Summary
Relatamos um método para reconstrução mesoscópica de todo o coração do rato, combinando novos avanços na transformação e coloração de tecidos com o desenvolvimento de um microscópio de folha de luz digitalizado axialmente.
Abstract
Doenças cardíacas genéticas e não genéticas podem causar processos graves de remodelação no coração. O remodelamento estrutural, como a deposição de colágeno (fibrose) e o desalinhamento celular, pode afetar a condução elétrica, introduzir disfunções eletromecânicas e, eventualmente, levar à arritmia. Os modelos preditivos atuais dessas alterações funcionais são baseados em informações estruturais não integradas e de baixa resolução. Colocar essa estrutura em uma ordem diferente de magnitude é um desafio devido à ineficácia dos métodos de imagem padrão na realização de imagens de alta resolução em tecidos maciços. Neste trabalho, descrevemos um referencial metodológico que permite a imagem de corações inteiros de camundongos com resolução micrométrica. A consecução deste objetivo exigiu um esforço tecnológico onde os avanços na transformação de tecidos e métodos de imagem foram combinados. Primeiro, descrevemos um protocolo CLARITY otimizado capaz de transformar um coração intacto em uma forma nanoporosa, hibridizada em hidrogel e livre de lipídios que permite alta transparência e coloração profunda. Em seguida, um microscópio de folha de luz de fluorescência capaz de adquirir rapidamente imagens de um campo de visão mesoscópico (escala mm) com a resolução em escala mícron é descrito. Seguindo o projeto mesoSPIM, o microscópio concebido permite a reconstrução de todo o coração do rato com resolução micrométrica em uma única varredura tomográfica. Acreditamos que esse referencial metodológico permitirá esclarecer o envolvimento do desarranjo citoarquitetônico nas disfunções elétricas e abrir caminho para um modelo abrangente que considere tanto os dados funcionais quanto estruturais, possibilitando assim uma investigação unificada das causas estruturais que levam a alterações elétricas e mecânicas após o remodelamento tecidual.
Introduction
O remodelamento estrutural associado a doenças cardíacas pode afetar a condução elétrica e introduzir disfunções eletromecânicas do órgão 1,2. As abordagens atuais utilizadas para predizer alterações funcionais comumente empregam RM e DT-MRI para obter uma reconstrução geral da deposição de fibrose, árvore vascular e distribuição de fibras do coração, e são usadas para modelar caminhos de propagação do potencial de ação preferencial (APP) através do órgão 3,4. Essas estratégias podem fornecer uma bela visão geral da organização do coração. No entanto, sua resolução espacial é insuficiente para investigar o impacto do remodelamento estrutural na função cardíaca em nível celular.
Colocar essa estrutura em uma ordem diferente de magnitude, onde células individuais podem desempenhar papéis individuais na propagação do potencial de ação, é um desafio. A principal limitação é a ineficiência dos métodos de imagem padrão para realizar imagens de alta resolução (resolução micrométrica) em tecidos maciços (tamanho de centímetros). De fato, a imagem de tecidos biológicos em 3D em alta resolução é muito complicada devido à opacidade do tecido. A abordagem mais comum para realizar reconstruções 3D em órgãos inteiros é preparar seções finas. No entanto, o seccionamento, a montagem e a imagem precisos exigem esforço e tempo significativos. Uma abordagem alternativa que não exija o corte da amostra é gerar um tecido transparente. Nos últimos anos, diversas metodologias de clarificação de tecidos têm sido propostas 5,6,7,8. O desafio de produzir tecidos maciços, transparentes e marcados fluorescentemente foi recentemente alcançado através do desenvolvimento de verdadeiras abordagens de transformação de tecidos (CLARITY9, SHIELD10). Em particular, o método CLARITY baseia-se na transformação de um tecido intacto em uma forma nanoporosa, hibridizada em hidrogel e livre de lipídios que permite conferir alta transparência pela remoção seletiva de bicamadas lipídicas de membrana. Notavelmente, esse método tem sido bem sucedido também no preparo cardíaco 11,12,13,14. No entanto, uma vez que o coração é demasiado frágil para ser adequado para uma clareira activa, deve ser limpo utilizando a abordagem passiva, que requer muito tempo para conferir total transparência.
Em combinação com técnicas avançadas de imagem, como a microscopia de folha de luz, o CLARITY tem o potencial de visualizar tecidos cardíacos maciços em 3D em resolução micrométrica. Na microscopia de folha de luz, a iluminação da amostra é realizada com uma fina folha de luz confinada no plano focal do objetivo de detecção. A emissão de fluorescência é coletada ao longo de um eixo perpendicular ao plano de iluminação15. A arquitetura de detecção é semelhante à microscopia de campo amplo, tornando a aquisição muito mais rápida do que os microscópios de varredura a laser. Mover a amostra através da folha de luz permite obter uma tomografia completa de grandes espécimes, amostras de até centímetros. No entanto, devido às propriedades intrínsecas do feixe gaussiano, é possível obter uma folha de luz muito fina (da ordem de alguns mícrons) apenas para uma extensão espacial limitada, limitando drasticamente o campo de visão (FoV). Recentemente, um novo esquema de excitação foi introduzido para superar essa limitação e aplicado para imagens cerebrais, permitindo reconstruções 3D com resolução isotrópica16.
Neste artigo, uma abordagem de compensação passiva é apresentada, permitindo uma redução significativa do tempo de compensação necessário para o protocolo CLARITY. O referencial metodológico aqui descrito permite reconstruir todo um coração de camundongo com resolução micrométrica em uma única tomografia com tempo de aquisição na ordem de minutos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os manuseamentos e procedimentos de animais foram realizados de acordo com as diretrizes da Diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu relativa à proteção dos animais utilizados para fins científicos e em conformidade com os princípios e regulamentos do Ministério da Saúde italiano. O protocolo experimental foi aprovado pelo Ministério da Saúde italiano (protocolo número 647/2015-PR). Todos os animais foram fornecidos pela ENVIGO, Itália. Para esses experimentos, foram utilizados 5 camundongos machos C57BL/6J de 6 meses de idade.
1. Preparação da solução
- Prepare paraformaldeído a 4% (PFA) em salina tamponada com fosfato (PBS) (pH 7,6) em um exaustor químico. Conservar as alíquotas de PFA a -20 °C durante vários meses.
- Preparar solução de hidrogel: Misture 4% de acrilamida, 0,05% de bis-acrilamida, 0,25% de Initiatior AV-044 em 0,01 M PBS em um exaustor químico. Mantenha os reagentes e a solução no gelo durante toda a preparação. Conservar as alíquotas de hidrogel a -20 °C durante vários meses.
- Preparar solução de Limpeza: Misture ácido bórico a 200 mM, Dodecil-Sulfato de Sódio (SDS) a 4% em água deionizada; pH 8,6 em um exaustor químico. Conservar a solução entre 21-37 °C para evitar a precipitação SDS.
- Preparar solução fresca de Tyrode no dia do experimento: Adicionar 10 mM de glicose, 10 mM de HEPES, 113 mM de NaCl, 1,2 mM de MgCl2 e 4,7 mM de KCl; titula para pH 7,4 usando 1 M de NaOH.
2. Isolamento cardíaco
- Injete 0,1 mL de 500 UI de heparina por via subcutânea 30 min antes do procedimento de isolamento cardíaco.
- Encha uma seringa de 30 ml e três placas de Petri de 6 cm com solução fresca de Tyrode. Faça uma pequena fenda (3-4 mm de profundidade) na borda de uma das placas de Petri e coloque-a sob um microscópio estereoscópico.
- Fixe uma cânula de 1 mm de diâmetro na seringa e insira-a na fenda da placa de Petri. Certifique-se de que não existem bolhas de ar na seringa.
- Encha uma seringa de 20 ml com 4% de PFA e mantenha-a no exaustor químico. Prepare uma placa de Petri vazia sob o capô.
- Anestesiar o ratinho com isoflurano/oxigénio a 3% a um caudal de 1,0 L/min e sacrificá-lo por luxação cervical de acordo com as regras de bem-estar animal em vigor.
- Após o sacrifício, remova o pelo sobre o peito e abra o peito para ter acesso total ao coração.
- Isole o coração, mergulhe-o na placa de Petri previamente preenchida com 50 mL de Solução de Tiroide. Use uma tesoura cirúrgica para cortar a aorta imediatamente perto do arco aórtico para ter o coração exposto.
- Transfira o coração sob um microscópio estereoscópico e realize cuidadosamente a canulação. Não insira a cânula muito profundamente na aorta (não mais de 2 mm) para evitar danos nos tecidos.
- Use um pouco de grampo e uma sutura (tamanho 5/0) para fixar o coração à cânula.
- Perfundir o coração com 30 ml da solução de Tyrode com uma pressão constante de 10 ml/min para remover o sangue dos vasos.
- Retire a cânula da seringa e coloque o coração na placa de Petri cheia de solução de Tyrode. Tenha cuidado para não ter bolhas de ar na cânula; caso contrário, remova as bolhas de ar corretamente.
- Ligue a seringa de 20 ml cheia de PFA a 4% frio à cânula e perfunda o coração à mesma pressão constante.
- Incubar o coração em 10 mL de PFA a 4% a 4 °C durante a noite (O/N). Para evitar a degradação tecidual, execute as etapas 2.6-2.13 no menor tempo possível.
3. Limpeza do coração
- No dia seguinte, lave o coração em 0,01 M PBS 3 vezes a 4 °C por 15 min.
NOTA: Após esta etapa, o coração pode ser armazenado em PBS + azida de sódio a 0,01% (NaN3) a 4 °C durante vários meses. - Incubar o coração em 30 ml de solução de Hidrogel em agitação (15 rpm) a 4 °C durante 3 dias.
- Desgaseifique a amostra à temperatura ambiente usando um secador, uma bomba de vácuo e um sistema de tubos que conecta o secador à bomba e a uma tubulação de nitrogênio.
- Coloque a amostra no secador e abra o frasco para injetáveis, mantendo a tampa sobre ele.
- Feche o secador e remova o oxigênio do tubo abrindo a tubulação de nitrogênio.
- Ligue a bomba de vácuo para remover o oxigênio do secador por 10 minutos.
- Desligue a bomba e use o botão do secador para abrir a tubulação de nitrogênio. Quando a pressão for igual à pressão atmosférica, abra cuidadosamente o secador e feche rapidamente o frasco para injetáveis.
- Manter o coração na solução de hidrogel desgaseificada a 37 °C durante 3 h em repouso.
- Quando o hidrogel estiver devidamente polimerizado e parecer inteiramente gelatinoso, retire cuidadosamente o coração dele e coloque-o no suporte da amostra.
- Insira o suporte da amostra com o coração em uma das câmaras de limpeza e feche-o corretamente para evitar vazamentos da solução de limpeza.
- Ligue o banho-maria onde o recipiente de solução de limpeza é colocado e a bomba peristáltica para iniciar a recirculação da solução de limpeza.
- Altere a solução de limpeza no recipiente uma vez por semana para acelerar o procedimento de clarificação.
4. Coloração da membrana celular
- Quando o coração parecer completamente clarificado, retire-o do suporte da amostra e lave-o em 50 mL de PBS aquecido por 24 h. Lavar novamente em 50 mL de PBS + 1% de Triton-X (PBS-T 1x) por 24 h.
- Incubar a amostra em 0,01 mg/mL de Aglutinina de Gérmen de Trigo (WGA) - Alexa Fluor 633 em 3 mL de PBS-T 1x em agitação (50 rpm) à temperatura ambiente por 7 dias.
- Após a incubação de 7 dias, lavar a amostra em 50 mL de PBS-T 1x em temperatura ambiente em agitação por 24 h.
- Incubar a amostra em PFA a 4% por 15 min e depois lavá-la 3 vezes em PBS por 5 min cada.
NOTA: Após esta etapa, o coração pode ser armazenado em PBS + 0,01% de NaN3 a 4 °C por vários meses. - Incubar o coração em concentrações crescentes de 2,2′-Tiodietanol (TDE) em 0,01 M PBS (20% e 47% TDE/PBS) por 8 h cada, até a concentração final de 68% de TDE em 0,01 M PBS para fornecer o índice de refração necessário (IR = 1,46). Este é o meio de correspondência do IR (RI-médio) para a aquisição de imagens16.
5. Montagem e aquisição do coração
NOTA: Todos os componentes do sistema óptico estão listados em detalhes na Tabela de Materiais.
- Encha suavemente cerca de 80% da cubeta externa (quartzo, 45 mm × 45 mm × 42,5 mm) com o meio RI.
NOTA: Aqui, é possível usar diferentes soluções não voláteis que garantem um IR de 1,46. - Encha suavemente a cubeta interna (quartzo, 45 mm × 12,5 mm × 12,5 mm) com o mesmo meio IR.
- Mergulhe a amostra dentro da cubeta interna. As incubações de amostras descritas acima permitem que a amostra permaneça estável dentro do meio IR sem ser mantida.
- Mova suavemente a amostra para o fundo da cubeta usando pinças finas e organize o coração com seu eixo longitudinal paralelo ao eixo principal da cubeta para minimizar o caminho da luz de excitação através do tecido durante a varredura.
- Fixe suavemente o plugue sob medida acima da cubeta interna com dois parafusos.
- Monte a amostra no estágio de microscópio usando os ímãs.
- Traduza o estágio vertical da amostra manualmente para imergir a cubeta interna na externa.
- Ligue a fonte de luz de excitação (comprimento de onda de 638 nm), definindo uma baixa potência (na ordem de 3 mW).
- Mova a amostra usando o tradutor motorizado para iluminar um plano interno do tecido.
- Ligue o software de imagem (HCImageLive) e defina o gatilho da câmera no modo externo (folha de luz) para acionar o gatilho de aquisição da câmera pelo software personalizado que controla toda a configuração.
- Habilite o Salvamento automático no painel Configurações de digitalização e defina a pasta de saída onde as imagens precisam ser salvas.
- Ajuste manualmente a posição da amostra no plano XY com os tradutores lineares para mover a amostra para o centro do FoV do sensor da câmera.
- Mova a amostra ao longo do eixo Z usando o tradutor motorizado linear para identificar as bordas do coração para reconstrução tomográfica.
- Aumente a potência do laser para ~20 mW, pronto para a sessão de imagem.
- Inicie a aquisição tomográfica, clique no botão Iniciar no Painel de Sequência do software de imagem e, ao mesmo tempo, mova a amostra ao longo do eixo Z na velocidade constante de 6 μm/s usando o tradutor motorizado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A configuração de limpeza passiva desenvolvida permite obter um coração de rato adulto limpo (com uma dimensão da ordem 10 mm x 6 mm x 6 mm) em cerca de 3 meses. Todos os componentes da configuração são montados como mostrado na Figura 1. O gradiente de temperatura insignificante entre cada câmara de compensação (da ordem de 3 ° C) permite manter a temperatura em uma faixa adequada em todas as câmaras.
Figura 1: Esquema da configuração de limpeza passiva. A solução de limpeza (depois de filtrada) circula sucessivamente através das câmaras de amostra com a ajuda da bomba peristáltica. A manutenção do recipiente de solução em banho-maria regulado a 50 °C permite que a temperatura da solução se situe entre 37-45 °C dentro das câmaras. Imagem criada com Biorender.com. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A Figura 2 mostra o resultado do processo de limpeza de um coração inteiro. Como já relatado por Costantini et al.16, a combinação da metodologia CLARITY com TDE como meio IR não altera significativamente o volume final da amostra nem leva à deformação anisotrópica do espécime.
Figura 2: Imagem representativa de um coração antes (à esquerda) e depois (à direita) do protocolo CLARITY. Os corações tornam-se totalmente transparentes e ligeiramente superdimensionados. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Uma vez que o coração foi limpo, as membranas celulares foram coradas com um WGA conjugado com Alexa Fluor 633 para realizar a reconstrução da citoarquitetura de todo o órgão. O microscópio de folha de luz de fluorescência feito sob medida (Figura 3) foi capaz de garantir a resolução em escala de mícrons 3D em todo o FoV.
Figura 3: MesoSPIM. Renderização CAD do microscópio de folha de luz de fluorescência feito sob medida. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Considerando a abertura numérica (NA = 0,1) da óptica de detecção, a Função de Propagação de Ponto (PSF) radial (XY) do sistema pode ser estimada na ordem de 4-5 μm. Por outro lado, a óptica de excitação produz uma folha de luz com cintura mínima de cerca de 6 μm (largura total meio máxima, FWHM) que diverge até 175 μm na borda do FoV (Figura 4A-C). A sincronização do obturador rolante da câmera com a varredura axial do feixe de laser garantiu a coleta do sinal de emissão apenas na porção da amostra excitada com a cintura da folha de luz, resultando em uma FWHM média de cerca de 6,7 μm ao longo de todo o FoV (Figura 4B-D).
Figura 4: Geração e caracterização de folhas de luz. (A) Uma folha de luz de excitação gerada com uma fonte de laser de 638 nm é focada no centro do Campo de Visão (FoV) e adquirida com um tamanho de pixel de 3,25 μm e um Tempo de Exposição de 10 ms. A intensidade da luz é normalizada e relatada com um mapa de cores. A Largura Total Meio Máximo (FWHM) do perfil de intensidade luminosa é avaliada em 15 posições diferentes ao longo do FoV. Os resultados são mostrados em C. (B) Imagem da folha de luz de excitação gerada pela sincronização entre o obturador de rolamento da câmera operando a 1,92 Hz e a posição do feixe de luz impulsionada pela lente ajustável. A FWHM do perfil de intensidade luminosa é avaliada ao longo do FoV e os resultados são apresentados em D. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O Z-PSF do microscópio também foi estimado por uma reconstrução tomográfica da nanoesfera fluorescente (Figura 5). Uma FWHM de 6,4 μm pode ser estimada pelo ajuste, em boa concordância com a avaliação anterior.
Figura 5: Função de propagação pontual no eixo Z. A Função de Propagação de Ponto (PSF) do sistema óptico é estimada por imagem de nanoesferas fluorescentes em escala sub-mícron (excitadas com uma folha de luz com um comprimento de onda de 638 nm) com um tamanho de pixel de 3,25 μm × 3,25 μm × 2,0 μm. O perfil de intensidade do PSF ao longo do eixo óptico (Z) é representado como pontos pretos. O perfil PSF é equipado com uma função gaussiana com μ = 18,6 μm e σ = 2,7 μm. O FWHM do PSF estimado pelo ajuste é de 6,4 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Devido à alta transparência do tecido, foi possível iluminar todo o coração sem distorção significativa da folha de luz digitalizada axialmente a um comprimento de onda de excitação de 638 nm. O sinal de fluorescência foi coletado pelo sensor sCMOS operando a 500 ms de tempo de exposição e uma taxa de quadros de 1,92 Hz. Com base na quantificação prévia, a aquisição tomográfica foi realizada usando uma velocidade Z-scan de 6 μm/s, e assumindo uma taxa de quadros de 1,92 Hz, um quadro a cada 3,12 μm foi adquirido, superamostrando o sistema Z-PSF em cerca de duas vezes. Dois quadros representativos (nos planos coronal e transversal) da câmara do ventrículo esquerdo são mostrados na Figura 6. Esse resultado confirma a potencialidade do sistema para resolver membranas celulares únicas em três dimensões com uma relação Sinal/Ruído suficiente em todo o órgão (Figura 6).
Figura 6: Reconstrução do tecido cardíaco do rato. O coração clarificado foi corado com WGA conjugado ao Alexa Fluor 633 e excitado por uma fonte de laser com comprimento de onda de 638 nm. (A) Seções representativas coronais e (B) transversais. (C-D) A transformação de tecidos produz alta transparência tecidual, permitindo resolver pequenas estruturas na profundidade da parede. O sistema óptico mostra uma resolução axial suficiente para resolver estruturas micrométricas (painel. D). (E) Renderização cardíaca 3D de baixa resolução. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neste trabalho, uma abordagem bem-sucedida para limpar, manchar e visualizar todo o coração de um rato em alta resolução foi introduzida. Primeiramente, um protocolo de transformação tecidual (CLARITY) foi otimizado e realizado, levemente modificado para sua aplicação no tecido cardíaco. De fato, para obter uma reconstrução eficiente em 3D de todo um coração, é essencial evitar o fenômeno da dispersão da luz. A metodologia CLARITY permite-nos obter um coração intacto altamente transparente, mas requer longos tempos de incubação quando realizada passivamente (cerca de 5 meses). Com relação ao cérebro, o tecido cardíaco não é adequado para uma limpeza ativa, que aproveita um campo elétrico. Mesmo em baixas tensões, o campo elétrico leva a danos e quebras de tecido. Aqui, uma abordagem de limpeza passiva foi otimizada para obter um coração completamente limpo em cerca de 3 meses. Após o isolamento e canulação do coração através da aorta proximal, a metodologia CLARITY foi realizada conforme descrito na seção 3 do protocolo. Para agilizar o procedimento, foi organizada uma configuração de limpeza passiva caseira (Figura 1), o que acabou diminuindo o tempo de limpeza do tecido em cerca de 40%. A configuração é composta por um recipiente para a solução de limpeza, um banho de água, uma bomba peristáltica, várias câmaras contendo diferentes suportes de amostra, filtros de cápsulas para cada câmara e um sistema de tubos para a recirculação da solução. A bomba extrai e circula a solução do recipiente sucessivamente através de cada uma das câmaras, onde as amostras são mantidas para limpeza. Antes de entrar nas câmaras, a solução flui através de um filtro de cápsulas para reter os lipídios liberados dos tecidos durante a limpeza. A temperatura ideal para a solução de limpeza, entre 37-45 °C, é mantida dentro das câmaras durante a recirculação, mantendo o recipiente da solução em banho-maria a 50 °C. É aconselhável mudar a solução de limpeza no recipiente uma vez por semana durante o procedimento. Todos os componentes utilizados estão listados em detalhes na Tabela de Materiais. A solução otimizada aqui apresentada nos permite obter todo um coração de rato passivamente limpo em um tempo significativamente menor em relação à técnica de limpeza passiva padrão, reduzindo assim o tempo experimental necessário sem danificar o órgão. A abordagem de coloração também foi otimizada para marcação homogênea das membranas celulares e do endotélio, utilizando-se lectina fluorescente (WGA - Alexa Fluor 633).
A citoarquitetura do coração foi reconstruída através do desenvolvimento de um mesoSPIM dedicado que varre axialmente a folha de luz através da amostra (https://mesospim.org). O microscópio de folha de luz de fluorescência feito sob medida (Figura 3) foi capaz de adquirir rapidamente imagens de um FoV mesoscópico (da ordem de milímetros) com resolução micrométrica. Desta forma, cardiomiócitos únicos podem ser resolvidos e mapeados em uma reconstrução 3D de todo o órgão. O microscópio ilumina a amostra limpa com uma folha de luz, gerada dinamicamente pela varredura de um feixe de laser a 638 nm usando um espelho galvanométrico. Uma câmera sCMOS caracteriza o braço de detecção em um esquema de ampliação de 2x que permite adquirir todo o FoV em uma única varredura. O sinal de fluorescência foi selecionado por meio da colocação de um filtro passa-longa após a objetiva. A câmera foi configurada para funcionar no modo de obturador rolante: a qualquer momento, as linhas de pixels ativos da câmera (ou seja, expostos à imagem) são sincronizadas com o deslocamento no plano da banda focal da folha de luz, realizada por uma lente eletricamente ajustável. Essa abordagem maximizou a capacidade de seccionamento óptico em todo o FoV, adquirindo apenas imagens na parte mais fina da folha de luz focada. Esta solução difere das configurações convencionais, onde a aquisição envolve toda a faixa de profundidade focal da folha de luz, evitando o pico de resolução de seccionamento óptico em grande parte do FoV. Um estágio de amostra integrado suporta cuvetes, otimizando assim o posicionamento e permitindo o movimento axial da amostra durante o processo de imagem. Desta forma, as reconstruções tomográficas são possíveis através da aquisição de seções internas consecutivas. As imagens obtidas têm um FoV mesoscópico e uma resolução micrométrica, enquanto o tempo de aquisição necessário para todo o coração de um rato é de ~ 15 min. A sincronização entre o obturador de rolamento da câmera e o feixe de luz de excitação que varre o FoV permite adquirir todo o plano de imagem com alta resolução espacial (Figura 4). Isso permite a reconstrução direta da amostra em uma única aquisição tomográfica, sem a necessidade de deslocamento radial da amostra e imagens baseadas em pilhas multiadjacentes. Notavelmente, o microscópio permitiu a reconstrução de todo o órgão de cerca de (10 mm x 6 mm x 6 mm) em uma única sessão de imagem, com um tamanho de voxel quase isotrópico e uma relação sinal-fundo suficiente para resolver células únicas em todo o órgão potencialmente.
Vale ressaltar que o protocolo proposto apresenta algumas etapas críticas que devem ser executadas com cuidado para alcançar bons resultados. Em particular, a canulação do coração através da aorta proximal pode ser bastante difícil, mas é um passo essencial para lavar e fixar o órgão adequadamente. Judd et al.17, mostraram como realizar essa etapa de forma eficaz. Além disso, o procedimento de desgaseificação necessário para o protocolo CLARITY também é bastante complexo, mas é essencial para a preservação dos tecidos; se esta etapa não for realizada corretamente, o tecido pode encontrar danos e decaimento durante a incubação em solução de limpeza.
Além disso, embora o fluxo de trabalho experimental apresentado seja adequado para pequenas sondas fluorescentes, o uso da imuno-histoquímica nem sempre proporciona boa eficiência na coloração devido ao maior peso molecular dos anticorpos. Cada protocolo de imunocoloração requer otimização adequada, e diferentes abordagens foram concebidas para melhorar a penetração de anticorpos, por exemplo, expansão tecidual18 e/ou variações no pH e força iônica19.
A configuração do mesoSPIM também apresenta duas limitações principais: i) a preservação da folha de luz em toda a amostra é fortemente dependente da transparência do tecido e ii) a dimensão do sensor da câmera limita o FoV. Garantir uma correspondência perfeita do índice de refração dentro de todo o coração é muito desafiador, e pequenas variações no índice de refração podem produzir espalhamento de luz, levando à degradação da qualidade da imagem. A este respeito, pode ser introduzido um esquema de iluminação de dois lados. Dois braços de excitação podem gerar duas folhas de luz dinâmicas distintas e alinhadas com iluminação maximamente focada, alternando a iluminação de um lado para o outro do espécime. Além disso, o FoV pode ser melhorado usando uma nova geração de sCMOS retroiluminados de alta resolução com sensores muito grandes em combinação com lentes telecêntricas de alta abertura numérica com baixa distorção de campo. Essa implementação nos permitiria reconstruir órgãos maiores ou tecidos expandidos mantendo a mesma capacidade de seção óptica e, assim, produzindo imagens 3D em escala mícron de amostras limpas de tamanho centímetro.
Embora o protocolo apresentado ainda exija um longo tempo para o preparo da amostra e um alto nível de transparência para obter uma reconstrução citoarquitetura confiável de todo o órgão, o principal significado da abordagem reside nas melhorias do protocolo de limpeza e na capacidade de realizar a reconstrução mesoscópica em uma única varredura em resolução micrométrica. No futuro, esses avanços podem ser combinados com um protocolo de multicoloração para alcançar a reconstrução de todo o órgão, integrando diferentes estruturas biológicas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nada a divulgar.
Acknowledgments
Este projeto recebeu financiamentos do programa de investigação e inovação Horizonte 2020 da União Europeia ao abrigo do contrato de subvenção n.º 952166 (REPAIR), MUR no âmbito do programa FISR, projeto FISR2019_00320 e Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, projeto PERCARE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-2’ Thiodiethanol | Sigma-Aldrich | 166782 | |
| Acrylamide | Bio-Rad | 61-0140 | |
| AV-044 Initiator | Wako Chemicals | AVP5874 | |
| Bis-Acrylamide | Bio-Rad | 161-042 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Camera | Hamamatsu | Orca flash 4.0 v3 | |
| Camera software | Hamamatsu | HC Image | |
| Collimating lens | Thorlabs | AC254-050-A-ML | |
| Detection arm | Integrated optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Excitation lens | Nikon | 91863 | |
| Exteraìnal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-753 | |
| Fold mirrors | Thorlabs | BBE1-E02 | |
| Galvanometric mirror | Thorlabs | GVS211/M | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCImage Live | Hamamatsu | 4.6.1.19 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Internal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-204 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Laser source | Integrated Optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Long-pass filter | Thorlabs | FELH0650 | |
| Magnetic base | Thorlabs | KB25/M | |
| MgCl2 | Chem-Lab | CI-1316-0250 | |
| Motorized traslator | Physisk Instrument | M-122.2DD | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 59888 | |
| Objective | Thorlabs | TL2X-SAP | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Polycap AS | Whatman | 2606T | |
| Relay lens | Qioptiq | G063200000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Tube lens | Thorlabs | ACT508-200-A-ML | |
| Tunable lens | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger Inc | N86KT.18 | |
| Water bath | Memmert | WTB |
References
- Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling. Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).
- Finocchiaro, G., et al. Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death. EP Europace. 2, 1-11 (2021).
- Bishop, M. J., et al. Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).
- Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation. IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106, 369-387 (2020).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Park, Y. G., et al. Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers. Nature Biotechnology. 37, 73 (2019).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769 (2018).
- Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).
- Pianca, N., et al. Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery. The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).
- Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).
- Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative - open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5, 9808 (2015).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012 (2016).
- Yi, F., et al. Microvessel prediction in H&E stained pathology images using fully convolutional neural networks. BMC Bioinformatics. 19 (1), 64 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1982 (2020).
