Summary
Una lesión por escaldadura transitoria (65 °C ± 0,5 °C, 3 s) de una pata trasera disminuye el umbral (g) a la estimulación del filamento von Frey del lado ipsilateral y altera el patrón de marcha. Además, la lesión por quemadura induce un comportamiento similar a la depresión en la prueba de natación forzada.
Abstract
El agua hirviendo es la causa más común de lesiones por quemaduras tanto en poblaciones de edad avanzada como jóvenes. Es uno de los principales desafíos clínicos debido a la alta mortalidad y secuelas en los países de ingresos bajos y medios. Las quemaduras con frecuencia inducen dolor espontáneo intenso y alodinia persistente, así como problemas potencialmente mortales. Más importante aún, el dolor excesivo a menudo se acompaña de depresión, lo que puede disminuir significativamente la calidad de vida. Este artículo muestra cómo desarrollar un modelo animal para el estudio del dolor inducido por quemaduras y el comportamiento similar a la depresión. Después de la anestesia, la lesión por quemadura se indujo sumergiendo una pata trasera del ratón en agua caliente (65 ° C ± 0,5 ° C) durante 3 s. La prueba de von Frey y el análisis automatizado de la marcha se realizaron cada 2 días después de la lesión por quemadura. Además, se examinó el comportamiento similar a la depresión utilizando la prueba de natación forzada, y se realizó la prueba de varilla giratoria para diferenciar la función motora anormal después de una lesión por quemadura. El objetivo principal de este estudio es describir el desarrollo de un modelo animal para el estudio del dolor inducido por quemaduras y el comportamiento similar a la depresión en ratones.
Introduction
El daño tisular, como quemaduras y traumatismos, generalmente se asocia con la co-ocurrencia de dolor agudo. Se estima que las lesiones por quemaduras y los síntomas relacionados con el trauma se estiman en que 1,80,000 muertes cada año son causadas por quemaduras; la gran mayoría ocurren en países de ingresos bajos y medios de diferentes tipos de quemaduras1. Según un informe mundial, las quemaduras son comunes en los niños y representan alrededor del 40%-60% de los pacientes hospitalizados 2,3. Estas lesiones específicas son aún más graves, ya que pueden ocurrir en la vida cotidiana, como hervir o bañarseen agua 4,5. Aunque el dolor agudo puede resolverse espontáneamente después de la recuperación del daño tisular en la mayoría de los casos, puede ser posible que se vuelva crónico debido a cambios anormales en el sistema nervioso 6,7.
Recientemente, se ha sugerido que el dolor agudo puede inducir un estado de ánimo deprimido, y el dolor crónico puede causar ansiedad y depresión 8,9,10,11. La coexistencia del dolor y la depresión hace que sea más difícil tratar al paciente. La depresión también tiende a aumentar la sensibilidad al dolor, lo que es probable que induzca una depresión y dolor másintensos 12. Las complicaciones del dolor y la depresión se muestran en modelos animales de inflamación periférica 13,14,15,16. Los mecanismos detallados que subyacen a la depresión inducida por el dolor no son bien conocidos hasta ahora17. Por lo tanto, es necesario desarrollar tratamientos más efectivos para las quemaduras para aliviar los efectos secundarios y los síntomas.
Por lo tanto, el presente estudio fue diseñado para desarrollar un modelo animal para estudiar el dolor agudo inducido por quemaduras y el comportamiento similar a la depresión en ratones. Para esto, se midió la sensibilidad táctil anormal relacionada con las lesiones por quemaduras, el patrón de marcha alterado y el comportamiento similar a la depresión. Además, este estudio intenta validar el modelo utilizando AINE.
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Protocol
Todos los protocolos experimentales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Nacional de Chungnam en Corea del Sur, y luego se llevaron a cabo en base a las pautas éticas de la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor18.
1. Inducción de la lesión por quemaduras hirviendo en la pata trasera
- Alojar a los ratones machos ICR que pesan 20-25 g en una habitación con luz y temperatura controlada (ciclo de luz-oscuridad de 12/12 h, 22,5 °C ± 2,5 °C) con una humedad del 40%-60%.
NOTA: Tanto los ratones machos como las hembras se pueden utilizar para este protocolo. - Permita que el animal tenga libre acceso a alimentos y agua, y aclimata durante al menos 1 semana antes de comenzar el experimento.
NOTA: Todos los animales fueron alojados en grupo para excluir variables como el estrés de aislamiento. - Asigne a los ratones al azar al grupo experimental o de control y realice experimentos ciegos utilizando números de animales como códigos.
- El día de la inducción de la quemadura, anestesiar al ratón mediante inyección intraperitoneal (i.p.) de 300 μL de alfaxalona a una dosis de 100 mg/kg. Use una bata quirúrgica, guantes y máscara mientras realiza la inducción de quemaduras.
- Después de anestesiar profundamente al ratón, desinfecte alrededor de la pata trasera derecha con etanol al 70%.
NOTA: Compruebe la falta de respuesta a la estimulación de pellizco aplicada a los dedos traseros o la cola para confirmar el estado de anestesia profunda. - Aplique un ungüento oftálmico en los ojos para evitar el secado corneal después de la inducción de la anestesia.
- Sumerja la pata trasera derecha del ratón profundamente anestesiado en agua caliente a 65 °C ± 0,5 °C durante 3 s. Haga una marca en el tobillo de cada ratón antes de sumergir la pata trasera en agua caliente para mantener la consistencia en el área quemada.
- Después de la inducción de quemaduras, lleve a los ratones a una jaula casera limpia y colóquelos en una almohadilla térmica hasta que los animales se recuperen de la anestesia.
NOTA: El agente analgésico, paracetamol (200 mg/kg), se administró por vía intraperitoneal una vez al día durante 7 días a partir del día de la lesión por quemadura (solo burn + acetaminofén). El grupo burn fue tratado con solución salina como control vehicular. El experimento se realizó según el método descrito en un estudio previo4.
2. Medición de la alodinia mecánica
- Lleve a los ratones a la sala de pruebas de comportamiento y déjelos aclimatarse al menos durante 30 minutos antes de la prueba. Use una bata quirúrgica, guantes y máscara mientras realiza la prueba.
- Coloque los ratones en una caja cuadrada (diámetro: 13 cm, altura: 12 cm) en un piso de malla metálica (tamaño de malla: 0,7 cm x 0,7 cm) y déjelos aclimatarse durante al menos 30 min.
- Evaluar el umbral mecánico de la pata trasera utilizando el método de estímulo ascendente 19,20.
- Empuje suavemente una serie de filamentos von Frey con intervalos de 5-8 s para estimular la planta posterior. Obtenga los valores basales el día antes de la inducción de quemaduras.
NOTA: Los filamentos von Frey de 0,16-1,2 g se utilizaron en la prueba para medir el umbral de retirada de la pata en todos los animales, respectivamente. La prueba de respuesta de retirada de la pata se inició con la fuerza de flexión más baja del filamento von Frey (0,16 g en este protocolo). Si no había respuesta, entonces se aplicaba un filamento con la siguiente fuerza de flexión. - Realizar cinco ensayos para evaluar los umbrales mecánicos para cada pata trasera ipsilateral (lesionada).
NOTA: La fuerza de flexión del filamento de von Frey que produce respuesta más de tres veces de los cinco ensayos en cada animal se expresó como umbral de retirada de la pata (PWT, g). Los umbrales mecánicos se midieron un día antes y a los 1, 3, 5 y 7 días después de la lesión por quemadura. El efecto analgésico se evaluó 1 h después de la administración del paracetamol en el animal.
3. Análisis automatizado de la marcha
- Aclimatar a los ratones en el sistema de análisis de la marcha una vez al día durante 10-15 minutos desde 5 días antes de la lesión por quemadura. Use una bata quirúrgica, guantes y máscara mientras realiza un análisis de la marcha.
- El día de la prueba, lleve a los ratones a la sala de pruebas de comportamiento y aclimatarlos durante al menos 30 minutos antes de la prueba.
NOTA: Realice pruebas de aclimatación y análisis de la marcha en un entorno oscuro. Establezca las condiciones del menú del programa de la siguiente manera.- Después de ejecutar el programa, haga clic en el menú Crear nuevo experimento para designar la carpeta para guardar los datos.
- Después de la designación, establezca el tiempo máximo de ejecución en 5 s y las variaciones de velocidad máximas permitidas en 50%.
- Seleccione una cámara registrada y establezca la longitud de la pasarela en 30 cm en la pestaña Configuración del programa.
- En la pestaña Adquirir del menú del programa, seleccione Abrir adquisición.
- Según los mensajes de estado, haga clic en el botón Ajustar fondo para adquirir una imagen de fondo de una pasarela vacía.
- Haga clic en el botón Iniciar adquisición y luego coloque el mouse en la entrada de la pasarela transitable izquierda-derecha. La grabación se iniciará automáticamente tras el libre movimiento del ratón.
NOTA: Si la marcha del animal se ha registrado con éxito y se han detectado todos los pasos, se marcará como Compliant Run con un icono verde. Si el software no detecta ningún paso, se muestra un icono rojo, en cuyo caso se recomienda realizar la grabación nuevamente. Los autores recomiendan recopilar y analizar al menos cinco ejecuciones compatibles exitosas realizadas con velocidades de ejecución similares. - En la pestaña Adquirir del menú del programa, seleccione Clasificar ejecuciones.
NOTA: Después de seleccionar los datos obtenidos de la ejecución de cumplimiento exitosa anterior, vaya a la pantalla de análisis de video donde se registraron los patrones de marcha de los ratones. - Seleccione la ejecución que desea analizar y haga clic en el botón Clasificación automática .
- Después de realizar la clasificación automática, elimine la nariz, el reconocimiento genital y el reconocimiento incorrecto de las patas a los datos basura en cada carrera, y luego analice los datos.
NOTA: Todos los parámetros estadísticos se analizan y guardan automáticamente en el programa, y los valores de datos sin procesar se pueden encontrar en el menú de análisis del experimentador. El análisis automático de la marcha se realizó antes y a los 1, 3, 5 y 7 días después de la lesión por quemadura. La evaluación se realizó 30 min después de la administración de paracetamol en el grupo Burn + Acetaminophen y 30 min después del tratamiento salino en el grupo Burn. Este experimento se realizó según el método descrito en los estudios previos 4,21,22.
4. Medición del comportamiento similar a la depresión
NOTA: El comportamiento basado en la desesperación, el tiempo de inmovilidad en el agua se midió mediante la prueba de natación forzada.
- Lleve a los ratones a la sala de pruebas de comportamiento y aclimatarlos durante al menos 30 minutos antes de la prueba. Use una bata quirúrgica, guantes y máscara mientras realiza la prueba de natación forzada.
- Coloque el ratón en un cilindro de plexiglás transparente (10 cm x 25 cm) que contenga 15 cm de agua (25 °C ± 0,5 °C) durante 15 min.
- Después de 24 h, coloque el ratón en el cilindro de las mismas condiciones y mida el tiempo de inmovilidad.
NOTA: El tiempo de inmovilidad se midió durante 5 minutos de tiempo de prueba, y se registró el tiempo en que los ratones dejaron de escalar o nadar y simplemente flotaron para mantener la cabeza por encima de la superficie del agua. La prueba de natación forzada se realizó el día 7 después de la lesión por quemadura. La evaluación se realizó 1 h después de la administración de paracetamol en el grupo Burn + Acetaminophen, y 1 h después del tratamiento salino en el grupo Burn. El experimento se realizó según el método descrito en estudios previos23,24.
5. Medición de la función motora normal
NOTA: La prueba de varilla rotativa se realizó para diferenciar la función motora anormal después de una lesión por quemadura.
- Lleve a los ratones a la sala de pruebas de comportamiento y aclimatarlos durante al menos 30 minutos antes de la prueba. Use una bata quirúrgica, guantes y máscara mientras realiza la prueba de natación forzada.
- Coloque a los animales en una plataforma cilíndrica rodante (5,7 cm de ancho; 3 cm de diámetro) suspendida 16 cm por encima de la parte inferior del aparato.
- Permita que cada animal entrene una vez al día en una varilla giratoria durante al menos 5 días antes de la inducción de la lesión por quemadura.
- Realice la prueba de varilla rotativa cada 20 minutos durante 2 h después de la administración del medicamento. Establezca el tiempo de corte en 2 min.
- Mida la duración del tiempo que el ratón funciona en una varilla giratoria a la velocidad constante de 15 revoluciones por minuto sin caer.
NOTA: La prueba de varilla rotatoria se realizó 7 días después de la inducción de la lesión por quemadura. La evaluación se realizó inmediatamente después de la administración de paracetamol en el grupo Burn + Acetaminophen y después del tratamiento con solución salina en el grupo Burn. La alfaxalona se utilizó como un control positivo para los fármacos tratados experimentalmente en esta prueba. Durante la prueba de rotarod, se mide la duración del tiempo que el ratón corre sobre la varilla giratoria sin caerse. El experimento se realizó según el método descrito en estudios previos22,25.
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Representative Results
Con el fin de minimizar el sufrimiento de los animales y reducir el número de animales utilizados según las tres R (Reemplazo, Reducción y Refinamiento), este estudio fue diseñado con el número mínimo de animales para la recopilación de datos significativos establecidos a través de experimentos preliminares. En este estudio, los experimentos conductuales se realizaron de forma independiente dos veces de la siguiente manera. El análisis de la marcha, la alodinia mecánica y las pruebas de comportamiento similares a la depresión se realizaron con los grupos Control (n = 5), Burn (n = 7; control del vehículo; solución salina) y Burn + Acetaminophen (n = 7). En la prueba de varilla rotatoria, Control (n = 3), Quemadura (n = 4; control del vehículo; solución salina), Quemadura + Acetaminofén (n = 4), Control positivo (n = 4; Alfaxalone) se diseñaron grupos. La alfaxalona es un tipo de esteroide neuroactivo y anestésico que actualmente se utiliza en medicina veterinaria como inductor anestésico general inyectable. En este estudio, la alfaxalona se utilizó en anestesia animal para la inducción de quemaduras y se utilizó como un fármaco de control positivo para las deficiencias motoras en la prueba de varilla rotativa.
Los datos se expresaron como media ± S.E.M. Además, los datos experimentales obtenidos en diferentes momentos se analizaron de forma independiente. Las respuestas conductuales al dolor se calcularon como el área bajo la curva (AUC). Se realizaron medidas repetidas bidireccionales ANOVA para determinar las diferencias en los datos de la prueba de alodinia mecánica, el análisis de la marcha y la prueba de varilla rotativa a lo largo del tiempo. La prueba de Dunnett se utilizó para el análisis Post-hoc para determinar el valor P entre los grupos experimentales. Los valores de P inferiores a 0,05 se consideraron significativos. Se utilizó el software GraphPad Prism 6.0 para analizar esta validez estadística. Todos los procedimientos de análisis estadístico se realizaron a ciegas en relación con las condiciones experimentales. Una figura que ilustra el daño tisular inducido por quemaduras se muestra en la Figura suplementaria 1.
Los cambios en el curso del tiempo en el umbral de retirada de la pata (PWT, g) después de una lesión por quemadura se muestran en la Figura 1. El PWT (g) de los ratones inducidos por quemaduras se disminuyó 1 día después de la inducción de quemaduras y se mantuvo durante 7 días en comparación con el del grupo de control. La administración de paracetamol (200 mg/kg, p.p., una vez al día durante 7 días a partir del día de la inducción de la quemadura) redujo significativamente la disminución inducida por la quemadura en la PWT (Figura 1A, ** p < 0,01 versus Grupo de quemaduras). Además, el análisis de AUC (durante 7 días) mostró que la administración de paracetamol disminuyó significativamente la alodinia mecánica inducida por lesiones por quemaduras (Figura 1B, *** p < 0,001 versus Grupo control, ** p < 0,01 versus Grupo quemado).
Los cambios en el área de impresión de la pata trasera después de una lesión por quemadura a lo largo del tiempo se muestran en la Figura 2. La lesión por quemadura redujo significativamente el área de impresión de la pata trasera ipsilateral desde el día después de la inducción y persistió durante 7 días. El área de impresión de la pata trasera mejoró significativamente mediante la administración de paracetamol (200 mg/kg, i.p., una vez al día durante 7 días a partir del día de la inducción de la quemadura) en comparación con el grupo tratado con el vehículo (Figura 2A, B, * p < 0,05 y ** p < 0,01 versus grupo Quemado).
Los cambios en el curso del tiempo en una sola postura después de una lesión por quemadura se muestran en la Figura 3. La lesión por quemadura redujo la postura única (%) de la pata trasera ipsilateral 1 día después de la inducción de la quemadura, y esta reducción se mantuvo durante 7 días. La postura única de la pata trasera mejoró mediante la administración de paracetamol (200 mg/kg, i.p., una vez al día durante 7 días a partir del día de la inducción de la quemadura) en comparación con el grupo tratado con el vehículo (Figura 3A, B, * p < 0,05 versus Grupo de quemaduras).
Los cambios en el tiempo de inmovilidad obtenido de la prueba de natación forzada se muestran en la Figura 4. El tiempo de inmovilidad de los ratones inducidos por quemaduras aumentó 7 días después de la inducción de quemaduras en comparación con el del grupo de control. En ratones inducidos por quemaduras, la administración de paracetamol (200 mg / kg, es decir, una vez al día durante 7 días a partir del día de la inducción de la quemadura) redujo significativamente el aumento inducido por la lesión por quemadura en el tiempo de inmovilidad (** p < 0.01 y *** p < 0.001 versus grupo de quemaduras).
La función motora normal se evaluó en función de los cambios en el tiempo de funcionamiento de la varilla giratoria, como se muestra en la Figura 5. El tiempo de ejecución de los ratones inducidos por lesiones por quemaduras no cambió a los 7 días después de la inducción de la quemadura en comparación con el del grupo de control. Por el contrario, el tiempo de ejecución de los ratones tratados con alfaxalona (control positivo) disminuyó significativamente durante aproximadamente 60 min. Este resultado indica que una lesión por quemadura utilizada en este estudio no causa deterioro motor (*** p < 0,001 versus grupo de quemaduras).
Figura 1: Alodinia mecánica evaluada por la prueba de von Frey en ratones inducidos por lesiones por quemaduras. (A) El umbral de retirada de la pata (PWT, g) en la pata trasera ipsilateral de ratones disminuyó 1 día después de la lesión por quemadura y se mantuvo durante 7 días en comparación con el grupo de control. La administración de paracetamol (200 mg/kg, p.i., una vez al día durante 7 días a partir del día de la inducción de la quemadura) redujo significativamente la alodinia mecánica inducida por la lesión por quemadura. (B) El PWT fue analizado como el área bajo la curva (AUC). Las flechas indican el día de la administración del medicamento. p < 0,001 versus grupo control, ** p < 0,01 versus grupo Burn. Se realizaron medidas repetidas bidireccionales ANOVA para determinar los efectos generales en el curso temporal de la prueba de von Frey. El análisis post-hoc se realizó utilizando la prueba de Dunnett para determinar el valor P. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Área de impresión de la pata obtenida del análisis automatizado de la marcha en ratones inducidos por quemaduras. (A) El software de análisis de la marcha capturó imágenes representativas de las patas traseras ipsilaterales y contralaterales de los ratones. El tamaño de contacto de la pata se reduce después de una lesión por quemadura en comparación con el del grupo de control. Esta reducción se recuperó parcialmente mediante la administración de paracetamol (200 mg/kg, p.i., una vez al día durante 7 días a partir del día de la inducción de la quemadura). Los rectángulos blancos indican las patas traseras analizadas por el software, (B) un gráfico muestra los cambios del curso de tiempo en el área de impresión de la pata (%). Los datos se calculan como el porcentaje de cambios en el área de impresión entre las patas traseras ipsilaterales (derecha) y contralaterales (izquierda) (por ejemplo, el valor del 50% indica las mismas áreas de impresión de patas en las patas traseras derecha e izquierda). Las flechas indican el día de la administración del medicamento. * p < 0,05 y ** p < 0,01 frente al grupo Burn. Se realizaron medidas repetidas bidireccionales ANOVA para determinar los efectos generales en el curso del tiempo del área de impresión en el análisis de la marcha. El análisis post-hoc se realizó utilizando la prueba de Dunnett para determinar el valor P. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Postura única obtenida del análisis automatizado de la marcha en ratones inducidos por quemaduras. (A) El software de análisis de la marcha capturó imágenes representativas de una sola postura. Diferentes colores indicaron la postura de cada pata: azul, pata delantera derecha; rosa, pata trasera derecha; amarillo, pata delantera izquierda; verde, pata trasera izquierda. La postura única de la pata trasera ipsilateral se acortó después de la lesión por quemadura. Este cambio se recuperó parcialmente mediante la administración de paracetamol (200 mg/kg, i.p., una vez al día durante 7 días a partir del día de la inducción de la quemadura). (B) Un gráfico muestra los cambios en el curso del tiempo en la postura única (%). Los datos se resumen como un gráfico de líneas después de calcular el porcentaje de cambios en la postura individual entre las patas traseras ipsilaterales (derecha) y contralaterales (izquierda) (por ejemplo, el valor del 50% indica la misma postura única en las patas traseras derecha e izquierda). Las flechas indican el día de la administración del medicamento. * p < 0,05 versus grupo Burn. Se realizaron medidas repetidas bidireccionales ANOVA para determinar los efectos generales en el curso temporal de una postura única en el análisis de la marcha. El análisis post-hoc se realizó utilizando la prueba de Dunnett para determinar el valor P. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: El tiempo de inmovilidad de la prueba de natación forzada en ratones inducidos por quemaduras. El tiempo de inmovilidad de los ratones inducidos por quemaduras aumentó 7 días después de la inducción de quemaduras en comparación con el del grupo control. En ratones inducidos por quemaduras, la administración de paracetamol (200 mg / kg, i.p., una vez al día durante 7 días a partir del día de la inducción de la quemadura) alivió significativamente el tiempo de inmovilidad mejorado inducido por la lesión por quemaduras. p < 0,001 versus grupo control, ** p < 0,01 versus grupo Burn. Se realizaron medidas repetidas unidireccionales ANOVA para determinar los efectos generales en el curso temporal de la prueba de natación forzada. El análisis post-hoc se realizó utilizando la prueba de Dunnett para determinar el valor P. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: La evaluación de la función motora normal basada en los cambios en el tiempo de ejecución de la prueba de varilla rotativa en ratones inducidos por quemaduras. No hubo cambios en el tiempo de ejecución de los ratones inducidos por lesiones por quemaduras a los 7 días después de la inducción de quemaduras en comparación con los de los grupos de lesiones por quemaduras tratadas con control y paracetamol. Sin embargo, el tiempo de ejecución de los ratones tratados con alfaxalona (control positivo) se redujo significativamente a ~ 60 s. Este resultado indica que una lesión por quemadura utilizada en este estudio no causa deterioro motor. p < 0,001 versus grupo Burn. Se realizaron medidas repetidas bidireccionales ANOVA para determinar los efectos generales en el curso temporal de la prueba de varilla giratoria. El análisis post-hoc se realizó utilizando la prueba de Dunnett para determinar el valor P. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria 1: Cambios en el daño tisular a lo largo del tiempo después de la inducción de quemaduras. Después de la inducción de la quemadura por quemaduras, se observó un daño tisular significativo, que aumentó gradualmente con el tiempo. En este estudio, el paracetamol, utilizado como un fármaco de control positivo, ha demostrado un efecto protector sobre los daños tisulares. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
La quemadura por escaldado es un tipo de quemadura térmica causada por líquidos calentados. Se ha sugerido que las quemaduras de primer o segundo grado ocurren en la mayoría de los casos, pero el contacto a largo plazo con fuentes de calor puede causar quemaduras de tercer grado26. En el presente estudio, la lesión por quemaduras se indujo al exponer la pata trasera derecha de los ratones en agua caliente a 65 ° C durante 3 s 4,26. Se detectó daño tisular en la pata lesionada por quemaduras, que muestra síntomas comunes de quemaduras como enrojecimiento, descamación de la piel e hinchazón (Figura suplementaria 1)4.
La medición mecánica de la alodinia es un método de identificación de la respuesta al dolor comúnmente utilizado en modelos animales de dolor y se midió utilizando filamentos von-Frey en este estudio. El método de estímulo ascendente con los filamentos de von Frey se utiliza para determinar el umbral mecánico requerido para inducir la respuesta de retirada de la pata de un animal19,20. El experimento comenzó con el filamento con el menor estímulo. La fuerza de flexión del filamento que responde a un número establecido (tres veces en este protocolo) se obtuvo como un valor umbral de retirada de la pata.
El análisis de la marcha de roedores durante la marcha libre se utiliza para estudiar la enfermedad de Parkinson o los movimientos de las extremidades y los cambios de posición en los modelos de deterioro sensitivo-motor, incluida la lesión de la médula espinal y el accidente cerebrovascular27,28. El sistema de análisis de la marcha analiza automáticamente varios parámetros de la marcha, incluida la intensidad de la pata, la impresión de la pata, la fase de postura, etc. Las alteraciones de los parámetros que el sistema de análisis de la marcha puede analizar se pueden utilizar como indicadores relacionados con el dolor en el análisis de la marcha de modelos animales de dolor. Por lo tanto, el análisis de la marcha puede utilizarse como método experimental para cuantificar de forma no invasiva el dolor espontáneo en modelos animales 4,21,22. Sobre la base de hallazgos previos de que los parámetros de la marcha se redujeron en el lado inducido por el dolor en modelos animales de dolor 21,22, este protocolo presentado cuantificó cada parámetro de la marcha como la relación del lado ipsilateral y contralateral inducido por quemaduras. En este protocolo, los datos del área de impresión de la pata y de la postura única se convirtieron en la tasa de cambios entre las patas traseras ipsilaterales (lesionadas) y contralaterales (no lesionadas). El valor del 50% significa que el tamaño de la impresión de la pata y el tiempo para llegar al piso son los mismos tanto en el ipsilateral como en el contralateral, mientras que el valor inferior al 50% indica que estos parámetros disminuyen en la pata trasera ipsilateral inducida por quemaduras. Los cambios porcentuales entre las patas traseras ipsilaterales y contralaterales se utilizaron para obtener todos los datos (es decir, los ratones normales mostraron ~ 50%, lo que significa que la relación ipsilateral: contralateral fue de 50: 50). En los animales normales, los parámetros relacionados con cada miembro posterior aparecen iguales en ambos lados cuando se camina libremente. Sin embargo, el análisis de este protocolo se centra en el hecho de que los parámetros en el lado ipsilateral disminuyen después de la inducción del dolor. Además, hay variación individual en cada animal; es posible que no se obtengan datos precisos cuando los datos en bruto se analizan tal cual. Por lo tanto, cada valor del parámetro de marcha se convirtió en una relación para obtener resultados más precisos durante el análisis. El presente estudio ha demostrado que el tamaño del área de impresión y el tiempo de postura única de la pata trasera ipsilateral se redujeron después de la lesión por quemadura, y esta reducción se restauró mediante la administración repetida de paracetamol intraperitoneal. Estos cambios coincidieron con un patrón similar de cambios en el curso del tiempo en los comportamientos de dolor después de la lesión por quemaduras y la administración de medicamentos.
Aunque controvertida, la prueba de natación forzada es el método más utilizado para estudiar el comportamiento de los roedores deprimidos. Los animales intentan escapar del recipiente lleno de agua pero finalmente no se mueven, induciendo desesperación29. Sin embargo, se argumenta que la inmovilidad es difícil de evaluar como una medida de la depresión porque esta prueba se asocia con la resistencia, así como con sentimientos de desesperación. Para apoyar los resultados del experimento de natación forzada, se pueden considerar otros métodos de evaluación de la depresión, como la prueba de suspensión de la cola, la prueba de alimentación suprimida por novedad y la prueba de consumo de sacarosa30,31. En el presente estudio, el tiempo de inmovilización se incrementó después de la lesión por quemadura, y este aumento se restauró mediante la administración de paracetamol.
Los protocolos de este estudio fueron diseñados para establecer un modelo de dolor agudo que acompaña al comportamiento similar a la depresión después de una lesión por quemaduras. El comportamiento similar a la depresión en este estudio puede ser los efectos secundarios del deterioro físico y los cambios en la sensibilidad térmica después de una lesión por quemadura 15,32,33. Los resultados podrían sugerir que los ratones con dolor agudo inducido después de una lesión por quemadura exhibieron un comportamiento similar a la depresión. Se ha demostrado que mejora la respuesta al dolor y los consiguientes comportamientos similares a la depresión mediante medicamentos tratados experimentalmente.
La prueba de varilla rota es una prueba de rendimiento basada en una carga rotacional que generalmente se aplica por la fuerza a roedores con actividad atlética. La prueba mide parámetros como el tiempo de carrera y la resistencia. Algunas de las características de la prueba incluyen, entre otros, los efectos de un fármaco experimental o el equilibrio de los sujetos en el modelo de dolor neuropático, la fuerza de agarre y la evaluación de la coordinaciónmotora 22,25,34. Como se muestra en los resultados de este estudio, no hubo cambios en el tiempo de funcionamiento de la varilla giratoria después de la lesión por quemadura o el tratamiento con paracetamol en comparación con el del grupo de control.
Este estudio demuestra el desarrollo de un modelo animal para estudiar el dolor inducido por lesiones por quemaduras y el comportamiento similar a la depresión en ratones. En este sentido, este estudio ha demostrado que las lesiones por quemaduras hirviendo indujeron alodinia mecánica, alteraciones de los parámetros de la marcha y comportamientos similares a la depresión, como el tiempo de inmovilidad. Este modelo es adecuado para la investigación sobre los diversos aspectos y resultados del dolor por quemaduras y su tratamiento y se espera que aporte información importante a este campo de investigación.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por la Universidad Nacional de Chungnam y la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno de Corea (NRF-2019R1A6A3A01093963 y NRF-2021R1F1A1062509).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD | 307809 | |
| 1.5 mL tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 50 mL tube | SPL | 50050 | |
| Acetaminophen BioXtra, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | A7085-100G | This analgesic agent is used as a positive control. |
| Alfaxan multidose (Alfaxalone) | JUROX Pty.Limited | In this experiment, this material was used for animal anesthesia, and was used as a positive control for experimentally treated drugs in the rota-rod test. | |
| CatWalk automated gait analysis system | Noldus | CatWalk XT | Gait analysis in freely walking rodents is used to study the changes in limb movement and positioning in models with sensory-motor dysfunction |
| OPTISHIELD (Cyclosporin ophthalmic ointment) | Ashish Life Science | This material was used for an ointment to prevent corneal drying after induction of anesthesia. | |
| Plexiglass cylinder | SCITECH KOREA | custom made products | Used in forced swimming test |
| Rota-rod system | SCITECH KOREA | Accelerating rota rod | Used in the measurement of Normal Motor Function |
| von Frey filaments | North Coast Medical | NC12775 | Used in the measurement of Mechanical Allodynia |
| Waterbath | CHANGSHIN SCIENCE | C-WBE | Used in the burn injury induction |
References
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