Summary
Bu prosedürün genel amacı, beslenme ve obezitenin fare modellerinde kullanılabilecek ilaçların kendi kendine yönetimi için bir yöntem tanımlamaktır.
Abstract
Farelerdeki preklinik çalışmalar genellikle ilaç teslim etmek için enjeksiyonlar veya oral gavage gibi invaziv protokollere dayanır. Bu stresli uygulama yolları, gıda alımı ve vücut ağırlığı da dahil olmak üzere önemli metabolik parametreler üzerinde önemli etkilere sahiptir. Bunu atlatmak için cazip bir seçenek ilacı kemirgen gıdasında birleştirmek veya suda çözmek olsa da, bu yaklaşımlar oda sıcaklığında uzun süre ilaç stabilitesi, ilacın sudaki çözünürlüğü ve dozlamanın gıda veya su alımının zamanlamasına oldukça bağlı olduğu için sınırlamalara da sahiptir. İlacın sürekli mevcudiyeti, ilaçların hastalara nasıl uygulandığına dair çevirisel alaka düzeyini de sınırlar. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, ilaçlar fıstık ezmesi gibi son derece lezzetli yiyeceklerle karıştırılabilir ve farelerin bileşikleri kendi kendine yönetmesine izin verebilir. Fareler ilaç / fıstık ezmesi peletini kısa bir zaman diliminde güvenilir ve tekrar tekrar tüketir. Bu yaklaşım, enjeksiyon veya gavage ile karşılaştırıldığında minimum stresle bir doğum yaklaşımını kolaylaştırır. Bu protokol, ilaç hazırlama, plasebo teslimatına hayvan iklimlendirme ve ilaç teslimatı yaklaşımını göstermektedir. Bu yaklaşımın etkileri ilaç kullanımının zamanlaması ve sirkadiyen ritim ile ilgili çalışmalarda tartışılmaktadır.
Introduction
Bu yöntemin amacı, farelerde invaziv olmayan, minimal stresli bir prosedürle ilaç sunmaktır. Farelerde preklinik çalışmalar genellikle metabolik parametreler üzerinde önemli etkileri olabilecek stresli, invaziv ilaç uygulama yollarına dayanır. Örneğin, tekrarlayan günlük oral gavage farelerde kalori alımını ve kilo alımını önemli ölçüde azaltabilir1. Ek olarak, oral gavage teknik olarak zor olabilir ve yaralanmalara neden olma potansiyeline sahiptir. Alternatif olarak, fareler yiyeceklerinde karıştırılan veya içme sularında çözünen bileşikleri kendi kendine uygulayabilir 2. Bununla birlikte, bu yaklaşımın büyük bir sınırlaması vardır, yani gıda veya su alımının doğal sirkadiyen zamanlamasına dayanır. Ayrıca, bu şekilde kronik olarak teslim edildiğinde sudaki ilaç stabilitesi veya çözünürlüğü önemli sorunlar olabilir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, ilaçlar belirli bir zamanda farelerde kendi kendine yönetimi teşvik etmek için kurabiye hamuru 3, jöle 4,5 veya fıstık ezmesi 6 gibi son derece lezzetli yiyeceklerle karıştırılabilir. Bu yaklaşım, bir enjeksiyon veya günlük gavage1ile karşılaştırıldığında minimum stresle ilaç dağıtımını kolaylaştırma avantajına sahiptir. Bu prosedür farelere çok çeşitli ilaçlar sunmak için uyarlanabilir. Bu protokol, ilaç hazırlama, eğitim ve ardından son derece lezzetli gıdalarda ilaç teslimi sürecini göstermektedir. Örnek olarak, bu yöntem antipsikotik ilaç risperidone'yi C57BL / 6J dişi farelere uygulamak için kullanılır. Risperidone kemirgenlerde iyi modellenmiş hastalarda güçlü hiperfajik ve kilo alma etkileri olduğu bilinmektedir 6 ,8. Bu uygulama sistemi, çok çeşitli ilaçları ve gıda alımını ve vücut ağırlığını düzenleyen yollar üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılabilecek son derece çevirisel bir modeli kolaylaştırır 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan denekleri ile ilgili tüm prosedürler San Diego Kaliforniya Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. İlaç-fıstık ezmesi pelet yapımı
- İstenilen dozda ilacı bir fıstık ezmesi peletinde yapmak için gereken ilaç miktarını hesaplayın ve bir deney için gereken partinin boyutuna ölçeklendirin. Daha da önemlisi, peletler ilaç stabilitesine bağlı olarak -80 ° C'de tutulabilir.
- İlaç tabletlerini bir harç ve pestle kullanarak pulverize edin.
- Tared tartıda bir tartım teknesine yerleştirerek gerekli hesaplanan miktarda fıstık ezmesini tartın.
- Fıstık ezmesini eriyene kadar bir bardak ılık suyun üzerine yerleştirin.
- Eritilmiş fıstığın içine gerekli miktarda toz haline getirilmiş ilacı ekleyin ve iyice karıştırın.
- İlaç-fıstık ezmesi karışımının soğumasını bekleyin, böylece kauçuk kalıplara kolayca yerlenebilir.
- Fıstık ezmesi-ilaç karışımını bir kalıba yerleştirin. Burada kullanılan kauçuk kortikosteron pelet kalıbıdır ve yaklaşık 100 mg fıstık ezmesi peletleri oluşturur. Lezzeti sağlamak için ilacın fıstık ezmesine oranının ayarlanmasında gerekli olabilir.
- Plasebo peletleri yapmak için bu adımları sadece fıstık ezmesi ile tekrarlayın.
- Fıstık ezmesinin kullanıma kadar sertleşmesi için kalıbı -20 °C veya -80 °C'de (ilaç stabilitesine bağlı olarak) dondurun.
2. Fare kurulumu
- Fareleri standart fare kafeslerinde tek tek barındırır. Kağıt havlular ve konut kubbesi de dahil olmak üzere son derece emici kağıt yatak ve zenginleştirme ile çizgi. Bu kağıt yatak, dışkı ve yataklardan dökülen yiyeceklerin ölçülmesine izin vererek doğru gıda alımı ölçümlerini kolaylaştırır.
NOT: Tekil konut fareleri için ENsure IACUC onayı alınmıştır. - Reklam libitum yiyecek ve suyu sağlayın ve farelerin yaklaşık 3 gün boyunca muhafazaya alışmasına izin verin.
3. İlaç-fıstık ezmesinin kendi kendine doza yapılması eğitimi
- İlaç kullanımı için günün en uygun zamanını planlayın ve seçin.
- Fareleri 24 saat boyunca oruç tutun ve seçilen oruç süresi için IACUC onayı alındığından emin olun.
- Kalıbı dondurucudan alın, kauçuk kalıbın yumuşamasını bekleyin, böylece peletler kalıptan kolayca ekstrüde edilebilir. Plasebo kontrol topakları kullanılarak tüm eğitim tamamlanabilir.
- Tabandan yaklaşık 1,5 inç uzaklıktaki kafesin duvarına plasebo kontrolü fıstık ezmesi pelet yerleştirin. İlk gün, farenin yenilik nedeniyle fıstık ezmesi peletini tüketmesi yaklaşık 1 saat sürebilir.
- Eğitim seansından sonra yiyecek ve suya reklam libitum erişimi sağlar.
- Ertesi gün, oruç tutmamış fareler üzerinde daha fazla eğitim için aynı yerde kafesin duvarına fıstık ezmesi peletini yerleştirin.
- Yaklaşık 3 gün boyunca beslenen farelerde eğitimi tekrarlayın. Fıstık ezmesinin tüketilmesi için geçen süre, eğitimin üçüncü gününe kadar 30 dakikadan az olacaktır.
4. Deney
- Fareleri vücut ağırlığına göre tedavi gruplarına randomize edin, böylece gruplar tedaviden önce aynı ortalama vücut ağırlığına sahiptir.
- Fıstık ezmesi ilaçlarını (tedavi veya plasebo) farelere, fıstık ezmesi peletlerini almak için eğitildikleri anda uygulamayı planlayın.
- Yiyecekleri ve fareyi tartın ve değerleri kaydedin.
- Fıstık ezmesi haplarının (tedavi veya plasebo) eğitim sırasında kurulan kafeste aynı yere yerleştirildiklarından emin olun.
- Deneme süresince günlük olarak dosing prosedürüne devam edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada sunulan örnekte, risperidone'yi 14 gün boyunca günlük olarak farelere ulaştırmak için fıstık ezmesi kullanılmıştır.
Bu çalışma, risperidone'un bu yöntemle kronik olarak teslim edildiğini göstermektedir, gıda alımında ve vücut ağırlığında kontrole kıyasla oldukça tekrarlanabilir artışı kolaylaştırır (Şekil 1a,b). Ek olarak, bu doğum yöntemi intraperitoneal enjeksiyonlar (Şekil 1c,d)gibi alternatif, daha stresli doğum yaklaşımlarına kıyasla son derece tutarlı verilerle sonuçlanır.
Şekil 1. İlaç dağıtım yöntemlerinin farelerde gıda alımı ve kilo alımı üzerindeki etkisi. C57BL/6J dişi fareler, 14 gün boyunca her gün sabah 8'de fıstık ezmesi pelet veya plasebo kontrol peletinde risperidone (3 mg / kg) ile tedavi edildi. Fıstık ezmesinde risperidone ile tedavi edilen fareler, günlük gıda alımının(a)önemli ölçüde daha yüksek olduğunu ve kontrol tedavisine kıyasla önemli ölçüde daha fazla kilo (b) aldığını söyledi. Ayrıca, risperidone (3 mg/kg) intraperitoneal teslimatı, fıstık ezmesinde kendi kendine teslimata kıyasla gıda alımı (c) veya kilo alımı (d) üzerinde bu kadar sağlam etkilere sahip değildi. Veriler SEM ± ortalama olarak ifade edilir ve öğrenci t-testi ile analiz edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolü yaparken, çalışma boyunca gıda alımı ve vücut ağırlığı ölçümlerinin doğruluğu ve ilaç uygulama zamanlaması ile tutarlı olmak önemlidir. Bu kendi kendine uygulama yöntemi önemli bir eğitim aşaması gerektirirken, bu özellikle fareleri fıstık ezmesinin yeniliğine alıştırmak ve farelerin verilen zamanda ilacı tüketmesini sağlamak için önemlidir. Kurulduktan sonra, aynı zamanda büyük deneysel esneklik sunar ve çeşitli dozlarda günde birden fazla kez ilaç teslim etmek için değiştirilebilir ve uyarlanabilir. Bu teknik en iyi fareler ana beslenme kaynağı olarak normal yemek tüketirken çalışır. Fareler son derece lezzetli yüksek yağlı, yüksek şekerli diyetlerle beslendiğinde, bazı fareler bu koşullar altında fıstık ezmesini tüketmek için daha az motive oldukları ve bu tekniğin bir sınırlaması olabileceği için eğitim aşamasını daha zor hale getirebilir.
Enjeksiyonlar veya oral gavage gibi mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında, ilaçların bu kendi kendine teslim yöntemi minimum strese neden olur ve gıda alımı ve vücut ağırlığı da dahil olmak üzere metabolik fenotipler üzerindeki ilaç kaynaklı etkilerle ilgili sağlam ve tutarlı verilerle sonuçlanır. Bu tekniğin gelecekteki uygulamaları, sirkadiyen ritimler ve metabolik sağlık bağlamında gıda alımı ve kilo alımı konusunda ilaç teslimatının zamanlaması ile ilgili çalışmaları içerir10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecekleri bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, OO'ya verilen Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi R01DK117872 ve RCZ'ye verilen Larry L Hillblom Vakfı Bursu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57B6/J mice | Jackson Labs, Sacramento, CA, USA | 664 | |
| corticosterone pellet mold | Ted Pella Inc, Redding, CA, USA | 106A | |
| Mouse igloo | VWR, Visalia, CA, USA | 89067-850 | cage enrichment |
| peanut butter | Jif Peanut Butter, Orrville, OH, USA | Creamy peanut butter | |
| pestle and mortar | VWR, Visalia, CA, USA | 470148-960 | |
| risperidone | Patriot Pharmaceuticals, Horsham, PA, USA | 50458-593-50 | |
| rodent chow | LabDiet, St. Louis, MO, USA | 5001 | |
| weigh boat | VWR, Visalia, CA, USA | 10803-148 | |
| weighing scale | Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland | MS104TS | |
| Wypall paper X60 | Kimberly-Clark, Corinth, MS, USA | 34865-05 | absorbent paper bedding |
References
- de Meijer, V. E., Le, H. D., Meisel, J. A., Puder, M. Repetitive orogastric gavage affects the phenotype of diet-induced obese mice. Physiology and Behavior. 100 (4), 387-393 (2010).
- Perez-Gomez, A., et al. A phenotypic Caenorhabditis elegans screen identifies a selective suppressor of antipsychotic-induced hyperphagia. Nature Communications. 9 (1), 5272 (2018).
- Corbett, A., McGowin, A., Sieber, S., Flannery, T., Sibbitt, B. A method for reliable voluntary oral administration of a fixed dosage (mg/kg) of chronic daily medication to rats. Laboratory Animal. 46 (4), 318-324 (2012).
- Teixeira-Santos, L., Albino-Teixeira, A., Pinho, D. An alternative method for oral drug administration by voluntary intake in male and female mice. Laboratory Animal. 55 (1), 76-80 (2021).
- Zhang, L. Method for voluntary oral administration of drugs in mice. STAR Protocols. 2 (1), 100330 (2021).
- Cope, M. B., et al. Risperidone alters food intake, core body temperature, and locomotor activity in mice. Physiology and Behaviour. 96 (3), 457-463 (2009).
- Barton, B. B., Segger, F., Fischer, K., Obermeier, M., Musil, R. Update on weight-gain caused by antipsychotics: a systematic review and meta-analysis. Expert Opinion in Drug Safety. 19 (3), 295-314 (2020).
- Cope, M. B., et al. Antipsychotic drug-induced weight gain: development of an animal model. International Journal of Obesity. 29 (6), 607-614 (2005).
- Domecq, J. P., et al. Clinical review: Drugs commonly associated with weight change: a systematic review and meta-analysis. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (2), 363-370 (2015).
- Wei, H., et al. Dopamine D2 receptor signaling modulates pancreatic beta cell circadian rhythms. Psychoneuroendocrinology. 113, 104551 (2020).
