Summary
Dette papir giver en detaljeret protokol til forberedelse af prøvegitter ved temperaturer så høje som 70 ° C, inden nedfrysning til cryo-EM-eksperimenter.
Abstract
Prøvegitterene til kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) eksperimenter fremstilles normalt ved en temperatur, der er optimal til opbevaring af biologiske prøver, for det meste ved 4 °C og lejlighedsvis ved stuetemperatur. For nylig opdagede vi, at proteinstrukturen løst ved lav temperatur muligvis ikke er funktionelt relevant, især for proteiner fra termofile arkæer. Der blev udviklet en procedure til fremstilling af proteinprøver ved højere temperaturer (op til 70 °C) til cryo-EM-analyse. Vi viste, at strukturerne fra prøver fremstillet ved højere temperaturer er funktionelt relevante og temperaturafhængige. Her beskriver vi en detaljeret protokol til forberedelse af prøvegitre ved høj temperatur ved hjælp af 55 °C som eksempel. Forsøget gjorde brug af et forglasningsapparat modificeret ved hjælp af et yderligere centrifugerør, og prøverne blev inkuberet ved 55 °C. De detaljerede procedurer blev finjusteret for at minimere dampkondensation og opnå et tyndt lag is på gitteret. Eksempler på vellykkede og mislykkede eksperimenter gives.
Introduction
Kryo-EM-teknologien til løsning af strukturerne i proteinkomplekser er fortsat med at blive forbedret, især i retning af at opnå strukturer med høj opløsning 1,2. I mellemtiden er landskabet for dets anvendelse også blevet udvidet ved at variere prøvebetingelserne såsom pH eller ligander forud for forglasningsprocessen3, hvilket indebærer forberedelse af prøvegitter efterfulgt af springfrysning 4,5. En anden vigtig betingelse er temperaturen. Selvom cryo-EM-eksperimenter, som røntgenkrystallografi, udføres ved lave temperaturer, afspejler strukturen løst af cryo-EM strukturen ved opløsningstilstanden før vitrifikation. Indtil for nylig bruger størstedelen af enkeltpartikelanalyse (SPA) cryo-EM-undersøgelser prøver, der opbevares på is (dvs. ved 4 ° C) før vitrifikation6, selvom en række undersøgelser bruger prøver ved omkring stuetemperatur 7,8,9,10 eller så højt som 42 ° C 11. I en nylig rapport udførte vi temperaturafhængige undersøgelser af enzymet ketolsyrereduktoisomerase (KARI) fra den termofile arkæon Sulfolobus solfataricus (Sso) ved seks forskellige temperaturer fra 4 °C til 70 °C12. Vores undersøgelser tyder på, at det er vigtigt at forberede prøvegitter ved funktionelt relevante temperaturer, og at cryo-EM er den eneste strukturelle metode, der er praktisk mulig til at løse strukturen af det samme proteinkompleks ved flere temperaturer.
Den største vanskelighed ved forglasning ved høje temperaturer er at minimere dampkondensation og opnå tynd is. Her rapporterer vi den detaljerede protokol, der blev brugt til fremstilling af prøvegitter ved høje temperaturer i vores tidligere undersøgelse af Sso-KARI 12. Vi antager, at læserne eller seerne allerede har erfaring med den samlede prøveforberedelse og databehandlingsprocedurer for cryo-EM-eksperimenter og understreger de aspekter, der er relevante for høj temperatur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Denne protokol sigter mod at anvende et modificeret kommercielt vitrifikationsapparat til at forberede kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) prøver ved specifikke temperaturer, især højere end 37 ° C. Den samlede forsøgsopstilling er vist i figur 1. Protokollen bruger 55 °C som eksempel. For de særlige forhold ved andre temperaturer henvises til supplerende tabel 2 i reference12.
1. Fremstilling af forglasningsapparatet
- Lav et hul på 1 cm i et 50 ml centrifugerør på den lukkede ende.
- Anbring røret i vitrifikationsapparatets kammer ved ultralydsvandudløbet, som vist i figur 2.
BEMÆRK: Formålet er at minimere vandkondensation ved at lede vanddamp til varmeveksleren gennem røret, inden den når hele kammeret. - Vitrifikationsapparatets temperatur indstilles til den angivne temperatur (f.eks. 55 °C som vist i figur 3), og vitrifikationsapparatets kammer når op på 55 °C og 100 % relativ luftfugtighed. Lad det stå i mindst en halv time for at stabilisere forholdene, inden eksperimentet startes.
2. Opvarmning af prøven og værktøjerne
- Anbring vandbadet på en kogeplade og indstil kogepladen til den ønskede temperatur (her 55 °C). Kontroller med et termometer for at sikre, at vandet når 55 °C.
- Prøven inkuberes i vandbadet, og pipettespidsen forvarmes på kanten af kogepladen i 2 minutter eller længere før blottingforsøget.
BEMÆRK: Den højeste temperaturindstilling for vitrifikationsapparatets kammer er 60 °C. For at forberede højere temperaturgitter til cyro-EM-forsøg (f.eks. 70 °C) inkuberes prøven i vandbadet ved 80 °C, og gennemsnittet mellem prøvetemperaturen og vitrifikationsapparatets temperatur anslås at være prøvens faktiske temperatur på nettet (70 °C i dette tilfælde). Se afsnittet Diskussion for yderligere detaljer og begrænsninger for dette skøn.
3. Forberedelse til blottingeksperimentet
- Glød udleder et hullet kulstofunderstøttet gitter ved 25 mA i 30 s eller alternativ til værdierne afhængigt af den anvendte enhed.
- Inkuber pincetten med gitteret i forglasningsapparatet i 2 minutter eller længere.
- Fyld ethanbeholderen med ethan i henhold til standardprocedurer. Lad ikke ethanen flyde over.
BEMÆRK: Dette trin tager ca. 10 minutter og skal straks følges med blottingeksperimentet for at undgå frysning. - Anbring forglasningsfilterpapiret i vitrifikationsapparatets kammer tidligst 5 minutter før blottingforsøget.
BEMÆRK: Hvis du placerer filterpapiret i kammeret for tidligt, bliver det for vådt.
4. Blotting eksperiment
BEMÆRK: Når du holder gitteret, skal du sikre dig, at gitteret er stabilt, og at der er et minimalt kontaktområde med pincetten (figur 4). Dette gøres for at opretholde den bedste køleeffektivitet af ethan og for at undgå ikke-glasagtig is.
- Brug en pipettespids til at påføre 7-9 μL af prøven på gitteret. Vent derefter i 1-2 s, blot i 1-1,5 s, og spring hurtigt prøven til flydende ethan.
- Overfør gitteret fra flydende ethan til cryoboksen, som opbevares i flydende nitrogen.
BEMÆRK: Dette trin skal udføres meget omhyggeligt, fordi pincetten stadig er varm, så hele køletanken er fuld af damp på dette tidspunkt.
5. Kvalitetskontrol af nettene
- Klip gitrene og upload dem til et cryo-EM-instrument.
- Brug skærmen på cryo-EM-instrumentet og softwarens lavdosisfunktion til at screene istilstanden på nettet og fordelingen af prøven på nettet.
BEMÆRK: Ofte er gitterene meget tørre, eller islaget er for tykt. Succesraten for de net, der tilberedes ved høje temperaturer, er væsentligt lavere end ved stuetemperatur eller 4 °C. Repræsentative resultater af gode gitre og ikke-tilfredsstillende gitre vises i næste afsnit. - Hvis kvaliteten af det resulterende gitter ikke er god, skal du gentage processen med gitterforberedelse med forskellige forhold (såsom ventetid, blottingtid osv.). Hvis kvaliteten af det resulterende gitter er god, skal du gentage de samme trin for at lave gitre ved en anden temperatur.
6. Dataindsamling
- Overfør gitterene af god kvalitet til et cryo-EM-instrument med høj opløsning.
- Udfør dataindsamling og dataanalyser i henhold til etablerede procedurer.
BEMÆRK: Som vist i vores tidligere publikation påvirkes strukturens opløsning ikke af den høje temperatur12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oversigten over lav forstørrelse er vist i figur 5A,B. Panel A er et eksempel på et vellykket gitter. Der er en isgradient fra øverst til venstre (tykkere) til nederst til højre (tyndere eller tom). Et sådant gitter gør det lettere at finde en passende tykkelse af islaget i det midterste område, der er egnet til dataindsamling, såsom de blå og grønne kasser. Gitteret B er for tørt. Firkanterne i gitteret har lys kontrast, hvilket betyder, at islaget er for tyndt, eller at der slet ikke er noget islag. Kun de to firkanter, der er angivet med de røde pile, er egnede til dataindsamling.
Desuden er eksempler på lavdosisbilleder fra forskellige gitre vist i figur 5C,D. Billedet i panel C viser, at det meste af isen er i krystallinsk form, ikke egnet til dataindsamling. På den anden side viser billedet i panel D, at islaget for det meste er i en amorf tilstand, der er egnet til dataindsamling.
Bemærk, at dette er et kort papir med fokus på gitterforberedelse ved høje temperaturer. Gitteret indeholder kun eksemplet til dataindsamling. Et godt gitter har en god chance, men ikke en bestemt chance, for at generere gode data til løsning af en struktur med høj opløsning. De virkelige cryo-EM-data og endelige strukturer for de eksempler, der er beskrevet i dette papir, er allerede beskrevet i det offentliggjorte papir12. Kort sagt har vi opnået gitre, der er gode nok til dataindsamling, løst strukturerne i to Sso-KARI-komplekser ved seks forskellige temperaturer hver og sammenlignet strukturerne fra forskellige temperaturer for hvert kompleks samt strukturerne mellem de to komplekser fra samme temperatur. Resultaterne indikerer, at strukturen af hvert kompleks er temperaturafhængig, og at de temperaturafhængige ændringer er forskellige mellem de to komplekser. Det er vigtigt, at de successive strukturelle ændringer korrelerer godt med de successive temperaturændringer, hvilket er en stærk indikation for succesen med den temperaturafhængige prøvegitterforberedelse.
Figur 1: Den samlede eksperimentelle opsætning for højtemperatur cryo-EM prøveforberedelse. De viste genstande inkluderer forglasningsapparat, inkubator, timer, placering af pipettespids, køletank og pincet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Modifikation af vitrifikationsapparatets kammer. Et 50 ml rør er installeret ved ultralydssprøjteudløbet som angivet med den røde pil12. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Forglasningsapparatets udseende under forsøget. Skærmen viser temperaturen ved 55 °C og luftfugtigheden ved 100 %. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Brug af pincet til at få fat i gitteret. Det anbefales, at pincetten griber fat i gitteret med så lidt kontakt som muligt, men det skal være i stand til at holde gitteret stabilt under driftsprocessen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Repræsentative resultater: Gitterkontrol af Cryo-EM. (A,B) viser nettets overordnede tilstand. (C,D) viser eksempler på lavdosisbilleder fra forskellige gitre. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I trin 1 i protokollen skal du sørge for, at centrifugerøret er installeret godt og ikke falder, når eksperimentet er i gang. På grund af akkumuleringen af et stort antal vanddråber i kammeret, som kan ændre filterpapirets adsorptionskapacitet, anbefales det, at eksperimentets samlede tid ikke overstiger 30 minutter efter, at vitrifikationsapparatets kammer nåede ligevægtstemperaturen. Hvis driftstiden overstiger 30 minutter, skal operatøren udskifte filterpapiret og vente på, at kabinen balancerer temperatur og fugtighed igen. Ved trin 8 i protokollen er det foreslåede prøvevolumen på 7-9 μL større end normalt, da prøven ellers fordamper hurtigt ved høj temperatur, hvilket fører til tomme firkanter på gitteret. På den anden side anbefales det stærkt, at den anvendte prøve ikke overstiger 9 μL. Ellers er det meget sandsynligt, at prøven drypper ned under processen med at flytte pincetten inden blotting. Samlet set er en nøgle til succesen med denne teknik stabil og hurtig greb om gitre og korrekt og stabil udførelse af hver tidsbegrænset handling. Desuden anbefales det, at hver runde af eksperimenter kun omhandler en bestemt høj temperatur. Før eksperimentet udføres ved en anden temperatur, skal alle systemer genvindes fuldstændigt og nulstilles.
På grund af kammerets høje temperatur og høje luftfugtighed er vinduet ofte dækket af tåge, hvilket fører til vanskeligheder med at starte eksperimentet. Brug af lidt sæbeskum anbefales til at rydde vinduet. Hvis gitre ikke er gode, er mulige årsager, at de ovenfor beskrevne trin ikke følges nøjagtigt, og / eller at trinene tager for lang tid. Prøv at gentage forberedelsen af prøvegitter med præcision og hurtighed. Hvis gitterene stadig ikke er gode efter gentagelser, så prøv at justere forholdene. Det hyppigere problem, der observeres i dette eksperiment, er ingen is på nettet ved den høje temperatur. Hvis ja, prøv at reducere blottingtiden yderligere. På den anden side, hvis isen er for tyk, skal du prøve at øge blottingtiden.
En begrænsning af højtemperatur cryo-EM er, at den maksimale opvarmningstemperatur på vitrifikationsapparatet er 60 °C. For at nå frem til den højere temperatur blev prøven opvarmet til over 60 °C (f.eks. 80 °C), og gennemsnittet mellem prøvetemperaturen og forglasningstemperaturen blev anslået til at være prøvens reelle temperatur i gitteret (70 °C, i dette tilfælde). Der kan være en vis unøjagtighed baseret på dette skøn. En mulig fremtidig løsning er at bygge et termoelement til at måle gittertemperaturen nøjagtigt lige før nedfrysning. En anden potentiel begrænsning er proteinets stabilitet ved høje temperaturer. Et separat eksperiment med cirkulær dikroisme bør udføres for at sikre, at proteinet er stabilt ved temperaturen for det planlagte cryo-EM-eksperiment.
En anden begrænsning er, at kun to typer kommercielt tilgængelige forglasningsapparater kan opvarmes til over 37 °C og op til 60 °C som nævnt ovenfor (f.eks. Thermo Fischer Vitrobot og Leica EM-GP). Forglasningsapparater fra andre leverandører er enten begrænset til stuetemperatur eller kan kun justeres mellem 4 °C og 37 °C. Det er dog muligt for forskergrupper at bygge deres egne faldende enheder med udvidede temperaturområder i fremtiden.
Vores protokol er ændret fra eksisterende protokoller 4,5,6 med det formål at forberede gitterene ved temperaturer højere end stuetemperatur. Uden at foretage de ændringer, der er beskrevet her, er chancen for succes for at lave gode højtemperaturprøvegitter, der er egnede til cryo-EM-billedindsamling, meget lille.
To artikler i 2019 har vist, at proteinstrukturer er temperaturafhængige i forhold til proteinfunktionernes temperaturafhængighed i området fra 4 °C til 42 °C for TRP-kanalen TRPV311 og 4 °C til 70 °C for Sso-KARI 12. Disse rapporter vil sandsynligvis tilskynde til en ændring i cryo-EM-forskningen, idet flere fremtidige undersøgelser vil blive udført ved funktionelt relevante temperaturer, normalt ved 37 °C. Stabiliteten af det oprensede protein ved denne temperatur kan være et problem. Det er dog nødvendigt at inkubere proteinprøven ved denne temperatur i kun 2 minutter i henhold til vores protokol. Alternativt kan fysiologiske tilstande opnås ved billeddannelse af proteiner i celler ved hjælp af tomografi og sub-tomo-gennemsnit. Desuden kan cryo-EM bruges til at studere mekanismen og mellemprodukterne af protein, der udfolder sig ved høje temperaturer, sandsynligvis i området fra 40 °C til 80 °C. Disse undersøgelser vil alle drage fordel af den protokol, der er beskrevet her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Hervé Remigy fra Thermo Fisher Scientific for nyttige råd. Kryo-EM-eksperimenterne blev udført på Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM). ASCEM er støttet af Academia Sinica (Grant No. AS-CFII-108-110) og Taiwan Protein Project (tilskudsnr. AS-KPQ-109-TPP2). Forfatterne takker også fru Hui-Ju Huang for hjælpen med prøveforberedelsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon tube | Falcon | 352070 | size: 50 mL |
| Filter paper | Ted Pella | 47000-100 | Ø55/20mm, Grade 595 |
| HI1210 | Leica | water bath | |
| K100X | Electron Microscopy Sciences | glow discharge | |
| Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid | Ted Pella | 658-200-CU-100 | |
| Titan Krios G3 | Thermo Fisher Scientific | 1063996 | low dose imaging |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot Tweezer | Ted Pella | 47000-500 |
References
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587, 157-161 (2020).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
- Chen, C. Y., et al. Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase. Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).
- Cabra, V., Samsó, M. Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction. Journal of Visualized Experiments. (95), e52311 (2015).
- Klebl, D. P., et al. Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales. Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).
- Passmore, L. A., Russo, C. Specimen preparation for high resolution cryo-EM. J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
- Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -F., Savage, D. F., Davies, K. M. Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis. Nature. 566, 411-414 (2019).
- Gao, Y., et al. Structures and operating principles of the replisome. Science. 363, (2019).
- Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364, 355-362 (2019).
- Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23, 1097-1105 (2015).
- Singh, A. K., et al. Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3. Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).
- Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions. Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).
