Summary
Vi rapporterar en metod för mesoskopisk rekonstruktion av hela mushjärtat genom att kombinera nya framsteg inom vävnadstransformation och färgning med utvecklingen av ett axiellt skannat ljusarkmikroskop.
Abstract
Både genetiska och icke-genetiska hjärtsjukdomar kan orsaka allvarliga ombyggnadsprocesser i hjärtat. Strukturell ombyggnad, såsom kollagenavsättning (fibros) och cellulär felinriktning, kan påverka elektrisk ledning, införa elektromekaniska dysfunktioner och så småningom leda till arytmi. Nuvarande prediktiva modeller av dessa funktionella förändringar är baserade på icke-integrerad och lågupplöst strukturell information. Att placera detta ramverk i en annan storleksordning är utmanande på grund av ineffektiviteten hos standardavbildningsmetoder för att utföra högupplöst avbildning i massiv vävnad. I detta arbete beskriver vi ett metodiskt ramverk som möjliggör avbildning av hela mushjärtan med mikrometrisk upplösning. För att uppnå detta mål har det krävts en teknisk insats där framsteg inom vävnadsomvandling och avbildningsmetoder har kombinerats. Först beskriver vi ett optimerat CLARITY-protokoll som kan omvandla ett intakt hjärta till en nanoporös, hydrogelhybridiserad, lipidfri form som möjliggör hög transparens och djup färgning. Därefter beskrivs ett fluorescensljusarkmikroskop som snabbt kan förvärva bilder av ett mesoskopiskt synfält (mm-skala) med mikronskalans upplösning. Efter mesoSPIM-projektet möjliggör det tänkta mikroskopet rekonstruktion av hela mushjärtat med mikrometrisk upplösning i en enda tomografisk skanning. Vi tror att denna metodologiska ram kommer att göra det möjligt att klargöra involveringen av cytoarkitekturens oordning i de elektriska dysfunktionerna och bana väg för en omfattande modell som tar hänsyn till både funktionella och strukturella data, vilket möjliggör en enhetlig undersökning av de strukturella orsakerna som leder till elektriska och mekaniska förändringar efter vävnadsombyggnad.
Introduction
Strukturell ombyggnad i samband med hjärtsjukdomar kan påverka elektrisk ledning och införa elektromekaniska dysfunktioner i organet 1,2. Nuvarande metoder som används för att förutsäga funktionella förändringar använder vanligtvis MR och DT-MRI för att erhålla en övergripande rekonstruktion av fibrosavsättning, vaskulärt träd och fiberfördelning av hjärtat, och de används för att modellera APP-vägar (Preferential Action Potential Propagation) över organet 3,4. Dessa strategier kan ge en vacker översikt över hjärtorganisationen. Deras rumsliga upplösning är dock otillräcklig för att undersöka effekterna av strukturell ombyggnad på hjärtfunktionen på cellnivå.
Att placera detta ramverk i en annan storleksordning, där enskilda celler kan spela individuella roller på handlingspotentialutbredning, är utmanande. Huvudbegränsningen är ineffektiviteten hos standardavbildningsmetoder för att utföra högupplöst avbildning (mikrometrisk upplösning) i massiva (centimeterstora) vävnader. Faktum är att avbildning av biologiska vävnader i 3D vid hög upplösning är mycket komplicerat på grund av vävnadsogenomskinlighet. Det vanligaste sättet att utföra 3D-rekonstruktioner i hela organ är att förbereda tunna sektioner. Exakt sektionering, montering och avbildning kräver dock betydande ansträngning och tid. Ett alternativt tillvägagångssätt som inte kräver att provet skärs är att generera en transparent vävnad. Under de senaste åren har flera metoder för att klargöra vävnader föreslagits 5,6,7,8. Utmaningen att producera massiva, transparenta och fluorescerande märkta vävnader har nyligen uppnåtts genom att utveckla sanna vävnadstransformationsmetoder (CLARITY9, SHIELD10). I synnerhet är CLARITY-metoden baserad på omvandlingen av en intakt vävnad till en nanoporös, hydrogelhybridiserad, lipidfri form som gör det möjligt att ge hög transparens genom selektivt avlägsnande av membranlipid-dubbelskikt. I synnerhet har denna metod visat sig framgångsrik även i hjärtpreparat11,12,13,14. Men eftersom hjärtat är för bräckligt för att vara lämpligt för en aktiv röjning, måste det rensas med det passiva tillvägagångssättet, vilket kräver lång tid för att ge fullständig transparens.
I kombination med avancerade bildtekniker som ljusarkmikroskopi har CLARITY potential att avbilda massiva 3D-hjärtvävnader med mikrometrisk upplösning. I ljusarkmikroskopi utförs belysningen av provet med ett tunt ljusark begränsat i detektionsmålets fokalplan. Fluorescensemissionen samlas upp längs en axel vinkelrätt mot belysningsplanet15. Detektionsarkitekturen liknar widefieldmikroskopi, vilket gör förvärvet mycket snabbare än laserskanningsmikroskop. Genom att flytta provet genom ljusarket kan man få en fullständig tomografi av stora prover, upp till centimeterstora prover. På grund av de inneboende egenskaperna hos den gaussiska strålen är det emellertid möjligt att erhålla ett mycket tunt (i storleksordningen några mikron) ljusark endast för en begränsad rumslig förlängning, vilket drastiskt begränsar synfältet (FoV). Nyligen har ett nytt excitationsschema introducerats för att övervinna denna begränsning och tillämpas för hjärnavbildning, vilket möjliggör 3d-rekonstruktioner med isotrop upplösning16.
I detta dokument presenteras en passiv clearingmetod som möjliggör en betydande minskning av den clearingtid som krävs enligt CLARITY-protokollet. Den metodologiska ramen som beskrivs här möjliggör rekonstruktion av ett helt mushjärta med mikrometrisk upplösning i en enda tomografisk skanning med en förvärvstid i storleksordningen minuter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All djurhantering och alla försök utfördes i enlighet med riktlinjerna från Europaparlamentets direktiv 2010/63/EU om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål och överensstämde med principerna och bestämmelserna från det italienska hälsoministeriet. Det experimentella protokollet godkändes av det italienska hälsoministeriet (protokollnummer 647/2015-PR). Alla djuren tillhandahölls av ENVIGO, Italien. För dessa experiment användes 5 manliga C57BL/6J-möss med 6 månaders ålder.
1. Beredning av lösningen
- Bered 4% paraformaldehyd (PFA) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (pH 7.6) i en kemisk huva. Förvara 4% PFA-alikvoter vid -20 °C i flera månader.
- Förbered hydrogellösning: Blanda 4% akrylamid, 0,05% Bis-akrylamid, 0,25% Initiatior AV-044 i 0,01 M PBS i en kemisk huva. Håll reagenserna och lösningen på is under hela beredningen. Förvara hydrogelens alikvoter vid -20 °C i flera månader.
- Förbered clearinglösning: Blanda 200 mM borsyra, 4% natriumdodecylsulfat (SDS) i avjoniserat vatten; pH 8,6 i en kemisk huva. Förvara lösningen mellan 21-37 °C för att undvika SDS-nederbörd.
- Förbered färsk tyrodlösning på experimentdagen: Tillsätt 10 mM glukos, 10 mM HEPES, 113 mM NaCl, 1,2 mM MgCl2 och 4,7 mM KCl; titrera till pH 7,4 med 1 M NaOH.
2. Hjärtisolering
- Injicera 0,1 ml 500 I.U. Heparin subkutant 30 minuter före hjärtisoleringsproceduren.
- Fyll en 30 ml spruta och tre 6 cm petriskålar med färsk tyrodlösning. Gör en liten rift (3-4 mm djup) på gränsen till en av petriskålarna och placera den under ett stereoskopiskt mikroskop.
- Fäst en kanyl med en diameter på 1 mm på sprutan och sätt in den i petriskålens spricka. Se till att det inte finns några luftbubblor i sprutan.
- Fyll en 20 ml spruta med 4% PFA och förvara den i kemikaliehuven. Förbered en tom petriskål under huven.
- Bedöva musen med 3% isofluran/syre vid en flödeshastighet av 1,0 l/min och offra den genom cervikal dislokation enligt gällande djurskyddsregler.
- Efter offret, ta bort pälsen över bröstet och öppna bröstet för att få full tillgång till hjärtat.
- Isolera hjärtat, sänk ner det i petriskålen som tidigare fyllts med 50 ml tyrodlösning. Använd kirurgisk sax för att skära aortan omedelbart nära aortabågen för att få hjärtat exponerat.
- Överför hjärtat under ett stereoskopiskt mikroskop och utför noggrant cannulationen. För inte in kanylen för djupt i aortan (högst 2 mm) för att undvika vävnadsskador.
- Använd en liten klämma och en sutur (storlek 5/0) för att fixera hjärtat till kanylen.
- Blötlägg hjärtat med 30 ml av tyrodlösningen med ett konstant tryck på 10 ml/min för att avlägsna blod från kärlen.
- Lossa kanylen från sprutan och placera hjärtat i petriskålen fylld med tyrodlösning. Var försiktig så att du inte har luftbubblor i kanylen; Annars tar du bort luftbubblorna ordentligt.
- Fäst 20 ml sprutan fylld med kall 4% PFA på kanylen och perfusera hjärtat vid samma konstanta tryck.
- Inkubera hjärtat i 10 ml 4% PFA vid 4 °C över natten (O/N). För att undvika vävnadsnedbrytning, utför steg 2.6-2.13 på kortast möjliga tid.
3. Hjärtröjning
- Dagen efter, tvätta hjärtat i 0,01 M PBS 3 gånger vid 4 °C i 15 min.
OBS: Efter detta steg kan hjärtat förvaras i PBS + 0,01% natriumazid (NaN3) vid 4 ° C i flera månader. - Inkubera hjärtat i 30 ml hydrogellösning i skakning (15 rpm) vid 4 °C i 3 dagar.
- Avgasa provet vid rumstemperatur med hjälp av en torktumlare, en vakuumpump och ett rörsystem som ansluter torken till både pumpen och en kväveledning.
- Placera provet i torktumlaren och öppna injektionsflaskan och håll locket på den.
- Stäng torken och ta bort syret från röret genom att öppna kväveledningen.
- Slå på vakuumpumpen för att ta bort syret från torken i 10 minuter.
- Stäng av pumpen och använd torkens ratt för att öppna kväveledningen. När trycket är lika med atmosfärstrycket, öppna försiktigt torken och stäng snabbt injektionsflaskan.
- Förvara hjärtat i den avgasade hydrogellösningen vid 37 °C i vila i 3 timmar.
- När hydrogelen är ordentligt polymeriserad och verkar helt gelatinös, ta försiktigt bort hjärtat från det och placera det i provhållaren.
- Sätt in provhållaren med hjärtat i en av rensningskamrarna och stäng den ordentligt för att undvika läckage av röjningslösningen.
- Slå på vattenbadet där clearinglösningsbehållaren är placerad och den peristaltiska pumpen för att starta återcirkulationen av röjningslösningen.
- Byt clearinglösningen i behållaren en gång i veckan för att påskynda förtydligandeproceduren.
4. Cellulär membranfärgning
- När hjärtat verkar helt klargjort, ta bort det från provhållaren och tvätta det i 50 ml uppvärmd PBS i 24 timmar. Tvätta igen i 50 ml PBS + 1% Triton-X (PBS-T 1x) i 24 timmar.
- Inkubera provet i 0,01 mg / ml vetegroddar agglutinin (WGA) - Alexa Fluor 633 i 3 ml PBS-T 1x i skakning (50 rpm) vid rumstemperatur i 7 dagar.
- Efter 7-dagars inkubation, tvätta provet i 50 ml PBS-T 1x vid rumstemperatur i skakning i 24 timmar.
- Inkubera provet i 4% PFA i 15 min och tvätta det sedan 3 gånger i PBS i 5 min vardera.
OBS: Efter detta steg kan hjärtat förvaras i PBS + 0,01% NaN3 vid 4 ° C i flera månader. - Inkubera hjärtat i ökande koncentrationer av 2,2′-tiodietanol (TDE) i 0,01 M PBS (20% och 47% TDE/PBS) i 8 timmar vardera, upp till den slutliga koncentrationen av 68% TDE i 0,01 M PBS för att ge det erforderliga brytningsindexet (RI = 1,46). Detta är RI-matchningsmediet (RI-medium) för att hämta bilder16.
5. Hjärtmontering och förvärv
OBS: Alla komponenter i det optiska systemet listas i detalj i materialförteckningen.
- Fyll försiktigt ca 80% av den yttre kyvetten (kvarts, 45 mm × 45 mm × 42,5 mm) med RI-mediet.
OBS: Här är det möjligt att använda olika icke-flyktiga lösningar som garanterar en RI på 1,46. - Fyll försiktigt den inre kyvetten (kvarts, 45 mm × 12,5 mm × 12,5 mm) med samma RI-medium.
- Sänk ner provet inuti den inre kyvetten. De provinkubationer som beskrivs ovan gör att provet kan förbli stabilt inuti RI-mediet utan att hållas.
- Flytta försiktigt provet till botten av kyvetten med hjälp av tunn pincett och ordna hjärtat med dess längsgående axel parallellt med kyvettens huvudaxel för att minimera excitationsljusvägen över vävnaden under skanningen.
- Fäst försiktigt den skräddarsydda kontakten ovanför den inre kyvetten med två skruvar.
- Montera provet på mikroskopsteget med magneterna.
- Översätt det vertikala provsteget manuellt för att fördjupa den interna kyvetten i den externa.
- Slå på excitationsljuskällan (våglängd på 638 nm) och ställ in låg effekt (i storleksordningen 3 mW).
- Flytta provet med hjälp av den motoriserade översättaren för att belysa ett inre plan i vävnaden.
- Slå på bildbehandlingsprogrammet (HCImageLive) och ställ in kamerans utlösare på externt läge (light-sheet) för att driva kamerans förvärvsutlösare av den anpassade programvaran som styr hela installationen.
- Aktivera Autospara i panelen Skanningsinställningar och ställ in utdatamappen där bilderna måste sparas.
- Justera provpositionen manuellt i XY-planet med de linjära översättarna för att flytta provet till mitten av kamerasensorns FoV.
- Flytta provet längs Z-axeln med hjälp av den linjära motoriserade översättaren för att identifiera hjärtgränser för tomografisk rekonstruktion.
- Öka lasereffekten till ~ 20 mW, redo för bildsessionen.
- Starta det tomografiska förvärvet, klicka på Start-knappen i bildprogramvarans sekvenspanel och flytta samtidigt provet längs Z-axeln med konstant hastighet på 6 μm/s med hjälp av den motoriserade översättaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den utvecklade passiva röjningsinställningen gör det möjligt att få ett rensat vuxet mushjärta (med en dimension av ordningen 10 mm x 6 mm x 6 mm) på cirka 3 månader. Alla komponenter i installationen är monterade som visas i figur 1. Den försumbara temperaturgradienten mellan varje röjningskammare (i storleksordningen 3 °C) gör det möjligt att hålla temperaturen inom ett lämpligt intervall över alla kammare.
Bild 1: Schematisk bild av inställningen för passiv rensning. Clearinglösningen (efter att ha filtrerats) cirkulerar i följd genom provkamrarna med hjälp av den peristaltiska pumpen. Förvaringen av lösningsbehållaren i ett vattenbad vid 50 °C gör att lösningstemperaturen kan ligga mellan 37 och 45 °C i kamrarna. Bild skapad med Biorender.com. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 visar resultatet av rensningsprocessen för ett helt hjärta. Som redan rapporterats av Costantini et al.16 ändrar kombinationen av CLARITY-metoden med TDE som RI-medium inte signifikant provets slutliga volym eller leder till anisotrop deformation av provet.
Figur 2: Representativ bild av ett hjärta före (till vänster) och efter (till höger) CLARITY-protokollet. Hjärtan blir helt genomskinliga och något överdimensionerade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
När hjärtat var rensat färgades cellmembran med en Alexa Fluor 633-konjugerad WGA för att utföra cytoarkitekturrekonstruktionen av hela organet. Det skräddarsydda fluorescensljusmikroskopet (figur 3) kunde säkerställa 3D-mikronskalaupplösning över hela FoV.
Bild 3: MesoSPIM. CAD-rendering av det skräddarsydda fluorescensljusarkmikroskopet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Med tanke på detektionsoptikens numeriska bländare (NA = 0,1) kan systemets radiella (XY) punktspridningsfunktion (PSF) uppskattas i storleksordningen 4-5 μm. Å andra sidan producerar excitationsoptiken ett ljusark med en minsta midja på cirka 6 μm (Full bredd halv maximalt, FWHM) som avviker upp till 175 μm vid kanten av FoV (Figur 4A-C). Synkroniseringen av kamerans rullande slutare med den axiella skanningen av laserstrålen säkerställde att utsläppssignalen endast samlades in i provdelen upphetsad med ljusarkets midja, vilket resulterade i en genomsnittlig FWHM på cirka 6,7 μm längs hela FoV (figur 4B-D).
Figur 4: Generering och karakterisering av ljusark . (A) Ett excitationsljusark som genereras med en laserkälla på 638 nm fokuseras på mitten av synfältet (FoV) och förvärvas med en pixelstorlek på 3,25 μm och en exponeringstid på 10 ms. Ljusintensiteten normaliseras och rapporteras med en färgkarta. Full Width Half Maximum (FWHM) för ljusintensitetsprofilen utvärderas i 15 olika positioner längs FoV. Resultaten visas i C. (B) Bild av excitationsljusarket som genereras av synkroniseringen mellan kamerans rullande slutare som arbetar vid 1,92 Hz och ljusstråleläget som drivs av det avstämbara objektivet. FWHM för ljusintensitetsprofilen utvärderas längs FoV och resultaten visas i D. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Mikroskopets Z-PSF uppskattades också genom en tomografisk rekonstruktion av den fluorescerande nanosfären (figur 5). En FWHM på 6,4 μm kan uppskattas av passformen, i god överensstämmelse med den tidigare bedömningen.
Figur 5: Punktspridningsfunktion i Z-axeln. Det optiska systemets punktspridningsfunktion (PSF) uppskattas genom avbildning av fluorescerande nanosfärer i submikronskala (exciterade med ett ljusark med en våglängd på 638 nm) med en pixelstorlek på 3,25 μm × 3,25 μm × 2,0 μm. PSF-intensitetsprofilen längs den optiska axeln (Z) representeras som svarta prickar. PSF-profilen är försedd med en Gaussisk funktion med μ = 18,6 μm och σ = 2,7 μm. FWHM för polyesterstapelfibrerna som uppskattas av passformen är 6,4 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
På grund av vävnadens höga transparens var det möjligt att belysa hela hjärtat utan signifikant förvrängning av det axiellt skannade ljusarket vid en excitationsvåglängd på 638 nm. Fluorescenssignalen samlades in av sCMOS-sensorn som arbetade vid 500 ms exponeringstid och en bildhastighet på 1,92 Hz. Baserat på tidigare kvantifiering utfördes det tomografiska förvärvet med en Z-skanningshastighet på 6 μm / s, och förutsatt en bildhastighet på 1,92 Hz förvärvades en ram var 3,12 μm, översampling av systemet Z-PSF med ungefär två gånger. Två representativa ramar (på koronala och tvärgående plan) i vänster ventrikelkammare visas i figur 6. Detta resultat bekräftar systemets potential att lösa enskilda cellmembran i tre dimensioner med ett tillräckligt signal/brusförhållande i hela organet (figur 6).
Figur 6: Rekonstruktion av musens hjärtvävnad. Det klarade hjärtat färgades med WGA konjugerat till Alexa Fluor 633 och upphetsades av en laserkälla med en våglängd på 638 nm. (A) Koronala och (B) tvärgående representativa sektioner. (C–D) Vävnadstransformation ger hög vävnadstransparens, vilket gör det möjligt att lösa små strukturer i väggdjupet. Det optiska systemet visar en axiell upplösning som är tillräcklig för att lösa mikrometriska strukturer (panel. D). (E) 3D-hjärtåtergivning med låg upplösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta arbete introducerades ett framgångsrikt tillvägagångssätt för att rensa, fläcka och avbilda ett helt mushjärta med hög upplösning. Först optimerades och utfördes ett vävnadstransformationsprotokoll (CLARITY), något modifierat för dess applicering på hjärtvävnaden. För att få en effektiv rekonstruktion i 3D av ett helt hjärta är det faktiskt viktigt att förhindra fenomenet ljusspridning. CLARITY-metoden gör det möjligt för oss att få ett mycket transparent intakt hjärta, men det kräver långa inkubationstider när det utförs passivt (cirka 5 månader). Med avseende på hjärnan är hjärtvävnaden inte lämplig för en aktiv clearing, som utnyttjar ett elektriskt fält. Även vid låga spänningar leder det elektriska fältet till skador och vävnadsbrott. Här optimerades en passiv clearingmetod för att få ett helt rensat hjärta på cirka 3 månader. Efter att ha isolerat och kanylerat hjärtat genom den proximala aortan utfördes CLARITY-metoden enligt beskrivningen i avsnitt 3 i protokollet. För att påskynda proceduren ordnades en hemlagad passiv röjningsinställning (figur 1), vilket slutade med att tidpunkten för vävnadsrensning minskade med cirka 40%. Installationen består av en behållare för röjningslösningen, ett vattenbad, en peristaltisk pump, flera kamrar som innehåller olika provhållare, kapselfilter för varje kammare och ett slangsystem för återcirkulation av lösningen. Pumpen extraherar och cirkulerar lösningen från behållaren i följd genom var och en av kamrarna, där proverna hålls för rensning. Innan du går in i kamrarna strömmar lösningen genom ett kapselfilter för att fånga lipiderna som spolas bort från vävnader under röjningen. Den optimala temperaturen för röjningslösningen, mellan 37 och 45 °C, hålls i kamrarna under återcirkulationen genom att hålla lösningsbehållaren i ett vattenbad vid 50 °C. Det rekommenderas att byta clearinglösning i behållaren en gång i veckan under proceduren. Alla komponenter som används listas i detalj i materialförteckningen. Den optimerade lösningen som presenteras här gör det möjligt för oss att få ett helt passivt rensat mushjärta på en betydligt kortare tid med avseende på den vanliga passiva röjningstekniken, vilket minskar den erforderliga experimenttiden utan att skada organet. Färgningsmetoden optimerades också för homogen märkning av cellmembranen och endotelet med hjälp av ett fluorescerande lektin (WGA - Alexa Fluor 633).
Hjärtcytoarkitekturen har rekonstruerats genom att utveckla en dedikerad mesoSPIM som axiellt sveper ljusarket över provet (https://mesospim.org). Det skräddarsydda fluorescensljusarkmikroskopet (figur 3) kunde snabbt förvärva bilder av en mesoskopisk FoV (i storleksordningen millimeter) med mikrometrisk upplösning. På detta sätt kan enskilda kardiomyocyter lösas och kartläggas till en 3D-rekonstruktion av hela organet. Mikroskopet belyser det rensade provet med ett ljusark, dynamiskt genererat genom att skanna en laserstråle vid 638 nm med hjälp av en galvanometrisk spegel. En sCMOS-kamera karakteriserar detekteringsarmen i ett 2x förstoringsschema som gör det möjligt att förvärva hela FoV i en enda skanning. Fluorescenssignalen valdes genom att placera ett långpassfilter efter målet. Kameran var inställd på att fungera i rullande slutarläge: när som helst synkroniseras linjerna med aktiva kamerapixlar (dvs. exponeras för bilden) med planförskjutningen av ljusarkets brännband, utfört av en elektriskt avstämbar lins. Detta tillvägagångssätt maximerade den optiska sektionsförmågan i hela FoV genom att endast hämta bilder i den tunnaste delen av det fokuserade ljusarket. Denna lösning skiljer sig från konventionella konfigurationer, där förvärv involverar hela spektrumet av brännvidd på ljusarket, vilket förhindrar maximal optisk sektionsupplösning i stor del av FoV. Ett integrerat provsteg stöder cuvetter, vilket optimerar positionering och möjliggör axiell rörelse av provet under avbildningsprocessen. På detta sätt är tomografiska rekonstruktioner möjliga genom att förvärva på varandra följande inre sektioner. De erhållna bilderna har en mesoskopisk FoV och en mikrometrisk upplösning, medan förvärvstiden som krävs för ett helt mushjärta är ~ 15 min. Synkroniseringen mellan kamerans rullande slutare och excitationsljusstrålen som sveper FoV gör det möjligt att förvärva hela bildplanet med hög rumslig upplösning (figur 4). Detta möjliggör direkt rekonstruktion av provet i ett enda tomografiskt förvärv, utan nödvändighet av provradiell förskjutning och flera angränsande stackar-baserad avbildning. I synnerhet tillät mikroskopet rekonstruktionen av hela organet på cirka (10 mm x 6 mm x 6 mm) i en enda bildsession, med en nästan isotrop voxelstorlek och ett tillräckligt signal-till-bakgrundsförhållande för att lösa enskilda celler över hela organet potentiellt.
Det är anmärkningsvärt att det föreslagna protokollet presenterar några kritiska steg som måste utföras noggrant för att uppnå goda resultat. I synnerhet kan hjärtans kanyl genom proximal aorta vara ganska svårt, men det är ett viktigt steg att tvätta och fixa organet ordentligt. Judd et al.17, visade hur man utför detta steg effektivt. Dessutom är det avgasningsförfarande som krävs enligt CLARITY-protokollet också ganska komplicerat, men det är viktigt för vävnadsbevarande. Om detta steg inte utförs korrekt kan vävnaden stöta på skador och förfall under inkubationen i clearinglösning.
Dessutom, även om det presenterade experimentella arbetsflödet är lämpligt för små fluorescerande sonder, ger användningen av immunohistokemi inte alltid god effektivitet vid färgningen på grund av antikropparnas högre molekylvikt. Varje immunfärgningsprotokoll kräver korrekt optimering, och olika tillvägagångssätt har utformats för att förbättra antikroppspenetrationen, till exempel vävnadsutvidgning18 och / eller variationer i pH och jonstyrka19.
MesoSPIM-installationen presenterar också två huvudsakliga begränsningar: i) ljusarkets bevarande över provet är starkt beroende av vävnadstransparensen, och ii) kamerasensorns dimension begränsar FoV. Att garantera en perfekt brytningsindexmatchning inuti hela hjärtat är mycket utmanande, och små variationer på brytningsindexet kan ge ljusspridning, vilket leder till försämring av bildkvaliteten. I detta avseende kan ett dubbelsidigt belysningsschema införas. Två excitationsarmar kan generera två distinkta och inriktade dynamiska ljusark med maximalt fokuserad belysning genom att växla belysningen från ena sidan till den andra av provet. FoV kan också förbättras genom att använda en ny generation högupplöst bakgrundsbelyst sCMOS med mycket stora sensorer i kombination med telecentriska linser med hög numerisk bländare med låg fältförvrängning. Denna implementering skulle göra det möjligt för oss att rekonstruera större organ eller expanderade vävnader som upprätthåller samma optiska sektionskapacitet och därmed producerar 3D-bilder i mikronskala av rensade prover i centimeterstorlek.
Även om det presenterade protokollet fortfarande kräver lång tid för provberedning och en hög grad av transparens för att erhålla en tillförlitlig cytoarkitekturrekonstruktion av hela organet, ligger huvudbetydelsen av tillvägagångssättet i förbättringarna av clearingprotokollet och förmågan att utföra mesoskopisk rekonstruktion i en enda skanning med mikrometrisk upplösning. I framtiden kan dessa framsteg kombineras med ett protokoll med flera färgningar för att uppnå rekonstruktion av hela organ som integrerar olika biologiska strukturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta projekt har fått finansiering från Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 enligt bidragsavtal nr 952166 (REPAIR), MUR under FISR-programmet, projekt FISR2019_00320 och Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, PERCARE-projektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-2’ Thiodiethanol | Sigma-Aldrich | 166782 | |
| Acrylamide | Bio-Rad | 61-0140 | |
| AV-044 Initiator | Wako Chemicals | AVP5874 | |
| Bis-Acrylamide | Bio-Rad | 161-042 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Camera | Hamamatsu | Orca flash 4.0 v3 | |
| Camera software | Hamamatsu | HC Image | |
| Collimating lens | Thorlabs | AC254-050-A-ML | |
| Detection arm | Integrated optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Excitation lens | Nikon | 91863 | |
| Exteraìnal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-753 | |
| Fold mirrors | Thorlabs | BBE1-E02 | |
| Galvanometric mirror | Thorlabs | GVS211/M | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCImage Live | Hamamatsu | 4.6.1.19 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Internal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-204 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Laser source | Integrated Optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Long-pass filter | Thorlabs | FELH0650 | |
| Magnetic base | Thorlabs | KB25/M | |
| MgCl2 | Chem-Lab | CI-1316-0250 | |
| Motorized traslator | Physisk Instrument | M-122.2DD | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 59888 | |
| Objective | Thorlabs | TL2X-SAP | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Polycap AS | Whatman | 2606T | |
| Relay lens | Qioptiq | G063200000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Tube lens | Thorlabs | ACT508-200-A-ML | |
| Tunable lens | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger Inc | N86KT.18 | |
| Water bath | Memmert | WTB |
References
- Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling. Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).
- Finocchiaro, G., et al. Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death. EP Europace. 2, 1-11 (2021).
- Bishop, M. J., et al. Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).
- Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation. IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106, 369-387 (2020).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Park, Y. G., et al. Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers. Nature Biotechnology. 37, 73 (2019).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769 (2018).
- Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).
- Pianca, N., et al. Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery. The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).
- Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).
- Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative - open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5, 9808 (2015).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012 (2016).
- Yi, F., et al. Microvessel prediction in H&E stained pathology images using fully convolutional neural networks. BMC Bioinformatics. 19 (1), 64 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1982 (2020).
