Summary
Wir berichten über eine Methode zur mesoskopischen Rekonstruktion des gesamten Mausherzens durch die Kombination neuer Fortschritte in der Gewebetransformation und Färbung mit der Entwicklung eines axial gescannten Lichtblattmikroskops.
Abstract
Sowohl genetische als auch nicht-genetische Herzerkrankungen können schwere Umbauprozesse im Herzen verursachen. Strukturelle Umbauten, wie Kollagenablagerung (Fibrose) und zelluläre Fehlausrichtung, können die elektrische Leitung beeinträchtigen, elektromechanische Funktionsstörungen verursachen und schließlich zu Arrhythmien führen. Aktuelle Vorhersagemodelle dieser funktionellen Veränderungen basieren auf nicht integrierten und niedrig aufgelösten Strukturinformationen. Diesen Rahmen auf eine andere Größenordnung zu legen, ist aufgrund der Unwirksamkeit von Standard-Bildgebungsmethoden bei der Durchführung hochauflösender Bildgebung in massivem Gewebe eine Herausforderung. In dieser Arbeit beschreiben wir einen methodischen Rahmen, der die Abbildung ganzer Mausherzen mit mikrometrischer Auflösung ermöglicht. Die Erreichung dieses Ziels erforderte eine technologische Anstrengung, bei der Fortschritte bei der Gewebetransformation und bildgebenden Verfahren kombiniert wurden. Zunächst beschreiben wir ein optimiertes CLARITY-Protokoll, das in der Lage ist, ein intaktes Herz in eine nanoporöse, hydrogelhybridisierte, lipidfreie Form umzuwandeln, die eine hohe Transparenz und tiefe Färbung ermöglicht. Dann wird ein Fluoreszenz-Lichtblattmikroskop beschrieben, das in der Lage ist, schnell Bilder eines mesoskopischen Sichtfeldes (mm-Skala) mit der Auflösung im Mikrometerbereich aufzunehmen. Im Anschluss an das mesoSPIM-Projekt ermöglicht das konzipierte Mikroskop die Rekonstruktion des gesamten Mausherzens mit mikrometrischer Auflösung in einem einzigen tomographischen Scan. Wir glauben, dass dieser methodische Rahmen es ermöglichen wird, die Beteiligung der Zytoarchitektur an den elektrischen Dysfunktionen zu klären und den Weg für ein umfassendes Modell zu ebnen, das sowohl die funktionellen als auch die strukturellen Daten berücksichtigt und so eine einheitliche Untersuchung der strukturellen Ursachen ermöglicht, die zu elektrischen und mechanischen Veränderungen nach dem Gewebeumbau führen.
Introduction
Strukturumbau im Zusammenhang mit Herzerkrankungen kann die elektrische Leitung beeinträchtigen und elektromechanische Funktionsstörungen des Organs 1,2 verursachen. Aktuelle Ansätze zur Vorhersage funktioneller Veränderungen verwenden häufig MRT und DT-MRT, um eine Gesamtrekonstruktion der Fibroseablagerung, des Gefäßbaums und der Faserverteilung des Herzens zu erhalten, und sie werden verwendet, um APP-Pfade (Preferential Action Potential Propagation) über das Organ 3,4 zu modellieren. Diese Strategien können einen schönen Überblick über die Herzorganisation geben. Ihre räumliche Auflösung reicht jedoch nicht aus, um die Auswirkungen des strukturellen Umbaus auf die Herzfunktion auf zellulärer Ebene zu untersuchen.
Es ist eine Herausforderung, dieses Framework in einer anderen Größenordnung zu platzieren, in der einzelne Zellen individuelle Rollen bei der Ausbreitung des Aktionspotentials spielen können. Die Haupteinschränkung ist die Ineffizienz von Standard-Bildgebungsmethoden zur Durchführung hochauflösender Bildgebung (mikrometrische Auflösung) in massiven (zentimetergroßen) Geweben. Tatsächlich ist die Abbildung biologischer Gewebe in 3D mit hoher Auflösung aufgrund der Undurchsichtigkeit des Gewebes sehr kompliziert. Der gebräuchlichste Ansatz zur Durchführung von 3D-Rekonstruktionen in ganzen Organen ist die Vorbereitung von Dünnschnitten. Präzises Schneiden, Zusammensetzen und Abbilden erfordern jedoch erheblichen Aufwand und Zeit. Ein alternativer Ansatz, bei dem die Probe nicht geschnitten werden muss, besteht darin, ein transparentes Gewebe zu erzeugen. In den letzten Jahren wurden mehrere Methoden zur Klärung von Geweben vorgeschlagen 5,6,7,8. Die Herausforderung, massive, transparente und fluoreszenzmarkierte Gewebe herzustellen, wurde kürzlich durch die Entwicklung echter Gewebetransformationsansätze (CLARITY9, SHIELD10) erreicht. Insbesondere basiert die CLARITY-Methode auf der Umwandlung eines intakten Gewebes in eine nanoporöse, hydrogel-hybridisierte, lipidfreie Form, die es ermöglicht, durch die selektive Entfernung von Membranlipiddoppelschichten eine hohe Transparenz zu verleihen. Bemerkenswerterweise hat sich diese Methode auch in der Herzvorbereitung als erfolgreich erwiesen 11,12,13,14. Da das Herz jedoch zu zerbrechlich ist, um für eine aktive Klärung geeignet zu sein, muss es mit dem passiven Ansatz gereinigt werden, der lange Zeit benötigt, um vollständige Transparenz zu verleihen.
In Kombination mit fortschrittlichen bildgebenden Verfahren wie der Lichtblattmikroskopie hat CLARITY das Potenzial, massives 3D-Herzgewebe mit mikrometrischer Auflösung abzubilden. In der Lichtblattmikroskopie wird die Beleuchtung der Probe mit einer dünnen Lichtschicht durchgeführt, die in der Brennebene des Detektionsobjektivs eingeschlossen ist. Die Fluoreszenzemission wird entlang einer Achse senkrecht zur Beleuchtungsebene15 gesammelt. Die Detektionsarchitektur ähnelt der Weitfeldmikroskopie, wodurch die Erfassung viel schneller ist als bei Laserscanning-Mikroskopen. Das Bewegen der Probe durch die Lichtschicht ermöglicht eine vollständige Tomographie von großen Proben, bis zu zentimetergroßen Proben. Aufgrund der intrinsischen Eigenschaften des Gaußstrahls ist es jedoch möglich, ein sehr dünnes (in der Größenordnung von wenigen Mikrometern) Lichtblatt nur für eine begrenzte räumliche Ausdehnung zu erhalten, wodurch das Sichtfeld (FoV) drastisch eingeschränkt wird. Vor kurzem wurde ein neuartiges Anregungsschema eingeführt, um diese Einschränkung zu überwinden, und für die Bildgebung des Gehirns angewendet, was 3D-Rekonstruktionen mit isotroper Auflösung ermöglicht16.
In diesem Beitrag wird ein passiver Clearingansatz vorgestellt, der eine signifikante Reduzierung des vom CLARITY-Protokoll benötigten Clearing-Timings ermöglicht. Der hier beschriebene methodische Rahmen erlaubt es, ein ganzes Mausherz mit mikrometrischer Auflösung in einem einzigen tomographischen Scan mit einer Erfassungszeit in der Größenordnung von Minuten zu rekonstruieren.
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Protocol
Alle Tierbehandlungen und -verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere durchgeführt und entsprachen den Grundsätzen und Vorschriften des italienischen Gesundheitsministeriums. Das Versuchsprotokoll wurde vom italienischen Gesundheitsministerium genehmigt (Protokollnummer 647/2015-PR). Alle Tiere wurden von ENVIGO, Italien, zur Verfügung gestellt. Für diese Experimente wurden 5 männliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von 6 Monaten verwendet.
1. Lösungsvorbereitung
- Bereiten Sie 4% Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (pH 7,6) in einer chemischen Haube vor. Lagern Sie die 4%igen PFA-Aliquots mehrere Monate bei -20 °C.
- Hydrogel-Lösung vorbereiten: Mischen Sie 4% Acrylamid, 0,05% Bis-Acrylamid, 0,25% Initiatior AV-044 in 0,01 M PBS in einer chemischen Haube. Bewahren Sie die Reagenzien und die Lösung während der gesamten Zubereitung auf Eis auf. Lagern Sie die Hydrogel-Aliquots mehrere Monate bei -20 °C.
- Clearing-Lösung vorbereiten: 200 mM Borsäure, 4% Natriumdodecylsulfat (SDS) in entionisiertem Wasser mischen; pH 8,6 in einer chemischen Haube. Lagern Sie die Lösung zwischen 21-37 °C, um SDS-Niederschläge zu vermeiden.
- Bereiten Sie am Tag des Experiments eine frische Tyrode-Lösung vor: Fügen Sie 10 mM Glucose, 10 mM HEPES, 113 mM NaCl, 1,2 mM MgCl2 und 4,7 mM KCl hinzu; titrieren auf pH 7,4 mit 1 M NaOH.
2. Herzisolation
- Injizieren Sie 0,1 ml 500 I.E. Heparin subkutan 30 min vor der Herzisolierung.
- Füllen Sie eine 30-ml-Spritze und drei 6-cm-Petrischalen mit frischer Tyrode-Lösung. Machen Sie einen kleinen Riss (3-4 mm tief) am Rand einer der Petrischalen und legen Sie ihn unter ein stereoskopisches Mikroskop.
- Befestigen Sie eine Kanüle mit einem Durchmesser von 1 mm an der Spritze und führen Sie sie in den Riss der Petrischale ein. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in der Spritze befinden.
- Füllen Sie eine 20-ml-Spritze mit 4% PFA und bewahren Sie sie in der chemischen Haube auf. Bereiten Sie eine leere Petrischale unter der Haube vor.
- Betäuben Sie die Maus mit 3% Isofluran/Sauerstoff bei einer Flussrate von 1,0 l/min und opfern Sie sie durch zervikale Dislokation gemäß den geltenden Tierschutzbestimmungen.
- Entfernen Sie nach dem Opfer das Fell über der Brust und öffnen Sie die Brust, um vollen Zugang zum Herzen zu haben.
- Isolieren Sie das Herz, tauchen Sie es in die Petrischale, die zuvor mit 50 ml Tyrode Solution gefüllt war. Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um die Aorta unmittelbar in der Nähe des Aortenbogens zu schneiden, um das Herz freizulegen.
- Übertragen Sie das Herz unter ein stereoskopisches Mikroskop und führen Sie die Kanülierung sorgfältig durch. Führen Sie die Kanüle nicht zu tief in die Aorta ein (nicht mehr als 2 mm), um Gewebeschäden zu vermeiden.
- Verwenden Sie eine kleine Klemme und eine Naht (Größe 5/0), um das Herz an der Kanüle zu befestigen.
- Durchbluten Sie das Herz mit 30 ml der Tyrode-Lösung mit einem konstanten Druck von 10 ml / min, um Blut aus den Gefäßen zu entfernen.
- Lösen Sie die Kanüle von der Spritze und legen Sie das Herz in die mit Tyrodenlösung gefüllte Petrischale. Achten Sie darauf, keine Luftblasen in der Kanüle zu haben; Andernfalls entfernen Sie die Luftblasen ordnungsgemäß.
- Befestigen Sie die 20-ml-Spritze, die mit kaltem 4% PFA gefüllt ist, an der Kanüle und perfundiert Sie das Herz mit dem gleichen konstanten Druck.
- Inkubieren Sie das Herz in 10 ml 4% PFA bei 4 °C über Nacht (O/N). Um einen Gewebeabbau zu vermeiden, führen Sie die Schritte 2.6-2.13 in kürzester Zeit durch.
3. Herzreinigung
- Am nächsten Tag das Herz in 0,01 M PBS 3 mal bei 4 °C für 15 min waschen.
HINWEIS: Nach diesem Schritt kann das Herz in PBS + 0,01% Natriumazid (NaN3) bei 4 °C für mehrere Monate gelagert werden. - Das Herz in 30 ml Hydrogel-Lösung unter Schütteln (15 U/min) bei 4 °C für 3 Tage inkubieren.
- Entgasen Sie die Probe bei Raumtemperatur mit einem Trockner, einer Vakuumpumpe und einem Rohrsystem, das den Trockner sowohl mit der Pumpe als auch mit einer Stickstoffleitung verbindet.
- Legen Sie die Probe in den Trockner und öffnen Sie die Durchstechflasche, wobei Sie die Kappe darauf halten.
- Schließen Sie den Trockner und entfernen Sie den Sauerstoff aus dem Rohr, indem Sie die Stickstoffleitung öffnen.
- Schalten Sie die Vakuumpumpe ein, um den Sauerstoff für 10 Minuten aus dem Trockner zu entfernen.
- Schalten Sie die Pumpe aus und verwenden Sie den Knopf des Trockners, um die Stickstoffleitung zu öffnen. Sobald der Druck dem atmosphärischen Druck entspricht, öffnen Sie vorsichtig den Trockner und schließen Sie die Durchstechflasche schnell.
- Halten Sie das Herz in der entgasten Hydrogel-Lösung bei 37 °C für 3 h in Ruhe.
- Wenn das Hydrogel richtig polymerisiert ist und vollständig gallertartig erscheint, entfernen Sie vorsichtig das Herz davon und legen Sie es in den Probenhalter.
- Führen Sie den Probenhalter mit dem Herzen in eine der Clearingkammern ein und schließen Sie ihn ordnungsgemäß, um ein Auslaufen der Clearing-Lösung zu vermeiden.
- Schalten Sie das Wasserbad ein, in dem sich der Klärlösungsbehälter befindet, und die Schlauchpumpe, um die Rezirkulation der Klärlösung zu starten.
- Wechseln Sie die Clearinglösung im Behälter einmal pro Woche, um den Klärungsprozess zu beschleunigen.
4. Zellmembranfärbung
- Sobald das Herz vollständig geklärt erscheint, nehmen Sie es aus dem Probenhalter und waschen Sie es in 50 ml aufgewärmtem PBS für 24 Stunden. Erneut in 50 ml PBS + 1% Triton-X (PBS-T 1x) für 24 h waschen.
- Inkubieren Sie die Probe in 0,01 mg/ml Weizenkeimagglutinin (WGA) - Alexa Fluor 633 in 3 ml PBS-T 1x im Schütteln (50 U/min) bei Raumtemperatur für 7 Tage.
- Nach der 7-tägigen Inkubation waschen Sie die Probe in 50 ml PBS-T 1x bei Raumtemperatur in Schütteln für 24 h.
- Inkubieren Sie die Probe in 4% PFA für 15 min und waschen Sie sie dann 3 mal in PBS für jeweils 5 min.
HINWEIS: Nach diesem Schritt kann das Herz in PBS + 0,01% NaN3 bei 4 °C für mehrere Monate gelagert werden. - Das Herz wird in steigenden Konzentrationen von 2,2′-Thiodiethanol (TDE) in 0,01 M PBS (20% und 47% TDE/PBS) für jeweils 8 h bis zur Endkonzentration von 68% TDE in 0,01 M PBS inkubiert, um den erforderlichen Brechungsindex (RI = 1,46) zu erhalten. Dies ist das RI-Matching-Medium (RI-Medium) zur Aufnahme von Bildern16.
5. Herzmontage und -erfassung
HINWEIS: Alle Komponenten des optischen Systems sind in der Materialtabelle detailliert aufgeführt.
- Füllen Sie ca. 80% der äußeren Küvette (Quarz, 45 mm × 45 mm × 42,5 mm) vorsichtig mit dem RI-Medium.
HINWEIS: Hier ist es möglich, verschiedene nichtflüchtige Lösungen zu verwenden, die eine RI von 1,46 garantieren. - Füllen Sie die interne Küvette (Quarz, 45 mm × 12,5 mm × 12,5 mm) vorsichtig mit dem gleichen RI-Medium.
- Tauchen Sie die Probe in die interne Küvette. Die oben beschriebenen Probeninkubationen ermöglichen es, dass die Probe im RI-Medium stabil bleibt, ohne gehalten zu werden.
- Bewegen Sie die Probe vorsichtig mit einer dünnen Pinzette auf den Boden der Küvette und ordnen Sie das Herz mit seiner Längsachse parallel zur Hauptachse der Küvette an, um den Anregungslichtweg über das Gewebe während des Scannens zu minimieren.
- Befestigen Sie den maßgeschneiderten Stecker vorsichtig mit zwei Schrauben über der Innenküvette.
- Montieren Sie die Probe mit den Magneten auf dem Mikroskoptisch.
- Übersetzen Sie den vertikalen Probentisch manuell, um die interne Küvette in die externe einzutauchen.
- Schalten Sie die Anregungslichtquelle (Wellenlänge von 638 nm) ein und stellen Sie eine niedrige Leistung ein (in der Größenordnung von 3 mW).
- Bewegen Sie die Probe mit dem motorisierten Übersetzer, um eine innere Ebene des Gewebes zu beleuchten.
- Schalten Sie die Imaging-Software (HCImageLive) ein und stellen Sie den Kamera-Trigger auf External (Light-Sheet) - Modus ein, um den Erfassungstrigger der Kamera durch die benutzerdefinierte Software zu steuern, die das gesamte Setup steuert.
- Aktivieren Sie die automatische Speicherung im Bedienfeld " Scaneinstellungen " und legen Sie den Ausgabeordner fest, in dem die Bilder gespeichert werden sollen.
- Stellen Sie die Probenposition in der XY-Ebene manuell mit den linearen Übersetzern ein, um die Probe in die Mitte des FoV des Kamerasensors zu bewegen.
- Bewegen Sie die Probe mit dem linearen motorisierten Übersetzer entlang der Z-Achse, um Herzgrenzen für die tomographische Rekonstruktion zu identifizieren.
- Erhöhen Sie die Laserleistung auf ~20 mW, bereit für die Bildgebungssitzung.
- Starten Sie die tomographische Erfassung, klicken Sie auf die Schaltfläche Start im Sequence Panel der Imaging-Software und bewegen Sie gleichzeitig die Probe mit der konstanten Geschwindigkeit von 6 μm/s mit dem motorisierten Übersetzer entlang der Z-Achse.
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Representative Results
Das entwickelte passive Clearing-Setup ermöglicht es, in etwa 3 Monaten ein freies erwachsenes Mausherz (mit einer Dimension der Größenordnung von 10 mm x 6 mm x 6 mm) zu erhalten. Alle Komponenten des Setups sind wie in Abbildung 1 dargestellt montiert. Der vernachlässigbare Temperaturgradient zwischen den einzelnen Räumkammern (in der Größenordnung von 3 °C) ermöglicht es, die Temperatur in einem angemessenen Bereich über alle Kammern hinweg zu halten.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des passiven Clearing-Setups. Die Klärlösung zirkuliert (nach dem Filtrieren) nacheinander mit Hilfe der Schlauchpumpe durch die Probenkammern. Die Wartung des Lösungsbehälters in einem Wasserbad auf 50 °C ermöglicht es, dass die Lösungstemperatur innerhalb der Kammern zwischen 37-45 °C liegt. Bild erstellt mit Biorender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2 zeigt das Ergebnis des Klärungsprozesses eines ganzen Herzens. Wie bereits von Costantini et al.16 berichtet, verändert die Kombination der CLARITY-Methodik mit TDE als RI-Medium weder signifikant das Endvolumen der Probe noch führt sie zu einer anisotropen Verformung der Probe.
Abbildung 2: Repräsentatives Bild eines Herzens vor (links) und nach (rechts) dem CLARITY-Protokoll. Die Herzen werden vollständig transparent und leicht überdimensioniert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Sobald das Herz gereinigt war, wurden die Zellmembranen mit einer Alexa Fluor 633-konjugierten WGA angefärbt, um die Zytoarchitekturrekonstruktion des gesamten Organs durchzuführen. Das maßgeschneiderte Fluoreszenz-Lichtblattmikroskop (Abbildung 3) konnte eine Auflösung im 3D-Mikrometerbereich über das gesamte FoV sicherstellen.
Abbildung 3: MesoSPIM. CAD-Rendering des maßgefertigten Fluoreszenz-Lichtblattmikroskops. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Unter Berücksichtigung der numerischen Apertur (NA = 0,1) der Detektionsoptik kann die radiale (XY) Point Spread Function (PSF) des Systems in der Größenordnung von 4-5 μm geschätzt werden. Auf der anderen Seite erzeugt die Anregungsoptik eine Lichtfolie mit einer minimalen Taille von etwa 6 μm (Full width half maximum, FWHM), die am Rand des FoV bis zu 175 μm divergiert (Abbildung 4A-C). Die Synchronisation des Kamera-Rolling-Shutters mit dem axialen Scan des Laserstrahls stellte sicher, dass das Emissionssignal nur in dem Probenteil erfasst wurde, der mit der Taille des Lichtblatts angeregt wurde, was zu einer durchschnittlichen FWHM von etwa 6,7 μm entlang des gesamten FoV führte (Abbildung 4B-D).
Abbildung 4: Lichtblatterzeugung und Charakterisierung . (A) Ein mit einer Laserquelle von 638 nm erzeugtes Anregungslichtblatt wird auf das Zentrum des Sichtfeldes (FoV) fokussiert und mit einer Pixelgröße von 3,25 μm und einer Belichtungszeit von 10 ms aufgenommen. Die Lichtintensität wird normalisiert und mit einer Farbkarte angegeben. Das Full Width Half Maximum (FWHM) des Lichtintensitätsprofils wird in 15 verschiedenen Positionen entlang des FoV ausgewertet. Die Ergebnisse werden in C angezeigt. (B) Bild des Anregungslichtblatts, das durch die Synchronisation zwischen dem mit 1,92 Hz arbeitenden Rolling-Shutter der Kamera und der vom abstimmbaren Objektiv gesteuerten Lichtstrahlposition erzeugt wird. Die FWHM des Lichtintensitätsprofils wird entlang des FoV ausgewertet und die Ergebnisse in D dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Die Z-PSF des Mikroskops wurde ebenfalls durch eine tomographische Rekonstruktion der fluoreszierenden Nanokugel geschätzt (Abbildung 5). Ein FWHM von 6,4 μm kann durch die Passung geschätzt werden, in guter Übereinstimmung mit der vorherigen Bewertung.
Abbildung 5: Punktspreizfunktion in der Z-Achse. Die Point Spread Function (PSF) des optischen Systems wird durch die Abbildung fluoreszierender Nanosphären im Submikrometerbereich (angeregt mit einer Lichtschicht mit einer Wellenlänge von 638 nm) mit einer Pixelgröße von 3,25 μm × 3,25 μm × 2,0 μm geschätzt. Das PSF-Intensitätsprofil entlang der optischen Achse (Z) wird als schwarze Punkte dargestellt. Das PSF-Profil ist mit einer Gaußfunktion mit μ = 18,6 μm und σ = 2,7 μm ausgestattet. Die FWHM der PSF wird durch die Anpassung geschätzt 6,4 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Aufgrund der hohen Transparenz des Gewebes war es möglich, das gesamte Herz ohne nennenswerte Verzerrung der axial abgetasteten Lichtschicht bei einer Anregungswellenlänge von 638 nm zu beleuchten. Das Fluoreszenzsignal wurde vom sCMOS-Sensor erfasst, der mit einer Belichtungszeit von 500 ms und einer Bildrate von 1,92 Hz arbeitete. Basierend auf früheren Quantifizierungen wurde die tomographische Erfassung mit einer Z-Scangeschwindigkeit von 6 μm/s durchgeführt, und unter der Annahme einer Bildrate von 1,92 Hz wurde ein Bild alle 3,12 μm aufgenommen, wodurch das System Z-PSF um etwa das Doppelte überbewertet wurde. Zwei repräsentative Rahmen (auf koronaler und transversaler Ebene) der linken Ventrikelkammer sind in Abbildung 6 dargestellt. Dieses Ergebnis bestätigt das Potenzial des Systems, einzelne zelluläre Membranen in drei Dimensionen mit einem ausreichenden Signal-Rausch-Verhältnis im gesamten Organ aufzulösen (Abbildung 6).
Abbildung 6: Rekonstruktion des Herzgewebes der Maus. Das geklärte Herz wurde mit WGA angefärbt, das an Alexa Fluor 633 konjugiert war, und von einer Laserquelle mit einer Wellenlänge von 638 nm angeregt. (A) koronale und (B) quer verlaufende repräsentative Abschnitte. (C-D) Die Gewebetransformation erzeugt eine hohe Gewebetransparenz, die es ermöglicht, kleine Strukturen in der Wandtiefe aufzulösen. Das optische System zeigt eine axiale Auflösung, die ausreicht, um mikrometrische Strukturen aufzulösen (Panel. (E) 3D-Herzwiedergabe mit niedriger Auflösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
In dieser Arbeit wurde ein erfolgreicher Ansatz vorgestellt, um ein ganzes Mausherz in hoher Auflösung zu klären, zu färben und abzubilden. Zunächst wurde ein Gewebetransformationsprotokoll (CLARITY) optimiert und durchgeführt, leicht modifiziert für seine Anwendung auf das Herzgewebe. Um eine effiziente Rekonstruktion eines ganzen Herzens in 3D zu erhalten, ist es wichtig, das Phänomen der Lichtstreuung zu verhindern. Die CLARITY-Methodik ermöglicht es uns, ein hochtransparentes intaktes Herz zu erhalten, erfordert jedoch lange Inkubationszeiten, wenn sie passiv durchgeführt wird (ca. 5 Monate). In Bezug auf das Gehirn ist das Herzgewebe nicht für eine aktive Klärung geeignet, die ein elektrisches Feld ausnutzt. Schon bei niedrigen Spannungen führt das elektrische Feld zu Schäden und Gewebebrüchen. Hier wurde ein passiver Clearing-Ansatz optimiert, um in ca. 3 Monaten ein vollständig gereinigtes Herz zu erhalten. Nach der Isolierung und Kanülierung des Herzens durch die proximale Aorta wurde die CLARITY-Methodik wie in Abschnitt 3 des Protokolls beschrieben durchgeführt. Um das Verfahren zu beschleunigen, wurde ein hausgemachtes passives Clearing-Setup eingerichtet (Abbildung 1), das den Zeitpunkt der Gewebereinigung um etwa 40% verringerte. Der Aufbau besteht aus einem Behälter für die Reinigungslösung, einem Wasserbad, einer Schlauchpumpe, mehreren Kammern mit verschiedenen Probenhaltern, Kapselfiltern für jede Kammer und einem Schlauchsystem für die Rezirkulation der Lösung. Die Pumpe extrahiert und zirkuliert die Lösung nacheinander aus dem Behälter durch jede der Kammern, in denen die Proben zur Reinigung aufbewahrt werden. Vor dem Eintritt in die Kammern fließt die Lösung durch einen Kapselfilter, um die während der Reinigung aus dem Gewebe gespülten Lipide einzufangen. Die optimale Temperatur für die Reinigungslösung zwischen 37-45 °C wird während der Rezirkulation in den Kammern aufrechterhalten, indem der Lösungsbehälter in einem Wasserbad auf 50 °C gehalten wird. Es wird empfohlen, die Clearing-Lösung im Behälter einmal pro Woche während des Verfahrens zu wechseln. Alle verwendeten Komponenten sind in der Materialtabelle detailliert aufgeführt. Die hier vorgestellte optimierte Lösung ermöglicht es uns, ein ganzes passiv gereinigtes Mausherz in einer deutlich kürzeren Zeit im Vergleich zur passiven Standard-Clearing-Technik zu erhalten und so die erforderliche Versuchszeit zu reduzieren, ohne das Organ zu schädigen. Der Färbeansatz wurde auch für die homogene Markierung der Zellmembranen und des Endothels unter Verwendung eines fluoreszierenden Lektins (WGA - Alexa Fluor 633) optimiert.
Die Herzzytoarchitektur wurde durch die Entwicklung eines dedizierten MesoSPIM rekonstruiert, das das Lichtblatt axial über die Probe streicht (https://mesospim.org). Das speziell angefertigte Fluoreszenz-Lichtblattmikroskop (Abbildung 3) war in der Lage, schnell Bilder eines mesoskopischen FoV (in der Größenordnung von Millimetern) mit mikrometrischer Auflösung aufzunehmen. Auf diese Weise können einzelne Kardiomyozyten aufgelöst und in eine 3D-Rekonstruktion des gesamten Organs abgebildet werden. Das Mikroskop beleuchtet die gereinigte Probe mit einer Lichtfolie, die dynamisch durch Scannen eines Laserstrahls bei 638 nm mit einem galvanometrischen Spiegel erzeugt wird. Eine sCMOS-Kamera charakterisiert den Detektionsarm in einem 2-fachen Vergrößerungsschema, wodurch er das gesamte FoV in einem einzigen Scan erfassen kann. Das Fluoreszenzsignal wurde ausgewählt, indem ein Langpassfilter nach dem Objektiv platziert wurde. Die Kamera wurde so eingestellt, dass sie im Rolling-Shutter-Modus arbeitet: Zu jeder Zeit werden die Linien der aktiven Kamerapixel (d.h. dem Bild ausgesetzt) mit der Verschiebung des Brennbereichs des Lichtblatts in der Ebene synchronisiert, die von einem elektrisch abstimmbaren Objektiv ausgeführt wird. Dieser Ansatz maximierte die optische Schnittfähigkeit im gesamten FoV, indem nur Bilder im dünnsten Teil der fokussierten Lichtschicht aufgenommen wurden. Diese Lösung unterscheidet sich von herkömmlichen Konfigurationen, bei denen die Erfassung den gesamten Brennweitenbereich des Lichtblattes umfasst, wodurch eine maximale optische Schnittauflösung in einem großen Teil des FoV verhindert wird. Ein integrierter Probentisch unterstützt Küvetten, wodurch die Positionierung optimiert und die axiale Bewegung der Probe während des Bildgebungsprozesses ermöglicht wird. Auf diese Weise sind tomographische Rekonstruktionen durch die Erfassung aufeinanderfolgender Innenschnitte möglich. Die erhaltenen Bilder haben eine mesoskopische FoV und eine mikrometrische Auflösung, während die Aufnahmezeit für ein ganzes Mausherz ~ 15 min beträgt. Die Synchronisation zwischen dem Rolling-Shutter der Kamera und dem Anregungslichtstrahl, der das FoV durchzieht, ermöglicht es, die gesamte Bildebene mit hoher räumlicher Auflösung zu erfassen (Abbildung 4). Dies ermöglicht eine direkte Rekonstruktion der Probe in einer einzigen tomographischen Erfassung, ohne dass eine radiale Probenverschiebung und eine auf mehreren benachbarten Stapeln basierende Bildgebung erforderlich sind. Bemerkenswerterweise ermöglichte das Mikroskop die Rekonstruktion des gesamten Organs von etwa (10 mm x 6 mm x 6 mm) in einer einzigen Bildgebungssitzung, mit einer nahezu isotropen Voxelgröße und einem ausreichenden Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis, um einzelne Zellen über das gesamte Organ potenziell aufzulösen.
Es ist bemerkenswert, dass das vorgeschlagene Protokoll einige kritische Schritte enthält, die sorgfältig durchgeführt werden müssen, um gute Ergebnisse zu erzielen. Insbesondere die Kanülierung des Herzens durch die proximale Aorta kann ziemlich schwierig sein, aber es ist ein wesentlicher Schritt, das Organ richtig zu waschen und zu fixieren. Judd et al.17 zeigten, wie man diesen Schritt effektiv durchführt. Darüber hinaus ist das vom CLARITY-Protokoll erforderliche Entgasungsverfahren ebenfalls recht komplex, aber für die Gewebekonservierung unerlässlich. Wenn dieser Schritt nicht ordnungsgemäß durchgeführt wird, kann das Gewebe während der Inkubation in Clearing-Lösung beschädigt und zerfallen.
Obwohl der vorgestellte experimentelle Arbeitsablauf für kleine Fluoreszenzsonden geeignet ist, bietet der Einsatz der Immunhistochemie aufgrund des höheren Molekulargewichts der Antikörper nicht immer eine gute Effizienz bei der Färbung. Jedes Immunfärbungsprotokoll erfordert eine angemessene Optimierung, und es wurden verschiedene Ansätze entwickelt, um die Antikörperpenetration zu verbessern, z. B. Gewebeexpansion18 und/oder Schwankungen des pH-Werts und der Ionenstärke19.
Das mesoSPIM-Setup weist auch zwei Haupteinschränkungen auf: i) die Lichtblattkonservierung über die Probe hängt stark von der Gewebetransparenz ab und ii) die Abmessung des Kamerasensors begrenzt das FoV. Die Gewährleistung einer perfekten Brechungsindexanpassung im gesamten Herzen ist eine große Herausforderung, und kleine Variationen des Brechungsindex können zu Lichtstreuung führen, was zu einer Verschlechterung der Bildqualität führt. In dieser Hinsicht kann ein beidseitiges Beleuchtungsschema eingeführt werden. Zwei Anregungsarme können zwei unterschiedliche und ausgerichtete dynamische Lichtblätter mit maximal fokussierter Beleuchtung erzeugen, indem sie die Beleuchtung von einer Seite zur anderen der Probe abwechseln. Außerdem kann das FoV verbessert werden, indem eine neue Generation hochauflösender rückbeleuchteter sCMOS mit sehr großen Sensoren in Kombination mit telezentrischen Objektiven mit hoher numerischer Apertur und geringer Feldverzerrung verwendet wird. Diese Implementierung würde es uns ermöglichen, größere Organe oder expandiertes Gewebe unter Beibehaltung der gleichen optischen Schnittfähigkeit zu rekonstruieren und so 3D-Bilder von zentimetergroßen geklärten Proben im Mikrometerbereich zu erzeugen.
Obwohl das vorgestellte Protokoll noch viel Zeit für die Probenvorbereitung und ein hohes Maß an Transparenz benötigt, um eine zuverlässige Zytoarchitekturrekonstruktion des gesamten Organs zu erhalten, liegt die Hauptbedeutung des Ansatzes in den Verbesserungen des Clearing-Protokolls und der Fähigkeit, mesoskopische Rekonstruktionen in einem einzigen Scan mit mikrometrischer Auflösung durchzuführen. In Zukunft können diese Fortschritte mit einem Multi-Färbe-Protokoll kombiniert werden, um eine Ganzorganrekonstruktion zu erreichen, die verschiedene biologische Strukturen integriert.
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Disclosures
Nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Dieses Projekt erhielt Mittel aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 952166 (REPAIR), MUR im Rahmen des FISR-Programms, Projekt FISR2019_00320 und Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, PERCARE-Projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-2’ Thiodiethanol | Sigma-Aldrich | 166782 | |
| Acrylamide | Bio-Rad | 61-0140 | |
| AV-044 Initiator | Wako Chemicals | AVP5874 | |
| Bis-Acrylamide | Bio-Rad | 161-042 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Camera | Hamamatsu | Orca flash 4.0 v3 | |
| Camera software | Hamamatsu | HC Image | |
| Collimating lens | Thorlabs | AC254-050-A-ML | |
| Detection arm | Integrated optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Excitation lens | Nikon | 91863 | |
| Exteraìnal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-753 | |
| Fold mirrors | Thorlabs | BBE1-E02 | |
| Galvanometric mirror | Thorlabs | GVS211/M | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCImage Live | Hamamatsu | 4.6.1.19 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Internal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-204 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Laser source | Integrated Optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Long-pass filter | Thorlabs | FELH0650 | |
| Magnetic base | Thorlabs | KB25/M | |
| MgCl2 | Chem-Lab | CI-1316-0250 | |
| Motorized traslator | Physisk Instrument | M-122.2DD | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 59888 | |
| Objective | Thorlabs | TL2X-SAP | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Polycap AS | Whatman | 2606T | |
| Relay lens | Qioptiq | G063200000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Tube lens | Thorlabs | ACT508-200-A-ML | |
| Tunable lens | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger Inc | N86KT.18 | |
| Water bath | Memmert | WTB |
References
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