Summary
Vi rapporterer en metode til mesoskopisk rekonstruktion af hele musehjertet ved at kombinere nye fremskridt inden for vævstransformation og farvning med udviklingen af et aksialt scannet lysarkmikroskop.
Abstract
Både genetiske og ikke-genetiske hjertesygdomme kan forårsage alvorlige ombygningsprocesser i hjertet. Strukturel ombygning, såsom kollagenaflejring (fibrose) og cellulær forskydning, kan påvirke elektrisk ledning, introducere elektromekaniske dysfunktioner og i sidste ende føre til arytmi. Nuværende prædiktive modeller af disse funktionelle ændringer er baseret på ikke-integrerede strukturelle oplysninger med lav opløsning. At placere denne ramme i en anden størrelsesorden er udfordrende på grund af ineffektiviteten af standardbilleddannelsesmetoder til udførelse af billeddannelse i høj opløsning i massivt væv. I dette arbejde beskriver vi en metodologisk ramme, der tillader billeddannelse af hele musehjerter med mikrometrisk opløsning. Opnåelsen af dette mål har krævet en teknologisk indsats, hvor fremskridt inden for vævstransformation og billeddannelsesmetoder er blevet kombineret. For det første beskriver vi en optimeret CLARITY-protokol, der er i stand til at omdanne et intakt hjerte til en nanoporøs, hydrogelhybridiseret, lipidfri form, der tillader høj gennemsigtighed og dyb farvning. Derefter beskrives et fluorescenslysarkmikroskop, der hurtigt kan erhverve billeder af et mesoskopisk synsfelt (mm-skala) med mikronskalaopløsningen. Efter mesoSPIM-projektet tillader det udtænkte mikroskop rekonstruktion af hele musehjertet med mikrometrisk opløsning i en enkelt tomografisk scanning. Vi mener, at denne metodologiske ramme vil gøre det muligt at afklare inddragelsen af cytoarkitekturens uorden i de elektriske dysfunktioner og bane vejen for en omfattende model, der overvejer både de funktionelle og strukturelle data, hvilket muliggør en samlet undersøgelse af de strukturelle årsager, der fører til elektriske og mekaniske ændringer efter vævsombygningen.
Introduction
Strukturel ombygning forbundet med hjertesygdomme kan påvirke elektrisk ledning og indføre elektromekaniske dysfunktioner i organet 1,2. Nuværende tilgange, der bruges til at forudsige funktionelle ændringer, anvender almindeligvis MR og DT-MR for at opnå en samlet rekonstruktion af fibroseaflejring, vaskulær træ- og fiberfordeling af hjertet, og de bruges til at modellere præferenceaktionspotentialeudbredelse (APP) stier over organet 3,4. Disse strategier kan give et smukt overblik over hjerteorganisationen. Imidlertid er deres rumlige opløsning utilstrækkelig til at undersøge virkningen af strukturel ombygning på hjertefunktion på celleniveau.
Det er udfordrende at placere denne ramme i en anden størrelsesorden, hvor enkeltceller kan spille individuelle roller på handlingspotentialeudbredelse. Den største begrænsning er ineffektiviteten af standardbilleddannelsesmetoder til at udføre billeddannelse i høj opløsning (mikrometrisk opløsning) i massive (centimeterstore) væv. Faktisk er billeddannelse af biologiske væv i 3D ved høj opløsning meget kompliceret på grund af vævets uigennemsigtighed. Den mest almindelige tilgang til at udføre 3D-rekonstruktioner i hele organer er at forberede tynde sektioner. Præcis sektionering, samling og billeddannelse kræver dog en betydelig indsats og tid. En alternativ tilgang, der ikke kræver udskæring af prøven, er at generere et gennemsigtigt væv. I løbet af de sidste år er der foreslået flere metoder til afklaring af væv 5,6,7,8. Udfordringen med at producere massivt, gennemsigtigt og fluorescerende mærket væv er for nylig opnået ved at udvikle ægte vævstransformationsmetoder (CLARITY9, SHIELD10). Clarity-metoden er især baseret på omdannelse af et intakt væv til en nanoporøs, hydrogelhybridiseret, lipidfri form, der gør det muligt at give høj gennemsigtighed ved selektiv fjernelse af membranlipiddobbeltlag. Især har denne metode vist sig at være vellykket også i hjertepræparat11,12,13,14. Men da hjertet er for skrøbeligt til at være egnet til en aktiv rydning, skal det ryddes ved hjælp af den passive tilgang, som kræver lang tid at give fuldstændig gennemsigtighed.
I kombination med avancerede billeddannelsesteknikker som lysarkmikroskopi har CLARITY potentialet til at afbilde 3D massivt hjertevæv ved mikrometrisk opløsning. I lysarkmikroskopi udføres belysningen af prøven med et tyndt lysark, der er begrænset i detektionsmålets fokusplan. Fluorescensemissionen opsamles langs en akse vinkelret på belysningsplanet15. Detektionsarkitekturen ligner widefield-mikroskopi, hvilket gør erhvervelsen meget hurtigere end laserscanningsmikroskoper. Flytning af prøven gennem lysarket gør det muligt at opnå en komplet tomografi af store prøver, op til centimeterstore prøver. På grund af den gaussiske stråles iboende egenskaber er det imidlertid kun muligt at opnå et meget tyndt (i størrelsesordenen nogle få mikron) lysark til en begrænset rumlig udvidelse, hvilket drastisk begrænser synsfeltet (FoV). For nylig er en ny excitationsordning blevet introduceret for at overvinde denne begrænsning og anvendt til hjernebilleddannelse, hvilket tillader 3d-rekonstruktioner med isotrop opløsning16.
I dette dokument præsenteres en passiv clearingmetode, der muliggør en betydelig reduktion af den clearingtid, der er nødvendig i henhold til CLARITY-protokollen. Den metodologiske ramme, der er beskrevet her, gør det muligt at rekonstruere et helt musehjerte med mikrometrisk opløsning i en enkelt tomografisk scanning med en anskaffelsestid i rækkefølgen af minutter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrehåndtering og -procedurer blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i Europa-Parlamentets direktiv 2010/63/EU om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål, og i overensstemmelse med det italienske sundhedsministeriums principper og forskrifter. Forsøgsprotokollen blev godkendt af det italienske sundhedsministerium (protokolnummer 647/2015-PR). Alle dyrene blev leveret af ENVIGO, Italien. Til disse forsøg blev der anvendt 5 C57BL/6J-hanmus på 6 måneder.
1. Forberedelse af opløsning
- Der fremstilles 4% paraformaldehyd (PFA) i fosfatbufferet saltvand (PBS) (pH 7,6) i en kemisk hætte. De 4 % PFA-alikvoter opbevares ved -20 °C i flere måneder.
- Forbered hydrogelopløsning: Bland 4% acrylamid, 0,05% Bis-acrylamid, 0,25% Initiatior AV-044 i 0,01 M PBS i en kemisk hætte. Hold reagenserne og opløsningen på is under hele tilberedningen. Hydrogelaliquoterne opbevares ved -20 °C i flere måneder.
- Forbered rydningsopløsning: Bland 200 mM borsyre, 4% natriumdodecylsulfat (SDS) i deioniseret vand; pH 8,6 i en kemisk hætte. Opbevar opløsningen mellem 21-37 °C for at undgå SDS-udfældning.
- Forbered frisk Tyrodeopløsning på forsøgsdagen: Tilsæt 10 mM glucose, 10 mM HEPES, 113 mM NaCl, 1,2 mM MgCl2 og 4,7 mM KCl; titrere til pH 7,4 ved hjælp af 1 M NaOH.
2. Hjerte isolation
- Injicer 0,1 ml 500 I.U. Heparin subkutant 30 minutter før hjerteisoleringsproceduren.
- Fyld en 30 ml sprøjte og tre 6 cm petriskåle med frisk Tyrode-opløsning. Lav en lille rift (3-4 mm dybde) på grænsen til en af petriskålene og læg den under et stereoskopisk mikroskop.
- Fastgør en kanyle med en diameter på 1 mm på sprøjten, og indsæt den i petriskålens rift. Sørg for, at der ikke er luftbobler i sprøjten.
- Fyld en 20 ml sprøjte med 4% PFA og opbevar den i kemikaliehætten. Forbered en tom petriskål under emhætten.
- Anæstetiser musen med 3% Isofluran/ilt ved en strømningshastighed på 1,0 L/min og ofr den ved cervikal forskydning i henhold til gældende dyrevelfærdsregler.
- Efter ofringen skal du fjerne pelsen over brystet og åbne brystet for at få fuld adgang til hjertet.
- Isoler hjertet, nedsænk det i petriskålen, der tidligere var fyldt med 50 ml Tyrode Solution. Brug kirurgisk saks til at skære aorta umiddelbart nær aortabuen for at få hjertet udsat.
- Overfør hjertet under et stereoskopisk mikroskop og udfør forsigtigt kannulationen. Indsæt ikke kanylen for dybt i aorta (højst 2 mm) for at undgå vævsskade.
- Brug en lille klemme og en sutur (størrelse 5/0) til at fastgøre hjertet til kanylen.
- Gennemsyr hjertet med 30 ml Tyrode-opløsningen med et konstant tryk på 10 ml/min for at fjerne blod fra karrene.
- Tag kanylen af sprøjten, og læg hjertet i petriskålen fyldt med Tyrodeopløsning. Pas på ikke at have luftbobler i kanylen; Ellers skal du fjerne luftboblerne ordentligt.
- Fastgør 20 ml sprøjten fyldt med kold 4% PFA til kanylen og perfuser hjertet ved samme konstante tryk.
- Inkuber hjertet i 10 ml 4% PFA ved 4 °C natten over (O/N). For at undgå vævsnedbrydning skal du udføre trin 2.6-2.13 på kortest mulig tid.
3. Rydning af hjerte
- Den følgende dag vaskes hjertet i 0,01 M PBS 3 gange ved 4 °C i 15 min.
BEMÆRK: Efter dette trin kan hjertet opbevares i PBS + 0,01% natriumazid (NaN3) ved 4 °C i flere måneder. - Inkuberes hjertet i 30 ml Hydrogel-opløsning ved omrystning (15 o / min) ved 4 ° C i 3 dage.
- Afgasning af prøven ved stuetemperatur ved hjælp af en tørretumbler, en vakuumpumpe og et rørsystem, der forbinder tørretumbleren med både pumpen og en nitrogenrørledning.
- Anbring prøven i tørretumbleren, og åbn hætteglasset, og hold hætten på den.
- Luk tørretumbleren, og fjern ilten fra røret ved at åbne nitrogenrørledningen.
- Tænd for vakuumpumpen for at fjerne ilten fra tørretumbleren i 10 minutter.
- Sluk for pumpen, og brug tørretumblerens knap til at åbne nitrogenrørledningen. Når trykket er lig med det atmosfæriske tryk, skal du forsigtigt åbne tørretumbleren og hurtigt lukke hætteglasset.
- Hjertet holdes i den afgassede hydrogelopløsning ved 37 °C i 3 timer i hvile.
- Når hydrogelen er korrekt polymeriseret og fremstår helt gelatinøs, skal du forsigtigt fjerne hjertet fra det og placere det i prøveholderen.
- Prøveholderen med hjertet indsættes i et af clearingkamrene, og luk det ordentligt for at undgå lækager af rydningsopløsningen.
- Tænd for vandbadet, hvor beholderen til rydningsopløsningen er placeret, og peristaltikpumpen for at starte recirkulationen af rydningsopløsningen.
- Skift rydningsløsningen i beholderen en gang om ugen for at fremskynde afklaringsproceduren.
4. Farvning af cellulær membran
- Når hjertet ser helt afklaret ud, fjernes det fra prøveholderen og vaskes i 50 ml opvarmet PBS i 24 timer. Vask igen i 50 ml PBS + 1% Triton-X (PBS-T 1x) i 24 timer.
- Prøven inkuberes i 0,01 mg/ml hvedekim agglutinin (WGA) - Alexa Fluor 633 i 3 ml PBS-T 1x ved omrystning (50 o/min) ved stuetemperatur i 7 dage.
- Efter 7-dages inkubation vaskes prøven i 50 ml PBS-T 1x ved stuetemperatur ved omrystning i 24 timer.
- Prøven inkuberes i 4% PFA i 15 min. og vaskes derefter 3 gange i PBS i 5 minutter hver.
BEMÆRK: Efter dette trin kan hjertet opbevares i PBS + 0,01% NaN3 ved 4 °C i flere måneder. - Inkubere hjertet i stigende koncentrationer af 2,2′-thiodiethanol (TDE) i 0,01 M PBS (20% og 47% TDE/PBS) i 8 timer hver, op til den endelige koncentration på 68% TDE i 0,01 M PBS for at tilvejebringe det krævede brydningsindeks (RI = 1,46). Dette er det RI-matchende medium (RI-medium) til at erhverve billeder16.
5. Hjertemontering og erhvervelse
BEMÆRK: Alle komponenterne i det optiske system er angivet detaljeret i materialetabellen.
- Fyld forsigtigt ca. 80% af den eksterne kuvette (kvarts, 45 mm × 45 mm × 42,5 mm) med RI-mediet.
BEMÆRK: Her er det muligt at bruge forskellige ikke-flygtige løsninger, der garanterer en RI på 1,46. - Fyld forsigtigt den indvendige kuvette (kvarts, 45 mm × 12,5 mm × 12,5 mm) med samme RI-medium.
- Dyp prøven inde i den interne kuvette. De ovenfor beskrevne inkubationer gør det muligt for prøven at forblive stabil inde i RI-mediet uden at blive opbevaret.
- Flyt forsigtigt prøven til bunden af kuvetten ved hjælp af en tynd pincet, og arranger hjertet med dets længdeakse parallelt med kuvettens hovedakse for at minimere excitationslysvejen over vævet under scanningen.
- Fastgør forsigtigt det skræddersyede stik over den indvendige kuvette med to skruer.
- Monter prøven på mikroskoptrinnet ved hjælp af magneterne.
- Oversæt det lodrette prøvetrin manuelt for at nedsænke den interne kuvette i den eksterne.
- Tænd for excitationslyskilden (bølgelængde på 638 nm), og indstil en lav effekt (i størrelsesordenen 3 mW).
- Flyt prøven ved hjælp af den motoriserede oversætter for at belyse et indre plan i vævet.
- Tænd for billedbehandlingssoftwaren (HCImageLive), og indstil kameraets udløser til ekstern (lysark) tilstand for at drive kameraets anskaffelsesudløser ved hjælp af den brugerdefinerede software, der styrer hele opsætningen.
- Aktivér Autosave i panelet Scanningsindstillinger, og indstil outputmappen, hvor billederne skal gemmes.
- Juster prøvepositionen i XY-planet manuelt med de lineære oversættere for at flytte prøven til midten af kamerasensorens FoV.
- Flyt prøven langs Z-aksen ved hjælp af den lineære motoriserede oversætter for at identificere hjertegrænser til tomografisk rekonstruktion.
- Forøg lasereffekten til ~20 mW, klar til billedbehandlingssessionen.
- Start den tomografiske erhvervelse, klik på Start-knappen i sekvenspanelet i billedbehandlingssoftwaren, og flyt samtidig prøven langs Z-aksen med en konstant hastighed på 6 μm / s ved hjælp af den motoriserede oversætter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den udviklede passive rydningsopsætning gør det muligt at opnå et ryddet voksenmusehjerte (med en dimension af ordren 10 mm x 6 mm x 6 mm) på cirka 3 måneder. Alle komponenter i opsætningen er monteret som vist i figur 1. Den ubetydelige temperaturgradient mellem hvert clearingkammer (i størrelsesordenen 3 °C) gør det muligt at opretholde temperaturen i et passende område på tværs af alle kamre.
Figur 1: Skematisk over opsætningen af passiv clearing. Rydningsopløsningen (efter filtrering) cirkulerer efter hinanden gennem prøvekamrene ved hjælp af den peristaltiske pumpe. Vedligeholdelsen af opløsningsbeholderen i et vandbad indstillet til 50 °C gør det muligt for opløsningstemperaturen at være mellem 37-45 °C i kamrene. Billede oprettet med Biorender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2 viser resultatet af rydningsprocessen af et helt hjerte. Som allerede rapporteret af Costantini et al.16 ændrer kombinationen af CLARITY-metoden med TDE som RI-medium ikke prøvens endelige volumen væsentligt eller fører til anisotrop deformation af prøven.
Figur 2: Repræsentativt billede af et hjerte før (til venstre) og efter (til højre) CLARITY-protokollen. Hjerterne bliver helt gennemsigtige og lidt overdimensionerede. Klik her for at se en større version af denne figur.
Når hjertet var ryddet, blev cellulære membraner farvet med en Alexa Fluor 633-konjugeret WGA for at udføre cytoarkitekturrekonstruktionen af hele organet. Det specialfremstillede fluorescenslysarkmikroskop (figur 3) var i stand til at sikre 3D-mikronskalaopløsning på tværs af hele FoV.
Figur 3: MesoSPIM. CAD-gengivelse af det specialfremstillede fluorescenslysarkmikroskop. Klik her for at se en større version af denne figur.
I betragtning af den numeriske blænde (NA = 0,1) af detektionsoptikken kan systemets radiale (XY) punktspredningsfunktion (PSF) estimeres i størrelsesordenen 4-5 μm. På den anden side producerer excitationsoptikken et lysark med en mindste talje på ca. 6 μm (fuld bredde halvt maksimum, FWHM), der afviger op til 175 μm ved kanten af FoV (figur 4A-C). Synkroniseringen af kameraets rullende lukker med laserstrålens aksiale scanning sikrede, at emissionssignalet kun blev opsamlet i prøvedelen, der var spændt med lyspladens talje, hvilket resulterede i en gennemsnitlig FWHM på ca. 6,7 μm langs hele FoV (figur 4B-D).
Figur 4: Generering og karakterisering af lysark . (A) Et excitationslysark genereret med en laserkilde på 638 nm er fokuseret på midten af synsfeltet (FoV) og erhvervet med en pixelstørrelse på 3,25 μm og en eksponeringstid på 10 ms. Lysintensiteten normaliseres og rapporteres med et farvekort. Lysintensitetsprofilens halve maksimum (Full Width Half Maximum) evalueres i 15 forskellige positioner langs FoV. Resultaterne er vist i C. (B) Billede af excitationslysarket, der genereres ved synkroniseringen mellem kameraets rulleskodder, der fungerer ved 1,92 Hz, og lysstrålepositionen drevet af det justerbare objektiv. FWHM for lysintensitetsprofilen evalueres langs FoV, og resultaterne vises i D. Klik her for at se en større version af denne figur.
Mikroskopets Z-PSF blev også estimeret ved en tomografisk rekonstruktion af den fluorescerende nanosfære (figur 5). En FWHM på 6,4 μm kan estimeres af pasformen, i god overensstemmelse med den tidligere vurdering.
Figur 5: Punktspredningsfunktion i Z-aksen. Point Spread Function (PSF) i det optiske system estimeres ved at afbilde fluorescerende nanosfærer i submikronskala (exciteret med et lysark med en bølgelængde på 638 nm) med en pixelstørrelse på 3,25 μm × 3,25 μm × 2,0 μm. PSF-intensitetsprofil langs den optiske akse (Z) er repræsenteret som sorte prikker. PSF-profilen er udstyret med en gaussisk funktion med μ = 18,6 μm og σ = 2,7 μm. PSF's FWHM estimeret ved pasformen er 6,4 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
På grund af vævets høje gennemsigtighed var det muligt at belyse hele hjertet uden signifikant forvrængning af det aksialt scannede lysark ved en excitationsbølgelængde på 638 nm. Fluorescenssignalet blev opsamlet af sCMOS-sensoren, der opererede ved 500 ms eksponeringstid og en billedhastighed på 1,92 Hz. Baseret på tidligere kvantificering blev den tomografiske erhvervelse udført ved hjælp af en Z-scanningshastighed på 6 μm / s, og under forudsætning af en billedhastighed på 1,92 Hz blev der erhvervet en ramme hver 3,12 μm, hvilket oversamplede systemet Z-PSF med ca. to gange. To repræsentative rammer (på koronale og tværgående planer) i venstre ventrikel kammer er vist i figur 6. Dette resultat bekræfter systemets potentiale til at løse enkelte cellulære membraner i tre dimensioner med et tilstrækkeligt signal/støj-forhold i hele organet (figur 6).
Figur 6: Rekonstruktion af musehjertevæv. Det klarede hjerte blev farvet med WGA konjugeret til Alexa Fluor 633 og ophidset af en laserkilde med en bølgelængde på 638 nm. (A) Koronale og (B) tværgående repræsentative sektioner. (C-D) Vævstransformation producerer høj vævsgennemsigtighed, hvilket gør det muligt at løse små strukturer i vægdybden. Det optiske system viser en aksial opløsning, der er tilstrækkelig til at løse mikrometriske strukturer (panel. D). (E) 3D hjertegengivelse med lav opløsning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette arbejde blev der introduceret en vellykket tilgang til at rydde, plette og afbilde et helt musehjerte i høj opløsning. For det første blev en vævstransformationsprotokol (CLARITY) optimeret og udført, lidt modificeret til dens anvendelse på hjertevævet. For at opnå en effektiv rekonstruktion i 3D af et helt hjerte er det faktisk vigtigt at forhindre fænomenet lysspredning. CLARITY-metoden giver os mulighed for at opnå et meget gennemsigtigt intakt hjerte, men det kræver lange inkubationstider, når det udføres passivt (ca. 5 måneder). Med hensyn til hjernen er hjertevævet ikke egnet til en aktiv rydning, der udnytter et elektrisk felt. Selv ved lave spændinger fører det elektriske felt til skader og vævsbrud. Her blev en passiv clearingtilgang optimeret til at opnå et helt renset hjerte på ca. 3 måneder. Efter isolering og kannulering af hjertet gennem den proksimale aorta blev CLARITY-metoden udført som beskrevet i afsnit 3 i protokollen. For at fremskynde proceduren blev der arrangeret en hjemmelavet passiv clearingopsætning (figur 1), som endte med at reducere timingen af vævsrensning med ca. 40%. Opsætningen består af en beholder til rydningsopløsningen, et vandbad, en peristaltisk pumpe, flere kamre indeholdende forskellige prøveholdere, kapselfiltre til hvert kammer og et slangesystem til recirkulation af opløsningen. Pumpen ekstraherer og cirkulerer opløsningen fra beholderen i rækkefølge gennem hvert af kamrene, hvor prøverne holdes til rydning. Før den kommer ind i kamrene, strømmer opløsningen gennem et kapselfilter for at fange lipiderne, der skylles væk fra væv under rydningen. Den optimale temperatur for rydningsopløsningen, mellem 37-45 °C, opretholdes i kamrene under recirkulationen ved at holde opløsningsbeholderen i et vandbad ved 50 °C. Det tilrådes at ændre rydningsopløsningen i beholderen en gang om ugen under proceduren. Alle anvendte komponenter er angivet detaljeret i materialetabellen. Den optimerede løsning, der præsenteres her, giver os mulighed for at opnå et helt passivt ryddet musehjerte på betydeligt kortere tid med hensyn til standard passiv clearingteknik, hvilket reducerer den krævede eksperimentelle tid uden at beskadige organet. Farvningsmetoden blev også optimeret til homogen mærkning af cellemembranerne og endotelet ved hjælp af et fluorescerende lectin (WGA - Alexa Fluor 633).
Hjertecytoarkitekturen er blevet rekonstrueret ved at udvikle en dedikeret mesoSPIM, der aksialt fejer lysarket hen over prøven (https://mesospim.org). Det specialfremstillede fluorescenslysarkmikroskop (figur 3) var i stand til hurtigt at erhverve billeder af en mesoskopisk FoV (i størrelsesordenen millimeter) med mikrometrisk opløsning. På denne måde kan enkelte kardiomyocytter løses og kortlægges i en 3D-rekonstruktion af hele organet. Mikroskopet belyser den ryddede prøve med et lysark, dynamisk genereret ved at scanne en laserstråle ved 638 nm ved hjælp af et galvanometrisk spejl. Et sCMOS-kamera karakteriserer detektionsarmen i et 2x forstørrelsesskema, der gør det muligt at erhverve hele FoV i en enkelt scanning. Fluorescenssignalet blev valgt ved at placere et langpasfilter efter målet. Kameraet blev indstillet til at arbejde i rullende lukkertilstand: Til enhver tid synkroniseres linjerne i aktive kamerapixels (dvs. udsat for billedet) med forskydningen i plan af lysarkets brændvidde, udført af en elektrisk justerbar linse. Denne tilgang maksimerede den optiske sektioneringskapacitet i hele FoV ved kun at erhverve billeder i den tyndeste del af det fokuserede lysark. Denne løsning adskiller sig fra konventionelle konfigurationer, hvor erhvervelse involverer hele lysarkets brændvidde, hvilket forhindrer maksimal optisk sektionsopløsning i store dele af FoV. Et integreret prøvetrin understøtter kuvetter og optimerer derved positionering og muliggør aksial bevægelse af prøven under billeddannelsesprocessen. På denne måde er tomografiske rekonstruktioner mulige ved at erhverve på hinanden følgende interne sektioner. De opnåede billeder har en mesoskopisk FoV og en mikrometrisk opløsning, mens den anskaffelsestid, der kræves for et helt musehjerte, er ~ 15 min. Synkroniseringen mellem kameraets rullende lukker og excitationslysstrålen, der fejer FoV, gør det muligt at erhverve hele billedplanet med en høj rumlig opløsning (figur 4). Dette muliggør direkte rekonstruktion af prøven i en enkelt tomografisk erhvervelse uden behov for prøve radial forskydning og multi-tilstødende stakkebaseret billeddannelse. Især tillod mikroskopet rekonstruktionen af hele organet på ca. (10 mm x 6 mm x 6 mm) i en enkelt billeddannelsessession med en næsten isotrop voxelstørrelse og et tilstrækkeligt signal-til-baggrund-forhold til at løse enkeltceller på tværs af hele organet potentielt.
Det er bemærkelsesværdigt, at den foreslåede protokol præsenterer nogle kritiske trin, der skal udføres omhyggeligt for at opnå gode resultater. Især kannelation af hjertet gennem den proksimale aorta kan være ret vanskelig, men det er et vigtigt skridt at vaske og fiksere organet korrekt. Judd et al.17, viste, hvordan man udfører dette trin effektivt. Desuden er den afgasningsprocedure, der kræves i henhold til CLARITY-protokollen, også ret kompleks, men den er afgørende for vævsbevarelse. Hvis dette trin ikke udføres korrekt, kan vævet støde på skader og henfald under inkubationen i rydningsopløsningen.
Selvom den præsenterede eksperimentelle arbejdsgang er egnet til små fluorescerende sonder, giver brugen af immunohistokemi ikke altid god effektivitet i farvningen på grund af antistoffernes højere molekylvægt. Hver immunostaining-protokol kræver korrekt optimering, og forskellige tilgange er blevet udtænkt for at forbedre antistofpenetrationen, for eksempel vævsudvidelse18 og / eller variationer i pH og ionstyrke19.
MesoSPIM-opsætningen præsenterer også to hovedbegrænsninger: i) bevarelsen af lysarket på tværs af prøven er stærkt afhængig af vævsgennemsigtigheden, og ii) kamerasensorens dimension begrænser FoV. At garantere et perfekt brydningsindeks, der matcher inde i hele hjertet, er meget udfordrende, og små variationer på brydningsindekset kan producere lysspredning, hvilket fører til forringelse af billedkvaliteten. I denne henseende kan der indføres et dobbeltsidet belysningsskema. To excitationsarme kan generere to forskellige og justerede dynamiske lysark med maksimalt fokuseret belysning ved at skifte belysningen fra den ene side til den anden af prøven. FoV kan også forbedres ved at bruge en ny generation af højopløselige baggrundsbelyste sCMOS med meget store sensorer i kombination med telecentriske objektiver med høj numerisk blænde med lav feltforvrængning. Denne implementering ville give os mulighed for at rekonstruere større organer eller udvidede væv, der opretholder den samme optiske sektionskapacitet og dermed producerer mikronskala 3D-billeder af centimeterstore ryddede prøver.
Selvom den præsenterede protokol stadig kræver lang tid til prøveforberedelse og et højt niveau af gennemsigtighed for at opnå en pålidelig cytoarkitekturrekonstruktion af hele organet, ligger hovedbetydningen af tilgangen i forbedringerne af clearingprotokollen og evnen til at udføre mesoskopisk rekonstruktion i en enkelt scanning ved mikrometrisk opløsning. I fremtiden kan disse fremskridt kombineres med en multi-farvningsprotokol for at opnå rekonstruktion af hele organer, der integrerer forskellige biologiske strukturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette projekt har modtaget finansiering fra EU's Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram under tilskudsaftale nr. 952166 (REPAIR), MUR under FISR-programmet, projekt FISR2019_00320 og Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, PERCARE-projektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-2’ Thiodiethanol | Sigma-Aldrich | 166782 | |
| Acrylamide | Bio-Rad | 61-0140 | |
| AV-044 Initiator | Wako Chemicals | AVP5874 | |
| Bis-Acrylamide | Bio-Rad | 161-042 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Camera | Hamamatsu | Orca flash 4.0 v3 | |
| Camera software | Hamamatsu | HC Image | |
| Collimating lens | Thorlabs | AC254-050-A-ML | |
| Detection arm | Integrated optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Excitation lens | Nikon | 91863 | |
| Exteraìnal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-753 | |
| Fold mirrors | Thorlabs | BBE1-E02 | |
| Galvanometric mirror | Thorlabs | GVS211/M | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCImage Live | Hamamatsu | 4.6.1.19 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Internal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-204 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Laser source | Integrated Optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Long-pass filter | Thorlabs | FELH0650 | |
| Magnetic base | Thorlabs | KB25/M | |
| MgCl2 | Chem-Lab | CI-1316-0250 | |
| Motorized traslator | Physisk Instrument | M-122.2DD | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 59888 | |
| Objective | Thorlabs | TL2X-SAP | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Polycap AS | Whatman | 2606T | |
| Relay lens | Qioptiq | G063200000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Tube lens | Thorlabs | ACT508-200-A-ML | |
| Tunable lens | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger Inc | N86KT.18 | |
| Water bath | Memmert | WTB |
References
- Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling. Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).
- Finocchiaro, G., et al. Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death. EP Europace. 2, 1-11 (2021).
- Bishop, M. J., et al. Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).
- Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation. IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106, 369-387 (2020).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Park, Y. G., et al. Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers. Nature Biotechnology. 37, 73 (2019).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769 (2018).
- Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).
- Pianca, N., et al. Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery. The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).
- Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).
- Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative - open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5, 9808 (2015).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012 (2016).
- Yi, F., et al. Microvessel prediction in H&E stained pathology images using fully convolutional neural networks. BMC Bioinformatics. 19 (1), 64 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1982 (2020).
