Summary
Las manipulaciones embriológicas como la extirpación y el trasplante de células son herramientas importantes para estudiar el desarrollo temprano. Este protocolo describe un dispositivo de trasplante simple y efectivo para realizar estas manipulaciones en embriones de pez cebra.
Abstract
Las manipulaciones embriológicas clásicas, como la extracción de células y el trasplante de células dentro o entre embriones, son técnicas poderosas para estudiar procesos de desarrollo complejos. Los embriones de pez cebra son ideales para estas manipulaciones, ya que son de fácil acceso, de tamaño relativamente grande y transparentes. Sin embargo, los dispositivos desarrollados previamente para la extracción y el trasplante de células son engorrosos de usar o costosos de comprar. En contraste, el dispositivo de trasplante presentado aquí es económico, fácil de ensamblar y fácil de usar. En este protocolo, primero introducimos el manejo del dispositivo de trasplante, así como su ensamblaje a partir de piezas comercialmente y ampliamente disponibles. A continuación, presentamos tres aplicaciones para su uso: generación de clones ectópicos para estudiar la dispersión de señales de fuentes localizadas, extirpación de células para producir embriones de tamaño reducido y trasplante de línea germinal para generar mutantes materno-cigóticos. Finalmente, mostramos que la herramienta también se puede utilizar para manipulaciones embriológicas en otras especies como el pez arroz japonés medaka.
Introduction
A partir de los experimentos clásicos de Mangold y Spemann que demostraron la existencia de un organizador que instruye la formación de un eje embrionario1, el trasplante de células entre embriones se ha convertido en una técnica establecida para estudiar el desarrollo embrionario2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Una configuración comúnmente utilizada para el trasplante consiste en una jeringa hermética al gas controlada por accionamiento micrométrico conectada a un soporte de micropipeta a través de tubos flexibles y un depósito lleno de aceite mineral12,13. En esta configuración, el émbolo de la jeringa se mueve a través de un tornillo. La presión generada de esta manera se transfiere a la micropipeta y se utiliza para extraer células de un embrión y depositarlas en otro. Sin embargo, este dispositivo operado hidráulicamente consta de muchas piezas y es laborioso de ensamblar desde cero. Dispositivos similares también se pueden comprar como un conjunto de trabajo completo, generalmente se venden como microinyectores manuales, y estas versiones comerciales generalmente cuestan más de 1500 US $. Tanto en la versión casera como en la comercial, la micropipeta para la manipulación embrionaria se separa del dispositivo generador de presión (la jeringa hermética al gas) a través de tubos llenos de aceite. La manipulación de la micropipeta y el movimiento del émbolo, por lo tanto, deben operarse por separado con diferentes manos, lo que reduce el rendimiento y la utilidad. Además, los dispositivos son engorrosos para prepararse para el trasplante, ya que el tubo debe llenarse cuidadosamente con aceite y evitar la formación de burbujas. Aquí, describimos un dispositivo alternativo operado neumáticamente para la extracción y el trasplante de células que es económico, fácil de ensamblar y fácil de usar.
El dispositivo que se presenta aquí comprende una jeringa hermética al gas de 25 μL equipada con un soporte de micropipeta y cuesta menos de 80 us$ en total. El dispositivo se monta fácilmente insertando el soporte de micropipeta en la jeringa a través del accesorio de bloqueo Luer (Figura 1A). El dispositivo se monta directamente en un micromanipulador, lo que permite al usuario controlar tanto su posición como la succión con una sola mano directamente en el micromanipulador. Esto deja convenientemente la otra mano libre para estabilizar y mover el plato de trasplante que contiene embriones de donantes y huéspedes. El dispositivo funciona por succión directa con aire y no necesita llenarse con aceite mineral. Debido a las fuerzas de atracción entre el agua y las paredes de la aguja de vidrio, un gran movimiento en el émbolo de la jeringa se traduce en un movimiento más pequeño en el nivel del agua dentro de la aguja, siempre que el nivel del agua esté en el extremo cónico de la aguja de vidrio. Esto permite un control preciso sobre el número de células aspiradas y la ubicación de su inserción.
Para demostrar la utilidad de este dispositivo, presentamos tres aplicaciones en embriones de pez cebra (Danio rerio). En primer lugar, mostramos cómo generar fuentes localizadas de moléculas de señalización secretadas, que pueden utilizarse para estudiar la formación de gradientes2,4,6. Aquí, los embriones de donantes se inyectan con ARNm que codifica una molécula de señalización marcada fluorescentemente. Las células donantes marcadas con fluorescencia se trasplantan a embriones huésped de tipo salvaje donde se puede obtener imágenes y analizar la formación de un gradiente de señal. En segundo lugar, describimos cómo se puede utilizar el dispositivo para extraer células mediante extirpación con el fin de generar embriones de tamaño reducido5,13. Finalmente, mostramos cómo producir de forma robusta mutantes materno-cigóticos mediante el trasplante de células portadoras de un reportero de células germinales primordiales en embriones huésped en los que la línea germinal había sido ablacionada6,10. En el futuro, el dispositivo de trasplante descrito aquí se puede adaptar fácilmente a otras manipulaciones embriológicas que requieren la extracción o el trasplante de células.
Protocol
1. Montaje y uso del dispositivo de trasplante
- Montaje del dispositivo de trasplante.
- Conecte la jeringa hermética al gas Luer de punta 25 μL y un soporte de micropipeta con ajuste de bloqueo Luer para montar el dispositivo de trasplante (Figura 1A).
NOTA: Humedecer la punta de Luer con una película delgada de agua puede ayudar a mejorar la conexión al mantener las partes unidas a través de la adhesión y cohesión del agua. - Monte el dispositivo directamente en un micromanipulador manual (Figura 1B). El dispositivo se puede controlar solo con la mano dominante, liberando la otra mano para tareas adicionales.
- Conecte la jeringa hermética al gas Luer de punta 25 μL y un soporte de micropipeta con ajuste de bloqueo Luer para montar el dispositivo de trasplante (Figura 1A).
- Preparación de la aguja de trasplante.
- Produzca una aguja de trasplante tirando de una pipeta capilar de vidrio (sin filamento) con un extractor de micropipetas.
- Rompa la punta de la aguja lo más suavemente posible, ya que los bordes afilados aumentan la posibilidad de rascarse la yema durante el trasplante, lo cual es fatal para el embrión.
NOTA: La punta se puede romper fácilmente con una hoja de afeitar de borde recto debajo de un estereomicroscopio. Sin embargo, el uso de una microtorcha permite generar una apertura precisa del tamaño deseado. Para la generación de fuentes ectópicas, es apropiado un diámetro exterior de aproximadamente 50-60 μm. Para las extirpaciones y el trasplante de la línea germinal, el diámetro exterior de la aguja debe medir aproximadamente 80-90 μm para aumentar el número de células trasplantadas. - Inserte la aguja lista para usar en el dispositivo de trasplante (Figura 1A).
- Uso del dispositivo de trasplante.
- Coloque el micromanipulador con el dispositivo de trasplante junto a un estereomicroscopio (Figura 1B).
- Retire el émbolo y baje la aguja de trasplante en el plato de trasplante lleno de solución de Ringer (ver paso 2.2.1) en un ángulo de 45° hasta que se sumerja la punta de la aguja (Figura 1B). El agua se precipitará por la aguja debido a la acción capilar.
- Inserte el émbolo aproximadamente hasta la mitad para eliminar las soluciones de Ringer, dejando solo un pequeño volumen de agua en la parte delgada y cónica de la aguja (Figura 1C).
NOTA: Esta es la posición neutral, y el nivel del agua debe ser estable allí por un tiempo (>20 min). Si el nivel del agua es inestable, el aire tiene fugas; vuelva a conectar el accesorio de bloqueo Luer o reemplace la jeringa. - Cuando use una aguja de trasplante por primera vez, cubra su interior extrayendo yema de un embrión sacrificado y luego expulsando el material de yema por completo. El recubrimiento ayudará a reducir la adherencia de las células al vidrio durante los procedimientos posteriores.
- Coloque suavemente el embrión donante con la ayuda de la aguja y luego coloque la abertura de la aguja ortogonal a la superficie del embrión (Figura 1D).
NOTA: La posición será diferente para diferentes ensayos. Para la generación de fuentes de moléculas de señalización ectópica y las extirpaciones celulares, esta será la parte superior del polo animal (Figura 1E); para el trasplante de línea germinal, este será el margen (Figura 1D, F). - Tire lenta y cuidadosamente del émbolo para atraer las células hacia la aguja.
NOTA: Si las células se absorben demasiado rápido, pueden dañarse. Si se hace correctamente, las células deben salir como una columna cilíndrica. Evite tomar yema en la aguja, ya que la yema trasplantada es tóxica para el embrión huésped. - Detenga la succión empujando suavemente el émbolo hacia abajo ligeramente una vez que se haya atraído el número deseado de células. Retire la aguja del embrión sacudiendo la aguja hacia un lado en un movimiento corto y rápido. Deje un poco de solución de Ringer a cada lado de la columna celular y restrinja las celdas al extremo cónico de la aguja (Figura 1C, D).
NOTA: El líquido frente a la columna celular ayudará a separar las células de los embriones huésped al depositar la columna celular. - Limpie cualquier resto de yema o restos celulares moviendo lentamente el émbolo hacia arriba y hacia abajo, mientras la aguja permanece sumergida, para lavar las células con la solución de Ringer. Si se hace correctamente, las células no dañadas permanecerán adheridas juntas en una columna mientras se lavan los escombros.
NOTA: Se debe tener mucho cuidado durante este paso, ya que el nivel del agua aumentará más allá del extremo cónico de la aguja. Esto causará una afluencia repentina de agua, que se puede utilizar para lavar las células. Sin embargo, una vez que el nivel del agua ha pasado el extremo cónico, el control fino con el émbolo se reducirá, y el émbolo debe moverse más lenta y cuidadosamente. - Mueva la placa de trasplante con la mano no dominante para colocar la aguja ortogonal en la superficie (ya sea polo o margen animal) del embrión huésped (Figura 1D-F)..
- Aplique suavemente una ligera presión y luego dé un movimiento rápido y agudo para perforar la capa envolvente del embrión huésped. Tenga cuidado de no rascarse la yema con la aguja.
NOTA: Aplicar una ligera presión sobre el embrión apretándolo cuidadosamente contra las paredes del pozo aumenta la tensión superficial del embrión y, por lo tanto, facilita la perforación de la capa envolvente. - Una vez que la aguja esté dentro, empuje suavemente el émbolo para extruir la columna de células en el embrión mientras retrae lentamente la aguja al mismo tiempo (Figura 1D-F).
- Limpieza de la aguja de trasplante.
- Enjuague la aguja moviendo el émbolo hacia arriba y hacia abajo mientras la aguja se sumerge en agua desionizada.
NOTA: Si la aguja permanece sucia, enjuáguela con una solución de hidróxido de sodio de 10 M antes de enjuagarla nuevamente con agua. - Guarde la aguja en una caja apropiada para su uso posterior.
- Enjuague la aguja moviendo el émbolo hacia arriba y hacia abajo mientras la aguja se sumerge en agua desionizada.
2. Generación de fuentes ectópicas de moléculas de señalización secretadas en embriones de pez cebra
- Preparación de los embriones huésped y donante.
- Recolecta embriones recién puestos apareando peces cebra.
- Decorionar embriones de pez cebra en etapa de 1 célula incubando hasta 100 embriones en 0.5 mg / ml de solución de pronasa durante aproximadamente 15 min en una pequeña placa de Petri de vidrio (una descripción detallada de este procedimiento ha sido publicada por Rogers, K. W. et al.14).
NOTA: Alternativamente, los embriones también pueden ser descoronados en la etapa alta justo antes del trasplante (paso 2.2), pero esto requiere que los embriones de donante inyectados y los embriones de huésped no inyectados se descorionen por separado. - Sumergir los embriones en medio embrionario en un vaso de precipitados de 200 ml.
NOTA: Los embriones en estadio de blástula y gastrula descorados son muy delicados. Su yema expuesta se adherirá a las superficies plásticas y se romperá al contacto con el aire. Por lo tanto, deben permanecer completamente sumergidos en el medio embrionario, transferidos con una pipeta de vidrio y mantenidos en placas de plástico recubiertas de agarosa (1% en el medio embrionario) o placas de Petri de vidrio. - Vacíe cuidadosamente la mayor parte del medio embrionario y llene lentamente el vaso de precipitados con medio embrionario fresco. La agitación leve causada de esta manera facilitará la eliminación de los coriones debilitados. Repita este paso 2-3 veces.
- Transfiera los embriones descoronados usando una pipeta Pasteur de vidrio a una placa de inyección recubierta de agarosa.
NOTA: Inflamar la punta de la pipeta Pasteur de vidrio exponiéndola a una llama de quemador Bunsen puede derretir y suavizar el borde, ayudando a prevenir daños a los embriones. - Inyectar el ARNm que codifica la proteína marcada fluorescentemente en un subconjunto de embriones (una descripción detallada de este procedimiento ha sido publicada por Rogers, K. W. et al.14). Inyecte el ARNm en la célula, no en la yema, para una expresión casi homogénea. Los embriones inyectados servirán como donantes, mientras que los embriones no inyectados servirán como huéspedes.
NOTA: La cantidad y el tipo de ARNm inyectado dependerán de la molécula de señalización que se esté estudiando y generalmente oscila entre 20 y 200 pg2,4,5,6 (pero puede ser tan alto como 1000 pg en ciertos casos4). - Transfiera los embriones inyectados a un plato de seis pocillos recubierto de agarosa lleno de medio embrionario. Incubar a 28 °C hasta que los embriones alcancen la etapa temprana.
- Trasplante de células para generar fuentes ectópicas.
- Llene un plato de trasplante (con pozos triangulares individuales en forma de cuña, consulte la Tabla de materiales) con la solución de Ringer (116 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 1 mM CaCl2, 5 mM HEPES; almacene el tampón HEPES a 4 °C).
NOTA: El calcio en la solución de Ringer promueve la adhesión celular y ayuda al embrión a sanar del procedimiento de trasplante. - Transfiera los embriones a la placa de trasplante.
- Coloque los embriones huésped y donante en columnas alternas, en cada caso con el polo animal orientado hacia la aguja de trasplante.
- Realizar el trasplante tal y como se describe en la sección 1.3. Para el trasplante de fuente ectópica, tome las células de origen de la parte superior del polo animal y depositelas en la misma ubicación en el embrión huésped (Figura 1E).
NOTA: Lavar las células con la solución de Ringer como se detalla en el paso 1.3.8 es importante para la generación de fuentes ectópicas para asegurarse de que las moléculas de señalización ya secretadas no se transfieran al huésped. No trasplante demasiadas células para asegurarse de que la fuente no se disperse. Una columna de aproximadamente 80 μm de diámetro y 100 μm de longitud es apropiada para muchas aplicaciones. - Permita que el embrión huésped permanezca en la solución de Ringer durante 30 minutos a 1 h para recuperarse.
- Examinar si las células se trasplantaron con éxito utilizando un estereomicroscopio de fluorescencia (Figura 2).
- Después de la recuperación, transfiera los embriones a una placa de seis pocillos recubierta de agarosa llena de medio embrionario y cúbralos a 28 ° C.
- Llene un plato de trasplante (con pozos triangulares individuales en forma de cuña, consulte la Tabla de materiales) con la solución de Ringer (116 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 1 mM CaCl2, 5 mM HEPES; almacene el tampón HEPES a 4 °C).
3. Generación de embriones de tamaño reducido mediante extirpación celular
- Preparación de embriones para la extirpación.
- Recolecte embriones recién puestos de pez cebra del genotipo deseado.
- Incubar los embriones a 28 °C hasta que alcancen la etapa alta.
- Decoorar los embriones como se describe en los pasos 2.1.2-2.1.5 cuando los embriones alcanzan la etapa alta.
NOTA: En este ejemplo, la extirpación celular se realiza en la etapa de esfera. En consecuencia, los embriones se descoronan aproximadamente 30 min a 1 h antes.
- Opcional: Etiquetado de la capa sincitial de yema (YSL).
NOTA: Si lo desea, inyecte dextrans fluorescente en el YSL antes de extirpar las células. Esta técnica permite determinar si el YSL permanece intacto después de la extracción celular, lo cual es importante para la embriogénesis normal15. Alternativamente, los ARNm o proteínas sintetizados in vitro también se pueden inyectar en el YSL.- Use una pipeta Pasteur para transferir los embriones decoronados a un plato de inyección recubierto de agarosa lleno de agua embrionaria.
- Oriente los embriones lateralmente, con el margen del blastodermo apuntando hacia la aguja de inyección (Figura 3A).
- Inyectar 0,5 nL de 1,5 μg/μL 10 kDa Alexa568-Dextran en el YSL, con el objetivo de obtener una región entre las células blastodérmicas y la yema a una profundidad de aproximadamente un tercio del diámetro del embrión. Inyecte todos los embriones dentro de una fila.
NOTA: Dado que la aguja de inyección no necesita perforar a través del corion, una abertura pequeña (~ 4 μm) y afilada es ventajosa. - Gire los embriones en 180° para que el lado opuesto del margen del blastodermo apunte hacia la aguja de inyección (Figura 3A).
- Inyectar otros 0,5 nL de 1,5 μg/μL 10 kDa Alexa568-Dextran en el YSL como se describe en el paso 3.2.3, produciendo un volumen total de inyección de 1 nL por embrión.
NOTA: La inyección desde dos lados permite una distribución más uniforme del dextrano fluorescente dentro del YSL. - Examine el resultado de la inyección bajo un estereomicroscopio de fluorescencia. Si se hace correctamente, la señal fluorescente se restringirá al YSL (Figura 3B) y no será visible en el espacio intercelular del blastodermo.
- Extirpación de células
- Llene un plato de trasplante con la solución de Ringer (ver paso 2.2.1).
- Transfiera los embriones al plato de trasplante.
- Orientar los embriones con el polo animal hacia la aguja de trasplante (Figura 3C).
- Retire cuidadosamente las células de la región del polo animal como se describe en los pasos 1.3.5-1.3.7, reduciendo así el blastodermo al tamaño deseado.
- Deseche las células extraídas expulsándolas de la aguja de trasplante.
- Una vez que se complete el procedimiento, permita que los embriones permanezcan en la solución de Ringer durante 30 minutos a 1 h para recuperarse.
- OPCIONAL: Examinar la integridad del YSL bajo un estereomicroscopio de fluorescencia (Figura 3D).
- Transfiera los embriones a una placa recubierta de agarosa llena de medio embrionario y incube a 28 °C.
4. Creación de mutantes materno-cigóticos mediante trasplante de línea germinal
- Preparación de embriones huésped y donante.
- Recolecta embriones recién puestos de peces cebra mutantes y de tipo salvaje. Los embriones de pez cebra con un fondo mutante servirán como donantes, mientras que los embriones de pez cebra con un fondo de tipo salvaje servirán como huéspedes.
NOTA: El trasplante de línea germinal requiere un alto número de embriones iniciales (~ 50 para donantes, ~ 500 para huéspedes) para garantizar un buen número de trasplantes exitosos de línea germinal que sobrevivan hasta la edad adulta. - Transfiera los embriones a una placa de inyección recubierta de agarosa con medio embrionario utilizando una pipeta Pasteur.
NOTA: Las inyecciones se realizan antes de la decorionación para aumentar el rendimiento. Las agujas para inyección a través del corion deben ser romas y tener una abertura más grande (~ 10 μm) para evitar la obstrucción. - Inyectar los embriones donantes con 1 nL de 100 ng/μL mRNA codificando GFP con un nos1 3'UTR. Inyecte el ARNm en la yema para aumentar el rendimiento.
NOTA: El nos1 3'UTR estabilizará el ARNm en las células germinales primordiales, haciendo que las células germinales sean fuertemente fluorescentes cuando se toman imágenes 1 día después de la fertilización10. - Inyectar a los embriones huéspedes 1 nL de morfolino de 0,33 mM (3 μg/μL ) sin salida (dnd ). Inyecte el morfolino en la yema para aumentar el rendimiento.
NOTA: El dnd morfolino bloquea la formación de células germinales primordiales, lo que asegura que la línea germinal del embrión huésped se poblará exclusivamente con células del donante después del trasplante10. - Transfiera los embriones inyectados a placas de Petri de plástico con medio embrionario. Incubar a 28 °C hasta que los embriones alcancen la etapa alta.
- Decoorar los embriones como se describe en los pasos 2.1.2-2.1.5 cuando los embriones alcanzan la etapa alta.
- Recolecta embriones recién puestos de peces cebra mutantes y de tipo salvaje. Los embriones de pez cebra con un fondo mutante servirán como donantes, mientras que los embriones de pez cebra con un fondo de tipo salvaje servirán como huéspedes.
- Trasplante de células germinales
- Llene un plato de trasplante con la solución de Ringer (ver paso 2.2.1).
- Transfiera los embriones de la esfera descoronada a la etapa de cúpula en el plato de trasplante.
- Coloque los embriones huésped y los embriones donantes en columnas alternas para trasplantar las células de un embrión donante a seis embriones huésped diferentes. Esto aumenta la probabilidad de que las células germinales de un embrión huésped determinado se trasplanten con éxito.
- Orientar los embriones con el margen hacia la aguja de trasplante y realizar el trasplante como se describe en la sección 1.3. Para los trasplantes de línea germinal (Figura 1D, F), tome las células de origen del margen (donde se encuentran las células germinales primordiales) y depositarlas en la misma ubicación en el embrión huésped.
NOTA: El trasplante de una columna grande (aproximadamente 80 μm de diámetro y 600 μm de longitud) aumentará la probabilidad de obtener un trasplante exitoso de la línea germinal. - Permita que el embrión permanezca en la solución de Ringer durante 30 minutos a 1 h para recuperarse una vez que se complete el trasplante.
NOTA: Si no se espera que todos los embriones de donantes sean mutantes homocigotos, por ejemplo, si son el resultado de un cruce heterocigoto, deben genotiparse después del trasplante para determinar el genotipo de la futura línea germinal trasplantada del huésped. En este caso, asegúrese de que las posiciones de los embriones del huésped y del donante no se mezclen durante la manipulación. - Use un estereomicroscopio de fluorescencia para examinar si las células se trasplantaron con éxito (Figura 4A, B).
- Transfiera los embriones a una placa recubierta de agarosa de 24 pocillos. Agrupe todos los embriones huésped que recibieron células del mismo donante en el mismo pozo y etiquételos en consecuencia. Incubarlos hasta el día siguiente a 28 °C.
- Si es necesario, transfiera los embriones de la donante a tiras de PCR marcadas para el genotipado.
- Detección de trasplantes exitosos de la línea germinal
- Examinar los embriones huéspedes para trasplantes exitosos de la línea germinal bajo un estereomicroscopio de fluorescencia aproximadamente 30 h después de la fertilización (hpf). Las células germinales se encuentran en el surco por encima de la extensión de la yema (Figura 4C).
NOTA: Los experimentos típicos con el dispositivo y la estrategia presentados aquí tendrán una tasa de éxito de ~ 60% -80% para obtener al menos un embrión huésped que lleve células germinales trasplantadas por embrión donante. Un informe anterior describió una eficiencia de ~ 10%10. - Si procede, descarte los embriones que recibieron células de embriones de donantes con un genotipo incorrecto. Cultivar larvas con células germinales trasplantadas con éxito a la edad adulta de acuerdo con las condiciones de cría estándar y siguiendo las pautas institucionales.
- Examinar los embriones huéspedes para trasplantes exitosos de la línea germinal bajo un estereomicroscopio de fluorescencia aproximadamente 30 h después de la fertilización (hpf). Las células germinales se encuentran en el surco por encima de la extensión de la yema (Figura 4C).
Representative Results
El éxito y el fracaso en el uso del dispositivo de trasplante para las tres aplicaciones descritas anteriormente se pueden evaluar fácilmente mediante inspección visual bajo un estereomicroscopio. En los trasplantes exitosos, el embrión debe verse normal y similar en forma y claridad de yema a los embriones no trasplantados, sin grandes desgarros en el blastodermo. Si el embrión está visiblemente dañado (Figura 4B), no se desarrollará normalmente. Idealmente, las células trasplantadas que expresan un marcador fluorescente deben aparecer como una columna continua cuando se ven bajo un estereomicroscopio de fluorescencia (Figura 2A, Figura 4A). Si la columna está fragmentada, esto indica que las células fueron cortadas por la succión en la aguja de trasplante o que la deposición de las células se realizó con demasiada fuerza. Esto se puede prevenir moviendo el émbolo más lenta y suavemente.
Aunque el dispositivo de trasplante se ha utilizado principalmente en embriones de pez cebra en etapas de blástula5,6, el trasplante y la extirpación celular funcionan igual de bien para embriones descimoronados en etapa de blástula del pez arroz japonés medaka (Oryzias latipes) (Figura 2B). Aparte de la deselección embrionaria, descrita por Porazinski, S. R. et al.17, se pueden seguir los mismos procedimientos descritos anteriormente.
En el caso específico del trasplante de línea germinal, un buen trasplante dará como resultado un embrión con una larga columna horizontal de células directamente por encima del margen de la yema (Figura 4A). Sin embargo, si las células germinales se trasplantaron con éxito solo se puede evaluar al día siguiente (Figura 4C-F) debido a la expresión de fondo de GFP en las etapas de la blástula (Figura 1F). Las células germinales primordiales aparecerán como pequeñas esferas fluorescentes en el surco directamente sobre la extensión de la yema (Figura 4C-E). La presencia de estas células en la ubicación correcta indica un trasplante exitoso de la línea germinal. Las células con una forma diferente no son células germinales (por ejemplo, las células alargadas son típicamente células musculares, Figura 4F). Además, si las células germinales primordiales se encuentran fuera del surco, esto significa que no han podido migrar correctamente y no podrán contribuir a la línea germinal del embrión. Finalmente, la morfología general de los embriones trasplantados debe parecer similar a la de los embriones no trasplantados (Figura 4D); la cola no debe deformarse, y la cabeza no debe encogerse o faltar ojos (Figura 4E). Estos defectos generalmente son el resultado de concentraciones excesivamente altas de morfolino o del daño embrionario durante el trasplante. Los experimentos de trasplante de línea germinal como se describe aquí generalmente darán como resultado 1-2 de cada 6 embriones huésped con células germinales trasplantadas con éxito para el 60% -80% de los embriones de donantes, dependiendo de la experiencia del experimentador. Por lo tanto, las células de 40-50 embriones de donantes homocigotos deben trasplantarse a 200-300 embriones huésped para criar aproximadamente 30 individuos con células germinales mutantes.
Figura 1: Montaje y uso del dispositivo de trasplante. (A) El dispositivo de trasplante se ensambla conectando una jeringa hermética al gas con un soporte de micropipeta a través del accesorio de bloqueo Luer. La aguja de vidrio para el trasplante se inserta en el soporte de la micropipeta. (B) Fotografía del dispositivo de trasplante ensamblado montado en un micromanipulador (tenga en cuenta que el fondo y las etiquetas se han eliminado de la imagen). (C) Al utilizar el dispositivo de trasplante, es importante asegurarse de que el nivel de agua en la aguja de trasplante permanezca en el extremo cónico. (D) El dispositivo se utiliza bajo un estereomicroscopio para extraer e insertar células de y dentro de embriones teleósteos colocados en pocillos individuales de un plato de trasplante. (E) Para la generación de fuentes ectópicas, las células se toman del polo animal de un embrión donante (i-ii) y se transfieren al polo animal de un embrión huésped (iii-vi). (F) Para el trasplante de línea germinal, se toma un mayor número de células del margen de un embrión donante (i-ii), donde se encuentran las células germinales. Las células se transfieren al margen de los embriones huésped (iii-vi). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Generación de clones por trasplante celular. (A) Ejemplo de un clon doble generado por trasplante secuencial de células fluorescentes (verde) de un donante de pez cebra a un embrión huésped de pez cebra. Los clones simples y dobles se pueden utilizar para estudiar cómo las moléculas de señalización secretadas forman gradientes espaciotemporales2,4,5,6. (B) Ejemplo de un solo clon generado por el trasplante de células de un donante de medaka transgénico que expresa eGFP (Wimbledon)17 a un huésped medaka de tipo salvaje. Las barras de escala representan 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Generación de embriones de tamaño reducido mediante extirpación celular. (A) Antes de eliminar células por extirpación, el YSL se puede etiquetar inyectando colorantes fluorescentes en dos lados opuestos del YSL. (B) Ejemplo de un embrión después de la inyección de YSL. (C) Para generar embriones de tamaño reducido, las células del polo animal se eliminan mediante extirpación5. (D) Ejemplo de un embrión después de la extirpación celular. Tenga en cuenta que el YSL permanece intacto. Las barras de escala representan 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Trasplante de línea germinal. (A) Ejemplo de un trasplante exitoso de células de donantes (verde) en la zona marginal del huésped. (B) Ejemplo de un trasplante fallido. La yema del embrión huésped fue severamente dañada, y el embrión no podrá desarrollarse normalmente. (C) A 30 hpf, las células germinales trasplantadas con éxito se encontrarán únicamente en el mesodermo gonadal en la región anterior de la extensión de la yema. (D) Ejemplo de un trasplante exitoso en el que varias células germinales de donantes marcadas con GFP han poblado la futura gónada del huésped. (E) Ejemplo de un trasplante fallido. Aunque las células germinales han alcanzado el mesodermo gonadal, el embrión huésped está severamente deformado y no se desarrollará normalmente. (F) Ejemplo de un trasplante fallido. Las células germinales fluorescentes que no migraron a la ubicación correcta no repoblarán las gónadas. Las barras de escala representan 100 μm. Las imágenes en D-F se tomaron con un aumento total de aproximadamente 50x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
El éxito de un experimento de trasplante depende en gran medida de las habilidades motoras finas del experimentador. Para llevar a cabo con éxito los procedimientos, se requiere práctica. Sin embargo, el instrumento presentado aquí es relativamente fácil de aprender y usar en comparación con otros en el mercado y, en general, solo se necesitan unos pocos días de práctica.
El éxito del procedimiento de trasplante se puede mejorar tomando varias precauciones. Un paso es asegurarse de que el micromanipulador sea de buena calidad y capaz de funcionar sin problemas. Agregar un ocular con mayor aumento al estereomicroscopio puede ayudar a posicionar con precisión la aguja en relación con el embrión. El uso de peces cebra o medaka bien reproductores para adquirir embriones sanos y tener cuidado de no dañar los embriones durante el manejo (especialmente durante y después de la etapa de deselección) también mejorará la tasa de éxito.
Los problemas con la toxicidad retardada pueden ser más difíciles de solucionar. Si un embrión muere después de unas horas, pero no inmediatamente después del trasplante, la yema podría haber sido dañada por la aguja (por ejemplo, al ingresar al embrión demasiado profundamente), o tal vez las células fueron expulsadas con demasiada fuerza. La toxicidad retardada y la muerte embrionaria también pueden ser el resultado de la yema o los restos celulares inyectados junto con las células del donante; otra causa puede ser el deterioro del búfer HEPES en la solución de Ringer. Estos problemas se pueden superar lavando las células (ver paso 1.3.8) o simplemente usando un nuevo lote de tampón, respectivamente. Además, los embriones huésped deformados en experimentos de trasplante de línea germinal podrían ser el resultado de concentraciones excesivamente altas de morfolino. Es crucial usar suficiente morfolino para extirpar completamente la línea germinal de tipo salvaje del huésped, evitando así que estas células contribuyan a la descendencia, pero al mismo tiempo, se deben evitar las concentraciones excesivamente altas de morfolino. Por lo tanto, las cantidades consistentes de morfolino en todos los embriones huésped inyectados (unos pocos cientos en un experimento típico) son clave para el éxito de los trasplantes de línea germinal. Esto se puede ayudar complementando la mezcla de inyección de morfolino con un tinte trazador fácilmente visible14, que se puede rastrear bajo un estereomicroscopio de fluorescencia para garantizar que todos los embriones reciban el mismo volumen de inyección.
Los procedimientos descritos en este protocolo implican exclusivamente manipulaciones de células en embriones de pez cebra en etapa de blástula o medaka, pero en el futuro, es probable que sea posible adaptar el dispositivo a diferentes etapas y especies cambiando el diámetro y la forma de la aguja de trasplante.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Este proyecto fue apoyado por la Sociedad Max Planck y recibió financiación del Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (acuerdo de subvención n.º 637840 (QUANTPATTERN) y acuerdo de subvención n.º 863952 (ACE-OF-SPACE)).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mm glass capillary, ends cut without filament | To make the transplantation needle | ||
| 1.0 mm glass capillary, ends cut with filament | To make injection needles | ||
| 200 mL glass beaker | For embryo dechorionation | ||
| 24-well plastic plate | To be coated with agarose in order to incubate embryos | ||
| 5 cm diameter glass Petri dish | For embryo dechorionation | ||
| 6-well plastic plate | To be coated with agarose in order to incubate embryos | ||
| Agarose | To coat plastic dishes | ||
| dnd1 morpholino | Gene Tools | Sequence: GCTGGGCATCCATGTCTCCGAC CAT |
|
| Embryo medium | 250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
| Fluorescence stereomicroscope with GFP/RFP filters and light source | To assess YSL injections and germ-line transplantations | ||
| Glass micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | To make the transplantation needle |
| Glass pasteur pipette | Kimble Chase (via Fisher) | 63A53WT | For pipetting embryos; the tips can be flamed to smoothen out the edge |
| Incubator at 28 °C | For incubating zebrafish embryos | ||
| Luer tip 25 μL Hamilton syringe, 1700 series | Hamilton | Ref: 80201 | Part of the transplantation device |
| Manual micromanipulator with 3 axes of movement | Narishige | M-152 | For controlling the transplantation device |
| Manual pipetting pump | Bio-Tek | Cat. # 641 | For use with the glass pipettes to transfer embryos |
| Metal dissecting probe | For moving and rotating zebrafish embryos | ||
| Microforge | Narishige | MF2 | To make the transplantation needle |
| Microinjection apparatus | For injection of mRNA and morpholino into embryos | ||
| Microinjection molds, triangular grooves | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare microinjection plates with agarose |
| Microinjection-molds, single wells | Adaptive Science Tools | PT-1 | To prepare transplantation plates with agarose |
| Micropipette holder with Luer fitting for a 1.0 mm glass capillary | World Precision Instruments | MPH6S10 | Part of the transplantation device |
| mMessage mMachine Sp6 transcription kit |
Life Technologies | AM1340M | To generate capped mRNA for injection into embryos |
| Plasmid with GFP-nos1 3'UTR | Plasmid that can be transcriped to produce mRNA encoding GFP with the 3'UTR of nos1 | ||
| Plastic petri dish 100 mm | To be coated with agarose in order to make injection and transplantation dishes | ||
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | For embryo dechorionation: Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos |
| Ringer’s solution | For 1 L: Add 6.78 g of NaCl, 0.22 g of KCl, 0.26 g of CaCl2 and 1.19 g of HEPES; then fill to 1 L; adjust pH to 7.2; sterilize by filtration | ||
| Stereomicroscope | For injection and transplantation |
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