Summary
L'obiettivo generale di questa procedura è descrivere un metodo per l'auto-somministrazione di farmaci che possono essere utilizzati in modelli murini di alimentazione e obesità.
Abstract
Gli studi preclinici sui topi spesso si basano su protocolli invasivi, come iniezioni o gavage orali, per portare i farmaci. Queste stressanti vie di somministrazione hanno effetti significativi su importanti parametri metabolici tra cui l'assunzione di cibo e il peso corporeo. Sebbene un'opzione interessante per aggirare questo sia quella di comporre il farmaco nel cibo dei roditori o scioglierlo in acqua, questi approcci hanno anche limitazioni in quanto sono influenzati dalla stabilità del farmaco a temperatura ambiente per lunghi periodi di tempo, dalla solubilità del farmaco in acqua e dal fatto che il dosaggio dipende fortemente dai tempi di assunzione di cibo o acqua. La costante disponibilità del farmaco limita anche la rilevanza traslazionale su come i farmaci vengono somministrati ai pazienti. Per superare queste limitazioni, i farmaci possono essere miscelati con alimenti altamente appetibili, come il burro di arachidi, consentendo ai topi di auto-somministrare composti. I topi consumano in modo affidabile e riproducibile il pellet di burro di droga / arachidi in un breve lasso di tempo. Questo approccio facilita un approccio di consegna con uno stress minimo rispetto a un'iniezione o a un gavage. Questo protocollo dimostra l'approccio della preparazione del farmaco, dell'acclimatazione animale alla consegna del placebo e della somministrazione del farmaco. Le implicazioni di questo approccio sono discusse in studi relativi ai tempi di somministrazione del farmaco e al ritmo circadiano.
Introduction
L'obiettivo di questo metodo è quello di fornire farmaci nei topi attraverso una procedura non invasiva e minimamente stressante. Gli studi preclinici sui topi spesso si basano su vie stressanti e invasive di somministrazione del farmaco che possono avere impatti significativi sui parametri metabolici. Ad esempio, il gavage orale giornaliero ripetitivo può ridurre significativamente l'apporto calorico e l'aumento di peso nei topi1. Inoltre, il gavage orale può essere tecnicamente impegnativo e ha il potenziale per causare lesioni. In alternativa, i topi possono auto-somministrare composti che vengono miscelati nel loro cibo o disciolti nella loro acqua potabile 2. Tuttavia, questo approccio ha una limitazione importante, che si basa sui tempi circadiani naturali dell'assunzione di cibo o acqua. Inoltre, la stabilità del farmaco o la solubilità in acqua possono essere problemi importanti se somministrati cronicamente in questo modo. Per superare queste limitazioni, i farmaci possono essere miscelati con alimenti altamente appetibili, come l'impasto per biscotti 3, gelatina 4,5 o burro di arachidi 6 per incoraggiare l'auto-somministrazione nei topi in un momento specificato. Questo approccio ha il vantaggio di facilitare la somministrazione di farmaci con uno stress minimo rispetto a un'iniezione o a un gavage giornaliero1. Questa procedura può essere adattata per fornire un'ampia varietà di farmaci ai topi. Questo protocollo dimostra il processo di preparazione del farmaco, l'addestramento, seguito dalla somministrazione di farmaci in alimenti altamente appetibili. Ad esempio, questo metodo viene utilizzato per somministrare il farmaco antipsicotico risperidone a topi femmina C57BL / 6J. Risperidone è ben noto per avere potenti effetti iperfagici e di aumento di peso nei pazienti 7 che è ben modellato nei roditori 6,8. Questo sistema di somministrazione facilita un modello altamente traslazionale che potrebbe essere utilizzato per studiare un'ampia varietà di farmaci e i loro effetti sui percorsi che regolano l'assunzione di cibo e il peso corporeo 9.
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Protocol
Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della California, San Diego.
1. Fare il pellet di burro di arachidi droga
- Calcola la quantità di farmaco necessaria per fare la dose desiderata di farmaco in un pellet di burro di arachidi e scala la dimensione del lotto richiesto per un esperimento. È importante sottolineare che i pellet possono essere mantenuti a -80 °C, a seconda della stabilità del farmaco.
- Polverizzare le compresse di droga usando un mortaio e un pestello.
- Pesare la quantità calcolata di burro di arachidi richiesto mettendolo in una barca di pesatura su una bilancia tarata.
- Mettere il burro di arachidi su un becher di acqua tiepida fino a quando non si scioglie.
- Aggiungere la quantità necessaria di farmaco polverizzato nell'arachide fusa e mescolare accuratamente.
- Lasciare raffreddare la miscela di burro di arachidi in modo che possa essere facilmente inserita negli stampi di gomma.
- Metti il mix di burro di arachidi e droga in uno stampo. Quello usato qui è uno stampo a pellet di corticosterone di gomma e crea circa ~ 100 mg di pellet di burro di arachidi. L'aggiustamento del rapporto tra farmaco e burro di arachidi può essere necessario per garantire l'appetibilità.
- Ripeti questi passaggi con il solo burro di arachidi per fare pellet placebo.
- Congelare lo stampo a -20 °C o -80 °C (a seconda della stabilità del farmaco) per consentire al burro di arachidi di indurirsi fino all'uso.
2. Configurazione del mouse
- Ospitare i topi da solo in gabbie standard per topi. Linea con biancheria da letto e arricchimento in carta altamente assorbente, compresi asciugamani di carta e cupola dell'alloggiamento. Questa lettiera di carta facilita misurazioni accurate dell'assunzione di cibo consentendo la quantificazione del cibo versato da feci e lettiere.
NOTA: È stata ottenuta l'approvazione IACUC di ENsure per i topi che ospitano singly. - Fornire cibo e acqua ad libitum e consentire ai topi di acclimatarsi all'alloggiamento per circa 3 giorni.
3. Formazione all'auto-dosaggio del burro di arachidi
- Pianificare e selezionare il momento ottimale della giornata per la somministrazione del farmaco.
- Veloci i topi per 24 ore e assicurati che l'approvazione IACUC sia stata ricevuta per la durata di digiuno scelta.
- Togliere lo stampo dal congelatore, lasciare che lo stampo di gomma si ammorbidisca in modo che il pellet possa essere facilmente estruso dallo stampo. Tutta la formazione può essere completata utilizzando pellet di controllo placebo.
- Posizionare un pellet di burro di arachidi di controllo placebo sulla parete della gabbia a circa 1,5 pollici dalla base. Il primo giorno, potrebbe essere necessario circa 1 ora perché il topo consumi il pellet di burro di arachidi a causa della novità.
- Dopo la sessione di allenamento fornire ad libitum l'accesso al cibo e all'acqua.
- Il giorno seguente, posizionare il pellet di burro di arachidi sulla parete della gabbia nella stessa posizione per un ulteriore addestramento su topi non a digiuno.
- Ripetere l'allenamento nei topi nutriti per circa 3 giorni. Il tempo necessario per consumare il burro di arachidi sarà inferiore a 30 minuti entro il terzo giorno di allenamento.
4. Esperimento
- Randomizzare i topi ai gruppi di trattamento in base al peso corporeo in modo che i gruppi abbiano lo stesso peso corporeo medio prima del trattamento.
- Pianifica di somministrare le pillole di burro di arachidi (trattamento o placebo) ai topi nello stesso momento in cui sono stati addestrati a ricevere i pellet di burro di arachidi.
- Pesare il cibo e il mouse e registrare i valori.
- Assicurarsi che le pillole di burro di arachidi (trattamento o placebo) siano collocate nella stessa posizione nella gabbia come stabilito durante l'allenamento.
- Continuare la procedura di dosaggio ogni giorno per tutta la durata dell'esperimento.
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Representative Results
Nell'esempio qui presentato, il burro di arachidi è stato usato per consegnare risperidone ai topi ogni giorno per 14 giorni.
Questo studio mostra che la somministrazione cronica di risperidone attraverso questo metodo facilita l'aumento altamente riproducibile dell'assunzione di cibo e del peso corporeo rispetto al controllo (Figura 1a,b). Inoltre, questo metodo di somministrazione si traduce in dati altamente coerenti rispetto ad approcci di consegna alternativi e più stressanti come le iniezioni intraperitoneali (Figura 1c,d).
Figura 1. L'effetto dei metodi di somministrazione di farmaci sull'assunzione di cibo e sull'aumento di peso nei topi. I topi femmina C57BL/6J sono stati trattati con risperidone (3 mg/kg) in un pellet di burro di arachidi o in un pellet di controllo placebo ogni giorno alle 8 del mattino per 14 giorni. I topi trattati con risperidone nel burro di arachidi avevano un'assunzione giornaliera di cibo significativamente più elevata (a) e guadagnavano significativamente più peso (b) rispetto al trattamento di controllo. Inoltre, il parto intraperitoneale di risperidone (3 mg/kg) non ha avuto effetti così robusti sull'assunzione di cibo(c)o sull'aumento di peso(d)rispetto all'auto-consegna nel burro di arachidi. I dati sono espressi come ± SEM e sono stati analizzati dallo studente t-test. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Quando si esegue questo protocollo, è importante essere coerenti con l'accuratezza delle misurazioni dell'assunzione di cibo e del peso corporeo e i tempi di somministrazione del farmaco durante lo studio. Mentre questo metodo di auto-somministrazione richiede una fase di allenamento significativa, questo è particolarmente importante per acclimatare i topi alla novità del burro di arachidi e garantire che i topi consumino il farmaco al momento dato. Una volta stabilito, offre anche una grande flessibilità sperimentale e può essere modificato e adattato per fornire farmaci più volte al giorno a varie dosi. Questa tecnica funziona meglio quando i topi consumano chow normale come principale fonte di nutrimento. Quando i topi vengono nutriti con diete ad alto contenuto di grassi e zuccheri altamente appetibili, questo può rendere la fase di allenamento più impegnativa in quanto alcuni topi sono meno motivati a consumare il burro di arachidi in queste condizioni e possono essere una limitazione di questa tecnica.
Rispetto ai metodi esistenti come iniezioni o gavage orale, questo metodo di auto-somministrazione di farmaci provoca uno stress minimo e si traduce in dati robusti e coerenti relativi agli effetti indotti da farmaci sui fenotipi metabolici, tra cui l'assunzione di cibo e il peso corporeo. Le applicazioni future di questa tecnica includono studi sui tempi di somministrazione del farmaco sull'assunzione di cibo e sull'aumento di peso nel contesto dei ritmi circadiani e della salute metabolica10.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione del National Institutes of Health R01DK117872 assegnata a OO e dalla Larry L Hillblom Foundation Fellowship assegnata a RCZ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57B6/J mice | Jackson Labs, Sacramento, CA, USA | 664 | |
| corticosterone pellet mold | Ted Pella Inc, Redding, CA, USA | 106A | |
| Mouse igloo | VWR, Visalia, CA, USA | 89067-850 | cage enrichment |
| peanut butter | Jif Peanut Butter, Orrville, OH, USA | Creamy peanut butter | |
| pestle and mortar | VWR, Visalia, CA, USA | 470148-960 | |
| risperidone | Patriot Pharmaceuticals, Horsham, PA, USA | 50458-593-50 | |
| rodent chow | LabDiet, St. Louis, MO, USA | 5001 | |
| weigh boat | VWR, Visalia, CA, USA | 10803-148 | |
| weighing scale | Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland | MS104TS | |
| Wypall paper X60 | Kimberly-Clark, Corinth, MS, USA | 34865-05 | absorbent paper bedding |
References
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