - Hvis det er aktuelt, kast embryoer som mottok celler fra donorembryoer med feil genotype. Vokse larver med vellykket transplanterte bakterieceller til voksen alder i henhold til standard husdyrholdsforhold og følge institusjonelle retningslinjer.
- Screen vertsembryoene for vellykkede bakterietransplantasjoner under et fluorescens stereomikroskop ca. 30 timer etter befruktning (hpf). Bakteriecellene finnes i sporet over eggeplommeforlengelsen (figur 4C).
Representative Results
Suksess og svikt i bruken av transplantasjonsenheten for de tre applikasjonene beskrevet ovenfor kan lett vurderes ved visuell inspeksjon under et stereomikroskop. Ved vellykkede transplantasjoner skal embryoet se normalt og lignende ut i form og eggeplommeklarhet til uforutsette embryoer, uten store tårer i blastodermen. Hvis embryoet er synlig skadet (figur 4B), vil det ikke utvikle seg normalt. Ideelt sett bør transplanterte celler som uttrykker en fluorescerende markør vises som en kontinuerlig kolonne når de ses under et fluorescens stereomikroskop (figur 2A, figur 4A). Hvis kolonnen er fragmentert, indikerer dette at cellene ble kuttet av suget inn i transplantasjonsnålen eller at avsetningen av cellene ble gjort for kraftig. Dette kan forhindres ved å flytte stempelet langsommere og forsiktig.
Selv om transplantasjonsanordningen hovedsakelig har blitt brukt på sebrafiskembryoer i blastula stadier5,6, transplantasjon og celleutskillelse arbeid like bra for dechorionated blastula-stage embryoer av den japanske risfisk medaka (Oryzias latipes) (Figur 2B). Bortsett fra embryodekorasjon, som er beskrevet av Porazinski, S. R. et al.17, kan de samme prosedyrene som beskrevet ovenfor følges.
Ved bakterietransplantasjon vil en god transplantasjon resultere i et embryo med en lang horisontal kolonne med celler rett over eggeplommemarginen (figur 4A). Hvorvidt bakterieceller ble transplantert, kan imidlertid bare vurderes neste dag (figur 4C-F) på grunn av bakgrunnsuttrykk av GFP ved blastulastadier (figur 1F). De opprinnelige bakteriecellene vises som små fluorescerende sfærer i sporet rett over eggeplommeforlengelsen (figur 4C-E). Tilstedeværelsen av disse cellene på riktig sted indikerer vellykket bakterietransplantasjon. Celler med en annen form er ikke bakterieceller (f.eks. langstrakte celler er vanligvis muskelceller, figur 4F). Også, hvis primordiale kimceller finnes utenfor sporet, betyr dette at de ikke har migrert riktig, og de vil ikke kunne bidra til embryoets bakterie. Til slutt skal den generelle morfologien til transplanterte embryoer vises på samme måte som ikke-planlagte embryoer (figur 4D); halen skal ikke deformeres, og hodet skal ikke krympes eller mangler øyne (figur 4E). Disse feilene skyldes vanligvis for høye morpholinokonsentrasjoner eller embryoskader under transplantasjon. Germline transplantasjonseksperimenter som beskrevet her, vil vanligvis resultere i 1-2 av 6 vertsembryoer med vellykket transplanterte bakterieceller for 60% -80% av donorembryoer, avhengig av erfaringen fra eksperimentet. Dermed må celler fra 40-50 homozygote donorembryoer transplanteres i 200-300 vertsembryoer for å heve ca. 30 personer med mutante bakterieceller.
Figur 1: Montering og bruk av transplantasjonsanordningen. (A) Transplantasjonsanordningen monteres ved å koble til en gasstett sprøyte med en mikropipetteholder gjennom Luer-låsebeslag. Glassnålen for transplantasjon settes deretter inn i mikropipetteholderen. (B) Fotografi av den monterte transplantasjonsenheten montert på en mikromanipulator (vær oppmerksom på at bakgrunn og etiketter er fjernet fra bildet). (C) Ved bruk av transplantasjonsanordningen er det viktig å sikre at vannstanden i transplantasjonsnålen forblir i den koniske enden. (D) Enheten brukes under et stereomikroskop for å trekke ut og sette inn celler fra og inn i teleostembryoer plassert i individuelle brønner i en transplantasjonsfat. (E) For generering av ektopiske kilder tas celler fra dyrestangen til et donorembryo (i-ii) og overføres til dyrestangen til et vertsembryo (iii-vi). (F) For bakterietransplantasjon tas et større antall celler fra marginen av et donorembryo (i-ii), hvor bakteriecellene er plassert. Cellene overføres deretter til marginen av vertsembryoer (iii-vi). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Generere kloner ved celletransplantasjon. (A) Eksempel på en dobbel klone generert ved sekvensiell transplantasjon av fluorescerende celler (grønn) fra en sebrafiskdonor til et sebrafiskvertembryo. Enkle og doble kloner kan brukes til å studere hvordan utskilte signalmolekyler danner romlige gradienter2,4,5,6. (B) Eksempel på en enkelt klone generert ved å transplantere celler fra en transgen eGFP-uttrykkende medakadonor (Wimbledon)17 til en villtype medakavert. Skalastenger representerer 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Generere størrelsesreduserende embryoer ved celleutskillelse. (A) Før du fjerner celler ved utryddelse, kan YSL merkes ved å injisere fluorescerende fargestoffer i to motstående sider av YSL. (B) Eksempel på embryo etter YSL-injeksjon. (C) For å generere størrelsesreduserende embryoer fjernes celler fra dyrestangen ved utryddelse5. (D) Eksempel på embryo etter celleutsettelse. Vær oppmerksom på at YSL forblir intakt. Skalastenger representerer 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Germlinetransplantasjon. (A) Eksempel på en vellykket transplantasjon av donorceller (grønn) inn i vertens marginale sone. (B) Eksempel på en mislykket transplantasjon. Eggeplommen til vertsembryoet ble alvorlig skadet, og embryoet vil ikke kunne utvikle seg normalt. (C) Ved 30 hkf vil vellykket transplanterte bakterieceller bli funnet utelukkende i gonadal mesoderm i den fremre delen av eggeplommeforlengelsen. (D) Eksempel på en vellykket transplantasjon der flere GFP-merkede donor bakterieceller har befolket vertens fremtidige gonad. (E) Eksempel på en mislykket transplantasjon. Selv om bakterieceller har nådd gonadal mesoderm, er vertsembryoet sterkt deformert og vil ikke utvikle seg normalt. (F) Eksempel på en mislykket transplantasjon. Fluorescerende bakterieceller som ikke klarte å migrere til riktig sted, vil ikke fylle gonadene på nytt. Skalastolper representerer 100 μm. Bilder i D-F ble tatt med en total forstørrelse på ca. 50x. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Suksessen til et transplantasjonseksperiment er sterkt avhengig av eksperimentets fine motoriske ferdigheter. For å kunne utføre prosedyrene, er det nødvendig med praksis. Instrumentet som presenteres her er imidlertid relativt enkelt å lære og bruke sammenlignet med andre på markedet, og generelt er det bare noen få dagers praksis som trengs.
Suksessen til transplantasjonsprosedyren kan forbedres ved å ta flere forholdsregler. Et trinn er å sikre at mikromanipulatoren er av god kvalitet og i stand til jevn drift. Å legge til en okulær med høyere forstørrelse til stereomikroskopet kan bidra til å nøyaktig plassere nålen i forhold til embryoet. Bruk av godt avl av sebrafisk eller medaka for å skaffe sunne embryoer og passe på å ikke skade embryoene under håndtering (spesielt under og etter dechorionation trinnet) vil også forbedre suksessraten.
Problemer med forsinket toksisitet kan være vanskeligere å feilsøke. Hvis et embryo dør etter noen timer - men ikke umiddelbart etter transplantasjon - kan eggeplommen ha blitt skadet av nålen (f.eks. ved å komme inn i embryoet for dypt), eller kanskje cellene ble kastet ut for kraftig. Forsinket toksisitet og embryonal død kan også skyldes eggeplomme eller cellerester injisert sammen med donorcellene; en annen årsak kan forverre HEPES-bufferen i Ringers løsning. Disse problemene kan løses ved å vaske cellene (se trinn 1.3.8) eller ved å bare bruke en ny bunke buffer, henholdsvis. Videre kan deformerte vertsembryoer i bakterietransplantasjonsforsøk skyldes for høye morpholinokonsentrasjoner. Det er viktig å bruke nok morpholino til å fyre opp vertens villtype bakterie, og dermed forhindre at disse cellene bidrar til avkom - men samtidig må for høye morpholinokonsentrasjoner unngås. Konsistente morpholinomengder på tvers av alle injiserte vertsembryoer (noen få hundre i et typisk eksperiment) er derfor nøkkelen til suksessen med bakterietransplantasjoner. Dette kan hjelpes ved å supplere morpholino injeksjon blandingen med en lett synlig tracer dye14, som kan spores under en fluorescens stereomikroskop for å sikre at alle embryoer får samme injeksjonsvolum.
Prosedyrene beskrevet i denne protokollen innebærer utelukkende manipulasjoner av celler i blastula-stadium sebrafisk eller medaka embryoer, men i fremtiden vil det sannsynligvis være mulig å tilpasse enheten til forskjellige stadier og arter ved å endre diameteren og formen på transplantasjonsnålen.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å erklære.
Acknowledgments
Dette prosjektet ble støttet av Max Planck Society og fikk støtte fra Det europeiske forskningsrådet (ERC) under EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 (tilskuddsavtale nr. 637840 (QUANTPATTERN) og tilskuddsavtale nr 863952.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mm glass capillary, ends cut without filament | To make the transplantation needle | ||
| 1.0 mm glass capillary, ends cut with filament | To make injection needles | ||
| 200 mL glass beaker | For embryo dechorionation | ||
| 24-well plastic plate | To be coated with agarose in order to incubate embryos | ||
| 5 cm diameter glass Petri dish | For embryo dechorionation | ||
| 6-well plastic plate | To be coated with agarose in order to incubate embryos | ||
| Agarose | To coat plastic dishes | ||
| dnd1 morpholino | Gene Tools | Sequence: GCTGGGCATCCATGTCTCCGAC CAT |
|
| Embryo medium | 250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
| Fluorescence stereomicroscope with GFP/RFP filters and light source | To assess YSL injections and germ-line transplantations | ||
| Glass micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | To make the transplantation needle |
| Glass pasteur pipette | Kimble Chase (via Fisher) | 63A53WT | For pipetting embryos; the tips can be flamed to smoothen out the edge |
| Incubator at 28 °C | For incubating zebrafish embryos | ||
| Luer tip 25 μL Hamilton syringe, 1700 series | Hamilton | Ref: 80201 | Part of the transplantation device |
| Manual micromanipulator with 3 axes of movement | Narishige | M-152 | For controlling the transplantation device |
| Manual pipetting pump | Bio-Tek | Cat. # 641 | For use with the glass pipettes to transfer embryos |
| Metal dissecting probe | For moving and rotating zebrafish embryos | ||
| Microforge | Narishige | MF2 | To make the transplantation needle |
| Microinjection apparatus | For injection of mRNA and morpholino into embryos | ||
| Microinjection molds, triangular grooves | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare microinjection plates with agarose |
| Microinjection-molds, single wells | Adaptive Science Tools | PT-1 | To prepare transplantation plates with agarose |
| Micropipette holder with Luer fitting for a 1.0 mm glass capillary | World Precision Instruments | MPH6S10 | Part of the transplantation device |
| mMessage mMachine Sp6 transcription kit |
Life Technologies | AM1340M | To generate capped mRNA for injection into embryos |
| Plasmid with GFP-nos1 3'UTR | Plasmid that can be transcriped to produce mRNA encoding GFP with the 3'UTR of nos1 | ||
| Plastic petri dish 100 mm | To be coated with agarose in order to make injection and transplantation dishes | ||
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | For embryo dechorionation: Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos |
| Ringer’s solution | For 1 L: Add 6.78 g of NaCl, 0.22 g of KCl, 0.26 g of CaCl2 and 1.19 g of HEPES; then fill to 1 L; adjust pH to 7.2; sterilize by filtration | ||
| Stereomicroscope | For injection and transplantation |
References
- Spemann, H., Mangold, H. Induction of embryonic primordia by implantation of organizers from a different species. Archives for Microscopic Anatomy and Developmental Mechanics. 100 (3-4), 599-638 (1924).
- Müller, P., et al. Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system. Science. 336 (6082), 721-724 (2012).
- Donovan, P., et al. Paracrine Activin-A signaling promotes melanoma growth and metastasis through immune evasion. Journal of Investigative Dermatology. 137 (12), 2578-2587 (2017).
- Pomreinke, A. P., et al. Dynamics of BMP signaling and distribution during zebrafish dorsal-ventral patterning. eLife. 6, 25861 (2017).
- Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signaling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
- Soh, G. H., Pomreinke, A. P., Müller, P. Integration of Nodal and BMP signaling by mutual signaling effector antagonism. Cell Reports. 31 (1), 107487 (2020).
- Mahalwar, P., Walderich, B., Singh, A. P., Nüsslein-Volhard, C. Local reorganization of xanthophores fine-tunes and colors the striped pattern of zebrafish. Science. 345 (6202), 1362-1364 (2014).
- Frohnhöfer, H. G., Krauss, J., Maischein, H. M., Nüsslein-Volhard, C. Iridophores and their interactions with other chromatophores are required for stripe formation in zebrafish. Development. 140 (14), 2997-3007 (2013).
- Chen, Y., Schier, A. F. The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen. Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).
- Ciruna, B., et al. Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germline replacement. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (23), 14919-14924 (2002).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edn. , University of Oregon Press. (2000).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (29), e1394 (2009).
- Capek, D., Müller, P. Positional information and tissue scaling during development and regeneration. Development. 146 (24), 177709 (2019).
- Rogers, K. W., Bläßle, A., Schier, A. F., Müller, P. Measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (FDAP). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52266 (2015).
- Carvalho, L., Heisenberg, C. P. The yolk syncytial layer in early zebrafish development. Trends in Cell Biology. 20 (10), 586-592 (2010).
- Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Dechorionation of medaka embryos and cell transplantation for the generation of chimeras. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2055 (2010).
- Centanin, L., Hoeckendorf, B., Wittbrodt, J. Fate restriction and multipotency in retinal stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 553-562 (2011).
