Summary
Nous rapportons une méthode de reconstruction mésoscopique de l’ensemble du cœur de souris en combinant de nouvelles avancées dans la transformation tissulaire et la coloration avec le développement d’un microscope à feuille de lumière à balayage axial.
Abstract
Les maladies cardiaques génétiques et non génétiques peuvent provoquer de graves processus de remodelage dans le cœur. Le remodelage structurel, tel que le dépôt de collagène (fibrose) et le désalignement cellulaire, peut affecter la conduction électrique, introduire des dysfonctionnements électromécaniques et, éventuellement, conduire à une arythmie. Les modèles prédictifs actuels de ces altérations fonctionnelles sont basés sur des informations structurelles non intégrées et à faible résolution. Il est difficile de placer ce cadre dans un ordre de grandeur différent en raison de l’inefficacité des méthodes d’imagerie standard pour effectuer une imagerie à haute résolution dans des tissus massifs. Dans ce travail, nous décrivons un cadre méthodologique qui permet l’imagerie de cœurs de souris entiers avec une résolution micrométrique. La réalisation de cet objectif a nécessité un effort technologique où les progrès de la transformation tissulaire et des méthodes d’imagerie ont été combinés. Tout d’abord, nous décrivons un protocole CLARITY optimisé capable de transformer un cœur intact en une forme nanoporeuse, hybride d’hydrogel, sans lipides qui permet une transparence élevée et une coloration profonde. Ensuite, un microscope à feuille de lumière à fluorescence capable d’acquérir rapidement des images d’un champ de vision mésoscopique (échelle mm) avec une résolution à l’échelle du micron est décrit. Suite au projet mesoSPIM, le microscope conçu permet la reconstruction de l’ensemble du cœur de souris avec une résolution micrométrique en un seul balayage tomographique. Nous pensons que ce cadre méthodologique permettra de clarifier l’implication du désarroi de la cytoarchitecture dans les dysfonctionnements électriques et d’ouvrir la voie à un modèle complet qui prend en compte à la fois les données fonctionnelles et structurelles, permettant ainsi une étude unifiée des causes structurelles qui conduisent à des altérations électriques et mécaniques après le remodelage tissulaire.
Introduction
Le remodelage structurel associé aux maladies cardiaques peut affecter la conduction électrique et introduire des dysfonctionnements électromécaniques de l’organe 1,2. Les approches actuelles utilisées pour prédire les altérations fonctionnelles utilisent couramment l’IRM et l’IRM-DT pour obtenir une reconstruction globale du dépôt de fibrose, de l’arbre vasculaire et de la distribution des fibres du cœur, et elles sont utilisées pour modéliser les voies de propagation du potentiel d’action préférentielle (APP) à travers l’organe 3,4. Ces stratégies peuvent fournir un bel aperçu de l’organisation du cœur. Cependant, leur résolution spatiale est insuffisante pour étudier l’impact du remodelage structurel sur la fonction cardiaque au niveau cellulaire.
Il est difficile de placer ce cadre à un ordre de grandeur différent, où des cellules individuelles peuvent jouer des rôles individuels dans la propagation du potentiel d’action. La principale limitation est l’inefficacité des méthodes d’imagerie standard pour effectuer une imagerie à haute résolution (résolution micrométrique) dans des tissus massifs (de la taille d’un centimètre). En fait, l’imagerie de tissus biologiques en 3D à haute résolution est très compliquée en raison de l’opacité des tissus. L’approche la plus courante pour effectuer des reconstructions 3D dans des organes entiers consiste à préparer des sections minces. Cependant, un sectionnement, un assemblage et une imagerie précis nécessitent beaucoup d’efforts et de temps. Une approche alternative qui ne nécessite pas de couper l’échantillon consiste à générer un tissu transparent. Au cours des dernières années, plusieurs méthodologies de clarification des tissus ont été proposées 5,6,7,8. Le défi de produire des tissus massifs, transparents et marqués par fluorescence a récemment été relevé en développant de véritables approches de transformation tissulaire (CLARITY9, SHIELD10). En particulier, la méthode CLARITY est basée sur la transformation d’un tissu intact en une forme nanoporeuse, hybride hydrogel, sans lipides qui permet de conférer une grande transparence par l’élimination sélective des bicouches lipidiques membranaires. Notamment, cette méthode s’est avérée efficace également dans la préparation cardiaque11,12,13,14. Cependant, comme le cœur est trop fragile pour convenir à une clairière active, il doit être dégagé en utilisant l’approche passive, qui nécessite beaucoup de temps pour conférer une transparence complète.
En combinaison avec des techniques d’imagerie avancées telles que la microscopie à feuille de lumière, CLARITY a le potentiel d’imager en 3D des tissus cardiaques massifs à une résolution micrométrique. En microscopie à feuille de lumière, l’éclairage de l’échantillon est réalisé avec une fine feuille de lumière confinée dans le plan focal de l’objectif de détection. L’émission de fluorescence est recueillie le long d’un axe perpendiculaire au plan d’éclairage15. L’architecture de détection est similaire à la microscopie à grand champ, ce qui rend l’acquisition beaucoup plus rapide que les microscopes à balayage laser. Le déplacement de l’échantillon à travers la feuille lumineuse permet d’obtenir une tomographie complète de grands spécimens, jusqu’à des échantillons de la taille d’un centimètre. Cependant, en raison des propriétés intrinsèques du faisceau gaussien, il est possible d’obtenir une feuille de lumière très mince (de l’ordre de quelques microns) uniquement pour une extension spatiale limitée, limitant ainsi drastiquement le champ de vision (FoV). Récemment, un nouveau schéma d’excitation a été introduit pour surmonter cette limitation et appliqué à l’imagerie cérébrale, permettant des reconstructions 3D avec une résolution isotrope16.
Dans ce document, une approche de compensation passive est présentée, permettant une réduction significative du délai de compensation requis par le protocole Clarity. Le cadre méthodologique décrit ici permet de reconstruire un cœur entier de souris avec une résolution micrométrique en un seul balayage tomographique avec un temps d’acquisition de l’ordre de quelques minutes.
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Protocol
Toutes les manipulations et procédures des animaux ont été effectuées conformément aux directives de la directive 2010/63/UE du Parlement européen sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques et conformes aux principes et règlements du ministère italien de la Santé. Le protocole expérimental a été approuvé par le ministère italien de la Santé (protocole numéro 647/2015-PR). Tous les animaux ont été fournis par ENVIGO, Italie. Pour ces expériences, 5 souris mâles C57BL/6J âgées de 6 mois ont été utilisées.
1. Préparation de la solution
- Préparer 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (pH 7,6) dans une hotte chimique. Conservez les aliquotes PFA à 4 % à -20 °C pendant plusieurs mois.
- Préparer la solution d’hydrogel: Mélanger 4% d’acrylamide, 0,05% de bis-acrylamide, 0,25% d’initiatior AV-044 dans 0,01 M PBS dans une hotte chimique. Gardez les réactifs et la solution sur la glace pendant toute la préparation. Conservez les aliquotes d’hydrogel à -20 °C pendant plusieurs mois.
- Préparer la solution de nettoyage: Mélanger 200 mM d’acide borique, 4% de dodécylsulfate de sodium (SDS) dans de l’eau désionisée; pH 8,6 dans une hotte chimique. Conserver la solution entre 21 et 37 °C pour éviter les précipitations de SDS.
- Préparer une solution fraîche de Tyrode le jour de l’expérience: Ajouter 10 mM de glucose, 10 mM HEPES, 113 mM de NaCl, 1,2 mM de MgCl2 et 4,7 mM de KCl; titrer à pH 7,4 en utilisant 1 M NaOH.
2. Isolement cardiaque
- Injecter 0,1 mL de 500 U.U. Héparine par voie sous-cutanée 30 minutes avant la procédure d’isolement cardiaque.
- Remplissez une seringue de 30 ml et trois boîtes de Petri de 6 cm avec une solution de Tyrode fraîche. Faites une petite faille (3-4 mm de profondeur) sur le bord de l’une des boîtes de Petri et placez-la sous un microscope stéréoscopique.
- Fixez une canule de 1 mm de diamètre à la seringue et insérez-la dans la faille de la boîte de Pétri. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la seringue.
- Remplissez une seringue de 20 ml avec du PFA à 4 % et conservez-la dans le capot chimique. Préparez une boîte de Petri vide sous le capot.
- Anesthésier la souris avec 3% d’isoflurane/oxygène à un débit de 1,0 L/min et la sacrifier par luxation cervicale selon les règles de bien-être animal en vigueur.
- Après le sacrifice, retirez la fourrure sur la poitrine et ouvrez la poitrine pour avoir un accès complet au cœur.
- Isoler le cœur, l’immerger dans la boîte de Petri préalablement remplie de 50 ml de solution Tyrode. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper l’aorte immédiatement près de l’arc aortique afin d’exposer le cœur.
- Transférer le cœur au microscope stéréoscopique et effectuer soigneusement la canulation. N’insérez pas la canule trop profondément dans l’aorte (pas plus de 2 mm) pour éviter des lésions tissulaires.
- Utilisez une petite pince et une suture (taille 5/0) pour fixer le cœur à la canule.
- Perfuser le cœur avec 30 mL de la solution Tyrode avec une pression constante de 10 mL/min pour éliminer le sang des vaisseaux.
- Détachez la canule de la seringue et placez le cœur dans la boîte de Petri remplie de solution Tyrode. Veillez à ne pas avoir de bulles d’air dans la canule; Sinon, retirez les bulles d’air correctement.
- Fixez la seringue de 20 ml remplie de PFA froid à 4% à la canule et perfuser le cœur à la même pression constante.
- Incuber le cœur dans 10 mL de PFA à 4 % à 4 °C pendant une nuit (O/N). Pour éviter la dégradation des tissus, effectuez les étapes 2.6-2.13 dans les plus brefs délais.
3. Nettoyage du cœur
- Le lendemain, laver le cœur dans 0,01 M PBS 3 fois à 4 °C pendant 15 min.
REMARQUE: Après cette étape, le cœur peut être stocké dans PBS + 0,01% d’azoture de sodium (NaN3) à 4 ° C pendant plusieurs mois. - Incuber le cœur dans 30 mL de solution d’hydrogel en secouant (15 rpm) à 4 °C pendant 3 jours.
- Dégazez l’échantillon à température ambiante à l’aide d’un sécheur, d’une pompe à vide et d’un système de tubes qui relie le sécheur à la pompe et à un pipeline d’azote.
- Placez l’échantillon dans le séchoir et ouvrez le flacon en gardant le capuchon dessus.
- Fermez le séchoir et retirez l’oxygène du tube en ouvrant la canalisation d’azote.
- Allumez la pompe à vide pour retirer l’oxygène de la sécheuse pendant 10 min.
- Éteignez la pompe et utilisez le bouton de la sécheuse pour ouvrir la canalisation d’azote. Une fois que la pression est égale à la pression atmosphérique, ouvrez soigneusement le séchoir et fermez rapidement le flacon.
- Maintenir le cœur dans la solution d’hydrogel dégazée à 37 °C pendant 3 h au repos.
- Lorsque l’hydrogel est correctement polymérisé et apparaît entièrement gélatineux, retirez-en soigneusement le cœur et placez-le dans le porte-échantillon.
- Insérez le porte-échantillon avec le cœur dans l’une des chambres de nettoyage et fermez-le correctement pour éviter les fuites de la solution de nettoyage.
- Allumez le bain-marie où le récipient de solution de nettoyage est placé et la pompe péristaltique pour démarrer la recirculation de la solution de nettoyage.
- Changez la solution de dédouanement dans le conteneur une fois par semaine pour accélérer la procédure de clarification.
4. Coloration de la membrane cellulaire
- Une fois que le cœur semble complètement clarifié, retirez-le du porte-échantillon et lavez-le dans 50 ml de PBS réchauffé pendant 24 heures. Laver à nouveau dans 50 ml de PBS + 1% de Triton-X (PBS-T 1x) pendant 24 h.
- Incuber l’échantillon dans 0,01 mg/mL d’agglutinine germée de blé (WGA) - Alexa Fluor 633 dans 3 mL de PBS-T 1x en agitation (50 rpm) à température ambiante pendant 7 jours.
- Après l’incubation de 7 jours, laver l’échantillon dans 50 mL de PBS-T 1x à température ambiante en agitant pendant 24 h.
- Incuber l’échantillon dans 4% PFA pendant 15 min, puis le laver 3 fois dans PBS pendant 5 min chacun.
NOTE: Après cette étape, le cœur peut être stocké dans PBS + 0,01% NaN3 à 4 ° C pendant plusieurs mois. - Incuber le cœur à des concentrations croissantes de 2,2′-thiodiéthanol (TDE) dans 0,01 M PBS (20% et 47% TDE/PBS) pendant 8 h chacun, jusqu’à la concentration finale de 68% TDE dans 0,01 M PBS pour fournir l’indice de réfraction requis (RI = 1,46). Il s’agit du support de correspondance RI (RI-medium) pour acquérir des images16.
5. Montage et acquisition du cœur
REMARQUE: Tous les composants du système optique sont énumérés en détail dans le tableau des matériaux.
- Remplir délicatement environ 80% de la cuvette externe (quartz, 45 mm × 45 mm × 42,5 mm) avec le milieu RI.
REMARQUE: Ici, il est possible d’utiliser différentes solutions non volatiles qui garantissent un RI de 1,46. - Remplir délicatement la cuvette interne (quartz, 45 mm × 12,5 mm × 12,5 mm) avec le même milieu RI.
- Immergez l’échantillon à l’intérieur de la cuvette interne. Les incubations de l’échantillon décrites ci-dessus permettent à l’échantillon de rester stable à l’intérieur du milieu IR sans être maintenu.
- Déplacez doucement l’échantillon vers le bas de la cuvette à l’aide d’une fine pince à épiler et disposez le cœur avec son axe longitudinal parallèle à l’axe principal de la cuvette pour minimiser le trajet de la lumière d’excitation à travers le tissu pendant le balayage.
- Fixez délicatement le bouchon sur mesure au-dessus de la cuvette interne à l’aide de deux vis.
- Montez l’échantillon sur l’étage du microscope à l’aide des aimants.
- Traduisez manuellement l’étage d’échantillonnage vertical pour immerger la cuvette interne dans la cuvette externe.
- Allumez la source lumineuse d’excitation (longueur d’onde de 638 nm), en réglant une faible puissance (de l’ordre de 3 mW).
- Déplacez l’échantillon à l’aide du traducteur motorisé pour éclairer un plan interne du tissu.
- Allumez le logiciel d’imagerie (HCImageLive) et réglez le déclencheur de la caméra sur le mode externe (feuille de lumière) pour piloter le déclencheur d’acquisition de la caméra par le logiciel personnalisé contrôlant l’ensemble de la configuration.
- Activez l’enregistrement automatique dans le panneau Paramètres de numérisation et définissez le dossier de sortie dans lequel les images doivent être enregistrées.
- Ajustez manuellement la position de l’échantillon dans le plan XY avec les traducteurs linéaires pour déplacer l’échantillon vers le centre du FoV du capteur de caméra.
- Déplacez l’échantillon le long de l’axe Z à l’aide du traducteur motorisé linéaire pour identifier les bordures cardiaques pour la reconstruction tomographique.
- Augmentez la puissance laser à ~20 mW, prêt pour la session d’imagerie.
- Démarrez l’acquisition tomographique, cliquez sur le bouton Démarrer dans le panneau de séquence du logiciel d’imagerie, et en même temps déplacez l’échantillon le long de l’axe Z à la vitesse constante de 6 μm/s à l’aide du traducteur motorisé.
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Representative Results
La configuration de nettoyage passif développée permet d’obtenir un cœur de souris adulte dégagé (avec une dimension de l’ordre de 10 mm x 6 mm x 6 mm) en environ 3 mois. Tous les composants de la configuration sont montés comme illustré à la Figure 1. Le gradient de température négligeable entre chaque chambre de dégagement (de l’ordre de 3°C) permet de maintenir la température dans une plage appropriée dans toutes les chambres.
Figure 1 : Schéma de la configuration de compensation passive. La solution de nettoyage (après avoir été filtrée) circule successivement à travers les chambres d’échantillonnage à l’aide de la pompe péristaltique. Le maintien du récipient de solution dans un bain-marie réglé à 50 °C permet à la température de la solution d’être comprise entre 37 et 45 °C dans les chambres. Image créée avec Biorender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
La figure 2 montre le résultat du processus d’effacement d’un cœur entier. Comme l’ont déjà signalé Costantini et coll.16, la combinaison de la méthodologie CLARITY avec le TDE en tant que milieu IR ne modifie pas de manière significative le volume final de l’échantillon et n’entraîne pas de déformation anisotrope de l’échantillon.
Figure 2 : Image représentative d’un cœur avant (à gauche) et après (à droite) le protocole CLARITY. Les cœurs deviennent entièrement transparents et légèrement surdimensionnés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Une fois le cœur dégagé, les membranes cellulaires ont été colorées avec un WGA conjugué Alexa Fluor 633 pour effectuer la reconstruction cytologique de l’organe entier. Le microscope à feuille de lumière à fluorescence sur mesure (Figure 3) a pu assurer une résolution 3D à l’échelle du micron sur l’ensemble du FoV.
Figure 3 : MesoSPIM. Rendu CAO du microscope à feuille de lumière à fluorescence sur mesure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Compte tenu de l’ouverture numérique (NA = 0,1) de l’optique de détection, la fonction d’étalement de point (PSF) radiale (XY) du système peut être estimée de l’ordre de 4-5 μm. D’autre part, l’optique d’excitation produit une feuille lumineuse avec une taille minimale d’environ 6 μm (pleine largeur demi maximum, FWHM) qui diverge jusqu’à 175 μm au bord du FoV (Figure 4A-C). La synchronisation de l’obturateur roulant de la caméra avec le balayage axial du faisceau laser a permis de recueillir le signal d’émission uniquement dans la partie échantillon excitée par la taille de la feuille de lumière, ce qui a donné une FWHM moyenne d’environ 6,7 μm sur l’ensemble du FoV (Figure 4B-D).
Figure 4 : Génération et caractérisation de la feuille de lumière. (A) Une feuille lumineuse d’excitation générée avec une source laser de 638 nm est focalisée sur le centre du champ de vision (FoV) et acquise avec une taille de pixel de 3,25 μm et un temps d’exposition de 10 ms. L’intensité lumineuse est normalisée et rapportée avec une carte de couleurs. La demi-largeur maximale (FWHM) du profil d’intensité lumineuse est évaluée dans 15 positions différentes le long du FoV. Les résultats sont indiqués en C. (B) Image de la feuille lumineuse d’excitation générée par la synchronisation entre l’obturateur roulant de l’appareil photo fonctionnant à 1,92 Hz et la position du faisceau lumineux entraînée par la lentille accordable. Le FWHM du profil d’intensité lumineuse est évalué le long du FoV et les résultats sont présentés en D. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Le Z-PSF du microscope a également été estimé par une reconstruction tomographique de la nanosphère fluorescente (Figure 5). Un FWHM de 6,4 μm peut être estimé par l’ajustement, en bon accord avec l’évaluation précédente.
Figure 5 : Fonction d’étalement de points sur l’axe Z. La fonction d’étalement ponctuel (PSF) du système optique est estimée par imagerie de nanosphères fluorescentes à l’échelle submicronique (excitées par une feuille de lumière d’une longueur d’onde de 638 nm) avec une taille de pixel de 3,25 μm × 3,25 μm × 2,0 μm. Le profil d’intensité PSF le long de l’axe optique (Z) est représenté par des points noirs. Le profil PSF est équipé d’une fonction gaussienne avec μ = 18,6 μm et σ = 2,7 μm. Le FWHM de la PSF estimé par l’ajustement est de 6,4 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Grâce à la grande transparence du tissu, il a été possible d’éclairer tout le cœur sans distorsion significative de la feuille de lumière balayée axialement à une longueur d’onde d’excitation de 638 nm. Le signal de fluorescence a été recueilli par le capteur sCMOS fonctionnant à 500 ms de temps d’exposition et une fréquence d’images de 1,92 Hz. Sur la base de la quantification précédente, l’acquisition tomographique a été réalisée en utilisant une vitesse de balayage Z de 6 μm/s, et en supposant une fréquence d’images de 1,92 Hz, une image tous les 3,12 μm a été acquise, suréchantillonnant le système Z-PSF d’environ deux fois. Deux cadres représentatifs (sur les plans coronal et transversal) de la chambre ventriculaire gauche sont représentés à la figure 6. Ce résultat confirme la capacité du système à résoudre des membranes cellulaires uniques en trois dimensions avec un rapport signal/bruit suffisant dans l’ensemble de l’organe (Figure 6).
Figure 6 : Reconstruction du tissu cardiaque de souris. Le cœur clarifié a été coloré avec WGA conjugué à Alexa Fluor 633 et excité par une source laser d’une longueur d’onde de 638 nm. (A) Sections coronales et (B) transversales représentatives. (C-D) La transformation tissulaire produit une grande transparence tissulaire, permettant de résoudre de petites structures dans la profondeur de la paroi. Le système optique présente une résolution axiale suffisante pour résoudre les structures micrométriques (panneau. D). (E) Rendu cardiaque 3D basse résolution. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Dans ce travail, une approche réussie pour nettoyer, colorer et imager un cœur de souris entier à haute résolution a été introduite. Tout d’abord, un protocole de transformation tissulaire (CLARITY) a été optimisé et réalisé, légèrement modifié pour son application sur le tissu cardiaque. En effet, pour obtenir une reconstruction efficace en 3D de tout un cœur, il est indispensable de prévenir le phénomène de diffusion de la lumière. La méthodologie CLARITY nous permet d’obtenir un cœur intact très transparent, mais elle nécessite de longs temps d’incubation lorsqu’elle est effectuée passivement (environ 5 mois). En ce qui concerne le cerveau, le tissu cardiaque ne convient pas à un nettoyage actif, qui profite d’un champ électrique. Même à basse tension, le champ électrique entraîne des dommages et des ruptures de tissus. Ici, une approche de compensation passive a été optimisée pour obtenir un cœur complètement dégagé en environ 3 mois. Après avoir isolé et canulé le cœur par l’aorte proximale, la méthodologie CLARITY a été réalisée comme décrit à la section 3 du protocole. Pour accélérer la procédure, une installation de nettoyage passif faite maison a été mise en place (Figure 1), ce qui a permis de réduire le temps de nettoyage des tissus d’environ 40 %. L’installation est composée d’un récipient pour la solution de nettoyage, d’un bain-marie, d’une pompe péristaltique, de plusieurs chambres contenant différents porte-échantillons, de filtres à capsules pour chaque chambre et d’un système de tubes pour la recirculation de la solution. La pompe extrait et fait circuler la solution du récipient successivement à travers chacune des chambres, où les échantillons sont conservés pour l’élimination. Avant d’entrer dans les chambres, la solution s’écoule à travers un filtre à capsule pour piéger les lipides évacués des tissus lors de l’éclaircissement. La température optimale pour la solution de nettoyage, comprise entre 37 et 45 °C, est maintenue dans les chambres pendant la recirculation en maintenant le récipient de solution dans un bain-marie à 50 °C. Il est conseillé de changer la solution de dédouanement dans le conteneur une fois par semaine pendant la procédure. Tous les composants utilisés sont énumérés en détail dans le tableau des matériaux. La solution optimisée présentée ici nous permet d’obtenir un cœur de souris entièrement effacé passivement dans un temps nettement plus court par rapport à la technique de nettoyage passif standard, réduisant ainsi le temps expérimental requis sans endommager l’organe. L’approche de coloration a également été optimisée pour un marquage homogène des membranes cellulaires et de l’endothélium, à l’aide d’une lectine fluorescente (WGA - Alexa Fluor 633).
La cytoarchitecture cardiaque a été reconstruite en développant un mesoSPIM dédié qui balaie axialement la feuille de lumière à travers l’échantillon (https://mesospim.org). Le microscope à feuille de lumière à fluorescence sur mesure (Figure 3) a pu acquérir rapidement des images d’un FoV mésoscopique (de l’ordre du millimètre) avec une résolution micrométrique. De cette façon, des cardiomyocytes uniques peuvent être résolus et cartographiés dans une reconstruction 3D de l’organe entier. Le microscope éclaire l’échantillon dégagé avec une feuille de lumière, générée dynamiquement en balayant un faisceau laser à 638 nm à l’aide d’un miroir galvanométrique. Une caméra sCMOS caractérise le bras de détection dans un schéma de grossissement 2x qui lui permet d’acquérir l’ensemble du FoV en un seul balayage. Le signal de fluorescence a été sélectionné en plaçant un filtre passe-long après l’objectif. L’appareil photo a été configuré pour fonctionner en mode obturateur roulant : à tout moment, les lignes des pixels actifs de l’appareil photo (c’est-à-dire exposés à l’image) sont synchronisées avec le décalage dans le plan de la bande focale de la feuille de lumière, effectué par un objectif réglable électriquement. Cette approche a maximisé la capacité de sectionnement optique dans l’ensemble du FoV en n’acquérant des images que dans la partie la plus mince de la feuille de lumière focalisée. Cette solution diffère des configurations conventionnelles, où l’acquisition implique toute la gamme de profondeur focale de la feuille de lumière, empêchant la résolution de sectionnement optique maximale dans une grande partie du FoV. Un étage d’échantillonnage intégré prend en charge les cuvettes, optimisant ainsi le positionnement et permettant le mouvement axial de l’échantillon pendant le processus d’imagerie. De cette façon, les reconstructions tomographiques sont possibles en acquérant des sections internes consécutives. Les images obtenues ont un FoV mésoscopique et une résolution micrométrique, tandis que le temps d’acquisition nécessaire pour un cœur de souris entier est de ~ 15 min. La synchronisation entre l’obturateur roulant de la caméra et le faisceau lumineux d’excitation balayant le FoV permet d’acquérir l’ensemble du plan d’image avec une haute résolution spatiale (Figure 4). Cela permet une reconstruction directe de l’échantillon en une seule acquisition tomographique, sans la nécessité d’un déplacement radial de l’échantillon et d’une imagerie basée sur des piles multi-adjacentes. Notamment, le microscope a permis la reconstruction de l’organe entier d’environ (10 mm x 6 mm x 6 mm) en une seule séance d’imagerie, avec une taille de voxel presque isotrope et un rapport signal / arrière-plan suffisant pour résoudre potentiellement des cellules individuelles sur l’ensemble de l’organe.
Il convient de noter que le protocole proposé présente certaines étapes critiques qui doivent être exécutées avec soin pour obtenir de bons résultats. En particulier, la canulation du cœur à travers l’aorte proximale peut être assez difficile, mais c’est une étape essentielle pour laver et réparer correctement l’organe. Judd et al.17, ont montré comment effectuer cette étape efficacement. De plus, la procédure de dégazage requise par le protocole CLARITY est également assez complexe, mais elle est essentielle pour la préservation des tissus; Si cette étape n’est pas effectuée correctement, le tissu pourrait subir des dommages et des caries pendant l’incubation dans la solution de nettoyage.
De plus, bien que le flux de travail expérimental présenté soit adapté aux petites sondes fluorescentes, l’utilisation de l’immunohistochimie n’offre pas toujours une bonne efficacité dans la coloration en raison du poids moléculaire plus élevé des anticorps. Chaque protocole d’immunomarquage nécessite une optimisation appropriée, et différentes approches ont été conçues pour améliorer la pénétration des anticorps, par exemple, l’expansion tissulaire18 et/ou les variations du pH et de la force ionique19.
La configuration mesoSPIM présente également deux limitations principales : i) la préservation de la feuille de lumière à travers l’échantillon dépend fortement de la transparence du tissu, et ii) la dimension du capteur de caméra limite le FoV. Garantir une correspondance parfaite de l’indice de réfraction à l’intérieur de tout le cœur est très difficile, et de petites variations de l’indice de réfraction peuvent produire une diffusion de la lumière, entraînant une dégradation de la qualité de l’image. À cet égard, un système d’éclairage à double face peut être introduit. Deux bras d’excitation peuvent générer deux feuilles de lumière dynamiques distinctes et alignées avec un éclairage focalisé au maximum en alternant l’éclairage d’un côté à l’autre de l’échantillon. En outre, le FoV peut être amélioré en utilisant une nouvelle génération de sCMOS rétroéclairé haute résolution avec de très grands capteurs en combinaison avec des objectifs télécentriques à grande ouverture numérique avec une faible distorsion de champ. Cette mise en œuvre nous permettrait de reconstruire des organes plus gros ou des tissus élargis en conservant la même capacité de coupe optique et en produisant ainsi des images 3D à l’échelle du micron d’échantillons effacés de la taille d’un centimètre.
Bien que le protocole présenté nécessite encore beaucoup de temps pour la préparation des échantillons et un haut niveau de transparence pour obtenir une reconstruction cytologique fiable de l’organe entier, l’importance principale de l’approche réside dans les améliorations du protocole de compensation et la capacité d’effectuer une reconstruction mésoscopique en un seul balayage à résolution micrométrique. À l’avenir, ces progrès pourront être combinés à un protocole de multicoloration pour réaliser une reconstruction d’organes entiers intégrant différentes structures biologiques.
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Disclosures
Rien à divulgation.
Acknowledgments
Ce projet a reçu des financements du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention n ° 952166 (REPAIR), MUR dans le cadre du programme FISR, projet FISR2019_00320 et Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, projet PERCARE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-2’ Thiodiethanol | Sigma-Aldrich | 166782 | |
| Acrylamide | Bio-Rad | 61-0140 | |
| AV-044 Initiator | Wako Chemicals | AVP5874 | |
| Bis-Acrylamide | Bio-Rad | 161-042 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Camera | Hamamatsu | Orca flash 4.0 v3 | |
| Camera software | Hamamatsu | HC Image | |
| Collimating lens | Thorlabs | AC254-050-A-ML | |
| Detection arm | Integrated optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Excitation lens | Nikon | 91863 | |
| Exteraìnal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-753 | |
| Fold mirrors | Thorlabs | BBE1-E02 | |
| Galvanometric mirror | Thorlabs | GVS211/M | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCImage Live | Hamamatsu | 4.6.1.19 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Internal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-204 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Laser source | Integrated Optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Long-pass filter | Thorlabs | FELH0650 | |
| Magnetic base | Thorlabs | KB25/M | |
| MgCl2 | Chem-Lab | CI-1316-0250 | |
| Motorized traslator | Physisk Instrument | M-122.2DD | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 59888 | |
| Objective | Thorlabs | TL2X-SAP | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Polycap AS | Whatman | 2606T | |
| Relay lens | Qioptiq | G063200000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Tube lens | Thorlabs | ACT508-200-A-ML | |
| Tunable lens | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger Inc | N86KT.18 | |
| Water bath | Memmert | WTB |
References
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