Summary
Uma lesão escalda transitória (65 °C ± 0,5 °C, 3 s) de uma pata traseira diminui o limiar (g) para a estimulação de filamento von Frey do lado ipsilateral e altera o padrão de marcha. Além disso, a lesão por queimadura induz o comportamento depressivo no teste de natação forçada.
Abstract
A água escaldante é a causa mais comum de queimaduras em populações idosas e jovens. É um dos principais desafios clínicos devido à alta mortalidade e sequelas em países de baixa e média renda. Queimaduras frequentemente induzem dor espontânea intensa e intolerância persistente, bem como problema de risco de vida. Mais importante, a dor excessiva é frequentemente acompanhada de depressão, o que pode diminuir significativamente a qualidade de vida. Este artigo mostra como desenvolver um modelo animal para o estudo da dor induzida por queimaduras e comportamento semelhante à depressão. Após anestesia, a lesão por queimadura foi induzida por mergulhar uma pata traseira do rato em água quente (65 °C ± 0,5 °C) para 3 s. O teste von Frey e a análise automatizada da marcha foram realizados a cada 2 dias após a lesão por queimadura. Além disso, o comportamento semelhante à depressão foi examinado por meio do teste de natação forçada, e o teste de rotação-vara foi realizado para diferenciar a função motora anormal após lesão por queimadura. O principal objetivo deste estudo é descrever o desenvolvimento de um modelo animal para o estudo da dor induzida por queimaduras e comportamento semelhante à depressão em camundongos.
Introduction
Danos teciduais, como queimaduras e traumas, geralmente estão associados à co-ocorrência de dor aguda. Lesões por queimaduras e sintomas relacionados ao trauma são estimados em 1.80.000 mortes por ano causadas por queimaduras - a grande maioria ocorre em países de baixa e média renda de diferentes tipos de queimaduras1. De acordo com um relatório mundial, as queimaduras são comuns em crianças e representam cerca de 40%-60% dos pacientes hospitalizados 2,3. Essas lesões específicas são ainda mais graves, pois podem ocorrer no dia a dia, como ferver ou tomar banho4,5. Embora a dor aguda possa ser resolvida espontaneamente após a recuperação de danos teciduais na maioria dos casos, pode ser possível tornar-se crônica devido a alterações anormais no sistema nervoso 6,7.
Recentemente, foi sugerido que a dor aguda pode induzir um humor deprimido, e a dor crônica pode causar ansiedade e depressão 8,9,10,11. A convivência da dor e da depressão dificulta o tratamento do paciente. A depressão também tende a aumentar a sensibilidade à dor, o que provavelmente induzirá depressão mais intensa e dor12. Complicações de dor e depressão são mostradas em modelos animais de inflamação periférica 13,14,15,16. Os mecanismos detalhados subjacentes à depressão induzida pela dor não são bem conhecidos até agora, 17 anos. Assim, é necessário desenvolver tratamentos mais eficazes para queimaduras para aliviar os efeitos colaterais e sintomas.
Assim, o presente estudo foi projetado para desenvolver um modelo animal para estudar dor aguda induzida por lesões de queimaduras e comportamento semelhante à depressão em camundongos. Para isso, foram medidas sensibilidade tátil anormal relacionada à lesão, padrão de marcha alterado e comportamento semelhante à depressão. Além disso, este estudo tenta validar o modelo usando NSAIDs.
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Protocol
Todos os protocolos experimentais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Nacional de Chungnam, na Coreia do Sul, e depois conduzidos com base nas diretrizes éticas da Associação Internacional para o Estudo da Dor18.
1. Indução de queimadura escaldante na pata traseira
- Abriga os camundongos machos ICR pesando 20-25 g em uma sala controlada por luz e temperatura (ciclo claro-escuro de 12/12 h, 22,5 °C ± 2,5 °C) com umidade de 40%-60%.
NOTA: Tanto camundongos machos quanto fêmeas podem ser usados para este protocolo. - Permita ao animal acesso livre a alimentos e água, e aclimata por pelo menos 1 semana antes de iniciar o experimento.
NOTA: Todos os animais foram agrupados para excluir variáveis como o estresse de isolamento. - Atribua os ratos aleatoriamente ao grupo experimental ou controle e realize experimentos cegos usando números de animais como códigos.
- No dia da indução da queimadura, anestesia o camundongo por injeção intraperitoneal (i.p.) de 300 μL de alfaxalona a uma dose de 100 mg/kg. Use um vestido cirúrgico, luvas e máscara durante a realização da indução de queimadura.
- Depois de anestesiar profundamente o rato, desinfete ao redor da pata traseira direita com 70% de etanol.
NOTA: Verifique a falta de resposta à estimulação de beliscar aplicada nos dedes traseiros ou cauda para confirmar o estado de anestesia profunda. - Aplique uma pomada oftalmica nos olhos para evitar a secagem da córnea após a indução da anestesia.
- Mergulhe a pata traseira direita do rato profundamente anestesiado em água quente a 65 °C ± 0,5 °C para 3 s. Faça uma marca no tornozelo de cada rato antes de mergulhar a pata traseira em água quente para manter a consistência na área queimada.
- Após a indução de queimaduras, leve os ratos para uma gaiola limpa e coloque-os em uma almofada de aquecimento até que os animais se recuperem da anestesia.
NOTA: O agente analgésico, acetaminofeno (200 mg/kg), foi administrado intraperitoneal uma vez por dia durante 7 dias a partir do dia da queimadura (Apenas Burn + Acetaminofeno grupo). O grupo Burn foi tratado com soro fisiológico como controle de veículos. O experimento foi realizado de acordo com o método descrito em um estudo anterior4.
2. Medição da aodínia mecânica
- Leve os ratos para a sala de testes comportamentais e deixe-os aclimatar pelo menos por 30 minutos antes do teste. Use um vestido cirúrgico, luvas e máscara durante a realização do teste.
- Coloque os ratos em uma caixa quadrada (diâmetro: 13 cm, altura: 12 cm) em um piso de malha metálica (tamanho de malha: 0,7 cm x 0,7 cm) e deixe-os aclimatar por pelo menos 30 min.
- Avalie o limiar mecânico da pata traseira utilizando o método de estímulo ascendente 19,20.
- Pique suavemente uma série de filamentos von Frey com intervalos de 5-8 s para estimular o plantar traseiro. Obtenha os valores da linha de base no dia anterior à indução da queimadura.
NOTA: Os filamentos de 0,16-1,2 g von Frey foram utilizados no teste para medir o limiar de retirada da pata em todos os animais, respectivamente. O teste de resposta de retirada da pata foi iniciado com a menor força de dobra do filamento von Frey (0,16 g neste protocolo). Se não houve resposta, então um filamento com a próxima força de dobra foi aplicado. - Realize cinco ensaios para avaliar limiares mecânicos para cada pata traseira ipsilateral (ferida).
NOTA: A força de dobra do filamento von Frey que produz resposta mais de três vezes dos cinco ensaios em cada animal foi expressa como limiar de abstinência de patas (PWT, g). Os limiares mecânicos foram medidos um dia antes e em 1, 3, 5 e 7 dias após a lesão por queimadura. O efeito analgésico foi avaliado 1h após a administração do acetaminofeno no animal.
3. Análise automatizada da marcha
- Aclimime os camundongos no sistema de análise de marcha uma vez por dia durante 10-15 min a partir de 5 dias antes da lesão da queimadura. Use um vestido cirúrgico, luvas e máscara durante a análise da marcha.
- No dia do teste, leve os ratos para a sala de testes comportamentais e aclimata-os por pelo menos 30 minutos antes do teste.
NOTA: Realize testes de aclimatação e análise de marcha em um ambiente escuro. Defina as condições do menu do programa da seguinte forma.- Depois de executar o programa, clique no menu Criar novos experimentos para designar a pasta para salvar os dados.
- Após a designação, defina o tempo máximo de execução para 5 s e variações máximas de velocidade permitidas para 50%.
- Selecione uma câmera registrada e defina o comprimento da passarela para 30 cm na guia Configuração do programa.
- Na guia Adquirir do menu do programa, selecione Aquisição Aberta.
- Com base nas mensagens de status, clique no botão "Snap Background" para adquirir uma imagem de fundo de uma passarela vazia.
- Clique no botão Iniciar aquisição e, em seguida, coloque o mouse na entrada da passarela transversível esquerda-direita. A gravação começará automaticamente após a livre circulação do mouse.
NOTA: Se a marcha do animal tiver sido registrada com sucesso e todos os passos forem detectados, ele será marcado como Compatível Run com um ícone verde. Se o software não detectar nenhum passo, um ícone vermelho será exibido, nesse caso é recomendado realizar a gravação novamente. Os autores recomendam coletar e analisar pelo menos cinco corridas bem-sucedidas realizadas com velocidades de execução semelhantes. - Na guia Adquirir do menu do programa, selecione Classificar corridas.
NOTA: Depois de selecionar os dados obtidos a partir da execução de conformidade bem sucedida acima, vá para a tela de análise de vídeo onde os padrões de marcha dos ratos foram gravados. - Selecione a execução a ser analisada e clique no botão Classificação automática .
- Depois de realizar a classificação automática, remova o nariz, o reconhecimento genital e o equívoco das patas para os dados de lixo em cada execução e, em seguida, analise os dados.
NOTA: Todos os parâmetros estatísticos são automaticamente analisados e salvos no programa, e valores de dados brutos podem ser encontrados no menu de análise do experimentador. A análise automática da marcha foi realizada antes e aos 1, 3, 5 e 7 dias após lesão por queimadura. A avaliação foi realizada 30 min após a administração de acetaminofeno no grupo Burn + Acetaminofeno e 30 min após o tratamento salino no grupo Burn. Este experimento foi realizado de acordo com o método descrito nos estudos anteriores 4,21,22.
4. Medição do comportamento semelhante à depressão
NOTA: Comportamento baseado em desespero, tempo de imobilidade na água foi medido pelo teste de natação forçado.
- Leve os ratos para a sala de testes comportamentais e aclimata-os por pelo menos 30 minutos antes do teste. Use um vestido cirúrgico, luvas e máscara durante a realização do teste de natação forçado.
- Coloque o mouse em um cilindro de plexiglass claro (10 cm x 25 cm) contendo 15 cm de água (25 °C ± 0,5 °C) por 15 min.
- Depois de 24 horas, coloque o mouse no cilindro das mesmas condições e meça o tempo de imobilidade.
NOTA: O tempo de imobilidade foi medido por 5 minutos de tempo de teste, e o tempo em que os ratos paravam de subir ou nadar e apenas flutuavam para manter a cabeça acima da superfície da água foi registrado. O teste de natação forçada foi realizado no dia 7 após a lesão por queimadura. A avaliação foi realizada 1 h após a administração de acetaminofeno no grupo Burn + Acetaminofeno, e 1h após o tratamento salino no grupo Burn. O experimento foi realizado de acordo com o método descrito em estudos anteriores23,24.
5. Medição da função motora normal
NOTA: O teste da haste rota foi realizado para diferenciar a função motora anormal após lesão por queimadura.
- Leve os ratos para a sala de testes comportamentais e aclimata-os por pelo menos 30 minutos antes do teste. Use um vestido cirúrgico, luvas e máscara durante a realização do teste de natação forçado.
- Coloque os animais em uma plataforma cilíndrica rolando (5,7 cm de largura; 3 cm de diâmetro) suspensos 16 cm acima da parte inferior do aparelho.
- Permita que cada animal treine uma vez por dia em uma vara rota por pelo menos 5 dias antes da indução de queimaduras.
- Realize o teste rota-rod a cada 20 minutos por 2 h após a administração de drogas. Defina o tempo de corte para 2 minutos.
- Meça a duração do tempo que o mouse corre em uma haste giratória na velocidade constante de 15 rotações por minuto sem cair.
NOTA: O teste de rota-has foi realizado 7 dias após a indução da lesão por queimadura. A avaliação foi realizada imediatamente após a administração de acetaminofeno no grupo Burn + Acetaminofeno e após o tratamento salino no grupo Burn. Alfaxalone foi usado como um controle positivo para drogas tratadas experimentalmente neste teste. Durante o teste rotarod, a duração do tempo que o mouse corre na haste giratória sem cair é medida. O experimento foi realizado de acordo com o método descrito em estudos anteriores22,25.
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Representative Results
Com o objetivo de minimizar o sofrimento animal e reduzir o número de animais utilizados pelas diretrizes de Três Rs (Substituição, Redução e Refinamento), este estudo foi desenhado com o número mínimo de animais para a coleta de dados significativos estabelecidos por meio de experimento preliminar. Neste estudo, os experimentos comportamentais foram realizados de forma independente duas vezes. Foram realizados os testes de comportamento semelhante à marcha, a aodínia mecânica e os ensaios comportamentais semelhantes à depressão com os grupos Control (n = 5), Burn (n = 7; controle do veículo; soro fisiológico) e Burn + Acetaminofeno (n = 7). No teste rota-rod, Controle (n = 3), Queimadura (n = 4; controle do veículo; solução salina), Queimadura + Acetaminofeno (n = 4), Controle positivo (n = 4; Foram projetados grupos alfaxalone. Alfaxalona é um tipo de esteroide neuroativo e anestésico que é atualmente usado na medicina veterinária como um indutor anestésico geral injetável. Neste estudo, a alfaxalona foi utilizada na anestesia animal para indução de queimaduras e utilizada como medicamento de controle positivo para prejuízos motores no teste da vara rota.
Os dados foram expressos como ± S.E.M. Além disso, os dados experimentais obtidos em diferentes momentos foram analisados de forma independente. As respostas comportamentais da dor foram calculadas como a área sob a curva (AUC). Medidas repetidas bidirecionais A ANOVA foi realizada para determinar diferenças nos dados do teste de aodínia mecânica, análise de marcha e teste de rota-has ao longo do tempo. O teste de Dunnett foi usado para análise pós-hoc para determinar o valor P entre os grupos experimentais. Os valores P inferiores a 0,05 foram considerados significativos. O software GraphPad Prism 6.0 foi utilizado para analisar essa validade estatística. Todos os procedimentos de análise estatística foram realizados às cegas em relação às condições experimentais. Uma figura que ilustra os danos teciduais induzidos por lesões por queimaduras é mostrada na Figura Suplementar 1.
Alterações no curso de tempo no limiar de retirada da pata (PWT, g) após a lesão por queimadura são mostradas na Figura 1. O PWT (g) de camundongos induzidos por queimaduras foi diminuído 1 dia após a indução de queimaduras e mantido por 7 dias em comparação com o do grupo controle. A administração de acetaminofeno (200 mg/kg, i.p., uma vez por dia durante 7 dias a partir do dia da indução de queimaduras) reduziu significativamente a diminuição induzida por queimaduras em PWT (Figura 1A, ** p < 0,01 versus grupo Burn). Além disso, a análise da AUC (por 7 dias) mostrou que a administração de acetaminofeno diminuiu significativamente a liga mecânica induzida por lesão por queimadura (Figura 1B, *** p < 0,001 versus grupo controle, ** p < 0,01 versus grupo Burn).
Alterações na área de impressão da pata traseira após ferimentos de queimadura ao longo do tempo são mostradas na Figura 2. A lesão por queimadura reduziu significativamente a área de impressão da pata traseira ipsilateral a partir do dia seguinte à indução e persistiu por 7 dias. A área de impressão da pata traseira foi significativamente melhorada pela administração do acetaminofeno (200 mg/kg, i.p., uma vez por dia durante 7 dias a partir do dia da indução de queimaduras) em comparação com o grupo tratado com veículos (Figura 2A,B, * p < 0,05 e ** p < 0,01 versus grupo Burn).
As mudanças de curso de tempo em uma única posição após a lesão por queimadura são mostradas na Figura 3. A lesão por queimaduras reduziu a posição única (%) da pata traseira ipsilateral 1 dia após a indução da queimadura, e essa redução foi mantida por 7 dias. A posição única da pata traseira foi melhorada pela administração de acetaminofeno (200 mg/kg, i.p., uma vez por dia durante 7 dias a partir do dia da indução de queimaduras) em comparação com o grupo tratado com o veículo (Figura 3A,B, * p < 0,05 versus grupo Burn).
Alterações no tempo de imobilidade obtidas a partir do teste de natação forçada são mostradas na Figura 4. O tempo de imobilidade dos camundongos induzidos por queimaduras foi aumentado 7 dias após a indução de queimadura em comparação com o do grupo controle. Em camundongos induzidos por queimaduras, a administração de acetaminofeno (200 mg/kg, i.p., uma vez por dia durante 7 dias a partir do dia da indução da queimadura) reduziu significativamente o aumento induzido por queimaduras no tempo de imobilidade (** p < 0,01 e *** p < 0,001 versus grupo burn).
A função motora normal foi avaliada com base nas alterações no tempo de funcionamento na haste rota, conforme mostrado na Figura 5. O tempo de execução dos camundongos induzidos por queimaduras não mudou aos 7 dias após a indução da queimadura em comparação com o do grupo controle. Em contrapartida, o tempo de funcionamento dos camundongos tratados com alfaxalona (controle positivo) diminuiu significativamente durante cerca de 60 min. Este resultado indica que uma lesão por queimadura utilizada neste estudo não causa comprometimento motor (*** p < 0,001 versus grupo Burn).
Figura 1: A liga mecânica avaliada pelo teste von Frey em camundongos induzidos por queimaduras. (A) O limiar de abstinência da pata (PWT, g) na pata traseira ipsilateral dos camundongos foi diminuído 1 dia após lesão por queimadura e sustentado por 7 dias em comparação com o grupo controle. A administração de acetaminofeno (200 mg/kg, i.p., uma vez por dia durante 7 dias a partir do dia da indução da queimadura) reduziu significativamente a liga mecânica induzida por queimaduras. (B) A PWT foi analisada como a área sob a curva (AUC). Flechas indicam o dia da administração de drogas. p < 0,001 versus Grupo Controle, ** p < 0,01 contra grupo Burn. Medidas repetidas bidirecional A ANOVA foi realizada para determinar os efeitos globais no curso do tempo do teste von Frey. A análise pós-hoc foi realizada usando o teste de Dunnett para determinar o valor P. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Área de impressão da pata obtida a partir da análise automatizada da marcha em camundongos induzidos por lesão por queimaduras. (A) Imagens representativas das patas traseiras ipsilaterais e contralateras de camundongos foram capturadas pelo software de análise de marcha. O tamanho de contato da pata é reduzido após a lesão de queimadura em comparação com a do grupo controle. Essa redução foi parcialmente recuperada pela administração do acetaminofeno (200 mg/kg, i.p., uma vez por dia durante 7 dias a partir do dia da indução da queimadura). Retângulos brancos indicam as patas traseiras analisadas pelo software, (B) um gráfico mostra as mudanças de curso de tempo na área de impressão da pata (%). Os dados são calculados como o percentual de mudanças na área de impressão entre as patas traseiras ipsilateral (direita) e contralateral (esquerda) (por exemplo, o valor de 50% indica as mesmas áreas de impressão da pata nas patas traseiras direita e esquerda). Flechas indicam o dia da administração de drogas. * p < 0,05 e ** p < 0,01 contra grupo Burn. Medidas repetidas bidirecional A ANOVA foi realizada para determinar os efeitos globais no curso do tempo da área de impressão na análise da marcha. A análise pós-hoc foi realizada usando o teste de Dunnett para determinar o valor P. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: A única postura obtida a partir da análise automatizada da marcha em camundongos induzidos por queimaduras. (A) Imagens representativas de uma única postura foram capturadas pelo software de análise de marcha. Cores diferentes indicavam a postura de cada pata: azul, pata dianteira direita; rosa, pata traseira direita; amarelo, pata dianteira esquerda; verde, pata traseira esquerda. A posição única da pata traseira ipsilateral foi encurtada após lesão por queimadura. Esta mudança foi parcialmente recuperada pela administração de acetaminofeno (200 mg/kg, i.p., uma vez por dia durante 7 dias a partir do dia da indução da queimadura). (B) Um gráfico mostra mudanças no curso de tempo na posição única (%). Os dados são resumidos como um gráfico de linha após calcular a porcentagem de mudanças na posição única entre as patas traseiras ipsilateral (direita) e contralateral (esquerda) (por exemplo, o valor de 50% indica a mesma posição única nas patas traseiras direita e esquerda). Flechas indicam o dia da administração de drogas. * p < 0,05 contra grupo Burn. Medidas repetidas bidirecional A ANOVA foi realizada para determinar os efeitos globais no curso do tempo de uma única posição na análise da marcha. A análise pós-hoc foi realizada usando o teste de Dunnett para determinar o valor P. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: O tempo de imobilidade do teste de natação forçada em camundongos induzidos por queimaduras. O tempo de imobilidade dos camundongos induzidos por queimaduras foi aumentado 7 dias após a indução de queimadura em comparação com o do grupo Controle. Em camundongos induzidos por queimaduras, a administração de acetaminofeno (200 mg/kg, i.p., uma vez por dia durante 7 dias a partir do dia da indução da queimadura) aliviou significativamente o tempo de imobilidade aumentada pela queimadura. p < 0,001 versus Grupo Controle, ** p < 0,01 contra grupo Burn. Medidas repetidas de uma forma ANOVA foi realizada para determinar os efeitos gerais no curso do tempo do teste de natação forçada. A análise pós-hoc foi realizada usando o teste de Dunnett para determinar o valor P. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: A avaliação normal da função motora com base nas alterações no tempo de execução do teste de rotação-haste em camundongos induzidos por lesão por queimadura. Não houve alteração no tempo de execução dos camundongos induzidos por queimaduras aos 7 dias após a indução da queimadura em comparação com os grupos de lesão de queimadura tratados com controle e acetaminofeno. No entanto, o tempo de funcionamento dos camundongos tratados com alfaxalona (controle positivo) foi significativamente reduzido para ~60 s. Este resultado indica que uma lesão por queimadura utilizada neste estudo não causa prejuízo motor. p < 0,001 contra grupo Burn. Medidas repetidas bidirecional A ANOVA foi realizada para determinar os efeitos gerais no curso do tempo do teste rota-rod. A análise pós-hoc foi realizada usando o teste de Dunnett para determinar o valor P. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Alterações nos danos teciduais ao longo do tempo após a indução de queimaduras. Após a indução da queimadura escaldante, observou-se danos significativos nos tecidos, que aumentaram gradualmente ao longo do tempo. Neste estudo, o acetaminofeno, usado como uma droga de controle positivo, mostrou um efeito protetor sobre os danos teciduais. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
A queimadura escaldante é um tipo de queimadura térmica causada por líquidos aquecidos. Foi sugerido que queimaduras de primeiro ou segundo grau ocorrem na maioria dos casos, mas o contato a longo prazo com fontes de calor pode causar queimaduras de terceiro grau26. No presente estudo, a lesão por queimadura foi induzida pela exposição da pata traseira direita dos camundongos em água quente a 65 °C por 3 s 4,26. Foram detectados danos teciduais na pata ferida por queimaduras, que apresenta sintomas comuns de queimaduras como vermelhidão, descascamento da pele e inchaço (Figura Suplementar 1)4.
A medição da aodínia mecânica é um método de identificação de resposta à dor comumente usado em modelos de dor animal e foi medido usando filamentos von-Frey neste estudo. O método de estímulo ascendente com os filamentos von Frey é usado para determinar o limiar mecânico necessário para induzir a resposta de retirada da pata de um animal19,20. O experimento começou com o filamento com o menor estímulo. A força de dobra do filamento respondendo a um número definido (três vezes neste protocolo) foi obtida como um valor limiar de retirada da pata.
A análise de marcha de roedores durante a caminhada livre é usada para estudar a doença de Parkinson ou movimentos dos membros e mudanças de posição em modelos de comprometimento sensorial-motor, incluindo lesão medular e derrame27,28. O sistema de análise de marcha analisa automaticamente vários parâmetros de marcha, incluindo intensidade da pata, impressão da pata, fase de postura, etc. Alterações de parâmetros que o sistema de análise de marcha pode analisar podem ser utilizadas como indicadores relacionados à dor na análise de marcha dos modelos animais de dor. Portanto, a análise da marcha pode ser utilizada como método experimental para quantificar a dor espontânea não invasivamente nos modelosanimais 4,21,22. Com base em achados anteriores de que os parâmetros de marcha foram diminuídos no lado induzido pela dor em modelos animais de dor21,22, este protocolo apresentou protocolo quantificado cada parâmetro de marcha como a razão do lado ipsilateral e contralateral induzido por queimaduras. Neste protocolo, a área de impressão da pata e os dados de posição única foram convertidos na taxa de alterações entre as patas traseiras ipsilateral (lesionadas) e contralateral (não-lesionadas). O valor de 50% significa que o tamanho da impressão da pata e o tempo para chegar ao chão são os mesmos tanto no ipsilateral quanto no contralateral, enquanto o valor inferior a 50% indica que esses parâmetros são diminuídos na pata traseira ipsilateral induzida por queimaduras. As alterações percentuais entre as patas traseiras ipsilaterais e contralaterais foram utilizadas para a obtenção de todos os dados (ou seja, camundongos normais apresentaram ~50%, o que significa que a razão ipsilateral: contralateral foi de 50:50). Em animais normais, os parâmetros relacionados a cada membro traseiro aparecem os mesmos em ambos os lados ao andar livremente. No entanto, a análise deste protocolo está focada no fato de que os parâmetros do lado ipsilateral diminuem após a indução da dor. Além disso, há variação individual em cada animal; dados precisos podem não ser obtidos quando os dados brutos são analisados como estão. Portanto, cada valor do parâmetro de marcha foi convertido em uma razão para obter resultados mais precisos durante a análise. O presente estudo mostrou que o tamanho da área de impressão e o tempo de postura única da pata traseira ipsilateral foram reduzidos após lesão por queimadura, e essa redução foi restaurada pela repetida administração de acetaminofeno intraperitoneal. Essas mudanças coincidiram com um padrão semelhante de mudanças no tempo-curso nos comportamentos de dor após lesões de queimaduras e administração de drogas.
Embora controverso, o teste de natação forçado é o método mais usado para estudar o comportamento de roedores deprimidos. Os animais tentam escapar do recipiente cheio de água, mas eventualmente não se movem, induzindo desespero29. No entanto, argumenta-se que a imobilidade é difícil de avaliar como medida de depressão porque este teste está associado à resistência, bem como sentimentos de desespero. Para apoiar os resultados do experimento de natação forçada, outros métodos de avaliação da depressão, como o teste de suspensão da cauda, teste de alimentação suprimido por novidades e teste de consumo de sacarose, podem ser considerados30,31. No presente estudo, o tempo de imobilização foi aumentado após a lesão por queimadura, e esse aumento foi restaurado pela administração do acetaminofeno.
Os protocolos deste estudo foram concebidos para estabelecer um modelo de dor aguda que acompanha o comportamento semelhante à depressão após a lesão por queimadura. O comportamento semelhante à depressão neste estudo pode ser os efeitos secundários do comprometimento físico e alterações na sensibilidade térmica após lesão por queimadura 15,32,33. Os resultados podem sugerir que camundongos com dor aguda induzida após lesão por queimadura apresentaram comportamento semelhante à depressão. Tem sido mostrado para melhorar a resposta à dor e consequentemente comportamentos semelhantes à depressão por drogas tratadas experimentalmente.
O teste de rotação-has é um teste de desempenho baseado em uma carga rotacional que geralmente é aplicada à força a roedores com atividade atlética. O teste mede parâmetros como tempo de execução e resistência. Algumas das características do teste incluem, entre outros, os efeitos de uma droga experimental ou o equilíbrio de indivíduos no modelo de dor neuropática, força de aderência e avaliação de coordenação motora 22,25,34. Como mostrado nos resultados deste estudo, não houve alteração no tempo de execução da vara rota após lesão por queimadura ou tratamento de acetaminofeno em comparação com o do grupo controle.
Este estudo demonstra o desenvolvimento de um modelo animal para estudar dor induzida por queimaduras e comportamento semelhante à depressão em camundongos. Nesse sentido, este estudo mostrou que lesões escaldantes de queimaduras induziram a aodynia mecânica, alterações dos parâmetros de marcha e comportamento semelhante à depressão, como o tempo de imobilidade. Este modelo é adequado para pesquisas sobre os diversos aspectos e desfechos da dor de queimadura e seu tratamento e espera-se que traga informações importantes para este campo de pesquisa.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pela Universidade Nacional de Chungnam e pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) financiada pelo governo da Coreia (NRF-2019R1A6A3A01093963 e NRF-2021R1F1A1062509).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD | 307809 | |
| 1.5 mL tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 50 mL tube | SPL | 50050 | |
| Acetaminophen BioXtra, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | A7085-100G | This analgesic agent is used as a positive control. |
| Alfaxan multidose (Alfaxalone) | JUROX Pty.Limited | In this experiment, this material was used for animal anesthesia, and was used as a positive control for experimentally treated drugs in the rota-rod test. | |
| CatWalk automated gait analysis system | Noldus | CatWalk XT | Gait analysis in freely walking rodents is used to study the changes in limb movement and positioning in models with sensory-motor dysfunction |
| OPTISHIELD (Cyclosporin ophthalmic ointment) | Ashish Life Science | This material was used for an ointment to prevent corneal drying after induction of anesthesia. | |
| Plexiglass cylinder | SCITECH KOREA | custom made products | Used in forced swimming test |
| Rota-rod system | SCITECH KOREA | Accelerating rota rod | Used in the measurement of Normal Motor Function |
| von Frey filaments | North Coast Medical | NC12775 | Used in the measurement of Mechanical Allodynia |
| Waterbath | CHANGSHIN SCIENCE | C-WBE | Used in the burn injury induction |
References
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