Summary
Riportiamo un metodo per la ricostruzione mesoscopica dell'intero cuore del topo combinando nuovi progressi nella trasformazione e colorazione dei tessuti con lo sviluppo di un microscopio a foglio di luce a scansione assiale.
Abstract
Sia le malattie cardiache genetiche che quelle non genetiche possono causare gravi processi di rimodellamento nel cuore. Il rimodellamento strutturale, come la deposizione di collagene (fibrosi) e il disallineamento cellulare, può influenzare la conduzione elettrica, introdurre disfunzioni elettromeccaniche e, infine, portare ad aritmia. Gli attuali modelli predittivi di queste alterazioni funzionali si basano su informazioni strutturali non integrate e a bassa risoluzione. Collocare questo quadro su un diverso ordine di grandezza è difficile a causa dell'inefficacia dei metodi di imaging standard nell'esecuzione di immagini ad alta risoluzione in tessuti massicci. In questo lavoro, descriviamo un quadro metodologico che consente l'imaging di interi cuori di topo con risoluzione micrometrica. Il raggiungimento di questo obiettivo ha richiesto uno sforzo tecnologico in cui sono stati combinati i progressi nella trasformazione dei tessuti e nei metodi di imaging. In primo luogo, descriviamo un protocollo CLARITY ottimizzato in grado di trasformare un cuore intatto in una forma nanoporosa, ibridata con idrogel e priva di lipidi che consente un'elevata trasparenza e una colorazione profonda. Quindi, viene descritto un microscopio a foglio di luce a fluorescenza in grado di acquisire rapidamente immagini di un campo visivo mesoscopico (scala mm) con la risoluzione su scala micron. A seguito del progetto mesoSPIM, il microscopio concepito permette la ricostruzione dell'intero cuore del topo con risoluzione micrometrica in un'unica scansione tomografica. Riteniamo che questo quadro metodologico consentirà di chiarire il coinvolgimento del disordine citoarchitettonico nelle disfunzioni elettriche e aprirà la strada a un modello completo che consideri sia i dati funzionali che strutturali, consentendo così un'indagine unificata delle cause strutturali che portano ad alterazioni elettriche e meccaniche dopo il rimodellamento tissutale.
Introduction
Il rimodellamento strutturale associato a malattie cardiache può influenzare la conduzione elettrica e introdurre disfunzioni elettromeccaniche dell'organo 1,2. Gli attuali approcci utilizzati per prevedere le alterazioni funzionali impiegano comunemente MRI e DT-MRI per ottenere una ricostruzione complessiva della deposizione di fibrosi, dell'albero vascolare e della distribuzione delle fibre del cuore e sono utilizzati per modellare percorsi di propagazione del potenziale di azione preferenziale (APP) attraverso l'organo 3,4. Queste strategie possono fornire una bella panoramica dell'organizzazione del cuore. Tuttavia, la loro risoluzione spaziale è insufficiente per studiare l'impatto del rimodellamento strutturale sulla funzione cardiaca a livello cellulare.
Collocare questo quadro a un diverso ordine di grandezza, in cui le singole cellule possono svolgere ruoli individuali sulla propagazione del potenziale d'azione, è impegnativo. La limitazione principale è l'inefficienza dei metodi di imaging standard per eseguire immagini ad alta risoluzione (risoluzione micrometrica) in tessuti massicci (centimetrici). In effetti, l'imaging dei tessuti biologici in 3D ad alta risoluzione è molto complicato a causa dell'opacità dei tessuti. L'approccio più comune per eseguire ricostruzioni 3D in interi organi è quello di preparare sezioni sottili. Tuttavia, il sezionamento, l'assemblaggio e l'imaging precisi richiedono uno sforzo e un tempo significativi. Un approccio alternativo che non richiede il taglio del campione è quello di generare un tessuto trasparente. Negli ultimi anni sono state proposte diverse metodologie per la chiarificazione dei tessuti 5,6,7,8. La sfida di produrre tessuti massicci, trasparenti e marcati con fluorescenza è stata recentemente raggiunta sviluppando veri approcci di trasformazione tissutale (CLARITY9, SHIELD10). In particolare, il metodo CLARITY si basa sulla trasformazione di un tessuto intatto in una forma nanoporosa, ibridata con idrogel, priva di lipidi che consente di conferire un'elevata trasparenza mediante la rimozione selettiva dei doppi strati lipidici di membrana. In particolare, questo metodo è stato trovato efficace anche nella preparazione cardiaca11,12,13,14. Tuttavia, poiché il cuore è troppo fragile per essere adatto a una compensazione attiva, deve essere eliminato utilizzando l'approccio passivo, che richiede molto tempo per conferire completa trasparenza.
In combinazione con tecniche di imaging avanzate come la microscopia a foglio di luce, CLARITY ha il potenziale per visualizzare tessuti cardiaci massicci 3D a risoluzione micrometrica. Nella microscopia a foglio di luce, l'illuminazione del campione viene eseguita con un sottile foglio di luce confinato nel piano focale dell'obiettivo di rilevamento. L'emissione di fluorescenza viene raccolta lungo un asse perpendicolare al piano di illuminazione15. L'architettura di rilevamento è simile alla microscopia a campo largo, rendendo l'acquisizione molto più veloce rispetto ai microscopi a scansione laser. Lo spostamento del campione attraverso il foglio luminoso consente di ottenere una tomografia completa di campioni di grandi dimensioni, fino a campioni di dimensioni centimetriche. Tuttavia, a causa delle proprietà intrinseche del fascio gaussiano è possibile ottenere un foglio di luce molto sottile (dell'ordine di pochi micron) solo per una limitata estensione spaziale, limitando così drasticamente il campo visivo (FoV). Recentemente, è stato introdotto un nuovo schema di eccitazione per superare questa limitazione e applicato per l'imaging cerebrale, consentendo ricostruzioni 3d con risoluzione isotropa16.
In questo documento, viene presentato un approccio di compensazione passiva, che consente una significativa riduzione dei tempi di compensazione necessari per il protocollo CLARITY. Il quadro metodologico qui descritto permette di ricostruire un cuore intero di topo con risoluzione micrometrica in un'unica scansione tomografica con un tempo di acquisizione nell'ordine dei minuti.
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Protocol
Tutte le manipolazioni e le procedure degli animali sono state eseguite in conformità con le linee guida della Direttiva 2010/63 / UE del Parlamento europeo sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici e conformi ai principi e ai regolamenti del Ministero della Salute italiano. Il protocollo sperimentale è stato approvato dal Ministero della Salute italiano (numero di protocollo 647/2015-PR). Tutti gli animali sono stati forniti da ENVIGO, Italia. Per questi esperimenti, sono stati utilizzati 5 topi maschi C57BL / 6J di 6 mesi di età.
1. Preparazione della soluzione
- Preparare il 4% di paraformaldeide (PFA) in soluzione salina tamponata fosfato (PBS) (pH 7,6) in una cappa chimica. Conservare le aliquote di PFA al 4% a -20 °C per diversi mesi.
- Preparare la soluzione di idrogel: mescolare 4% acrilammide, 0,05% bis-acrilammide, 0,25% iniziatore AV-044 in 0,01 M PBS in una cappa chimica. Mantenere i reagenti e la soluzione su ghiaccio durante l'intera preparazione. Conservare le aliquote di idrogel a -20 °C per diversi mesi.
- Preparare la soluzione di pulizia: Mescolare 200 mM di acido borico, 4% di sodio dodecil-solfato (SDS) in acqua deionizzata; pH 8,6 in una cappa chimica. Conservare la soluzione tra 21-37 °C per evitare la precipitazione di SDS.
- Preparare la soluzione fresca di Tyrode il giorno dell'esperimento: aggiungere 10 mM di glucosio, 10 mM di HEPES, 113 mM di NaCl, 1,2 mM di MgCl2 e 4,7 mM di KCl; titolare a pH 7,4 utilizzando 1 M NaOH.
2. Isolamento cardiaco
- Iniettare 0,1 ml di 500 U.I. eparina per via sottocutanea 30 minuti prima della procedura di isolamento cardiaco.
- Riempire una siringa da 30 ml e tre piastre di Petri da 6 cm con una soluzione fresca di Tyrode. Fai una piccola spaccatura (3-4 mm di profondità) sul bordo di una delle piastre di Petri e mettila sotto un microscopio stereoscopico.
- Fissare una cannula di 1 mm di diametro alla siringa e inserirla nella spaccatura della capsula di Petri. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nella siringa.
- Riempire una siringa da 20 mL con PFA al 4% e tenerla nel cappuccio chimico. Preparare una capsula di Petri vuota sotto il cofano.
- Anestetizzare il topo con il 3% di isoflurano/ossigeno ad una portata di 1,0 L/min e sacrificarlo per lussazione cervicale secondo le norme vigenti in materia di benessere animale.
- Dopo il sacrificio, rimuovere la pelliccia sul petto e aprire il petto per avere pieno accesso al cuore.
- Isolare il cuore, immergerlo nella capsula di Petri precedentemente riempita con 50 ml di soluzione di Tyrode. Utilizzare forbici chirurgiche per tagliare l'aorta immediatamente vicino all'arco aortico per avere il cuore esposto.
- Trasferire il cuore al microscopio stereoscopico ed eseguire con attenzione l'incannulamento. Non inserire la cannula troppo in profondità nell'aorta (non più di 2 mm) per evitare danni ai tessuti.
- Utilizzare un piccolo morsetto e una sutura (taglia 5/0) per fissare il cuore alla cannula.
- Perfondere il cuore con 30 mL della soluzione di Tyrode con una pressione costante di 10 mL/min per rimuovere il sangue dai vasi.
- Staccare la cannula dalla siringa e posizionare il cuore nella capsula di Petri riempita con la soluzione di Tyrode. Fare attenzione a non avere bolle d'aria nella cannula; In caso contrario, rimuovere correttamente le bolle d'aria.
- Attaccare la siringa da 20 mL riempita con PFA freddo al 4% alla cannula e perfondere il cuore alla stessa pressione costante.
- Incubare il cuore in 10 mL di PFA al 4% a 4 °C durante la notte (O/N). Per evitare la degradazione dei tessuti, eseguire i passaggi 2.6-2.13 nel più breve tempo possibile.
3. Pulizia del cuore
- Il giorno seguente, lavare il cuore in 0,01 M PBS 3 volte a 4 °C per 15 min.
NOTA: Dopo questo passaggio, il cuore può essere conservato in PBS + 0,01% di azoturo di sodio (NaN3) a 4 °C per diversi mesi. - Incubare il cuore in 30 mL di soluzione di idrogel agitando (15 rpm) a 4 °C per 3 giorni.
- Degasare il campione a temperatura ambiente utilizzando un essiccatore, una pompa per vuoto e un sistema di tubi che collega l'essiccatore sia alla pompa che a una tubazione di azoto.
- Posizionare il campione nell'essiccatore e aprire il flaconcino, mantenendo il tappo su di esso.
- Chiudere l'essiccatore e rimuovere l'ossigeno dal tubo aprendo la tubazione dell'azoto.
- Accendere la pompa per vuoto per rimuovere l'ossigeno dall'essiccatore per 10 minuti.
- Spegnere la pompa e utilizzare la manopola dell'essiccatore per aprire la tubazione dell'azoto. Una volta che la pressione è uguale alla pressione atmosferica, aprire con attenzione l'essiccatore e chiudere rapidamente il flaconcino.
- Mantenere il cuore nella soluzione di idrogel degassata a 37 °C per 3 ore a riposo.
- Quando l'idrogel è correttamente polimerizzato e appare interamente gelatinoso, rimuovere con cura il cuore da esso e metterlo nel supporto del campione.
- Inserire il portacampioni con il cuore in una delle camere di compensazione e chiuderlo correttamente per evitare perdite della soluzione di pulizia.
- Accendere il bagno d'acqua in cui è posizionato il contenitore della soluzione di compensazione e la pompa peristaltica per avviare il ricircolo della soluzione di pulizia.
- Cambiare la soluzione di compensazione nel contenitore una volta alla settimana per accelerare la procedura di chiarificazione.
4. Colorazione della membrana cellulare
- Una volta che il cuore appare completamente chiarificato, rimuoverlo dal portacampioni e lavarlo in 50 ml di PBS riscaldato per 24 ore. Lavare nuovamente in 50 mL di PBS + 1% di Triton-X (PBS-T 1x) per 24 h.
- Incubare il campione in 0,01 mg/mL di Agglutinina del Germe di Grano (WGA) - Alexa Fluor 633 in 3 mL di PBS-T 1x in agitazione (50 rpm) a temperatura ambiente per 7 giorni.
- Dopo l'incubazione di 7 giorni, lavare il campione in 50 ml di PBS-T 1x a temperatura ambiente agitando per 24 ore.
- Incubare il campione in PFA al 4% per 15 minuti e quindi lavarlo 3 volte in PBS per 5 minuti ciascuno.
NOTA: Dopo questo passaggio, il cuore può essere conservato in PBS + 0,01% NaN3 a 4 °C per diversi mesi. - Incubare il cuore in concentrazioni crescenti di 2,2′-tiodietanolo (TDE) in 0,01 M PBS (20% e 47% TDE/PBS) per 8 ore ciascuna, fino alla concentrazione finale del 68% TDE in 0,01 M PBS per fornire l'indice di rifrazione richiesto (RI = 1,46). Questo è il mezzo corrispondente RI (RI-medium) per acquisire immagini16.
5. Montaggio e acquisizione del cuore
NOTA: Tutti i componenti del sistema ottico sono elencati in dettaglio nella tabella dei materiali.
- Riempire delicatamente circa l'80% della cuvetta esterna (quarzo, 45 mm × 45 mm × 42,5 mm) con il mezzo RI.
NOTA: Qui è possibile utilizzare diverse soluzioni non volatili che garantiscono un RI di 1,46. - Riempire delicatamente la cuvetta interna (quarzo, 45 mm × 12,5 mm × 12,5 mm) con lo stesso mezzo RI.
- Immergere il campione all'interno della cuvetta interna. Le incubazioni del campione sopra descritte consentono al campione di rimanere stabile all'interno del mezzo IR senza essere trattenuto.
- Spostare delicatamente il campione sul fondo della cuvetta usando una pinzetta sottile e disporre il cuore con il suo asse longitudinale parallelo all'asse principale della cuvetta per ridurre al minimo il percorso della luce di eccitazione attraverso il tessuto durante la scansione.
- Fissare delicatamente il tappo su misura sopra la cuvetta interna con due viti.
- Montare il campione sullo stadio del microscopio utilizzando i magneti.
- Traslare manualmente lo stadio di campionamento verticale per immergere la cuvetta interna in quella esterna.
- Accendere la sorgente luminosa di eccitazione (lunghezza d'onda di 638 nm), impostando una potenza bassa (nell'ordine di 3 mW).
- Spostare il campione utilizzando il traduttore motorizzato per illuminare un piano interno del tessuto.
- Accendere il software di imaging (HCImageLive) e impostare il trigger della telecamera sulla modalità esterna (foglio luminoso) per pilotare il trigger di acquisizione della telecamera dal software personalizzato che controlla l'intera configurazione.
- Abilita il salvataggio automatico nel pannello Impostazioni scansione e imposta la cartella di output in cui devono essere salvate le immagini.
- Regolare manualmente la posizione del campione nel piano XY con i traslatori lineari per spostare il campione al centro del FoV del sensore della fotocamera.
- Spostare il campione lungo l'asse Z utilizzando il traslatore motorizzato lineare per identificare i bordi del cuore per la ricostruzione tomografica.
- Aumentare la potenza del laser a ~20 mW, pronto per la sessione di imaging.
- Avviare l'acquisizione tomografica, fare clic sul pulsante Start nel pannello Sequenza del software di imaging e contemporaneamente spostare il campione lungo l'asse Z alla velocità costante di 6 μm/s utilizzando il traduttore motorizzato.
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Representative Results
La configurazione di compensazione passiva sviluppata consente di ottenere un cuore di topo adulto cancellato (con una dimensione dell'ordine 10 mm x 6 mm x 6 mm) in circa 3 mesi. Tutti i componenti della configurazione sono montati come illustrato nella Figura 1. Il gradiente di temperatura trascurabile tra ciascuna camera di compensazione (dell'ordine di 3 °C) consente di mantenere la temperatura in un intervallo adeguato in tutte le camere.
Figura 1: Schema della configurazione di compensazione passiva. La soluzione di compensazione (dopo essere stata filtrata) circola in successione attraverso le camere del campione con l'aiuto della pompa peristaltica. Il mantenimento del contenitore della soluzione in bagnomaria impostato a 50 °C consente di raggiungere la temperatura della soluzione tra 37-45 °C all'interno delle camere. Immagine creata con Biorender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
La figura 2 mostra il risultato del processo di purificazione di un intero cuore. Come già riportato da Costantini et al.16, la combinazione della metodologia CLARITY con TDE come mezzo RI non modifica significativamente il volume finale del campione né porta alla deformazione anisotropa del campione.
Figura 2: Immagine rappresentativa di un cuore prima (a sinistra) e dopo (a destra) del protocollo CLARITY. I cuori diventano completamente trasparenti e leggermente sovradimensionati. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Una volta che il cuore è stato liberato, le membrane cellulari sono state colorate con un WGA coniugato con Alexa Fluor 633 per eseguire la ricostruzione citoarchitettonica dell'intero organo. Il microscopio a foglio di luce a fluorescenza personalizzato (Figura 3) è stato in grado di garantire una risoluzione su scala micron 3D su tutto il FoV.
Figura 3: MesoSPIM. Rendering CAD del microscopio a foglio di luce a fluorescenza su misura. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Considerando l'apertura numerica (NA = 0,1) dell'ottica di rilevamento, la funzione di diffusione del punto (PSF) radiale (XY) del sistema può essere stimata nell'ordine di 4-5 μm. D'altra parte, l'ottica di eccitazione produce un foglio leggero con una vita minima di circa 6 μm (Full width half maximum, FWHM) che diverge fino a 175 μm sul bordo del FoV (Figura 4A-C). La sincronizzazione del rolling shutter della telecamera con la scansione assiale del raggio laser ha assicurato di raccogliere il segnale di emissione solo nella porzione di campione eccitata con la vita del foglio luminoso, risultando in un FWHM medio di circa 6,7 μm lungo l'intero FoV (Figura 4B-D).
Figura 4: Generazione e caratterizzazione del foglio luminoso. (A) Un foglio luminoso di eccitazione generato con una sorgente laser di 638 nm è focalizzato sul centro del campo visivo (FoV) e acquisito con una dimensione dei pixel di 3,25 μm e un tempo di esposizione di 10 ms. L'intensità della luce viene normalizzata e riportata con una mappa dei colori. Il Full Width Half Maximum (FWHM) del profilo di intensità luminosa viene valutato in 15 diverse posizioni lungo il FoV. I risultati sono mostrati in C. (B) Immagine del foglio luminoso di eccitazione generato dalla sincronizzazione tra l'otturatore della fotocamera operante a 1,92 Hz e la posizione del fascio luminoso guidato dalla lente sintonizzabile. L'FWHM del profilo di intensità luminosa viene valutato lungo il FoV e i risultati sono mostrati in D. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Lo Z-PSF del microscopio è stato stimato anche da una ricostruzione tomografica della nanosfera fluorescente (Figura 5). Un FWHM di 6,4 μm può essere stimato dal fit, in buon accordo con la valutazione precedente.
Figura 5: Funzione di diffusione puntuale sull'asse Z. La funzione di diffusione puntuale (PSF) del sistema ottico viene stimata mediante l'imaging di nanosfere fluorescenti su scala sub-micron (eccitate con un foglio luminoso con una lunghezza d'onda di 638 nm) con una dimensione dei pixel di 3,25 μm × 3,25 μm × 2,0 μm. Il profilo di intensità PSF lungo l'asse ottico (Z) è rappresentato come punti neri. Il profilo PSF è dotato di una funzione gaussiana con μ = 18,6 μm e σ = 2,7 μm. L'FWHM della FPF stimato dall'accoppiamento è di 6,4 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Grazie all'elevata trasparenza del tessuto, è stato possibile illuminare l'intero cuore senza distorsioni significative del foglio luminoso scansionato assialmente ad una lunghezza d'onda di eccitazione di 638 nm. Il segnale di fluorescenza è stato raccolto dal sensore sCMOS operante a 500 ms di tempo di esposizione e un frame rate di 1,92 Hz. Sulla base della quantificazione precedente, l'acquisizione tomografica è stata eseguita utilizzando una velocità di scansione Z di 6 μm/s e, assumendo un frame rate di 1,92 Hz, è stato acquisito un fotogramma ogni 3,12 μm, sovracampionando il sistema Z-PSF di circa due volte. Due fotogrammi rappresentativi (sui piani coronale e trasversale) della camera ventricolare sinistra sono mostrati in Figura 6. Questo risultato conferma la potenzialità del sistema di risolvere singole membrane cellulari in tre dimensioni con un rapporto segnale/rumore sufficiente nell'intero organo (Figura 6).
Figura 6: Ricostruzione del tessuto cardiaco del topo. Il cuore chiarificato è stato colorato con WGA coniugato ad Alexa Fluor 633 ed eccitato da una sorgente laser con una lunghezza d'onda di 638 nm. (A) Sezioni rappresentative coronali e (B) trasversali. (C-D) La trasformazione del tessuto produce un'elevata trasparenza del tessuto, consentendo di risolvere piccole strutture nella profondità della parete. Il sistema ottico mostra una risoluzione assiale sufficiente a risolvere strutture micrometriche (pannello. D). (E) Rendering cardiaco 3D a bassa risoluzione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
In questo lavoro, è stato introdotto un approccio di successo per chiarire, colorare e visualizzare un intero cuore di topo ad alta risoluzione. In primo luogo, è stato ottimizzato ed eseguito un protocollo di trasformazione tissutale (CLARITY), leggermente modificato per la sua applicazione sul tessuto cardiaco. Infatti, per ottenere un'efficace ricostruzione in 3D di un cuore intero, è fondamentale prevenire il fenomeno della diffusione della luce. La metodologia CLARITY ci permette di ottenere un cuore intatto altamente trasparente, ma richiede lunghi tempi di incubazione se eseguita passivamente (circa 5 mesi). Per quanto riguarda il cervello, il tessuto cardiaco non è adatto per una compensazione attiva, che sfrutta un campo elettrico. Anche a basse tensioni, il campo elettrico porta a danni e rotture dei tessuti. Qui, un approccio di compensazione passiva è stato ottimizzato per ottenere un cuore completamente purificato in circa 3 mesi. Dopo aver isolato e incannulato il cuore attraverso l'aorta prossimale, è stata eseguita la metodologia CLARITY come descritto nella sezione 3 del protocollo. Per accelerare la procedura, è stata organizzata una configurazione di compensazione passiva fatta in casa (Figura 1), che ha finito per ridurre i tempi di eliminazione dei tessuti di circa il 40%. La configurazione è composta da un contenitore per la soluzione di pulizia, un bagno d'acqua, una pompa peristaltica, diverse camere contenenti diversi portacampioni, filtri a capsula per ogni camera e un sistema di tubi per il ricircolo della soluzione. La pompa estrae e fa circolare la soluzione dal contenitore in successione attraverso ciascuna delle camere, dove i campioni sono tenuti per la pulizia. Prima di entrare nelle camere, la soluzione scorre attraverso un filtro a capsula per intrappolare i lipidi lavati via dai tessuti durante la pulizia. La temperatura ottimale per la soluzione limpida, compresa tra 37-45 °C, viene mantenuta all'interno delle camere durante il ricircolo mantenendo il contenitore della soluzione a bagnomaria a 50 °C. Si consiglia di cambiare la soluzione di compensazione nel contenitore una volta alla settimana durante la procedura. Tutti i componenti utilizzati sono elencati in dettaglio nella tabella dei materiali. La soluzione ottimizzata qui presentata ci consente di ottenere un intero cuore di topo passivamente eliminato in un tempo significativamente più breve rispetto alla tecnica di compensazione passiva standard, riducendo così il tempo sperimentale richiesto senza danneggiare l'organo. L'approccio di colorazione è stato ottimizzato anche per la marcatura omogenea delle membrane cellulari e dell'endotelio, utilizzando una lectina fluorescente (WGA - Alexa Fluor 633).
La citoarchitettura cardiaca è stata ricostruita sviluppando un mesoSPIM dedicato che spazza assialmente il foglio luminoso attraverso il campione (https://mesospim.org). Il microscopio a foglio di luce a fluorescenza personalizzato (Figura 3) è stato in grado di acquisire rapidamente immagini di un FoV mesoscopico (dell'ordine di millimetri) con risoluzione micrometrica. In questo modo, i singoli cardiomiociti possono essere risolti e mappati in una ricostruzione 3D dell'intero organo. Il microscopio illumina il campione cancellato con un foglio luminoso, generato dinamicamente dalla scansione di un raggio laser a 638 nm utilizzando uno specchio galvanometrico. Una telecamera sCMOS caratterizza il braccio di rilevamento in uno schema di ingrandimento 2x che consente di acquisire l'intero FoV in una singola scansione. Il segnale di fluorescenza è stato selezionato posizionando un filtro passa-lungo dopo l'obiettivo. La fotocamera è stata impostata per funzionare in modalità rolling shutter: in qualsiasi momento, le linee dei pixel attivi della fotocamera (cioè esposte all'immagine) sono sincronizzate con lo spostamento nel piano della banda focale del foglio luminoso, eseguito da una lente sintonizzabile elettricamente. Questo approccio ha massimizzato la capacità di sezionamento ottico nell'intero FoV acquisendo immagini solo nella parte più sottile del foglio luminoso focalizzato. Questa soluzione differisce dalle configurazioni convenzionali, in cui l'acquisizione coinvolge l'intera gamma di profondità focale del foglio luminoso, impedendo la risoluzione di sezionamento ottico di picco in gran parte del FoV. Uno stadio di campionamento integrato supporta le cuvette, ottimizzando così il posizionamento e consentendo il movimento assiale del campione durante il processo di imaging. In questo modo sono possibili ricostruzioni tomografiche acquisendo sezioni interne consecutive. Le immagini ottenute hanno un FoV mesoscopico e una risoluzione micrometrica, mentre il tempo di acquisizione richiesto per un cuore di topo intero è ~ 15 min. La sincronizzazione tra il rolling shutter della telecamera e il fascio di luce di eccitazione che spazza il FoV consente di acquisire l'intero piano dell'immagine con un'elevata risoluzione spaziale (Figura 4). Ciò consente la ricostruzione diretta del campione in una singola acquisizione tomografica, senza la necessità di spostamento radiale del campione e imaging basato su pile adiacenti. In particolare, il microscopio ha permesso la ricostruzione dell'intero organo di circa (10 mm x 6 mm x 6 mm) in una singola sessione di imaging, con una dimensione del voxel quasi isotropa e un rapporto segnale-sfondo sufficiente per risolvere potenzialmente singole cellule in tutto l'organo.
È interessante notare che il protocollo proposto presenta alcuni passaggi critici che devono essere eseguiti con attenzione per ottenere buoni risultati. In particolare, l'incannulamento del cuore attraverso l'aorta prossimale può essere abbastanza difficile, ma è un passaggio essenziale per lavare e fissare correttamente l'organo. Judd et al.17, hanno mostrato come eseguire questo passaggio in modo efficace. Inoltre, anche la procedura di degasaggio necessaria al protocollo CLARITY è piuttosto complessa, ma è essenziale per la conservazione dei tessuti; Se questo passaggio non viene eseguito correttamente, il tessuto potrebbe incontrare danni e decadimento durante l'incubazione nella soluzione di clearing.
Inoltre, sebbene il flusso di lavoro sperimentale presentato sia adatto per piccole sonde fluorescenti, l'uso dell'immunoistochimica non sempre fornisce una buona efficienza nella colorazione a causa del peso molecolare più elevato degli anticorpi. Ogni protocollo di immunocolorazione richiede una corretta ottimizzazione e sono stati concepiti diversi approcci per migliorare la penetrazione degli anticorpi, ad esempio l'espansione tissutale18 e/o le variazioni del pH e della forza ionica19.
La configurazione mesoSPIM presenta anche due limitazioni principali: i) la conservazione del foglio luminoso su tutto il campione dipende fortemente dalla trasparenza del tessuto e ii) la dimensione del sensore della telecamera limita il FoV. Garantire una perfetta corrispondenza dell'indice di rifrazione all'interno dell'intero cuore è molto impegnativo e piccole variazioni sull'indice di rifrazione possono produrre diffusione della luce, portando al degrado della qualità dell'immagine. A questo proposito, è possibile introdurre uno schema di illuminazione a doppio lato. Due bracci di eccitazione possono generare due fogli di luce dinamici distinti e allineati con illuminazione massimamente focalizzata alternando l'illuminazione da un lato all'altro del campione. Inoltre, il FoV può essere migliorato utilizzando una nuova generazione di sCMOS retroilluminato ad alta risoluzione con sensori molto grandi in combinazione con obiettivi telecentrici ad alta apertura numerica con bassa distorsione di campo. Questa implementazione ci consentirebbe di ricostruire organi più grandi o tessuti espansi mantenendo la stessa capacità di sezione ottica e producendo così immagini 3D su scala micron di campioni cancellati di dimensioni centimetriche.
Sebbene il protocollo presentato richieda ancora molto tempo per la preparazione del campione e un alto livello di trasparenza per ottenere una ricostruzione citoarchitettonica affidabile dell'intero organo, il significato principale dell'approccio risiede nei miglioramenti del protocollo di clearing e nella capacità di eseguire la ricostruzione mesoscopica in un'unica scansione a risoluzione micrometrica. In futuro, questi progressi possono essere combinati con un protocollo multi-colorazione per ottenere la ricostruzione dell'intero organo integrando diverse strutture biologiche.
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Disclosures
Niente da divulgare.
Acknowledgments
Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea nell'ambito della convenzione di sovvenzione n. 952166 (REPAIR), MUR nell'ambito del programma FISR, progetto FISR2019_00320 e Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, progetto PERCARE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-2’ Thiodiethanol | Sigma-Aldrich | 166782 | |
| Acrylamide | Bio-Rad | 61-0140 | |
| AV-044 Initiator | Wako Chemicals | AVP5874 | |
| Bis-Acrylamide | Bio-Rad | 161-042 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Camera | Hamamatsu | Orca flash 4.0 v3 | |
| Camera software | Hamamatsu | HC Image | |
| Collimating lens | Thorlabs | AC254-050-A-ML | |
| Detection arm | Integrated optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Excitation lens | Nikon | 91863 | |
| Exteraìnal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-753 | |
| Fold mirrors | Thorlabs | BBE1-E02 | |
| Galvanometric mirror | Thorlabs | GVS211/M | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCImage Live | Hamamatsu | 4.6.1.19 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Internal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-204 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Laser source | Integrated Optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Long-pass filter | Thorlabs | FELH0650 | |
| Magnetic base | Thorlabs | KB25/M | |
| MgCl2 | Chem-Lab | CI-1316-0250 | |
| Motorized traslator | Physisk Instrument | M-122.2DD | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 59888 | |
| Objective | Thorlabs | TL2X-SAP | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Polycap AS | Whatman | 2606T | |
| Relay lens | Qioptiq | G063200000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Tube lens | Thorlabs | ACT508-200-A-ML | |
| Tunable lens | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger Inc | N86KT.18 | |
| Water bath | Memmert | WTB |
References
- Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling. Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).
- Finocchiaro, G., et al. Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death. EP Europace. 2, 1-11 (2021).
- Bishop, M. J., et al. Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).
- Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation. IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106, 369-387 (2020).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Park, Y. G., et al. Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers. Nature Biotechnology. 37, 73 (2019).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769 (2018).
- Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).
- Pianca, N., et al. Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery. The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).
- Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).
- Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative - open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5, 9808 (2015).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012 (2016).
- Yi, F., et al. Microvessel prediction in H&E stained pathology images using fully convolutional neural networks. BMC Bioinformatics. 19 (1), 64 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1982 (2020).
