Summary
Presentamos un método para la reconstrucción mesoscópica de todo el corazón del ratón mediante la combinación de nuevos avances en la transformación de tejidos y la tinción con el desarrollo de un microscopio de hoja de luz escaneado axialmente.
Abstract
Tanto las enfermedades cardíacas genéticas como las no genéticas pueden causar procesos de remodelación severos en el corazón. La remodelación estructural, como la deposición de colágeno (fibrosis) y la desalineación celular, puede afectar la conducción eléctrica, introducir disfunciones electromecánicas y, eventualmente, conducir a arritmias. Los modelos predictivos actuales de estas alteraciones funcionales se basan en información estructural no integrada y de baja resolución. Colocar este marco en un orden de magnitud diferente es un desafío debido a la ineficacia de los métodos de imagen estándar para realizar imágenes de alta resolución en tejido masivo. En este trabajo, describimos un marco metodológico que permite obtener imágenes de corazones de ratón enteros con resolución micrométrica. La consecución de este objetivo ha requerido un esfuerzo tecnológico donde se han combinado los avances en la transformación de tejidos y los métodos de imagen. Primero, describimos un protocolo CLARITY optimizado capaz de transformar un corazón intacto en una forma nanoporosa, hibridada con hidrogel, libre de lípidos que permite una alta transparencia y tinción profunda. Luego, se describe un microscopio de lámina de luz fluorescente capaz de adquirir rápidamente imágenes de un campo de visión mesoscópico (escala mm) con la resolución a escala micrométrica. Siguiendo el proyecto mesoSPIM, el microscopio concebido permite la reconstrucción de todo el corazón del ratón con resolución micrométrica en un solo escaneo tomográfico. Creemos que este marco metodológico permitirá aclarar la participación del desorden citoarquitectónico en las disfunciones eléctricas y allanar el camino para un modelo integral que considere tanto los datos funcionales como los estructurales, permitiendo así una investigación unificada de las causas estructurales que conducen a alteraciones eléctricas y mecánicas después de la remodelación tisular.
Introduction
La remodelación estructural asociada a enfermedades cardíacas puede afectar la conducción eléctrica e introducir disfunciones electromecánicas del órgano 1,2. Los enfoques actuales utilizados para predecir alteraciones funcionales comúnmente emplean MRI y DT-MRI para obtener una reconstrucción general de la deposición de fibrosis, el árbol vascular y la distribución de fibras del corazón, y se utilizan para modelar las rutas de propagación del potencial de acción preferencial (APP) a través del órgano 3,4. Estas estrategias pueden proporcionar una hermosa visión general de la organización del corazón. Sin embargo, su resolución espacial es insuficiente para investigar el impacto de la remodelación estructural en la función cardíaca a nivel celular.
Colocar este marco en un orden de magnitud diferente, donde las células individuales pueden desempeñar papeles individuales en la propagación del potencial de acción, es un desafío. La principal limitación es la ineficiencia de los métodos de imagen estándar para realizar imágenes de alta resolución (resolución micrométrica) en tejidos masivos (de tamaño centímetro). De hecho, la obtención de imágenes de tejidos biológicos en 3D a alta resolución es muy complicada debido a la opacidad del tejido. El enfoque más común para realizar reconstrucciones 3D en órganos enteros es preparar secciones delgadas. Sin embargo, la sección precisa, el ensamblaje y las imágenes requieren un esfuerzo y tiempo significativos. Un enfoque alternativo que no exige cortar la muestra es generar un tejido transparente. Durante los últimos años, se han propuesto varias metodologías para clarificar tejidos 5,6,7,8. El desafío de producir tejidos masivos, transparentes y marcados con fluorescencia se ha logrado recientemente mediante el desarrollo de verdaderos enfoques de transformación de tejidos (CLARITY9, SHIELD10). En particular, el método CLARITY se basa en la transformación de un tejido intacto en una forma nanoporosa, hibridada con hidrogel, libre de lípidos que permite conferir una alta transparencia mediante la eliminación selectiva de bicapas lipídicas de membrana. Cabe destacar que este método ha sido encontrado exitoso también en la preparación cardíaca11,12,13,14. Sin embargo, dado que el corazón es demasiado frágil para ser adecuado para una limpieza activa, debe limpiarse utilizando el enfoque pasivo, que requiere mucho tiempo para conferir una transparencia completa.
En combinación con técnicas avanzadas de imagen como la microscopía de hoja de luz, CLARITY tiene el potencial de obtener imágenes de tejidos cardíacos masivos en 3D a resolución micrométrica. En la microscopía de lámina de luz, la iluminación de la muestra se realiza con una lámina delgada de luz confinada en el plano focal del objetivo de detección. La emisión de fluorescencia se recoge a lo largo de un eje perpendicular al plano de iluminación15. La arquitectura de detección es similar a la microscopía de campo amplio, lo que hace que la adquisición sea mucho más rápida que los microscopios de barrido láser. El desplazamiento de la muestra a través de la lámina de luz permite obtener una tomografía completa de muestras grandes, de hasta un centímetro de tamaño. Sin embargo, debido a las propiedades intrínsecas del haz gaussiano, es posible obtener una lámina de luz muy delgada (del orden de unas pocas micras) solo para una extensión espacial limitada, lo que limita drásticamente el campo de visión (FoV). Recientemente, se ha introducido un novedoso esquema de excitación para superar esta limitación y se ha aplicado para imágenes cerebrales, permitiendo reconstrucciones 3D con resolución isotrópica16.
En este documento, se presenta un enfoque de compensación pasiva, lo que permite una reducción significativa del tiempo de compensación necesario para el protocolo CLARITY. El marco metodológico descrito aquí permite reconstruir un corazón de ratón completo con resolución micrométrica en una sola exploración tomográfica con un tiempo de adquisición del orden de minutos.
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Protocol
Todas las manipulaciones y procedimientos de los animales se realizaron de acuerdo con las directrices de la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos y se ajustaron a los principios y reglamentos del Ministerio de Salud italiano. El protocolo experimental fue aprobado por el Ministerio de Salud italiano (número de protocolo 647/2015-PR). Todos los animales fueron proporcionados por ENVIGO, Italia. Para estos experimentos, se utilizaron 5 ratones machos C57BL / 6J de 6 meses de edad.
1. Preparación de la solución
- Prepare paraformaldehído (PFA) al 4% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (pH 7.6) en una campana química. Conservar las alícuotas de PFA al 4% a -20 °C durante varios meses.
- Preparar solución de hidrogel: Mezclar 4% de acrilamida, 0,05% de bis-acrilamida, 0,25% de iniciador AV-044 en 0,01 M PBS en una campana química. Mantenga los reactivos y la solución en hielo durante toda la preparación. Conservar las alícuotas de hidrogel a -20 °C durante varios meses.
- Preparar solución de limpieza: Mezclar 200 mM de ácido bórico, 4% de dodecil-sulfato de sodio (SDS) en agua desionizada; pH 8.6 en una campana química. Conservar la solución entre 21-37 °C para evitar la precipitación SDS.
- Prepare una solución fresca de Tyrode el día del experimento: añadir 10 mM de glucosa, 10 mM de HEPES, 113 mM de NaCl, 1,2 mM de MgCl2 y 4,7 mM de KCl; valorar a pH 7,4 utilizando 1 M NaOH.
2. Aislamiento del corazón
- Inyecte 0.1 ml de heparina 500 U.I. por vía subcutánea 30 min antes del procedimiento de aislamiento cardíaco.
- Llene una jeringa de 30 ml y tres placas de Petri de 6 cm con una solución fresca de Tyrode. Haga una pequeña grieta (3-4 mm de profundidad) en el borde de una de las placas de Petri y colóquela bajo un microscopio estereoscópico.
- Fije una cánula de 1 mm de diámetro a la jeringa e insértela en la grieta de la placa de Petri. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la jeringa.
- Llene una jeringa de 20 ml con PFA al 4% y manténgala en la campana química. Prepare una placa de Petri vacía debajo del capó.
- Anestesiar al ratón con isoflurano/oxígeno al 3% a un caudal de 1,0 L/min y sacrificarlo por luxación cervical de acuerdo con las normas de bienestar animal vigentes.
- Después del sacrificio, retire el pelaje sobre el pecho y abra el pecho para tener acceso completo al corazón.
- Aísle el corazón, sumérjalo en la placa de Petri previamente llena con 50 ml de solución Tyrode. Use tijeras quirúrgicas para cortar la aorta inmediatamente cerca del arco aórtico para exponer el corazón.
- Transfiera el corazón bajo un microscopio estereoscópico y realice cuidadosamente la canulación con cuidado. No inserte la cánula demasiado profundamente en la aorta (no más de 2 mm) para evitar daños tisulares.
- Use una pequeña pinza y una sutura (tamaño 5/0) para fijar el corazón a la cánula.
- Perfundir el corazón con 30 ml de la solución Tyrode con una presión constante de 10 ml/min para eliminar la sangre de los vasos.
- Separe la cánula de la jeringa y coloque el corazón en la placa de Petri llena de solución Tyrode. Tenga cuidado de no tener burbujas de aire en la cánula; De lo contrario, retire las burbujas de aire correctamente.
- Conecte la jeringa de 20 ml llena de PFA fría al 4% en la cánula y perfunda el corazón a la misma presión constante.
- Incubar el corazón en 10 ml de PFA al 4% a 4 °C durante la noche (O/N). Para evitar la degradación del tejido, realice los pasos 2.6-2.13 en el menor tiempo posible.
3. Limpieza del corazón
- Al día siguiente, lavar el corazón en 0,01 M PBS 3 veces a 4 °C durante 15 min.
NOTA: Después de este paso, el corazón puede almacenarse en PBS + 0,01% de azida de sodio (NaN3) a 4 °C durante varios meses. - Incubar el corazón en 30 ml de solución de hidrogel agitando (15 rpm) a 4 °C durante 3 días.
- Desgasifique la muestra a temperatura ambiente usando un secador, una bomba de vacío y un sistema de tubos que conecta el secador tanto a la bomba como a una tubería de nitrógeno.
- Coloque la muestra en la secadora y abra el vial, manteniendo la tapa sobre él.
- Cierre la secadora y retire el oxígeno del tubo abriendo la tubería de nitrógeno.
- Encienda la bomba de vacío para eliminar el oxígeno de la secadora durante 10 minutos.
- Apague la bomba y use la perilla de la secadora para abrir la tubería de nitrógeno. Una vez que la presión sea igual a la presión atmosférica, abra con cuidado el secador y cierre rápidamente el vial.
- Mantener el corazón en la solución de hidrogel desgasificado a 37 °C durante 3 h en reposo.
- Cuando el hidrogel esté correctamente polimerizado y parezca completamente gelatinoso, retire con cuidado el corazón y colóquelo en el portamuestras.
- Inserte el portamuestras con el corazón en una de las cámaras de limpieza y ciérrelo correctamente para evitar fugas de la solución de limpieza.
- Encienda el baño de agua donde se coloca el recipiente de la solución de limpieza y la bomba peristáltica para iniciar la recirculación de la solución de limpieza.
- Cambie la solución de limpieza en el contenedor una vez a la semana para acelerar el procedimiento de clarificación.
4. Tinción de la membrana celular
- Una vez que el corazón aparezca completamente aclarado, retírelo del portamuestras y lávelo en 50 ml de PBS calentado durante 24 h. Lavar de nuevo en 50 mL de PBS + 1% de Triton-X (PBS-T 1x) durante 24 h.
- Incubar la muestra en 0.01 mg/mL de aglutinina de germen de trigo (WGA) - Alexa Fluor 633 en 3 mL de PBS-T 1x en agitación (50 rpm) a temperatura ambiente durante 7 días.
- Después de la incubación de 7 días, lavar la muestra en 50 ml de PBS-T 1x a temperatura ambiente agitando durante 24 h.
- Incubar la muestra en PFA al 4% durante 15 minutos y luego lavarla 3 veces en PBS durante 5 minutos cada una.
NOTA: Después de este paso, el corazón puede almacenarse en PBS + 0.01% NaN3 a 4 °C durante varios meses. - Incubar el corazón en concentraciones crecientes de 2,2′-tiodietanol (TDE) en 0,01 M PBS (20% y 47% TDE/PBS) durante 8 h cada una, hasta la concentración final de 68% TDE en 0,01 M PBS para proporcionar el índice de refracción requerido (RI = 1,46). Este es el medio de coincidencia de RI (RI-medium) para adquirir imágenes16.
5. Montaje y adquisición del corazón
NOTA: Todos los componentes del sistema óptico se enumeran en detalle en la Tabla de materiales.
- Llene suavemente aproximadamente el 80% de la cubeta externa (cuarzo, 45 mm × 45 mm × 42,5 mm) con el medio RI.
NOTA: Aquí es posible utilizar diferentes soluciones no volátiles que garantizan un RI de 1,46. - Llene suavemente la cubeta interna (cuarzo, 45 mm × 12,5 mm × 12,5 mm) con el mismo medio RI.
- Sumerja la muestra dentro de la cubeta interna. Las incubaciones de muestras descritas anteriormente permiten que la muestra permanezca estable dentro del medio RI sin ser retenida.
- Mueva suavemente la muestra hasta el fondo de la cubeta con pinzas finas y coloque el corazón con su eje longitudinal paralelo al eje principal de la cubeta para minimizar la trayectoria de la luz de excitación a través del tejido durante la exploración.
- Fije suavemente el tapón hecho a medida sobre la cubeta interna con dos tornillos.
- Monte la muestra en la etapa de microscopio usando los imanes.
- Traduzca la etapa de muestra vertical manualmente para sumergir la cubeta interna en la externa.
- Encienda la fuente de luz de excitación (longitud de onda de 638 nm), estableciendo una potencia baja (del orden de 3 mW).
- Mueva la muestra utilizando el traductor motorizado para iluminar un plano interno del tejido.
- Encienda el software de imágenes (HCImageLive) y configure el disparador de la cámara en modo externo (hoja de luz) para controlar el disparador de adquisición de la cámara mediante el software personalizado que controla toda la configuración.
- Active el guardado automático en el panel Configuración de escaneo y establezca la carpeta de salida donde se deben guardar las imágenes.
- Ajuste manualmente la posición de la muestra en el plano XY con los traductores lineales para mover la muestra al centro del FoV del sensor de la cámara.
- Mueva la muestra a lo largo del eje Z utilizando el traductor motorizado lineal para identificar los bordes del corazón para la reconstrucción tomográfica.
- Aumente la potencia del láser a ~ 20 mW, listo para la sesión de imágenes.
- Inicie la adquisición tomográfica, haga clic en el botón Inicio en el panel Secuencia del software de imágenes y, al mismo tiempo, mueva la muestra a lo largo del eje Z a una velocidad constante de 6 μm/s utilizando el traductor motorizado.
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Representative Results
La configuración de limpieza pasiva desarrollada permite obtener un corazón de ratón adulto despejado (con una dimensión del orden de 10 mm x 6 mm x 6 mm) en aproximadamente 3 meses. Todos los componentes de la configuración están montados como se muestra en la Figura 1. El gradiente de temperatura insignificante entre cada cámara de limpieza (del orden de 3 ° C) permite mantener la temperatura en un rango adecuado en todas las cámaras.
Figura 1: Esquema de la configuración de compensación pasiva. La solución de limpieza (después de ser filtrada) circula en sucesión a través de las cámaras de muestra con la ayuda de la bomba peristáltica. El mantenimiento del recipiente de la solución en un baño de agua establecido a 50 °C permite que la temperatura de la solución esté entre 37-45 °C dentro de las cámaras. Imagen creada con Biorender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La figura 2 muestra el resultado del proceso de limpieza de todo un corazón. Como ya informaron Costantini et al.16, la combinación de la metodología CLARITY con TDE como medio RI no cambia significativamente el volumen final de la muestra ni conduce a una deformación anisotrópica del espécimen.
Figura 2: Imagen representativa de un corazón antes (a la izquierda) y después (a la derecha) del protocolo CLARITY. Los corazones se vuelven completamente transparentes y ligeramente sobredimensionados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Una vez que se despejó el corazón, las membranas celulares se tiñeron con un WGA conjugado con Alexa Fluor 633 para realizar la reconstrucción citoarquitectura de todo el órgano. El microscopio de lámina de luz de fluorescencia hecho a medida (Figura 3) fue capaz de garantizar una resolución a escala de micras 3D en todo el FoV.
Figura 3: MesoSPIM. Representación CAD del microscopio de lámina de luz fluorescente hecho a medida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Teniendo en cuenta la apertura numérica (NA = 0,1) de la óptica de detección, la función de dispersión de puntos radial (XY) (PSF) del sistema se puede estimar en el orden de 4-5 μm. Por otro lado, la óptica de excitación produce una lámina de luz con una cintura mínima de aproximadamente 6 μm (ancho completo medio máximo, FWHM) que diverge hasta 175 μm en el borde del FoV (Figura 4A-C). La sincronización del obturador enrollable de la cámara con el escaneo axial del rayo láser aseguró recoger la señal de emisión solo en la porción de muestra excitada con la cintura de la hoja de luz, lo que resultó en un FWHM promedio de aproximadamente 6.7 μm a lo largo de todo el FoV (Figura 4B-D).
Figura 4: Generación y caracterización de hojas de luz. (A) Una hoja de luz de excitación generada con una fuente láser de 638 nm se enfoca en el centro del campo de visión (FoV) y se adquiere con un tamaño de píxel de 3,25 μm y un tiempo de exposición de 10 ms. La intensidad de la luz se normaliza y se informa con un mapa de colores. El Full Width Half Maximum (FWHM) del perfil de intensidad de la luz se evalúa en 15 posiciones diferentes a lo largo del FoV. Los resultados se muestran en C. (B) Imagen de la hoja de luz de excitación generada por la sincronización entre el obturador enrollable de la cámara que funciona a 1,92 Hz y la posición del haz de luz impulsada por la lente sintonizable. El FWHM del perfil de intensidad de la luz se evalúa a lo largo del FoV y los resultados se muestran en D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El Z-PSF del microscopio también se estimó mediante una reconstrucción tomográfica de la nanoesfera fluorescente (Figura 5). Un FWHM de 6,4 μm puede ser estimado por el ajuste, en buen acuerdo con la evaluación anterior.
Figura 5: Función de dispersión de puntos en el eje Z. La función de dispersión puntual (PSF) del sistema óptico se estima mediante imágenes de nanoesferas fluorescentes a escala submicrónica (excitadas con una hoja de luz con una longitud de onda de 638 nm) con un tamaño de píxel de 3,25 μm × 3,25 μm × 2,0 μm. El perfil de intensidad de PSF a lo largo del eje óptico (Z) se representa como puntos negros. El perfil PSF está equipado con una función gaussiana con μ = 18,6 μm y σ = 2,7 μm. El FWHM del PSF estimado por el ajuste es de 6,4 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Debido a la alta transparencia del tejido, fue posible iluminar todo el corazón sin una distorsión significativa de la lámina de luz escaneada axialmente a una longitud de onda de excitación de 638 nm. La señal de fluorescencia fue recogida por el sensor sCMOS que operaba a 500 ms de tiempo de exposición y una velocidad de fotogramas de 1,92 Hz. Sobre la base de la cuantificación anterior, la adquisición tomográfica se realizó utilizando una velocidad de barrido Z de 6 μm / s, y suponiendo una velocidad de fotogramas de 1,92 Hz, se adquirió un fotograma cada 3,12 μm, sobremuestreando el sistema Z-PSF aproximadamente dos veces. En la figura 6 se muestran dos marcos representativos (en los planos coronal y transversal) de la cámara del ventrículo izquierdo. Este resultado confirma la potencialidad del sistema para resolver membranas celulares individuales en tres dimensiones con una relación señal/ruido suficiente en todo el órgano (Figura 6).
Figura 6: Reconstrucción del tejido cardíaco del ratón. El corazón clarificado fue teñido con WGA conjugado a Alexa Fluor 633 y excitado por una fuente láser con una longitud de onda de 638 nm. (A) Secciones coronales y (B) transversales representativas. (C-D) La transformación tisular produce una alta transparencia tisular, lo que permite resolver pequeñas estructuras en la profundidad de la pared. El sistema óptico muestra una resolución axial suficiente para resolver estructuras micrométricas (panel. D). (E) Renderizado cardíaco 3D de baja resolución. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este trabajo, se introdujo un enfoque exitoso para limpiar, teñir e imaginar un corazón de ratón completo en alta resolución. En primer lugar, se optimizó y realizó un protocolo de transformación tisular (CLARITY), ligeramente modificado para su aplicación en el tejido cardíaco. De hecho, para obtener una reconstrucción eficiente en 3D de todo un corazón, es esencial prevenir el fenómeno de la dispersión de la luz. La metodología CLARITY nos permite obtener un corazón intacto altamente transparente, pero requiere largos tiempos de incubación cuando se realiza de forma pasiva (unos 5 meses). Con respecto al cerebro, el tejido cardíaco no es adecuado para un claro activo, que aprovecha un campo eléctrico. Incluso a bajas tensiones, el campo eléctrico provoca daños y roturas de tejidos. Aquí, se optimizó un enfoque de limpieza pasiva para obtener un corazón completamente despejado en aproximadamente 3 meses. Después de aislar y canular el corazón a través de la aorta proximal, se realizó la metodología CLARITY como se describe en la sección 3 del protocolo. Para acelerar el procedimiento, se organizó una configuración de limpieza pasiva casera (Figura 1), que terminó disminuyendo el tiempo de limpieza del tejido en aproximadamente un 40%. La configuración se compone de un recipiente para la solución de limpieza, un baño de agua, una bomba peristáltica, varias cámaras que contienen diferentes soportes de muestras, filtros de cápsulas para cada cámara y un sistema de tubos para la recirculación de la solución. La bomba extrae y hace circular la solución del recipiente en sucesión a través de cada una de las cámaras, donde las muestras se mantienen para su limpieza. Antes de entrar en las cámaras, la solución fluye a través de un filtro de cápsula para atrapar los lípidos eliminados de los tejidos durante el claro. La temperatura óptima para la solución de aclaración, entre 37-45 °C, se mantiene dentro de las cámaras durante la recirculación manteniendo el recipiente de la solución en un baño de agua a 50 °C. Se recomienda cambiar la solución de limpieza en el recipiente una vez a la semana durante el procedimiento. Todos los componentes utilizados se enumeran en detalle en la Tabla de materiales. La solución optimizada presentada aquí nos permite obtener un corazón de ratón completamente despejado pasivamente en un tiempo significativamente más corto con respecto a la técnica estándar de limpieza pasiva, reduciendo así el tiempo experimental requerido sin dañar el órgano. El enfoque de tinción también se optimizó para el etiquetado homogéneo de las membranas celulares y el endotelio, utilizando una lectina fluorescente (WGA - Alexa Fluor 633).
La citoarquitectura del corazón se ha reconstruido mediante el desarrollo de un mesoSPIM dedicado que barre axialmente la hoja de luz a través de la muestra (https://mesospim.org). El microscopio de lámina de luz fluorescente hecho a medida (Figura 3) fue capaz de adquirir rápidamente imágenes de un FoV mesoscópico (del orden de milímetros) con resolución micrométrica. De esta manera, los cardiomiocitos individuales se pueden resolver y mapear en una reconstrucción 3D de todo el órgano. El microscopio ilumina la muestra despejada con una lámina de luz, generada dinámicamente mediante el escaneo de un rayo láser a 638 nm utilizando un espejo galvanométrico. Una cámara sCMOS caracteriza el brazo de detección en un esquema de aumento 2x que le permite adquirir todo el FoV en un solo escaneo. La señal de fluorescencia se seleccionó colocando un filtro de paso largo después del objetivo. La cámara se configuró para funcionar en modo rolling shutter: en cualquier momento, las líneas de píxeles activos de la cámara (es decir, expuestos a la imagen) se sincronizan con el desplazamiento en el plano de la banda focal de la hoja de luz, realizado por una lente sintonizable eléctricamente. Este enfoque maximizó la capacidad de sección óptica en todo el FoV al adquirir solo imágenes en la parte más delgada de la hoja de luz enfocada. Esta solución difiere de las configuraciones convencionales, donde la adquisición implica todo el rango de profundidad focal de la hoja de luz, evitando la resolución máxima de sección óptica en gran parte del FoV. Una etapa de muestra integrada soporta cubetas, optimizando así el posicionamiento y permitiendo el movimiento axial de la muestra durante el proceso de obtención de imágenes. De esta manera, las reconstrucciones tomográficas son posibles mediante la adquisición de secciones internas consecutivas. Las imágenes obtenidas tienen un FoV mesoscópico y una resolución micrométrica, mientras que el tiempo de adquisición requerido para un corazón de ratón completo es ~ 15 min. La sincronización entre el rolling shutter de la cámara y el haz de luz de excitación que barre el FoV permite adquirir todo el plano de imagen con una alta resolución espacial (Figura 4). Esto permite la reconstrucción directa de la muestra en una sola adquisición tomográfica, sin la necesidad de desplazamiento radial de la muestra e imágenes basadas en pilas adyacentes. En particular, el microscopio permitió la reconstrucción de todo el órgano de aproximadamente (10 mm x 6 mm x 6 mm) en una sola sesión de imagen, con un tamaño de vóxel casi isotrópico y una relación señal-fondo suficiente para resolver células individuales en todo el órgano potencialmente.
Cabe destacar que el protocolo propuesto presenta algunos pasos críticos que deben realizarse cuidadosamente para lograr buenos resultados. En particular, la canulación del corazón a través de la aorta proximal puede ser bastante difícil, pero es un paso esencial para lavar y reparar el órgano correctamente. Judd et al.17, mostraron cómo realizar este paso de manera efectiva. Además, el procedimiento de desgasificación que necesita el protocolo CLARITY también es bastante complejo, pero es esencial para la preservación de los tejidos; Si este paso no se realiza correctamente, el tejido podría sufrir daños y descomposición durante la incubación en solución de limpieza.
Además, aunque el flujo de trabajo experimental presentado es adecuado para pequeñas sondas fluorescentes, el uso de inmunohistoquímica no siempre proporciona una buena eficiencia en la tinción debido al mayor peso molecular de los anticuerpos. Cada protocolo de inmunotinción requiere una optimización adecuada, y se han concebido diferentes enfoques para mejorar la penetración de anticuerpos, por ejemplo, la expansión tisular18 y/o las variaciones en el pH y la fuerza iónica19.
La configuración de mesoSPIM también presenta dos limitaciones principales: i) la preservación de la lámina de luz en toda la muestra depende en gran medida de la transparencia del tejido, y ii) la dimensión del sensor de la cámara limita el FoV. Garantizar una coincidencia perfecta del índice de refracción dentro de todo el corazón es muy desafiante, y pequeñas variaciones en el índice de refracción pueden producir dispersión de la luz, lo que lleva a la degradación de la calidad de la imagen. A este respecto, se puede introducir un esquema de iluminación de doble cara. Dos brazos de excitación pueden generar dos láminas de luz dinámicas distintas y alineadas con iluminación enfocada al máximo alternando la iluminación de un lado a otro de la muestra. Además, el FoV se puede mejorar mediante el uso de una nueva generación de sCMOS retroiluminado de alta resolución con sensores muy grandes en combinación con lentes telecéntricas de alta apertura numérica con baja distorsión de campo. Esta implementación nos permitiría reconstruir órganos más grandes o tejidos expandidos manteniendo la misma capacidad de sección óptica y, por lo tanto, produciendo imágenes 3D a escala micrométrica de muestras despejadas de un centímetro de tamaño.
Aunque el protocolo presentado todavía requiere mucho tiempo para la preparación de la muestra y un alto nivel de transparencia para obtener una reconstrucción citoarquitectura fiable de todo el órgano, la principal importancia del abordaje reside en las mejoras del protocolo de limpieza y la capacidad de realizar la reconstrucción mesoscópica en una sola exploración a resolución micrométrica. En el futuro, estos avances se pueden combinar con un protocolo de tinción múltiple para lograr la reconstrucción de órganos completos integrando diferentes estructuras biológicas.
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Disclosures
Nada que revelar.
Acknowledgments
Este proyecto ha recibido fondos del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea bajo el acuerdo de subvención No 952166 (REPAIR), MUR bajo el programa FISR, proyecto FISR2019_00320 y Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, proyecto PERCARE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-2’ Thiodiethanol | Sigma-Aldrich | 166782 | |
| Acrylamide | Bio-Rad | 61-0140 | |
| AV-044 Initiator | Wako Chemicals | AVP5874 | |
| Bis-Acrylamide | Bio-Rad | 161-042 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Camera | Hamamatsu | Orca flash 4.0 v3 | |
| Camera software | Hamamatsu | HC Image | |
| Collimating lens | Thorlabs | AC254-050-A-ML | |
| Detection arm | Integrated optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Excitation lens | Nikon | 91863 | |
| Exteraìnal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-753 | |
| Fold mirrors | Thorlabs | BBE1-E02 | |
| Galvanometric mirror | Thorlabs | GVS211/M | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCImage Live | Hamamatsu | 4.6.1.19 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Internal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-204 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Laser source | Integrated Optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Long-pass filter | Thorlabs | FELH0650 | |
| Magnetic base | Thorlabs | KB25/M | |
| MgCl2 | Chem-Lab | CI-1316-0250 | |
| Motorized traslator | Physisk Instrument | M-122.2DD | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 59888 | |
| Objective | Thorlabs | TL2X-SAP | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Polycap AS | Whatman | 2606T | |
| Relay lens | Qioptiq | G063200000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Tube lens | Thorlabs | ACT508-200-A-ML | |
| Tunable lens | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger Inc | N86KT.18 | |
| Water bath | Memmert | WTB |
References
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