Summary
한쪽 뒷발의 일시적인 스컬드 손상(65°C ± 0.5°C, 3초)은 동측성 측면의 폰 프레이 필라멘트 자극으로 역치(g)를 감소시키고 보행 패턴을 변경한다. 게다가, 화상 부상은 강제 수영 테스트에서 우울증과 같은 행동을 유도합니다.
Abstract
물을 돋우는 것은 노인과 젊은 인구 모두에서 화상 부상의 가장 흔한 원인입니다. 그것은 저소득 및 중산층 국가에서 높은 사망률과 후유증으로 인해 주요 임상 과제 중 하나입니다. 화상은 종종 강렬한 자발적인 통증과 지속적인 이질통뿐만 아니라 생명을 위협하는 문제를 유발합니다. 더 중요한 것은, 과도한 통증은 종종 삶의 질을 크게 떨어 뜨릴 수있는 우울증을 동반합니다. 이 기사에서는 화상으로 인한 통증과 우울증과 같은 행동에 대한 연구를위한 동물 모델을 개발하는 방법을 보여줍니다. 마취 후, 화상 손상은 마우스의 한쪽 뒷발을 3초 동안 온수(65°C± 0.5°C)에 침지함으로써 유도하였다. 폰 프레이 테스트 및 자동 보행 분석은 화상 손상 후 2일마다 수행되었다. 또한, 강제 수영 테스트를 이용하여 우울증 유사 행동을 검사하고, 화상 부상 후 비정상적인 운동 기능을 구별하기 위해 로타로드 테스트를 실시하였다. 이 연구의 주요 목적은 마우스에서 화상 부상으로 인한 통증 및 우울증과 같은 행동을 연구하기위한 동물 모델의 개발을 설명하는 것입니다.
Introduction
화상 및 외상과 같은 조직 손상은 일반적으로 급성 통증의 동시 발생과 관련이 있습니다. 화상 부상 및 외상 관련 증상은 매년 1,80,000명의 사망자가 화상으로 인한 것으로 추정되며, 대다수는 다양한 유형의 화상으로부터 저소득 및 중산층 국가에서 발생한다1. 전 세계 보고서에 따르면 화상은 어린이에게서 흔하며 입원 환자 2,3의 약 40 % -60 %를 차지합니다. 이러한 특정 부상은 끓이거나 목욕하는 물 4,5와 같은 일상 생활에서 발생할 수 있으므로 더욱 심각합니다. 급성 통증은 대부분의 경우 조직 손상으로부터 회복 된 후 자발적으로 해결 될 수 있지만, 신경계의 비정상적인 변화로 인해 만성화 될 수 있습니다 6,7.
최근에는 급성 통증이 우울한 기분을 유발할 수 있으며 만성 통증은 불안과 우울증을 유발할 수 있다고 제안되었습니다 8,9,10,11. 통증과 우울증의 공존은 환자를 치료하는 것을 더 어렵게 만듭니다. 우울증은 또한 통증 민감성을 증가시키는 경향이 있으며, 이는 더 강렬한 우울증과 통증을 유발할 가능성이 높습니다12. 통증과 우울증의 합병증은 말초 염증13,14,15,16의 동물 모델에서 나타난다. 통증으로 인한 우울증의 근간이 되는 상세한 메커니즘은 지금까지 잘 알려져 있지 않다17. 따라서 부작용과 증상을 완화하기 위해보다 효과적인 화상 치료법을 개발할 필요가 있습니다.
따라서, 본 연구는 마우스에서 화상 손상으로 유발된 급성 통증 및 우울증 유사 행동을 연구하기 위한 동물 모델을 개발하도록 설계되었다. 이를 위해 화상 부상과 관련된 비정상적인 촉각 감도, 변경된 보행 패턴 및 우울증과 유사한 행동을 측정했습니다. 또한이 연구는 NSAIDs를 사용하여 모델을 검증하려고 시도합니다.
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Protocol
모든 실험 프로토콜은 한국 충남대학교 기관동물관리이용위원회에서 검토 및 승인한 후 국제통증연구협회(International Association for the Study of Pain)18의 윤리지침에 따라 실시하였다.
1. 뒷발에 스케일링 화상 부상의 유도
- 체중 20-25 g의 수컷 ICR 마우스를 습도 40%-60%의 빛과 온도 조절된 방(12/12 h 광암주기, 22.5°C ± 2.5°C)에 보관한다.
참고: 수컷과 암컷 마우스 모두 이 프로토콜에 사용할 수 있습니다. - 동물이 음식과 물에 자유롭게 접근 할 수있게하고 실험을 시작하기 전에 적어도 1 주 동안 순응하십시오.
주: 모든 동물은 격리 스트레스와 같은 변수를 배제하기 위해 집단 수용되었다. - 마우스를 실험 또는 대조군에 무작위로 할당하고 동물 번호를 코드로 사용하여 맹검 실험을 수행하십시오.
- 화상 유도 당일, 100 mg / kg의 용량으로 300 μL의 alfaxalone 주사를 복강 내 (i.p.) 주사하여 마우스를 마취하십시오. 화상 유도를 수행하는 동안 수술 가운, 장갑 및 마스크를 착용하십시오.
- 마우스를 깊이 마취 한 후 오른쪽 뒷발 주위를 70 % 에탄올로 소독하십시오.
참고: 깊은 마취의 상태를 확인하기 위해 뒷발가락이나 꼬리에 적용된 핀치 자극에 대한 반응의 부족을 확인하십시오. - 마취 유도 후 각막 건조를 방지하기 위해 안과 연고를 눈에 바르십시오.
- 깊이 마취된 마우스의 오른쪽 뒷발을 65°C ±는 0.5°C의 온수에 3초 동안 담그십시오. 뒷발을 뜨거운 물에 담그기 전에 각 마우스의 발목에 표시를하여 화상을 입은 부위의 일관성을 유지하십시오.
- 화상을 입힌 후 마우스를 깨끗한 가정 케이지에 넣고 동물이 마취에서 회복 될 때까지 가열 패드에 놓습니다.
참고 : 진통제인 아세트 아미노펜 (200 mg / kg)은 화상 손상 당일부터 7 일 동안 매일 한 번 복강 내 투여되었습니다 (화상 + 아세트 아미노펜 그룹 만). 화상 그룹은 비히클 대조군으로서 식염수로 처리되었다. 실험은 이전 연구4에서 설명한 방법에 따라 수행되었다.
2. 기계적 이질의 측정
- 쥐를 행동 시험실로 데려와 시험 전에 적어도 30 분 동안 순응하게하십시오. 테스트를 수행하는 동안 수술 가운, 장갑 및 마스크를 착용하십시오.
- 마우스를 금속 메쉬 바닥 (메쉬 크기 : 0.7cm x 0.7cm)의 사각형 상자 (직경 : 13cm, 높이 : 12cm)에 넣고 적어도 30 분 동안 순응하게하십시오.
- 오름차순 자극 방법19,20을 사용하여 뒷발의 기계적 역치를 평가한다.
- 뒷다리 질경이를 자극하기 위해 5-8 초 간격으로 일련의 폰 프레이 필라멘트를 부드럽게 찌르십시오. 화상 유도 전날의 기준선 값을 구합니다.
참고: 0.16-1.2 g 폰 프레이 필라멘트를 모든 동물에서 발 금단 역치를 측정하기 위해 시험에 각각 사용하였다. 발 금단 반응 테스트는 폰 프레이 필라멘트의 가장 낮은 굽힘력 (이 프로토콜에서 0.16g)으로 시작되었습니다. 응답이 없으면 다음 굽힘력을 가진 필라멘트가 적용되었습니다. - 다섯 번의 시험을 수행하여 각 동측성 (부상 당한) 뒷발에 대한 기계적 역치를 평가하십시오.
참고: 각 동물에서 다섯 번의 시험 중 세 번 이상 반응을 일으키는 폰 프레이 필라멘트의 굽힘력은 발 철수 역치 (PWT, g)로 표현되었습니다. 기계적 역치는 화상 손상 전날과 1, 3, 5 및 7일 후에 측정되었다. 진통 효과는 동물에 아세트아미노펜을 투여한 후 1시간 후에 평가하였다.
3. 자동 보행 분석
- 화상 부상 5 일 전부터 10-15 분 동안 하루에 한 번 보행 분석 시스템에서 마우스를 적응시킵니다. 보행 분석을 수행하는 동안 수술 가운, 장갑 및 마스크를 착용하십시오.
- 시험 당일, 쥐를 행동 시험실로 데려와 시험 전에 적어도 30 분 동안 순응하십시오.
참고: 어두운 환경에서 순응 및 보행 분석 테스트를 수행합니다. 다음과 같이 프로그램 메뉴의 조건을 설정합니다.- 프로그램을 실행 한 후 새 실험 만들기 메뉴를 클릭하여 데이터를 저장할 폴더를 지정하십시오.
- 지정 후 최대 실행 시간을 5초로 설정하고 최대 허용 속도 변동을 50%로 설정합니다.
- 등록된 카메라를 선택하고 프로그램의 설정 탭에서 보도 길이를 30cm로 설정합니다.
- 프로그램 메뉴 의 획득 탭에서 획득 열기를 선택합니다.
- 상태 메시지에 따라 배경 스냅 버튼을 클릭하여 빈 보도의 배경 이미지를 가져옵니다.
- 획득 시작 버튼을 클릭한 다음, 마우스를 왼쪽-오른쪽 횡단 가능한 보도의 입구에 놓습니다. 마우스의 자유로운 움직임에 따라 녹음이 자동으로 시작됩니다.
참고: 동물의 보행이 성공적으로 기록되고 모든 발걸음이 감지되면 녹색 아이콘과 함께 준수 실행으로 표시됩니다. 소프트웨어가 발자국을 감지하지 못하면 빨간색 아이콘이 표시되며,이 경우 기록을 다시 수행하는 것이 좋습니다. 저자는 유사한 실행 속도로 수행 된 적어도 다섯 개의 성공적인 준수 실행을 수집하고 분석 할 것을 권장합니다. - 프로그램 메뉴의 획득 탭에서 실행 분류를 선택합니다.
참고 : 위의 성공적인 컴플라이언스 실행에서 얻은 데이터를 선택한 후 마우스의 보행 패턴이 기록 된 비디오 분석 화면으로 이동하십시오. - 분석할 실행을 선택하고 자동 분류 단추를 클릭합니다.
- 자동 분류를 수행 한 후 각 실행에서 코, 생식기 인식 및 발을 정크 데이터에 대한 잘못된 인식을 제거한 다음 데이터를 분석하십시오.
참고: 모든 통계 파라미터는 자동으로 분석되고 프로그램에 저장되며, 원시 데이터 값은 실험자의 분석 메뉴에서 찾을 수 있습니다. 자동 보행 분석은 화상 손상 전후 1, 3, 5 및 7일에 수행되었다. 평가는 Burn+Acetaminophen 투여군에서 아세트아미노펜 투여 후 30분, Burn 군에서 식염수 처리 후 30분 후에 수행하였다. 본 실험은 선행 연구 4,21,22에 기재된 방법에 따라 수행되었다.
4. 우울증과 같은 행동의 측정
참고 : 절망에 기반한 행동, 물에서의 부동성 시간은 강제 수영 테스트에 의해 측정되었습니다.
- 쥐를 행동 시험실로 데려와 시험 전에 적어도 30 분 동안 순응하십시오. 강제 수영 테스트를 수행하는 동안 수술 가운, 장갑 및 마스크를 착용하십시오.
- 마우스를 15 cm (25 °C ± 0.5 °C)의 물을 함유하는 투명한 플렉시 글라스 실린더 (10 cm x 25 cm)에 넣고 15 분 동안 넣는다.
- 24시간 후, 마우스를 동일한 조건의 실린더에 넣고 부동성 시간을 측정하였다.
참고 : 부동성 시간은 시험 시간의 5 분 동안 측정되었으며, 마우스가 등반이나 수영을 멈추고 물 표면 위에 머리를 유지하기 위해 떠 다니는 시간이 기록되었습니다. 강제 수영 테스트는 화상 부상 후 7 일째에 수행되었습니다. 평가는 Burn+Acetaminophen 투여 후 1 h, 및 Burn 그룹에서 식염수 처리 후 1 h를 수행하였다. 실험은 이전 연구23,24에 기재된 방법에 따라 수행되었다.
5. 정상적인 운동 기능의 측정
참고 : 화상 손상 후 비정상적인 운동 기능을 구별하기 위해 로타로드 테스트가 수행되었습니다.
- 쥐를 행동 시험실로 데려와 시험 전에 적어도 30 분 동안 순응하십시오. 강제 수영 테스트를 수행하는 동안 수술 가운, 장갑 및 마스크를 착용하십시오.
- 동물을 장치의 바닥 위 16cm 위에 현탁된 롤링 원통형 플랫폼 (폭 5.7cm; 직경 3cm) 위에 놓습니다.
- 각 동물이 화상 부상을 입기 전에 적어도 5 일 동안 로타로드에서 하루에 한 번 훈련하도록하십시오.
- 약물 투여 후 2 시간 동안 20 분마다 로타로드 테스트를 수행하십시오. 컷오프 시간을 2분으로 설정합니다.
- 마우스가 회전하는 막대에서 떨어지지 않고 분당 15회전의 일정한 속도로 달리는 시간을 측정합니다.
참고: 로타-로드 시험은 화상 부상의 유도 후 7일 후에 수행되었다. 평가는 Burn+Acetaminophen 투여 직후 및 Burn 군에서 식염수 처리 직후에 수행되었다. Alfaxalone은 이 시험에서 실험적으로 처리된 약물에 대한 양성 대조군으로 사용되었다. 로타로드 테스트 동안, 마우스가 떨어지지 않고 회전하는 막대에서 달리는 시간이 측정됩니다. 실험은 이전 연구22,25에 기재된 방법에 따라 수행되었다.
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Representative Results
동물의 고통을 최소화하고 Three Rs (대체, 감소 및 정제) 지침에 따라 사용되는 동물의 수를 줄이기 위해,이 연구는 예비 실험을 통해 확립 된 중요한 데이터의 수집을위한 최소 수의 동물로 설계되었습니다. 본 연구에서, 행동 실험은 독립적으로 다음과 같이 두 번 수행되었다. 보행 분석, 기계적 동종 다량체 및 우울증 유사 행동 시험을 대조군 (n = 5), 화상 (n = 7; 비히클 대조군; 식염수) 및 화상 + 아세트 아미노펜 (n = 7) 그룹으로 수행하였다. 로타로드 시험에서, 대조군 (n=3), 화상 (n=4; 비히클 대조군; 식염수), 화상 + 아세트아미노펜 (n=4), 양성 대조군 (n=4; Alfaxalone) 그룹이 설계되었다. Alfaxalone은 현재 수의학에서 주사 가능한 전신 마취 유도제로 사용되는 신경 활성 스테로이드 및 마취제의 일종입니다. 이 연구에서, alfaxalone은 화상 유도를 위한 동물 마취에 사용되었고, 로타-로드 시험에서 운동 장애에 대한 양성 대조군 약물로 사용되었다.
데이터는 평균 ± S.E.로 표.M되었다. 또한, 서로 다른 시간에 얻어진 실험 데이터를 독립적으로 분석하였다. 통증 행동 반응은 곡선 아래 면적(AUC)으로서 계산하였다. ANOVA는 시간에 따른 기계적 이질통 검사, 보행 분석 및 로타로드 테스트로부터의 데이터의 차이를 결정하기 위해 양방향 반복 측정을 수행하였다. Dunnett의 테스트는 실험 그룹 중 P-값을 결정하기 위해 사후 분석에 사용되었습니다. 0.05 미만의 P-값은 유의한 것으로 간주되었다. GraphPad Prism 6.0 소프트웨어는 이러한 통계적 타당성을 분석하기 위해 사용되었다. 모든 통계적 분석 절차는 실험 조건과 관련하여 맹목적으로 수행되었다. 화상 손상-유도된 조직 손상을 예시하는 그림이 보충 그림 1에 도시되어 있다.
화상 부상 후 발 철수 역치(PWT, g)의 시간-코스 변화는 그림 1에 도시되어 있다. 화상 손상이 유발된 마우스의 PWT(g)는 화상 유도 후 1일 동안 감소하였고, 대조군에 비해 7일 동안 지속하였다. 아세트아미노펜 투여(200 mg/kg, i.p., 화상을 유도한 날로부터 시작하여 7일 동안 매일 1회)는 PWT의 화상-유도된 감소를 유의하게 감소시켰다(도 1A, **p< 0.01 대 화상 그룹). 또한, AUC 분석(7일 동안)은 아세트아미노펜 투여가 화상 손상-유도된 기계적 이질통을 유의하게 감소시킨다는 것을 보여주었다(도 1B, ***p< 0.001 대 대조군, **p< 0.01 대 화상 그룹).
시간에 따른 화상 부상 후 뒷발 인쇄 영역의 변화는 그림 2에 나와 있습니다. 화상 부상은 유도 후 날부터 동측성 뒷발 인쇄 면적을 현저하게 감소시키고 7 일 동안 지속되었습니다. 뒷발 인쇄 영역은 비히클 처리 그룹과 비교하여 아세트 아미노펜 (200 mg / kg, 즉, 화상 유도 당일부터 시작하여 7 일 동안 매일 1 회)을 투여함으로써 유의하게 개선되었다 (그림 2A,B, * p < 0.05 및 ** p < 0.01 대 화상 그룹).
화상 부상 후 단일 자세의 시간 코스 변화는 그림 3에 나와 있습니다. 화상 손상은 화상 유도 1일 후 동측성 뒷발의 단일 자세(%)를 감소시켰고, 이러한 감소는 7일 동안 유지되었다. 뒷발 단일 자세는 비히클 처리 그룹과 비교하여 아세트 아미노펜 투여 (200 mg / kg, 즉, 화상 유도 당일부터 7 일 동안 매일 한 번)에 의해 개선되었다 (그림 3A,B, * p < 0.05 대 화상 그룹).
강제 수영 테스트로부터 얻은 부동성 시간의 변화는 도 4에 도시되어 있다. 화상 손상이 유발된 마우스의 부동성 시간은 대조군에 비해 화상 유도 7일 후 증가하였다. 화상 손상-유도된 마우스에서, 아세트아미노펜 투여(200 mg/kg, 즉, 화상 유도 날로부터 시작하여 7일 동안 매일 1회)는 화상 손상-유도된 부동성 시간의 증가를 유의하게 감소시켰다(**p<0.01 및 ***p< 0.001 대 화상 그룹).
정상 운동 기능은 그림 5와 같이 로타로드의 작동 시간 변화를 기반으로 평가되었습니다. 화상 손상이 유발된 마우스의 실행 시간은 화상 유도 후 7일째에 대조군의 시간에 비해 변하지 않았다. 대조적으로, 알팍솔로-처리된 마우스(양성 대조군)의 실행 시간은 약 60분 동안 유의하게 감소하였다. 이 결과는이 연구에서 사용 된 화상 손상이 운동 장애를 일으키지 않는다는 것을 나타냅니다 ( *** p < 0.001 대 화상 그룹).
도 1: 화상 손상-유도된 마우스에서 폰 프레이 시험에 의해 평가된 기계적 이질통. (A) 마우스의 동측성 뒷발에서 발 금단 역치(PWT, g)는 화상 손상 1일 후 감소하였고, 대조군과 비교하여 7일 동안 지속되었다. 아세트아미노펜 투여(200 mg/kg, i.p., 화상 유도 날부터 7일 동안 매일 한 번)는 화상 손상으로 인한 기계적 동종이양을 유의하게 감소시켰다. (b) PWT를 곡선 아래의 면적(AUC)으로서 분석하였다. 화살표는 약물 투여 당일을 나타냅니다. p < 0.001 대 대조군, ** p < 0.01 대 화상 그룹. 양방향 반복 측정 ANOVA는 폰 프레이 테스트의 시간-과정에서 전반적인 효과를 결정하기 위해 수행되었다. P-값을 결정하기 위해 Dunnett의 테스트를 사용하여 사후 분석을 수행했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 화상 손상이 유발된 마우스에서 자동화된 보행 분석으로부터 얻은 발 인쇄 영역 . (A) 마우스의 동측성 및 대측성 뒷발 모두의 대표적인 이미지는 보행 분석 소프트웨어에 의해 캡처되었다. 발의 접촉 크기는 대조군에 비해 화상 손상 후 감소합니다. 이 감소는 아세트 아미노펜 (200 mg / kg, 즉 화상 유도 일로부터 시작하여 7 일 동안 하루에 한 번)을 투여함으로써 부분적으로 회복되었습니다. 흰색 사각형은 소프트웨어에 의해 분석된 뒷발을 나타내고, (B) 그래프는 발 인쇄 영역의 시간 코스 변화(%)를 보여준다. 데이터는 동측 (오른쪽)과 대측 (왼쪽) 뒷발 사이의 인쇄 영역의 변화 퍼센트로서 계산됩니다 (예를 들어, 50 %의 값은 오른쪽 및 왼쪽 뒷발에서 동일한 발 인쇄 영역을 나타냄). 화살표는 약물 투여 당일을 나타냅니다. * p < 0.05이고 ** p < 0.01 대 화상 그룹. 양방향 반복 측정 ANOVA는 보행 분석에 대한 인쇄 영역의 시간 과정에서 전반적인 효과를 결정하기 위해 수행되었습니다. P-값을 결정하기 위해 Dunnett의 테스트를 사용하여 사후 분석을 수행했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 화상 손상 유발 마우스에서 자동화된 보행 분석으로부터 얻은 단일 자세. (A) 단일 자세의 대표적인 이미지는 보행 분석 소프트웨어에 의해 캡처되었다. 다른 색상은 각 발의 자세를 나타냅니다 : 파란색, 오른쪽 앞발; 분홍색, 오른쪽 뒷발; 노란색, 왼쪽 앞발; 녹색, 왼쪽 뒷발. 동측성 뒷발의 단일 자세는 화상 부상 후 짧아졌습니다. 이 변화는 아세트 아미노펜 (200 mg / kg, 즉 화상 유도 일로부터 시작하여 7 일 동안 하루에 한 번)을 투여함으로써 부분적으로 회복되었습니다. (B) 그래프는 단일 자세의 시간 코스 변화 (%)를 보여줍니다. 데이터는 동측 (오른쪽)과 대측 (왼쪽) 뒷발 사이의 단일 자세의 변화 퍼센트를 계산 한 후 선 그래프로 요약됩니다 (예를 들어, 50 %의 값은 오른쪽 및 왼쪽 뒷발에서 동일한 단일 자세를 나타냄). 화살표는 약물 투여 당일을 나타냅니다. * p < 0.05 대 화상 그룹. 양방향 반복 측정 ANOVA는 보행 분석에 대한 단일 자세의 시간 과정에서 전반적인 효과를 결정하기 위해 수행되었습니다. P-값을 결정하기 위해 Dunnett의 테스트를 사용하여 사후 분석을 수행했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 화상 손상이 유발된 마우스에서 강제 수영 테스트의 부동성 시간. 화상 손상이 유발된 마우스의 부동성 시간은 대조군의 경우와 비교하여 화상 유도 7일 후 증가하였다. 화상 손상-유도된 마우스에서, 아세트아미노펜 투여(200 mg/kg, 즉, 화상 유도 날로부터 시작하여 7일 동안 매일 한 번)는 화상 손상-유도된 향상된 부동성 시간을 상당히 완화시켰다. p < 0.001 대 대조군, ** p < 0.01 대 화상 그룹. 강제 수영 테스트의 시간-과정에서 전반적인 효과를 결정하기 위해 단방향 반복 측정 ANOVA를 수행하였다. P-값을 결정하기 위해 Dunnett의 테스트를 사용하여 사후 분석을 수행했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 화상 손상 유발 마우스에서 로타로드 테스트의 실행 시간 변화를 기반으로 한 정상 운동 기능 평가. 화상 유도 후 7일째에 화상 손상이 유발된 마우스의 실행 시간에는 대조군 및 아세트아미노펜 처리된 화상 손상 그룹의 그것들과 비교하여 변화가 없었다. 그러나, 알팍솔로 처리된 마우스(양성 대조군)의 실행 시간은 ∼60 s로 유의하게 감소하였다. 이 결과는이 연구에서 사용 된 화상 부상이 운동 장애를 일으키지 않는다는 것을 나타냅니다. p < 0.001 대 Burn 그룹. 양방향 반복 측정 ANOVA는 로타로드 시험의 시간-과정에서 전반적인 효과를 결정하기 위해 수행되었다. P-값을 결정하기 위해 Dunnett의 테스트를 사용하여 사후 분석을 수행했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1 : 화상 유도 후 시간에 따른 조직 손상의 변화. 스케일링 화상 유도 후, 상당한 조직 손상이 관찰되었고, 이는 시간이 지남에 따라 점진적으로 증가하였다. 이 연구에서, 양성 대조군 약물로 사용되는 아세트 아미노펜은 조직 손상에 대한 보호 효과를 보여주었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
스케일링 화상은 가열 된 액체에 의해 발생하는 열 화상의 일종입니다. 대부분의 경우 첫 번째 또는 두 번째 정도의 화상이 발생하지만 열원과의 장기간 접촉으로 인해 세 번째 정도의 화상이 발생할 수 있다고 제안되었습니다26. 본 연구에서, 화상 손상은 마우스의 오른쪽 뒷발을 3초동안 65°C에서 뜨거운 물에 노출시켜 4,26을 유도하였다. 화상 손상 발에서 조직 손상이 검출되었으며, 이는 발적, 피부 벗겨짐 및 붓기와 같은 화상의 일반적인 증상을 보여줍니다 (보충 그림 1)4.
기계적 이질통 측정은 동물 통증 모델에서 일반적으로 사용되는 통증 반응 식별 방법이며, 본 연구에서 von-Frey 필라멘트를 사용하여 측정되었다. 폰 프레이 필라멘트를 사용한 오름차순 자극 방법은 동물의 발 금단 반응(19,20)을 유도하는데 필요한 기계적 역치를 결정하는데 사용된다. 실험은 가장 적은 자극을 가진 필라멘트로 시작되었습니다. 설정된 수(이 프로토콜에서 세 번)에 응답하는 필라멘트의 굽힘력은 발 철수 임계값으로서 얻어졌다.
자유 보행 중 설치류의 보행 분석은 파킨슨 병 또는 사지 운동 및 척수 손상 및 뇌졸중27,28을 포함한 감각 운동 장애 모델의 위치 변화를 연구하는 데 사용됩니다. 보행 분석 시스템은 발 강도, 발 인쇄, 자세 단계 등 다양한 보행 파라미터를 자동으로 분석합니다. 보행 분석 시스템이 분석할 수 있는 파라미터의 변경은 통증 동물 모델의 보행 분석에서 통증 관련 지표로 사용될 수 있다. 따라서, 보행 분석은 동물 모델 4,21,22에서 자발적 통증을 비침습적으로 정량화하는 실험 방법으로 사용될 수 있다. 통증21,22의 동물 모델에서 통증 유발 측에서 보행 파라미터가 감소했다는 이전의 발견에 기초하여, 이것은 제시된 프로토콜이 화상-유도된 동측성 및 대측측의 비율로서 각 보행 파라미터를 정량화하였다. 이 프로토콜에서는 발 인쇄 영역과 단일 자세 데이터가 동측 (부상)과 대측 (부상 당하지 않은) 뒷발 사이의 변화 속도로 변환되었습니다. 50 %의 값은 발 인쇄 크기와 바닥에 도달하는 시간이 동측 및 대측 모두에서 동일하다는 것을 의미하고, 50 % 미만의 값은 화상으로 인한 동측성 뒷발에서 이러한 매개 변수가 감소했음을 나타냅니다. 동측성 및 대측성 뒷발 사이의 백분율 변화는 모든 데이터를 얻기 위해 사용되었다 (즉, 정상 마우스는 ~50%를 나타냈으며, 이는 동측성:대측성 비율이 50:50임을 의미한다). 정상적인 동물에서, 각 뒷다리와 관련된 매개 변수는 자유롭게 걸을 때 양쪽에서 동일하게 나타납니다. 그러나, 이 프로토콜의 분석은 통증 유도 후 동측성 측의 파라미터가 감소한다는 사실에 초점을 맞추고 있다. 또한 각 동물에는 개별적인 변형이 있습니다. 원시 데이터가 있는 그대로 분석될 때 정확한 데이터를 얻지 못할 수 있습니다. 따라서, 각 보행 파라미터 값은 분석 중에 보다 정확한 결과를 얻기 위해 비율로 변환되었다. 본 연구는 화상 손상 후 동측성 뒷발의 인쇄 면적 크기 및 단일 자세 시간이 감소되었으며, 이러한 감소는 반복적 인 복강 내 아세트 아미노펜 투여에 의해 회복되었음을 보여주었습니다. 이러한 변화는 화상 부상 및 약물 투여 후 통증 행동의 시간 과정 변화의 유사한 패턴과 일치했습니다.
논란의 여지가 있지만, 강제 수영 테스트는 우울한 설치류의 행동을 연구하는 데 가장 일반적으로 사용되는 방법입니다. 동물들은 물이 가득 찬 컨테이너에서 탈출하려고 시도하지만 결국 움직이지 않아절망을 불러 일으킨다. 그러나 부동성은 우울증의 척도로 평가하기가 어렵다고 주장되는데, 왜냐하면이 테스트는 지구력과 절망감과 관련이 있기 때문입니다. 강제 수영 실험의 결과를 뒷받침하기 위해 꼬리 서스펜션 테스트, 참신 억제 수유 테스트 및 자당 소비 테스트와 같은 우울증을 평가하는 다른 방법이30,31로 간주 될 수 있습니다. 본 연구에서, 고정화 시간은 화상 손상 후 증가되었고, 이러한 증가는 아세트아미노펜 투여에 의해 회복되었다.
이 연구의 프로토콜은 화상 부상 후 우울증과 같은 행동을 동반하는 급성 통증의 모델을 확립하도록 설계되었습니다. 이 연구에서 우울증과 같은 행동은 화상 손상 후 신체적 장애 및 열 감도의 변화15,32,33의 이차 효과 일 수 있습니다. 결과는 화상 손상 후 유발 된 급성 통증을 가진 마우스가 우울증과 같은 행동을 나타냈다는 것을 암시 할 수 있습니다. 실험적으로 치료 된 약물에 의해 통증 반응과 결과적으로 우울증과 같은 행동을 개선하는 것으로 나타났습니다.
로타로드 테스트는 일반적으로 운동 활동이있는 설치류에 강제로 적용되는 회전 하중을 기반으로 한 성능 테스트입니다. 이 테스트는 실행 시간 및 내구성과 같은 매개 변수를 측정합니다. 시험 특징 중 일부는 신경 병증 성 통증 모델에서 실험 약물의 효과 또는 피험자의 균형, 그립 강도 및 운동 조정 평가 22,25,34를 포함합니다. 본 연구의 결과에 나타난 바와 같이, 화상 손상 또는 아세트아미노펜 처리 후 로타로드 실행 시간에는 대조군의 것과 비교하여 변화가 없었다.
이 연구는 생쥐에서 화상 부상으로 인한 통증과 우울증과 같은 행동을 연구하기위한 동물 모델의 개발을 보여줍니다. 이와 관련하여,이 연구는 화상 부상이 기계적 동종 요법, 보행 매개 변수의 변화 및 부동성 시간과 같은 우울증과 같은 행동을 유발한다는 것을 보여주었습니다. 이 모델은 화상 통증 및 치료의 다양한 측면과 결과에 대한 연구에 적합하며이 연구 분야에 중요한 정보를 제공 할 것으로 예상됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
본 연구는 충남대학교와 한국연구재단(NRF) 정부가 지원하는 지원금(NRF-2019R1A6A3A01093963 및 NRF-2021R1F1A1062509)의 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD | 307809 | |
| 1.5 mL tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 50 mL tube | SPL | 50050 | |
| Acetaminophen BioXtra, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | A7085-100G | This analgesic agent is used as a positive control. |
| Alfaxan multidose (Alfaxalone) | JUROX Pty.Limited | In this experiment, this material was used for animal anesthesia, and was used as a positive control for experimentally treated drugs in the rota-rod test. | |
| CatWalk automated gait analysis system | Noldus | CatWalk XT | Gait analysis in freely walking rodents is used to study the changes in limb movement and positioning in models with sensory-motor dysfunction |
| OPTISHIELD (Cyclosporin ophthalmic ointment) | Ashish Life Science | This material was used for an ointment to prevent corneal drying after induction of anesthesia. | |
| Plexiglass cylinder | SCITECH KOREA | custom made products | Used in forced swimming test |
| Rota-rod system | SCITECH KOREA | Accelerating rota rod | Used in the measurement of Normal Motor Function |
| von Frey filaments | North Coast Medical | NC12775 | Used in the measurement of Mechanical Allodynia |
| Waterbath | CHANGSHIN SCIENCE | C-WBE | Used in the burn injury induction |
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