Summary
Una lesione transitoria da scottatura (65 °C ± 0,5 °C, 3 s) di una zampa posteriore riduce la soglia (g) alla stimolazione del filamento di von Frey del lato ipsilaterale e altera il modello dell'andatura. Inoltre, la lesione da ustione induce un comportamento simile alla depressione nel test di nuoto forzato.
Abstract
L'acqua scottante è la causa più comune di ustioni sia nelle popolazioni anziane che in quelle giovani. È una delle principali sfide cliniche a causa dell'alta mortalità e delle sequele nei paesi a basso e medio reddito. Le ustioni spesso inducono intenso dolore spontaneo e allodinia persistente, nonché problemi potenzialmente letali. Ancora più importante, il dolore eccessivo è spesso accompagnato da depressione, che può ridurre significativamente la qualità della vita. Questo articolo mostra come sviluppare un modello animale per lo studio del dolore indotto da ustioni e del comportamento simile alla depressione. Dopo l'anestesia, la lesione da ustione è stata indotta immergendo una zampa posteriore del topo in acqua calda (65 ° C ± 0,5 ° C) per 3 s. Il test di von Frey e l'analisi automatizzata dell'andatura sono stati eseguiti ogni 2 giorni dopo la lesione da ustione. Inoltre, il comportamento simile alla depressione è stato esaminato utilizzando il test di nuoto forzato e il test a rotazione è stato eseguito per differenziare la funzione motoria anormale dopo la lesione da ustione. Lo scopo principale di questo studio è descrivere lo sviluppo di un modello animale per lo studio del dolore indotto da ustioni e del comportamento simile alla depressione nei topi.
Introduction
Il danno tissutale, come ustioni e traumi, è generalmente associato alla co-occorrenza di dolore acuto. Le ustioni e i sintomi legati al trauma sono stimati in 1.80.000 morti ogni anno causati da ustioni: la stragrande maggioranza si verifica nei paesi a basso e medio reddito da diversi tipi di ustioni1. Secondo un rapporto mondiale, le ustioni sono comuni nei bambini e rappresentano circa il 40% -60% dei pazienti ospedalizzati 2,3. Queste lesioni specifiche sono ancora più gravi in quanto possono verificarsi nella vita di tutti i giorni, come l'ebollizione o l'acqua di balneazione 4,5. Sebbene il dolore acuto possa essere risolto spontaneamente dopo il recupero dal danno tissutale nella maggior parte dei casi, può essere possibile diventare cronico a causa di cambiamenti anormali nel sistema nervoso 6,7.
Recentemente, è stato suggerito che il dolore acuto può indurre uno stato d'animo depresso e il dolore cronico può causare ansia e depressione 8,9,10,11. La coesistenza di dolore e depressione rende più difficile trattare il paziente. La depressione tende anche ad aumentare la sensibilità al dolore, che è probabile che induca depressione e dolore più intensi12. Le complicanze del dolore e della depressione sono mostrate in modelli animali di infiammazione periferica 13,14,15,16. I meccanismi dettagliati alla base della depressione indotta dal dolore non sono ben noti fino ad ora17. Pertanto, è necessario sviluppare trattamenti più efficaci per le ustioni per alleviare gli effetti collaterali e i sintomi.
Pertanto, il presente studio è stato progettato per sviluppare un modello animale per studiare il dolore acuto indotto da ustioni e il comportamento simile alla depressione nei topi. Per questo, sono stati misurati la sensibilità tattile anormale correlata alle ustioni, il modello di andatura alterato e il comportamento simile alla depressione. Inoltre, questo studio tenta di convalidare il modello utilizzando i FANS.
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Protocol
Tutti i protocolli sperimentali sono stati esaminati e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso la Chungnam National University in Corea del Sud, e quindi condotti sulla base delle linee guida etiche dell'Associazione internazionale per lo studio del dolore18.
1. Induzione di lesioni da ustione scottante sulla zampa posteriore
- Ospitare i topi ICR maschi del peso di 20-25 g in una stanza luminosa e a temperatura controllata (ciclo luce-buio 12/12 h, 22,5 °C ± 2,5 °C) con un'umidità del 40%-60%.
NOTA: sia i topi maschi che quelli femmine possono essere utilizzati per questo protocollo. - Consentire all'animale il libero accesso al cibo e all'acqua e acclimatarsi per almeno 1 settimana prima di iniziare l'esperimento.
NOTA: Tutti gli animali sono stati alloggiati in gruppo per escludere variabili come lo stress da isolamento. - Assegna i topi in modo casuale al gruppo sperimentale o di controllo e conduci esperimenti ciechi usando numeri di animali come codici.
- Il giorno dell'induzione dell'ustione, anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale (i.p.) di 300 μL di alfaxalone alla dose di 100 mg/kg. Indossare un camice chirurgico, guanti e maschera durante l'esecuzione dell'induzione dell'ustione.
- Dopo aver anestetizzato profondamente il mouse, disinfettare intorno alla zampa posteriore destra con il 70% di etanolo.
NOTA: Controllare la mancanza di risposta alla stimolazione del pizzico applicata alle dita posteriori o alla coda per confermare lo stato di anestesia profonda. - Applicare un unguento oftalmico agli occhi per prevenire l'essiccazione corneale dopo l'induzione dell'anestesia.
- Immergere la zampa posteriore destra del topo profondamente anestetizzato in acqua calda a 65 °C ± 0,5 °C per 3 s. Fai un segno sulla caviglia di ogni topo prima di immergere la zampa posteriore in acqua calda per mantenere la consistenza nella zona bruciata.
- Dopo l'induzione delle ustioni, portare i topi in una gabbia domestica pulita e metterli su una piastra riscaldante fino a quando gli animali non si riprendono dall'anestesia.
NOTA: L'agente analgesico, paracetamolo (200 mg/kg), è stato somministrato per via intraperitoneale una volta al giorno per 7 giorni a partire dal giorno della ustione (solo burn + gruppo paracetamolo). Il gruppo Burn è stato trattato con soluzione salina come controllo del veicolo. L'esperimento è stato eseguito secondo il metodo descritto in uno studio precedente4.
2. Misurazione dell'allodinia meccanica
- Porta i topi nella sala di test comportamentali e lasciali acclimatare almeno per 30 minuti prima del test. Indossare un camice chirurgico, guanti e maschera durante l'esecuzione del test.
- Posizionare i topi in una scatola quadrata (diametro: 13 cm, altezza: 12 cm) su un pavimento in rete metallica (dimensioni della maglia: 0,7 cm x 0,7 cm) e lasciarli acclimatare per almeno 30 minuti.
- Valutare la soglia meccanica della zampa posteriore utilizzando il metodo dello stimolo ascendente19,20.
- Colpire delicatamente una serie di filamenti di von Frey con intervalli di 5-8 s per stimolare il plantare posteriore. Ottenere i valori basali il giorno prima dell'induzione della bruciatura.
NOTA: I filamenti di von Frey da 0,16-1,2 g sono stati utilizzati nel test per misurare la soglia di prelievo della zampa in tutti gli animali, rispettivamente. Il test di risposta al ritiro della zampa è stato avviato con la più bassa forza di flessione del filamento di von Frey (0,16 g in questo protocollo). Se non c'era risposta, veniva applicato un filamento con la forza di flessione successiva. - Eseguire cinque prove per valutare le soglie meccaniche per ogni zampa posteriore ipsilaterale (ferita).
NOTA: La forza di flessione del filamento di von Frey che produce risposta più di tre volte delle cinque prove in ciascun animale è stata espressa come soglia di prelievo della zampa (PWT, g). Le soglie meccaniche sono state misurate un giorno prima e a 1, 3, 5 e 7 giorni dopo la lesione da ustione. L'effetto analgesico è stato valutato 1 ora dopo la somministrazione del paracetamolo nell'animale.
3. Analisi automatizzata dell'andatura
- Acclimatare i topi nel sistema di analisi dell'andatura una volta al giorno per 10-15 minuti da 5 giorni prima della lesione da ustione. Indossare un camice chirurgico, guanti e maschera durante l'esecuzione dell'analisi dell'andatura.
- Il giorno del test, portare i topi nella sala test comportamentale e acclimatarli per almeno 30 minuti prima del test.
NOTA: eseguire test di acclimatazione e analisi dell'andatura in un ambiente buio. Impostare le condizioni del menu del programma come segue.- Dopo aver eseguito il programma, fare clic sul menu Crea nuovo esperimento per designare la cartella in cui salvare i dati.
- Dopo la designazione, impostare il tempo di funzionamento massimo su 5 s e le variazioni di velocità massime consentite al 50%.
- Selezionare una telecamera registrata e impostare la lunghezza della passerella su 30 cm nella scheda Configurazione del programma.
- Nella scheda Acquisisci del menu del programma, selezionare Apri acquisizione.
- In base ai messaggi di stato, fare clic sul pulsante Snap Background per acquisire un'immagine di sfondo di una passerella vuota.
- Fare clic sul pulsante Avvia acquisizione , quindi posizionare il mouse all'ingresso della passerella attraversabile sinistra-destra. La registrazione inizierà automaticamente seguendo il libero movimento del mouse.
NOTA: se l'andatura dell'animale è stata registrata con successo e tutti i passi sono stati rilevati, verrà contrassegnato come Esecuzione conforme con un'icona verde. Se il software non rileva alcun passo, viene visualizzata un'icona rossa, nel qual caso si consiglia di eseguire nuovamente la registrazione. Gli autori raccomandano di raccogliere e analizzare almeno cinque esecuzioni conformi di successo eseguite con velocità di esecuzione simili. - Nella scheda Acquisisci del menu del programma selezionare Classifica esecuzioni.
NOTA: dopo aver selezionato i dati ottenuti dall'esecuzione di conformità riuscita sopra, passare alla schermata di analisi video in cui sono stati registrati i modelli di andatura dei topi. - Selezionare la corsa da analizzare e fare clic sul pulsante Auto Classify .
- Dopo aver eseguito la classificazione automatica, rimuovere il naso, il riconoscimento genitale e il riconoscimento errato delle zampe per i dati spazzatura in ogni corsa, quindi analizzare i dati.
NOTA: tutti i parametri statistici vengono automaticamente analizzati e salvati nel programma e i valori dei dati grezzi possono essere trovati nel menu di analisi dello sperimentatore. L'analisi automatica dell'andatura è stata eseguita prima e a 1, 3, 5 e 7 giorni dopo la lesione da ustione. La valutazione è stata eseguita 30 minuti dopo la somministrazione di paracetamolo nel gruppo Burn + Paracetamolo e 30 minuti dopo il trattamento salino nel gruppo Burn. Questo esperimento è stato eseguito secondo il metodo descritto negli studi precedenti 4,21,22.
4. Misurazione del comportamento simile alla depressione
NOTA: Comportamento basato sulla disperazione, il tempo di immobilità in acqua è stato misurato dal test di nuoto forzato.
- Porta i topi nella sala di test comportamentale e acclimatali per almeno 30 minuti prima del test. Indossare un camice chirurgico, guanti e maschera durante l'esecuzione del test di nuoto forzato.
- Mettere il mouse in un cilindro di plexiglass trasparente (10 cm x 25 cm) contenente 15 cm di acqua (25 °C ± 0,5 °C) per 15 min.
- Dopo 24 ore, mettere il mouse nel cilindro delle stesse condizioni e misurare il tempo di immobilità.
NOTA: Il tempo di immobilità è stato misurato per 5 minuti di tempo di prova e il tempo in cui i topi hanno smesso di arrampicarsi o nuotare e galleggiavano per mantenere la testa sopra la superficie dell'acqua è stato registrato. Il test di nuoto forzato è stato eseguito il giorno 7 dopo l'ustione. La valutazione è stata eseguita 1 ora dopo la somministrazione di paracetamolo nel gruppo Burn + Paracetamolo e 1 ora dopo il trattamento salino nel gruppo Burn. L'esperimento è stato eseguito secondo il metodo descritto in precedenti studi23,24.
5. Misurazione della normale funzione del motore
NOTA: Il test rota-rod è stato eseguito per differenziare la funzione motoria anormale dopo la lesione da ustione.
- Porta i topi nella sala di test comportamentale e acclimatali per almeno 30 minuti prima del test. Indossare un camice chirurgico, guanti e maschera durante l'esecuzione del test di nuoto forzato.
- Posizionare gli animali su una piattaforma cilindrica rotante (5,7 cm di larghezza; 3 cm di diametro) sospesa a 16 cm sopra il fondo dell'apparecchio.
- Lasciare che ogni animale si alleni una volta al giorno su un'asta rotante per almeno 5 giorni prima dell'induzione di ustioni.
- Eseguire il test rota-rod ogni 20 minuti per 2 ore dopo la somministrazione del farmaco. Impostare il tempo limite su 2 min.
- Misurare la durata del tempo in cui il mouse scorre su un'asta rotante alla velocità costante di 15 giri al minuto senza cadere.
NOTA: Il test rota-rod è stato eseguito 7 giorni dopo l'induzione della lesione da ustione. La valutazione è stata eseguita immediatamente dopo la somministrazione di paracetamolo nel gruppo Burn + Paracetamolo e dopo il trattamento salino nel gruppo Burn. Alfaxalone è stato utilizzato come controllo positivo per i farmaci trattati sperimentalmente in questo test. Durante il test rotarod, viene misurata la durata del tempo in cui il mouse scorre sull'asta rotante senza cadere. L'esperimento è stato eseguito secondo il metodo descritto in precedenti studi22,25.
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Representative Results
Al fine di ridurre al minimo la sofferenza animale e ridurre il numero di animali utilizzati secondo le linee guida Three R (Replacement, Reduction, and Refinement), questo studio è stato progettato con il numero minimo di animali per la raccolta di dati significativi stabiliti attraverso esperimenti preliminari. In questo studio, gli esperimenti comportamentali sono stati condotti in modo indipendente due volte come segue. L'analisi dell'andatura, l'allodinia meccanica e i test di comportamento simile alla depressione sono stati condotti con i gruppi Control (n = 5), Burn (n = 7; controllo del veicolo; soluzione salina) e Burn + Paracetamolo (n = 7). Nella prova rota-rod, Controllo (n = 3), Brucia (n = 4; controllo del veicolo; soluzione salina), Brucia + Paracetamolo (n = 4), Controllo positivo (n = 4; Alfaxalone) sono stati progettati gruppi. Alfaxalone è un tipo di steroide neuroattivo e anestetico che è attualmente utilizzato in medicina veterinaria come induttore anestetico generale iniettabile. In questo studio, l'alfaxalone è stato utilizzato in anestesia animale per l'induzione della ustione e usato come farmaco di controllo positivo per le menomazioni motorie nel test rota-rod.
I dati sono stati espressi come ± S.E.M. Inoltre, i dati sperimentali ottenuti in momenti diversi sono stati analizzati in modo indipendente. Le risposte comportamentali al dolore sono state calcolate come l'area sotto la curva (AUC). Misure ripetute bidirezionali ANOVA è stato eseguito per determinare le differenze nei dati dal test meccanico dell'allodinia, dall'analisi dell'andatura e dal test rota-rod nel tempo. Il test di Dunnett è stato utilizzato per l'analisi post-hoc per determinare il valore P tra i gruppi sperimentali. Valori P inferiori a 0,05 sono stati considerati significativi. Il software GraphPad Prism 6.0 è stato utilizzato per analizzare questa validità statistica. Tutte le procedure di analisi statistica sono state eseguite alla cieca in relazione alle condizioni sperimentali. Una figura che illustra il danno tissutale indotto da ustioni è mostrata nella Figura supplementare 1.
I cambiamenti di rotta temporale nella soglia di prelievo della zampa (PWT, g) dopo la lesione da ustione sono mostrati nella Figura 1. La PWT (g) dei topi indotti da ustioni è diminuita 1 giorno dopo l'induzione della ustione e sostenuta per 7 giorni rispetto a quella del gruppo di controllo. La somministrazione di paracetamolo (200 mg/kg, cioè una volta al giorno per 7 giorni a partire dal giorno dell'induzione della bruciatura) ha ridotto significativamente la diminuzione indotta dalla bruciatura della PWT (Figura 1A, ** p < 0,01 rispetto al gruppo Burn). Inoltre, l'analisi dell'AUC (per 7 giorni) ha mostrato che la somministrazione di paracetamolo ha ridotto significativamente l'allodinia meccanica indotta da ustioni (Figura 1B, *** p < 0,001 rispetto al gruppo di controllo, ** p < 0,01 rispetto al gruppo Burn).
I cambiamenti nell'area di stampa della zampa posteriore dopo la lesione da ustione nel tempo sono mostrati nella Figura 2. La lesione da ustione ha ridotto significativamente l'area di stampa della zampa posteriore ipsilaterale dal giorno dopo l'induzione e ha persistito per 7 giorni. L'area di stampa della zampa posteriore è stata significativamente migliorata somministrando paracetamolo (200 mg/kg, cioè una volta al giorno per 7 giorni a partire dal giorno dell'induzione della bruciatura) rispetto al gruppo trattato con il veicolo (Figura 2A, B, * p < 0,05 e ** p < 0,01 rispetto al gruppo Burn).
I cambiamenti di rotta temporale in una singola posizione dopo l'ustione sono mostrati nella Figura 3. La lesione da ustione ha ridotto la singola posizione (%) della zampa posteriore omolaterale 1 giorno dopo l'induzione della ustione e questa riduzione è stata mantenuta per 7 giorni. La posizione singola della zampa posteriore è stata migliorata dalla somministrazione di paracetamolo (200 mg/kg, cioè una volta al giorno per 7 giorni a partire dal giorno dell'induzione della bruciatura) rispetto al gruppo trattato con veicolo (Figura 3A,B, * p < 0,05 rispetto al gruppo Burn).
Le variazioni del tempo di immobilità ottenute dalla prova di nuoto forzato sono mostrate nella Figura 4. Il tempo di immobilità dei topi indotti da ustioni è aumentato 7 giorni dopo l'induzione dell'ustione rispetto a quello del gruppo di controllo. Nei topi indotti da ustioni, la somministrazione di paracetamolo (200 mg/kg, cioè una volta al giorno per 7 giorni a partire dal giorno dell'induzione dell'ustione) ha ridotto significativamente l'aumento del tempo di immobilità indotto da ustioni (** p < 0,01 e *** p < 0,001 rispetto al gruppo Burn).
La normale funzione motoria è stata valutata in base alle variazioni del tempo di funzionamento sull'asta rotante, come mostrato nella Figura 5. Il tempo di esecuzione dei topi indotti da ustioni non è cambiato a 7 giorni dopo l'induzione dell'ustione rispetto a quello del gruppo di controllo. Al contrario, il tempo di esecuzione dei topi trattati con alfaxalone (controllo positivo) è diminuito significativamente durante circa 60 minuti. Questo risultato indica che una lesione da ustione utilizzata in questo studio non causa compromissione motoria (*** p < 0,001 rispetto al gruppo Burn).
Figura 1: Allodinia meccanica valutata dal test di von Frey in topi indotti da ustioni. (A) La soglia di prelievo della zampa (PWT, g) nella zampa posteriore ipsilaterale dei topi è diminuita 1 giorno dopo la lesione da ustione e sostenuta per 7 giorni rispetto al gruppo di controllo. La somministrazione di paracetamolo (200 mg/kg, cioè una volta al giorno per 7 giorni a partire dal giorno dell'induzione dell'ustione) ha ridotto significativamente l'allodinia meccanica indotta da ustioni. (B) Il PWT è stato analizzato come l'area sotto la curva (AUC). Le frecce indicano il giorno della somministrazione del farmaco. p < 0,001 contro il gruppo di controllo, ** p < 0,01 contro il gruppo burn. Misure ripetute bidirezionali ANOVA è stato eseguito per determinare gli effetti complessivi nel corso del test di von Frey. L'analisi post-hoc è stata eseguita utilizzando il test di Dunnett per determinare il valore P. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Area di stampa della zampa ottenuta dall'analisi automatizzata dell'andatura in topi indotti da ustioni. (A) Immagini rappresentative delle zampe posteriori ipsilaterali e controlaterali dei topi sono state catturate dal software di analisi dell'andatura. La dimensione di contatto della zampa è ridotta dopo la lesione da ustione rispetto a quella del gruppo di controllo. Questa riduzione è stata parzialmente recuperata somministrando paracetamolo (200 mg/kg, cioè una volta al giorno per 7 giorni a partire dal giorno di induzione dell'ustione). I rettangoli bianchi indicano le zampe posteriori analizzate dal software, (B) un grafico mostra i cambiamenti di rotta temporale nell'area di stampa della zampa (%). I dati sono calcolati come percentuale di variazioni nell'area di stampa tra le zampe posteriori ipsilaterali (destra) e controlaterali (sinistra) (ad esempio, il valore del 50% indica le stesse aree di stampa della zampa nelle zampe posteriori destra e sinistra). Le frecce indicano il giorno della somministrazione del farmaco. * p < 0,05 e ** p < 0,01 contro il gruppo Burn. Misure ripetute bidirezionali ANOVA è stato eseguito per determinare gli effetti complessivi nel corso temporale dell'area di stampa sull'analisi dell'andatura. L'analisi post-hoc è stata eseguita utilizzando il test di Dunnett per determinare il valore P. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Singola posizione ottenuta dall'analisi automatizzata dell'andatura in topi indotti da ustioni. (A) Immagini rappresentative di una singola posizione sono state acquisite dal software di analisi dell'andatura. Diversi colori indicavano la posizione di ogni zampa: blu, zampa anteriore destra; rosa, zampa posteriore destra; giallo, zampa anteriore sinistra; verde, zampa posteriore sinistra. La singola posizione della zampa posteriore ipsilaterale è stata accorciata dopo la lesione da ustione. Questo cambiamento è stato parzialmente recuperato somministrando paracetamolo (200 mg/kg, cioè una volta al giorno per 7 giorni a partire dal giorno dell'induzione dell'ustione). (B) Un grafico mostra i cambiamenti di rotta temporale nella singola posizione (%). I dati sono riassunti come un grafico a linee dopo aver calcolato la percentuale di cambiamenti nella singola posizione tra le zampe posteriori omolaterali (destra) e controlaterali (sinistra) (ad esempio, il valore del 50% indica la stessa singola posizione nelle zampe posteriori destra e sinistra). Le frecce indicano il giorno della somministrazione del farmaco. * p < 0,05 contro il gruppo Burn. Misure ripetute bidirezionali ANOVA è stato eseguito per determinare gli effetti complessivi nel corso temporale della singola posizione sull'analisi dell'andatura. L'analisi post-hoc è stata eseguita utilizzando il test di Dunnett per determinare il valore P. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Il tempo di immobilità del test di nuoto forzato nei topi indotti da ustioni. Il tempo di immobilità dei topi indotti da ustioni è aumentato 7 giorni dopo l'induzione dell'ustione rispetto a quello del gruppo di controllo. Nei topi indotti da ustioni, la somministrazione di paracetamolo (200 mg / kg, cioè una volta al giorno per 7 giorni a partire dal giorno dell'induzione dell'ustione) ha alleviato significativamente il tempo di immobilità indotto da ustioni. p < 0,001 contro il gruppo di controllo, ** p < 0,01 contro il gruppo burn. Sono state eseguite misure ripetute unidirezionali ANOVA per determinare gli effetti complessivi nel corso del test di nuoto forzato. L'analisi post-hoc è stata eseguita utilizzando il test di Dunnett per determinare il valore P. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: La normale valutazione della funzione motoria basata sulle variazioni nel tempo di esecuzione del test rota-rod nei topi indotti da ustioni. Non vi è stato alcun cambiamento nel tempo di esecuzione dei topi indotti da ustioni a 7 giorni dopo l'induzione dell'ustione rispetto a quelli dei gruppi di lesioni da ustione trattati con paracetamolo e di controllo. Tuttavia, il tempo di esecuzione dei topi trattati con alfaxalone (controllo positivo) è stato significativamente ridotto a ~ 60 s. Questo risultato indica che una lesione da ustione utilizzata in questo studio non causa compromissione motoria. p < 0,001 contro il gruppo Burn. Sono state eseguite misure ripetute bidirezionali ANOVA per determinare gli effetti complessivi nel corso temporale del test rota-rod. L'analisi post-hoc è stata eseguita utilizzando il test di Dunnett per determinare il valore P. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 1 supplementare: Cambiamenti nel danno tissutale nel tempo dopo l'induzione di ustioni. Dopo l'induzione dell'ustione scottante, è stato osservato un danno tissutale significativo, che è aumentato gradualmente nel tempo. In questo studio, il paracetamolo, usato come farmaco di controllo positivo, ha mostrato un effetto protettivo sui danni ai tessuti. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
La scottatura è una sorta di bruciatura termica causata da liquidi riscaldati. È stato suggerito che le ustioni di primo o secondo grado si verificano nella maggior parte dei casi, ma il contatto a lungo termine con fonti di calore può causare ustioni di terzo grado26. Nel presente studio, la lesione da ustione è stata indotta esponendo la zampa posteriore destra dei topi in acqua calda a 65 ° C per 3 s 4,26. Il danno tissutale è stato rilevato nella zampa ferita da ustione, che mostra sintomi comuni di ustioni come arrossamento, desquamazione della pelle e gonfiore (Figura supplementare 1)4.
La misurazione meccanica dell'allodinia è un metodo di identificazione della risposta al dolore comunemente usato nei modelli di dolore animale ed è stata misurata utilizzando filamenti di von-Frey in questo studio. Il metodo dello stimolo ascendente con i filamenti di von Frey viene utilizzato per determinare la soglia meccanica necessaria per indurre la risposta di ritiro della zampa di un animale19,20. L'esperimento è iniziato con il filamento con il minimo stimolo. La forza di flessione del filamento che risponde a un numero prestabilito (tre volte in questo protocollo) è stata ottenuta come valore soglia di prelievo della zampa.
L'analisi dell'andatura dei roditori durante la camminata libera viene utilizzata per studiare il morbo di Parkinson o i movimenti degli arti e i cambiamenti di posizione nei modelli di compromissione senso-motoria, tra cui lesioni del midollo spinale e ictus27,28. Il sistema di analisi dell'andatura analizza automaticamente vari parametri dell'andatura, tra cui l'intensità della zampa, l'impronta della zampa, la fase di posizione, ecc. Le alterazioni dei parametri che il sistema di analisi dell'andatura può analizzare possono essere utilizzate come indicatori relativi al dolore nell'analisi dell'andatura di modelli animali del dolore. Pertanto, l'analisi dell'andatura può essere utilizzata come metodo sperimentale per quantificare in modo non invasivo il dolore spontaneo nei modelli animali 4,21,22. Sulla base di precedenti risultati che i parametri dell'andatura erano diminuiti sul lato indotto dal dolore in modelli animali di dolore21,22, questo protocollo presentato ha quantificato ciascun parametro dell'andatura come il rapporto tra il lato ipsilaterale e controlaterale indotto da ustioni. In questo protocollo, l'area di stampa della zampa e i dati di posizione singola sono stati convertiti nel tasso di cambiamenti tra zampe posteriori omolaterali (ferite) e controlaterali (non ferite). Il valore del 50% significa che la dimensione dell'impronta della zampa e il tempo per raggiungere il pavimento sono gli stessi sia nell'omolaterale che nel controlaterale, mentre il valore inferiore al 50% indica che questi parametri sono diminuiti nella zampa posteriore ipsilaterale indotta dalla bruciatura. Le variazioni percentuali tra le zampe posteriori omolaterali e controlaterali sono state utilizzate per ottenere tutti i dati (cioè, i topi normali hanno mostrato ~ 50%, il che significa che il rapporto oplaterale: controlaterale era 50: 50). Negli animali normali, i parametri relativi a ciascun arto posteriore appaiono gli stessi su entrambi i lati quando si cammina liberamente. Tuttavia, l'analisi di questo protocollo si concentra sul fatto che i parametri sul lato ipsilaterale diminuiscono dopo l'induzione del dolore. Inoltre, c'è una variazione individuale in ogni animale; i dati accurati potrebbero non essere ottenuti quando i dati grezzi vengono analizzati così come sono. Pertanto, ogni valore del parametro di andatura è stato convertito in un rapporto per ottenere risultati più accurati durante l'analisi. Il presente studio ha dimostrato che la dimensione dell'area di stampa e il tempo di posizione singola della zampa posteriore ipsilaterale sono stati ridotti dopo la lesione da ustione, e questa riduzione è stata ripristinata dalla somministrazione ripetuta di paracetamolo intraperitoneale. Questi cambiamenti coincidevano con un modello simile di cambiamenti nel corso del tempo nei comportamenti del dolore dopo ustioni e somministrazione di farmaci.
Sebbene controverso, il test di nuoto forzato è il metodo più comunemente usato per studiare il comportamento dei roditori depressi. Gli animali tentano di fuggire dal contenitore pieno d'acqua ma alla fine non si muovono, inducendo disperazione29. Tuttavia, si sostiene che l'immobilità è difficile da valutare come misura della depressione perché questo test è associato alla resistenza e ai sentimenti di disperazione. Per supportare i risultati dell'esperimento di nuoto forzato, altri metodi di valutazione della depressione, come il test di sospensione della coda, il test di alimentazione soppresso dalla novità e il test del consumo di saccarosio, possono essere considerati30,31. Nel presente studio, il tempo di immobilizzazione è aumentato dopo la lesione da ustione e questo aumento è stato ripristinato dalla somministrazione di paracetamolo.
I protocolli di questo studio sono stati progettati per stabilire un modello di dolore acuto che accompagna il comportamento simile alla depressione dopo la lesione da ustione. Il comportamento simile alla depressione in questo studio può essere gli effetti secondari della menomazione fisica e dei cambiamenti nella sensibilità termica dopo la lesione da ustione 15,32,33. I risultati potrebbero suggerire che i topi con dolore acuto indotto dopo ustione hanno mostrato un comportamento simile alla depressione. È stato dimostrato che migliora la risposta al dolore e i conseguenti comportamenti simili alla depressione da farmaci trattati sperimentalmente.
Il test rota-rod è un test delle prestazioni basato su un carico rotazionale che viene generalmente applicato con la forza ai roditori con attività atletica. Il test misura parametri come il tempo di esecuzione e la resistenza. Alcune delle caratteristiche del test includono, tra gli altri, gli effetti di un farmaco sperimentale o l'equilibrio dei soggetti nel modello di dolore neuropatico, la forza di presa e la valutazione della coordinazione motoria 22,25,34. Come mostrato nei risultati di questo studio, non vi è stato alcun cambiamento nel tempo di funzionamento dell'asta rotante dopo ustioni o trattamento con paracetamolo rispetto a quello del gruppo di controllo.
Questo studio dimostra lo sviluppo di un modello animale per lo studio del dolore indotto da ustioni e del comportamento simile alla depressione nei topi. A questo proposito, questo studio ha dimostrato che le ustioni scottanti hanno indotto allodinia meccanica, alterazioni dei parametri dell'andatura e comportamenti simili alla depressione come il tempo di immobilità. Questo modello è adatto per la ricerca sui vari aspetti e risultati del dolore da ustione e del suo trattamento e dovrebbe portare informazioni importanti a questo campo di ricerca.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dalla Chungnam National University e dalla sovvenzione della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziata dal governo della Corea (NRF-2019R1A6A3A01093963 e NRF-2021R1F1A1062509).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD | 307809 | |
| 1.5 mL tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 50 mL tube | SPL | 50050 | |
| Acetaminophen BioXtra, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | A7085-100G | This analgesic agent is used as a positive control. |
| Alfaxan multidose (Alfaxalone) | JUROX Pty.Limited | In this experiment, this material was used for animal anesthesia, and was used as a positive control for experimentally treated drugs in the rota-rod test. | |
| CatWalk automated gait analysis system | Noldus | CatWalk XT | Gait analysis in freely walking rodents is used to study the changes in limb movement and positioning in models with sensory-motor dysfunction |
| OPTISHIELD (Cyclosporin ophthalmic ointment) | Ashish Life Science | This material was used for an ointment to prevent corneal drying after induction of anesthesia. | |
| Plexiglass cylinder | SCITECH KOREA | custom made products | Used in forced swimming test |
| Rota-rod system | SCITECH KOREA | Accelerating rota rod | Used in the measurement of Normal Motor Function |
| von Frey filaments | North Coast Medical | NC12775 | Used in the measurement of Mechanical Allodynia |
| Waterbath | CHANGSHIN SCIENCE | C-WBE | Used in the burn injury induction |
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